Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

안녕하세요, 막 구조 및 기능 생물학 연구 그룹에 오신 것을 환영합니다. 저는 Martin Caffery입니다. 본 영상은 in meso 또는 지질 입방상(lipic cubic phase) 방법을 사용하여 구조 결정을 위한 막 단백질을 결정화하는 방법에 관한 JoVE 시리즈 기사의 일부입니다.

첫 번째 논문인 JoVE 1 7 1 2에서 우리는 단백질이 포함된 입방상(cubic phase)을 준비하는 방법과 점성이 높고 끈적이는 misa 상을 결정화 실험을 위해 유리 샌드위치 플레이트에 수동으로 분주하는 방법을 시연하였습니다. 본 비디오 논문에서는 in meso 결정화 로봇을 사용하는 방법을 설명합니다. 로봇은 속도, 정확성, 정밀한 소형화라는 장점을 제공하며, 암실이나 저온과 같이 불편한 조건에서도 장시간 작업이 가능하다는 이점이 있습니다.

로봇을 적절히 활용하면 막 단백질의 구조 및 기능 연구 생산성을 크게 향상시킬 수 있습니다. 본 비디오 논문에서는 시판되는 세 가지 로봇의 사용법을 시연합니다. 첫 번째 로봇은 막 구조 및 기능 생물학 연구 그룹에서 개발되었으며, 참고 문헌 1에 상세히 설명되어 있습니다.

나머지 두 가지는 최근에 사용 가능해졌으며, 완전성을 위해 여기에 포함되었습니다. 로봇을 이용한 결정화 실험을 위해 결정화 플레이트를 준비하는 과정은, 베이스 플레이트 참조 섹션에 자세히 설명된 유리 샌드위치 결정화 플레이트의 베이스 플레이트를 준비하는 것부터 시작합니다. 먼저 베이스 플레이트를 실란 처리해야 하며, 웰을 형성하는 타공된 이중 접착 스페이서를 플레이트에 부착해야 합니다. 이에 필요한 재료들이 여기 표시되어 있습니다.

준비물에는 유리 결정화 베이스 플레이트, 천공된 이중 스틱 스페이서, 결정화 용액, 롤러 또는 브레이어, 종이 티슈, 그리고 초순수(UE water)가 담긴 비커가 포함됩니다. 플레이트를 실험대 위의 종이 타월 위에 놓습니다. 결정화 용액을 몇 방울 떨어뜨린 후, 종이 티슈를 사용하여 플레이트 표면에 고르게 도포합니다.

플레이트를 물이 담긴 비커에 완전히 담가 과량의 실란화 용액을 씻어냅니다. 플레이트를 비커에서 꺼내어 마른 종이 타월 위에 놓습니다. 실란화된 면이 위로 향하게 하고, 노출된 표면을 종이 타월로 가볍게 닦아 건조시킵니다.

다음으로, 타공된 더블 스틱 스페이서(double stick spacer)의 보호 커버를 제거하고, 이를 유리판의 실로화(siloized)된 표면에 부착합니다. 이때 스페이서의 왼쪽 상단 모서리와 인접한 두 면이 베이스 플레이트의 모서리와 일치하도록 정확하게 배치하는 것이 중요합니다. 롤러나 브레이어(brayer)를 사용하여 베이스 플레이트 위의 스페이서를 평평하게 펴고, 두 표면 사이에 빈틈없는 밀봉 상태를 만듭니다.

참고로, 참조 섹션에 기술된 바와 같이 천공된 스페이서가 포함된 실로형 플레이트를 상용 제품으로 구입할 수 있습니다. 결정화 베이스 플레이트를 준비했으므로, 다음으로 in meso 로봇의 설정 및 사용 단계로 넘어가겠습니다. 이하에서 설명하는 바와 같이, 세 종류의 in meso 로봇 사용법을 시연합니다.

제시된 모든 사례에서 로봇은 20 °C로 설정된 온도 조절실에서 설치 및 사용되었습니다. 이 영상에서 처음으로 시연되는 meso robot one은 책임 연구자(PI)의 실험실에서 개발되었으며 현재 상용 제품으로 구매 가능합니다. 자세한 내용은 참고 문헌 섹션에서 확인할 수 있습니다.

로봇을 이용한 결정화 시험 설정에 필요한 재료와 장비가 여기에 나와 있습니다. 여기에는 실험 노트, Article 1 7 1 2에 설명된 대로 갓 준비하여 Hamilton 시린지에 담은 단백질 함유 용액, 스페이서와 그에 맞는 커버 글라스가 포함된 실리콘 베이스 플레이트, 물병 및 티슈, 그리고 in miso 로봇이 포함됩니다.

