에 셀 운명을 따라 E. 대장균 파지 람다에 의해 감염 후

이 절차의 전반적인 목표는 형광 현미경을 사용하여 파지 람다에 감염된 후 실시간으로 대장균 내 황산염을 추적하는 것입니다. 먼저 파지 람다의 원유 용해물을 생성합니다. 그런 다음 파지를 정제하고 튜브의 파지 람다에 의해 대장균을 감염시킵니다.

현미경으로 박테리아 세포의 운명을 계속 따라가 보십시오. 궁극적으로, 결과는 세포 성장 또는 사멸과 관련된 다양한 형광 단백질의 발현을 통해 대장균의 다양한 세포 지방을 실시간으로 보여줄 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 대한 한 가지 확인은 정제된 전면과 라벨링된 FI 스톡을 생성하는 것입니다.

준비 및 정제 중 무화과 공유를 피하려면 현미경 아래에서 이미징 매개변수를 최적화하여 건강한 세포 성장을 가능하게 합니다. E 3 92 람다 LZ 1 PPL 별 D의 하룻밤 문화를 LBM으로. 약 0.6 주위 OD 600의 세포 밀도에서 매체는 섭씨 42도 수조 셰이커에서 lygen을 유도합니다.

용해가 분명해질 때까지 섭씨 37도에서 계속 배양합니다. 문화가 명확해집니다. 이제 2% 클로로포름을 첨가한 다음 실온에서 15분 동안 배양합니다.

다음으로, 파지 용해물을 250ml 병으로 옮기고 배양물을 원심분리합니다. 그런 다음 파지 입자가 포함된 상층액을 회수하고 두 번째 원심분리를 수행하여 표준 파지 적정 프로토콜로 눈에 보이는 파편을 제거합니다. 파지 농도를 측정한 다음 염화세슘 구배를 통해 파지를 정제하고 아로 슬래브 준비를 위해 DPI로 활성을 분석합니다.

70% 에탄올로 6개의 현미경 슬라이드를 청소합니다. 그림과 같이 5개의 슬라이드를 정렬하고 테이프로 고정합니다. 이제 1.5%aros의 용액을 고정된 슬라이드에 매체로 붓습니다.

기포를 조심스럽게 피하면서 마지막 슬라이드를 맨 위에 놓습니다. 그 위에 추를 얹고 AROS를 약 30분 동안 식힙니다. 측면에 있는 4개의 슬라이드를 제거하고 슬라이드 슬래브를 랩으로 포장합니다.

형질전환된 박테리아를 접종물로 하룻밤 동안 배양하여 LBMM 펠릿 1밀리리터의 박테리아와 소생체에서 배양물을 성장시킵니다. 세포를 얼음처럼 차가운 20마이크로리터에 현탁시킵니다. 넓은 피펫 팁이 있는 LBMM.

20마이크로리터의 정제된 파지를 추가합니다. 먼저 부드럽게 섞은 후 얼음 위에서 30분 동안 배양하여 파지가 흡수될 수 있도록 합니다. 그런 다음 섭씨 35도의 수조에서 5분 동안 담가둡니다.

파지 DNA 주입을 트리거하려면 혼합을 통해 세포 응집체를 분리하십시오. 혼합물을 1에서 10으로 LBMM으로 희석합니다. 이제 LBM 농업 슬래브를 배치합니다.

커버 슬립에 1마이크로리터의 파지 세포 혼합물을 추가합니다. 흡수되면 다른 커버 슬립을 위에 부드럽게 놓습니다. 초기 기간 동안 YFP 채널을 통해 설정된 이미지를 획득하는 것부터 시작합니다.

200나노미터 Z축 간격으로 15개의 이미지를 연속으로 촬영합니다. 또한 위상차 및 m cherry 채널을 통해 초점이 맞는 단일 이미지를 촬영합니다. 그런 다음 감염 후 세포의 운명에 대한 타임랩스 동영상을 획득합니다.

타임랩스 동영상 중 표백 및 광독성을 최소화하려면 시점 이미지당 채널당 단일 Z 위치 이미지를 사용하고, 약 4시간 동안 10분 간격으로 위상차 YFP 및 M 체리 채널의 샘플을 사용합니다. 수동으로 파지 수를 계산하여 이미지 분석을 시작하고 파지 위치와 세포 길이도 기록합니다. 초기 시간대에는 용해성, 용원성 또는 감염되지 않은 세포의 운명을 기록합니다.

또한 타임랩스 동영상을 재생하여 용해 시간 및 기타 원하는 정보를 문서화하고, 자동화된 세포 인식 및 계통 추적 알고리즘을 사용하여 개별 세포에서 시간 경과에 따른 형광 수준과 같은 보다 정량적인 정보를 추출합니다. 일반적으로 형광 표지된 파지의 플라크는 야생형의 플라크보다 훨씬 작으며 성공적으로 정제된 파지 co의 YFP 및 DAPI 신호는 국소화됩니다. 이 데이터는 위상차 YFP 및 M cherry 채널의 이미지 세트와 타임랩스 영화의 해당 오버레이 이미지를 결합합니다.

개별 파지는 초기 시간대에서 명확하게 볼 수 있습니다. 여기서 두 개의 세포가 각각 하나의 파지에 감염된 것을 볼 수 있고, 한 개의 세포가 세 개의 파지에 감염된 것을 볼 수 있습니다. 일반적으로 세포 표면에서 많은 파지가 보이지만 다른 파지는 흡수되지 않습니다.

시간이 지남에 따라 감염 결과를 구별할 수 있게 됩니다. 80분 후, 단일 파지에 감염된 두 개의 세포가 각각 용해 경로로 들어갑니다. 세포 내에서 새로운 파지가 생성됨에 따라 3개의 파지에 감염된 세포는 전동기에서 m 체리(m Cherry)를 생산하는 것으로 표시되는 용원 경로로 들어갔습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 정제된 파지 스톡을 만들어 파지 람다에 의해 eCo 박테리아를 감염시키는 방법과 현미경으로 실시간으로 라이프스타일 이미징을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.