뉴런의 사진 자극에 저렴한 LED 배열을 사용하여

이 절차의 목표는 뇌 절편의 신경 활동을 제어하기 위해 LED 어레이를 준비하고 원격으로 작동하는 것입니다. 이는 채널 REDSIN 두 개의 발현 뉴런이 있는 동물의 체외 슬라이스를 사용하고 현미경과 함께 LED 어레이를 사용하여 이러한 뉴런을 활성화하여 수행됩니다. 이 동영상은 LED 및 현미경을 보정하여 알려진 강도의 빛을 슬라이스 챔버에 전달하는 방법을 다룹니다.

이 설정을 사용하면 채널 2 발현 뉴런의 광시야 자극을 통해 광 자극에 대한 반응으로 채널 2 발현 뉴런의 활성화 임계값을 정확하게 측정할 수 있습니다. 이 기술은 큰 신경 세포 집단의 임시로 정밀한 광학 제어를 가능하게 합니다. 레이저 또는 셔터 기반 방법을 사용하는 방법을 포함한 기존 광유전학적 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 매우 저렴하고 기존 패치 클램프 스코프에 쉽게 장착할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 활동이 성인 뇌에 새로운 뉴런의 통합을 어떻게 형성하는지 포함하여 성인 신경 발생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 기존 신경 회로에 통합되는 성인 태생 뉴런의 활동에 대한 정확한 시간적 제어를 제공하기 때문에 성인 신경 줄기 세포를 기반으로 한 치료 또는 진단으로 확장됩니다. 이 방법은 성인 신경 발생의 기능적 결과에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 모든 체외 제제에서도 수행할 수 있습니다.

뉴런을 발현하는 채널 채택 포함 원하는 파장에서 피크 전력을 생성하는 LED 어레이를 선택하여 시작합니다. 또한 최대 정격 전류가 있는 어레이를 선택합니다. LED 어레이를 현미경에 통합합니다.

방열판의 효율성을 높이기 위해 열 페이스트를 사용하여 방열판이라는 팬에 LED 어레이를 부착하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 렌즈 어셈블리에서 저전력 스톡 LED를 제거하고 고출력 LED를 렌즈에 고정합니다. 이제 명시야 램프를 조립된 LED 장치로 교체하고 팬이 시스템의 공통 접지에 단단히 접지되어 있는지 확인하십시오.

LED 어레이를 신중하게 배치하여 조명이 목표와 일치하는지 확인해야 했습니다. 목표. 콘덴서의 초점을 맞춰 Kohler 조명을 구현하여 자기장 다이어프램의 이미지가 슬라이스 챔버에 초점이 맞춰지고 대물렌즈 광학 경로 아래 중앙에 오도록 합니다. 얇은 렌즈 티슈는 다른 깊이에서 후면 조리개의 이미지에 초점을 맞추는 데 도움이 될 수 있습니다.

이제 파워 미터의 조리개 역할을 할 수 있는 불투명한 재료에 알려진 직경의 핀홀을 뚫습니다. 이 작은 핀홀 중 하나를 광 파워 미터의 센서 위에 놓습니다. 그런 다음 파워 미터를 현미경에 고정하여 콘덴서를 핀홀에 집중시킵니다.

최대 판독값이 나올 때까지 파워미터를 수동으로 배치합니다. 이 위치에 파워미터를 부착합니다. 파워 미터 최대값이 슬라이스의 평면보다 높으면 해당 평면에서 Kohler 조명을 다시 설정합니다.

그런 다음 모든 조리개를 완전히 엽니다. 스테이지 매니퓰레이터를 사용하여 광학 광 경로를 기준으로 파워 미터를 체계적으로 이동합니다. 완료되면 대물렌즈의 초점 아래에 있어야 하는 최대 전력 주위의 그리드에서 전력 판독값을 체계적으로 취하여 조명 영역 내에서 광학 출력의 균일성을 측정하고, 현미경은 대물렌즈 초점을 중심으로 더 시원한 조명으로 적절하게 설정되었으며, 어레이의 최대 출력은 이 초점 영역에 있어야 합니다. 초점 외부의 영역은 이제 균일성에 따라 알려진 양의 전력을 받아야 합니다. 음모.