첫 번째 화면은 덱이 비어 있는 로봇의 모습입니다. 다음 화면은 가습기 파킹 스테이션, 결정화 베이스 플레이트 및 침전제 용액이 들어 있는 딥웰 블록이 모두 갖춰진 로봇의 모습입니다. 먼저 베이스 플레이트를 로봇 덱 위에 올려놓아 설정을 시작합니다.

베이스 플레이트 정렬을 위해 웰 위치가 명확하게 표시된 전용 플랫폼이 있습니다. 플레이트에는 식별을 위해 라벨을 명확하게 부착해야 합니다. 침전제 용액이 담긴 96웰 블록은 결정화 플레이트 옆의 로봇 데크에 있는 전용 플랫폼에 고정됩니다.

플라스틱 상단 캡을 조심스럽게 벗겨내어 블록을 엽니다. 가습기에서 나오는 습기 흐름이 로봇 데크 위의 베이스 플레이트 위와 가로 방향으로 흐르도록 유도합니다. 로봇 설정 단계에서 제조사의 지침에 따라 로봇을 초기화합니다.

정확한 프로토콜은 시간이 지남에 따라 변경될 수 있으므로, 여기에서는 이를 상세히 시연하지 않겠습니다. 기본적으로 초기화 과정 동안 로봇의 mease 분주 암(arm)에 x, Y, Z의 세 가지 직교 방향에 대한 기준 위치가 제공됩니다. 다음으로, 분주 바늘이 장착된 Hamilton 시린지에 단백질이 포함된 meza 상을 채워 로봇의 1번 암에 부착합니다. meza 상과 시린지를 준비하는 방법에 대한 자세한 내용은 JoVE Article 1 7 1 2 및 참고문헌 1에 설명되어 있습니다. 이제 분주 시린지의 바늘 팁을 결정화 플레이트의 왼쪽 상단 모서리에 있는 최상단 웰의 바닥 및 중앙에 맞춰야 합니다. 우선적으로 이는 웰 식별자 A1에 해당하며, 웰 A1의 바닥에 맞추는 과정입니다.

이는 바늘 팁이 웰 바닥에 얼마나 가까이 도달하는지 확인하면서 분주 암(dispensing arm)의 높이 또는 Z 좌표를 조정함으로써 수행됩니다. 팁이 웰 바닥에 막 닿았는지는 플랫폼 위에서 플레이트를 손으로 좌우로 움직이면서 분주 암의 높이를 아주 미세하게 조정하여 판단할 수 있습니다. 팁이 플레이트에 닿는 지점의 분주 암 Z 좌표를 컴퓨터에 입력하며, 분주 프로그램은 바닥판의 표면에 해당하는 이 기준 Z 위치에서 수 마이크로미터 떨어진 지점에서 바늘 팁이 위치하도록 설정됩니다. 다음으로 로봇을 활성화하여 사용자가 요청하는 일련의 단계를 거쳐 바늘 팁을 A1 웰의 중심에 위치시킵니다.

팁이 중심에 위치하는 분주 암의 기준 XY 좌표는 로봇을 제어하는 컴퓨터에 저장되어 있습니다. 이 좌표는 플레이트 내 나머지 웰의 중심을 정의하는 데 사용됩니다. 컴퓨터에 이러한 기준 좌표를 설정한 후, 측정 분주 암이 시작 위치로 돌아가도록 지시하여 시린지를 프라이밍합니다.

이제 분주 시린지를 프라이밍해야 합니다. 이는 신선한 mease가 분주 바늘을 채우도록 하여 플레이트의 첫 번째 웰에 mease가 정량으로 분주되도록 하기 위함입니다. 프로그램에는 로봇을 활성화하는 프라이밍 명령이 포함되어 있습니다.

사용자의 제어 하에 시린지의 플런저가 단계적으로 전진하게 됩니다. 이 과정 중에 바늘 끝을 확인하여 메자 상(meza phase)이 압출되어 나타나는지 살펴보고, 나타난 메자 상은 티슈로 제거합니다. 이로써 로봇을 가동하기 위한 프라이밍 과정이 완료됩니다.

