에 셀 운명을 따라

이 실험 과정의 전반적인 목표는 형광 현미경을 사용하여 파지 lambda 감염 후 e coli 내의 황산염을 실시간으로 추적하는 것입니다. 우선 파지 lambda의 조정액(crude lysate)을 제조하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 파지를 정제하고, 튜브 내에서 파지 lambda로 e coli를 감염시킵니다.

현미경 하에서 박테리아 세포의 운명을 지속적으로 관찰합니다. 궁극적으로, 세포 성장 또는 사멸과 관련된 서로 다른 형광 단백질의 발현을 통해 E. coli의 다양한 세포 운명을 실시간으로 확인할 수 있습니다. 일반적으로, 이 방법의 한 가지 점검 사항은 정제된 프론트 및 라벨링된 FI 스톡의 생성입니다.

준비 및 정제 과정 중의 응집을 방지하기 위해, 건강한 세포 성장이 가능하도록 현미경의 이미징 파라미터를 최적화하십시오. E 3 92 Lambda LZ one PPL star D의 하룻밤 배양액을 LBM 배지에 접종하십시오. 세포 밀도가 OD 600 기준 약 0.6이 되면, 42 °C 워터배스 셰이커에서 lygen을 유도하십시오.

용해가 확인될 때까지 37 °C에서 계속 배양합니다. 배양액이 투명해집니다. 이제 2% chloroform을 첨가하고, 실온에서 15분 동안 배양합니다.

다음으로, 파지 용해물을 250 milliliter 병에 옮기고 배양액을 원심 분리합니다. 그 후 파지 입자가 포함된 상층액을 회수하고, 표준 파지 역가 측정 프로토콜에 따라 가시적인 잔해물을 제거하기 위해 2차 원심 분리를 수행합니다. 파지 농도를 측정하고, cesium chloride 구배를 통해 파지를 정제한 다음, aro slab 제작을 위해 DPI로 활성을 측정합니다.

6개의 현미경 슬라이드를 70% ethanol로 세척합니다. 5개의 슬라이드를 표시된 대로 배치하고 테이프로 고정합니다. 이제 고정된 슬라이드 위에 배지에 1.5% aros를 녹인 용액을 붓습니다.

기포가 생기지 않도록 주의하며 마지막 슬라이드를 맨 위에 배치합니다. 그 위에 무게추를 올리고 AROS를 약 30분 동안 냉각시킵니다. 측면의 슬라이드 4개를 제거하고 슬라이드 뭉치를 랩으로 포장합니다.

형질전환된 박테리아의 하룻밤 배양액을 접종균으로 사용하여 LBMM에서 배양한 후, 박테리아 1 mL를 펠렛화하고 재현탁합니다. 넓은 피펫 팁을 사용하여 세포를 얼음처럼 차가운 LBMM 20 µL에 현탁합니다.

정제된 파지 20 µL를 첨가합니다. 가볍게 혼합한 후, 파지가 흡착될 수 있도록 먼저 얼음 위에서 30분간 배양합니다. 그 다음 35 °C 항온수조에서 5분간 배양합니다.

파지 DNA 주입을 유도하기 위해, 혼합하여 세포 응집물을 분리합니다. 혼합물을 LBMM에 1:10 비율로 희석합니다. 이제 LBM agro 슬랩에 배치합니다.

커버 슬립 위에 파지 세포 혼합물 1 µL를 추가합니다. 흡수되면 다른 커버 슬립을 그 위에 조심스럽게 덮습니다. 초기 시간대에 대해 YFP 채널을 통해 이미지 세트를 획득하는 것으로 시작하십시오.

200 nanometer Z축 간격으로 15장의 이미지를 연속 촬영합니다. 추가로, 위상차(phase contrast) 및 m cherry 채널을 통해 초점이 맞은 단일 이미지를 촬영합니다. 그 다음, 감염 후 세포 운명에 대한 타임랩스 동영상을 획득합니다.

타임랩스 영상 촬영 중 광퇴색과 광독성을 최소화하기 위해, 각 채널의 시간대별 이미지당 단일 Z 위치 이미지를 사용하고, 위상차, YFP 및 M cherry 채널의 샘플을 약 4시간 동안 10분 간격으로 촬영하십시오. 이미지 분석은 파지의 수를 수동으로 세는 것부터 시작하며, 파지의 위치와 세포 길이 또한 기록하십시오. 초기 시간대에는 용균성, 용원성 또는 비감염성 중 세포의 운명을 기록하십시오.

또한 타임랩스 영상을 재생하여 용해 시간을 비롯한 기타 필요한 정보를 기록하고, 자동 세포 인식 및 계보 추적 알고리즘을 사용하여 개별 세포의 시간에 따른 형광 수준과 같은 정량적 정보를 추가로 추출하십시오. 일반적으로 형광 표지된 파지의 플라크는 야생형보다 현저히 작으며, 성공적으로 정제된 파지의 YFP 및 DAPI 신호는 서로 공국소화(co-localize)됩니다. 이 데이터는 위상차, YFP 및 M cherry 채널의 이미지 세트와 타임랩스 영상에서 얻은 해당 중첩 이미지들을 결합한 것입니다.

초기 시점에서 개별 파지들이 명확하게 보입니다. 여기 두 개의 세포는 각각 단일 파지에 의해 감염되었으며, 한 세포는 세 개의 파지에 의해 감염된 것이 보입니다. 일반적으로 일부 파지는 세포 표면에서 관찰되는 반면, 다른 파지들은 흡착되지 않은 상태로 관찰됩니다.

시간이 지남에 따라 감염 결과가 뚜렷하게 구분됩니다. 80분 후, 단일 파지에 감염된 두 세포는 각각 용해 경로로 진입했습니다. 새로운 파지가 세포 내에서 생성됨에 따라, 세 개의 파지에 감염된 세포는 pre-motor로부터 m Cherry가 생성되는 것을 특징으로 하는 용원성 경로로 진입했습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 phage lambda를 이용하여 e co 박테리아를 감염시키기 위한 정제된 파지 스톡을 제작하는 방법과 현미경 하에서 실시간으로 라이프사이클 이미징을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.