이제 각 핀홀이 핀홀 면적의 함수로 광학 출력을 플롯하는 데 사용되는 드릴 비트 직경에 대한 지식을 사용하여 각 크기의 핀홀에 대한 최대 출력을 측정합니다. 천공된 핀홀은 완벽하지 않기 때문에 이러한 값의 평균을 구하면 광학 출력 밀도를 잘 추정할 수 있습니다. LED 어레이는 광학 패치를 적용하는 데 사용됩니다.

전력 플롯과 균일성 플롯을 구축할 때 패치에 필요한 모든 광학 요소를 고려해야 합니다. 예를 들어, 많은 현미경에는 균일성을 위해 전력을 희생하는 데 사용할 수 있는 뒤집을 수 있는 디퓨저 스크린이 있습니다. 표준 방법을 사용하여 뇌 조직 절편을 준비하고, 예열된 A CSF에서 절편이 30-45분 동안 회복되도록 하면서 패치 피펫을 만듭니다.

조직이 회복되면 산소가 공급된 A CSF를 지속적으로 관류하는 현미경의 기록 챔버에 슬라이스를 부드럽게 놓습니다. 형광등 조명의 밑에 epi 형광에 의하여 2개의 수로 redsin EYFP 수로의 존재를 확인하십시오. 슬라이스에서 성숙한 형태를 가진 건강한 채널 2 EYFP 뉴런을 찾습니다.

그런 다음 이 뉴런 소마를 패치 광학 장치 아래에 배치하고 원형질막과 패치 전극의 벽 사이에 기가 옴 밀봉을 생성합니다. 전극이 스파이크 뉴런에 충분히 닫혀 있으면 자발적인 활동으로 기가 옴 밀봉 없이도 측정 가능한 국소 전위를 생성해야 합니다. 이제 활성화 채널은 LED 전력과 지속 시간의 함수인 광 선량이 여러 전력과 지속 시간에서 활동 전위를 유발하는 데 얼마나 많은 빛이 필요한지 계산하기 때문에 다른 양의 빛을 번쩍임으로써 이 뉴런에서 두 개를 채택합니다.

Olympus BX 51 wi 현미경은 두 개의 조리개와 콘덴서 렌즈가 있는 LED 인라인으로 구성되었습니다. 패치 클램프 기록을 위한 충분한 명시야 대비는 자기장 다이어프램과 조리개 다이어프램을 모두 닫음으로써 얻어졌습니다. LED 광 강도의 균일성 플롯은 점선 원으로 표시된 객관적인 시야 주변 영역에서 구성되었습니다.

모든 다이어프램이 완전히 열린 상태에서 슬라이서는 채널 채택 활성화를 위해 최대 광력에 노출되었습니다. 이 구성은 패치 클램프 시각화에 사용되는 구성보다 3배 더 강력한 조명을 생성합니다. 성체에서 태어난 후각구 과립 및 사구체 뉴런의 광범위한 라벨링은 상부 철새 하천에서 이동하는 신경아세포의 렌티바이러스 감염 후 4주 후에 관찰되었습니다.

과립 세포를 발현하는 단일 생성 채널 Adoptin two EYFP의 느슨한 패치 기록은 이 뉴런의 경우 최대 전력에서 5밀리초 자극이 스파이킹을 유발하기에 충분하다는 것을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 오후에 완료할 수 있습니다. 이 절차 후에 시간 경과에 따른 드리프트에 대한 장비 및 설정을 항상 모니터링해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이러한 광유전학 기술은 개발 이후 신경 과학 분야의 연구자들이 벌레, 파리쥐, 심지어 영장류와 같은 여러 모델 유기체에서 시냅스 전달 및 통합을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.