이제 로봇이 자동 모드로 실행되어 가동될 준비가 되었습니다. 로봇 XAP 프로그램은 플러싱 단계를 시작하며, 이때 로봇의 두 번째 암에 장착된 침전제 분주 팁을 세척하고 딥 웰 블록에서 침전제 용액을 흡입할 준비를 합니다. 로봇의 분주 기능을 활성화하면, 먼저 8개 웰씩 단백질이 포함된 mease를 순차적으로 로딩한 후, 각 분주 사이에 침전제 용액을 로딩합니다. mease 분주 암은 파킹 위치로 돌아가며, 팁 끝의 mease가 마르는 것을 방지하기 위해 바늘 끝을 적신 스펀지에 배치합니다.

막 구조 및 기능 생물학 그룹에서 수행하는 결정화 시험에 가장 일반적으로 사용되는 값은 단백질 50 nanoliters와 침전제 용액 800 nanoliters입니다. 본 시연에서 로봇을 구동하는 프로그램은 두 개의 암이 동시에 움직이도록 설정되었습니다.

이러한 방식으로, 5분 이내에 96웰 플레이트에 시료와 침전제를 모두 분주할 수 있습니다. 플레이트가 채워지고 로봇 암이 원래의 대기 위치로 돌아가면, 즉시 플레이트를 로봇 데크에서 꺼내 평평하고 단단한 표면에 놓습니다.

커버 글라스를 베이스 플레이트 위에 조심스럽게 올려놓아 스페이서의 상단 접착면과 접촉하게 합니다. 96개 웰 전체가 완전히 덮였는지, 커버 글라스가 베이스 플레이트와 직각으로 정렬되었는지, 그리고 커버 글라스가 베이스 플레이트의 범위를 벗어나지 않았는지 확인하는 것이 중요합니다. 롤러나 브라이어를 사용하여 커버 글라스와 스페이서 사이에 기밀하고 균일한 밀봉을 형성합니다.

이 단계에서 플레이트를 검사하여 설정이 제대로 되었는지 확인해야 합니다. 이때 프라이팬 위의 계란 프라이와 같은 모양이 나타나는지 확인합니다. 각 웰에서 계란 노란색 부분은 meza 상에 해당합니다.

달걀 흰자는 침전 용액이며, 팬의 가장자리는 결정화의 경계가 됩니다. 이상적으로는 이 세 가지가 동심원을 이루어야 합니다. 이제 플레이트를 결정 성장을 위해 온도 조절 저장 구역에 배치할 준비가 되었습니다.

더 이상 설정할 플레이트가 없다면, 침전제 블록을 로봇 데크에서 제거하고 적절히 밀봉하여 보관 장소에 넣어야 합니다. mease가 담긴 시린지를 로봇의 분주 암에서 제거하고, 분주 바늘과 페룰을 포함한 다양한 부품을 분해합니다. 메탄올로 주의 깊게 세척하고 건조하여 다음 Meso robot two mosquito LCP 사용을 준비합니다.

다음 비디오 클립에서는 in meso 결정화 실험 설정에 사용할 수 있는 mosquito LCP 로봇을 보여줍니다. 이 로봇은 이 글에서 앞서 설명한 것과 유사한 meph 상 분주 시스템을 포함하고 있습니다. 다만, 로봇 1의 경우 침전제는 일회용 팁을 사용하여 분주합니다.

여기에 기기 본체가 표시되어 있습니다. 여기에는 결정화 플레이트와 침전제 블록이 놓이는 데크와 습도 제어를 위한 창이 달린 챔버가 포함되어 있습니다. 이 화면에서는 습도 챔버의 창이 열려 있으며, 분주 팁이 장착된 스풀, 측정 분주 암, 그리고 모페(meph) 상 분주 바늘의 위치를 설정하기 위한 레이저 기반 센서가 보입니다.

결정화 플레이트가 놓이는 돌출된 플랫폼과 침전제 스크린 블록을 유지하기 위한 매립형 플랫폼이 있습니다. 이 과정에서 로봇은 기기가 켜질 때 초기화 동작 시퀀스를 수행합니다. 프로그래밍 소프트웨어를 사용하여 특정 결정화 플레이트 및 침전제 블록에 맞게 기기를 설정하고, 정해진 순서에 따라 설정된 부피의 시료와 침전제를 분주합니다.

그러한 세부 사항은 제조업체에서 제공하며 여기서는 표시하지 않습니다. 로봇을 사용하여 결정화 플레이트를 설정하는 과정은 다음과 같이 시작됩니다. 앞서 'in meso robot one' 및 JoVE 1 7 1 2에서 설명한 대로, 바늘이 장착되고 단백질이 포함된 용액으로 채워진 Hamilton 시린지를 준비합니다. 해당 시린지를 로봇의 디스펜싱 암 아래 정해진 위치에 고정합니다.

분주 시린지의 바늘 X 및 y 좌표는 데크에 장착된 레이저 센서를 사용하여 설정합니다. 이는 결정화 플레이트의 각 웰 중앙에 mease가 정확하게 분주되도록 하기 위해 필요한 중요한 단계입니다. 제어 패널의 버튼을 누르면 시린지가 작동하여 바늘 끝에서 mease를 배출할 준비가 됩니다.

로봇을 사용하여 웰에 시료를 분주하기 전, 밀려 나온 매질을 티슈로 제거한 뒤 결정화 플레이트를 로봇 데크에 장착합니다. 플레이트가 제자리에 고정될 수 있도록 플랫폼 표면에 물 몇 방울을 떨어뜨려 적셔줍니다. 모세관 현상을 이용하여 플레이트에서 보호 커버를 제거하고, 플레이트가 잘 밀착되도록 플랫폼 위에 단단히 배치합니다.

플랫폼에는 세 개의 기준점이 있으며, 플레이트의 세 모서리 웰이 이 기준점에 맞춰 중심이 잡히게 하여 분주 니들 팁에 대해 플레이트의 위치를 정확하게 설정할 수 있도록 합니다. 이제 기기가 설정 사이클에 진입할 준비가 되었습니다. 이는 신선한 mease로 플레이트를 로딩하기 직전에 소형 유리판 위에 Mease를 분주하는 두 번째 프라이밍 단계로 시작됩니다. 이 과정에서 로봇이 먼저 플레이트의 8개 웰로 구성된 수직 컬럼에 mease를 로딩한 후, 일회용 팁을 사용하여 mease 볼루스 위에 침전 용액을 분주하는 것을 확인할 수 있습니다.

이 과정을 플레이트 길이를 따라 모든 웰이 채워질 때까지 11번 반복합니다. 전체 과정은 완료하는 데 약 5분이 소요됩니다. 본 영상에서는 각 웰에 50 nanoliters의 Mease와 800 nanoliters의 침전제 용액을 분주하였습니다.

충전된 플레이트를 벤치 위에 배치된 로봇 플랫폼에서 제거합니다. 커버 글라스를 덮고, 앞서 Meso Robot 1에서 설명한 대로 브라(bra)를 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 적절하게 라벨이 부착된 플레이트를 이제 Crystal Growth를 위해 온도 조절 환경인 Meso Robot 3(Griffin LCP)에 배치할 수 있습니다.

마지막 비디오 클립에서는 Griffin LCP 로봇을 사용하여 meso 결정화 실험을 설정하는 모습을 보여줍니다. Griffin은 앞서 로봇 1에 대해 설명한 것과 유사한 meph 상 분주 시스템을 통합하고 있습니다. 하지만 이 경우에는 96가지의 모든 침전제 용액이 동시에 분주됩니다.

기기 본체가 여기에 표시되어 있습니다. 여기에는 결정화 플레이트와 침전제 블록이 놓이는 데크, 시약 분주 암 및 Phoenix 96 팁 헤드가 포함됩니다. 침전제 용액을 분주하는 로봇의 작동 모습은 마지막 비디오 시퀀스에서 확인할 수 있습니다.

먼저 96개 팁 헤드에 침전제 용액을 분주합니다. 점성이 있는 침전제의 흡입을 용이하게 하기 위해 사용자 정의 지연 시간이 제공됩니다. MEA 상은 약 1분 정도의 시간에 걸쳐 96개 웰에 순차적으로 분주됩니다.

마지막으로, 96팁 헤드가 결정화 웰 내의 MEA 상 볼루스 위에 96가지 침전제 용액을 동시에 분주합니다. 전체 플레이트 로딩 과정은 2분 만에 완료됩니다. 채워진 플레이트를 로봇 데크에서 제거한 후, 커버 글라스로 밀봉하여 결정 성장을 위해 제어된 온도 조건의 보관소에 배치합니다.

거대분자 결정학을 통한 구조 결정의 전체 과정에서 다음 단계는 결정을 수확하여 저온 냉각하고, 결정으로부터 X선 회절 데이터를 기록하고 처리하는 것입니다. 이러한 주제들은 본 시리즈의 별도 작업 기사에서 다룹니다.I.