Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

Membrane Structural and Functional Biology Group에 오신 것을 환영합니다. 제 이름은 Martin Caffery입니다. 이것은 in meso 또는 lipic cubic phase 방법을 사용하여 구조화된 결정을 위한 막 단백질의 결정화에 대한 일련의 JO 기사 중 하나입니다.

첫 번째 논문인 JoVE 1 7 1 2에서는 단백질이 함유된 입방상을 준비하는 방법과 점성 및 끈적한 미사상을 결정화 시험을 위해 유리 샌드위치 플레이트에 수동으로 분주하는 방법을 보여주었습니다. 이 비디오 기사에서는 메조 결정화 로봇을 사용하는 방법을 설명합니다. 로봇은 속도, 정확성, 정밀한 소형화 및 어두운 곳이나 낮은 온도와 같은 불편한 조건에서도 장시간 작업할 수 있는 이점을 제공합니다.

로봇을 적절하게 사용하면 멤브레인 단백질 구조 및 기능 연구의 생산성을 크게 향상시킬 수 있습니다. 이 비디오 기사에서는 상업적으로 이용 가능한 세 가지 로봇의 사용을 보여줍니다. 첫 번째 로봇은 멤브레인 구조 및 기능 생물학 그룹에서 개발되었으며 참고 문헌 1에 자세히 설명되어 있습니다.

다른 두 개는 최근에 사용할 수 있게 되었으며 완전성을 위해 여기에 포함되어 있습니다. 결정화 시험을 수행하기 위한 결정화 플레이트 준비는 베이스 플레이트와 관련하여 자세히 설명된 유리 샌드위치 결정화 플레이트의 베이스 플레이트를 준비하는 것으로 시작되며, 베이스 플레이트를 참조하여 자세히 설명하고, 웰을 생성하는 천공된 이중 스틱 스페이서를 플레이트에 적용해야 합니다. 이를 위해 필요한 자료가 여기에 나와 있습니다.

여기에는 유리 결정화 베이스 플레이트, 천공된 이중 스틱 스페이서 라이징 용액, 롤러 또는 브레이어 종이 티슈 및 UE 물 비커가 포함됩니다. 접시는 벤치 탑의 종이 타월 위에 놓습니다. 몇 방울의 조용한 용액을 도포한 다음 종이 티슈로 플레이트 표면에 고르게 분포시킵니다.

플레이트는 물이 담긴 비이커에 완전히 담궈 과도한 izing 용액을 세척합니다. 마른 종이 타월 위에 놓인 비커에서 접시를 제거합니다. 사일로화된 면이 위로 향하게 하고 노출된 표면은 종이 타월로 가볍게 닦아 건조시킵니다.

다음으로, 천공된 양면 스틱 스페이서의 보호 커버를 제거하고 스페이서를 유리판의 사일로화된 표면에 도포합니다. 스페이서가 왼쪽 상단 모서리와 스페이서와 플레이트의 인접한 두 면이 일치하는 베이스 플레이트에 적절하게 배치되는 것이 중요합니다. 롤러 또는 브레이어는 베이스 플레이트의 스페이서를 평평하게 만들고 그 사이에 단단한 밀봉을 만드는 데 사용됩니다.

괄호 안에, 우리는 perforated spacer로 완성된 사일로화된 플레이트가 참조 섹션에 설명된 대로 상업적으로 이용 가능하다는 점에 주목합니다. 결정화 베이스 플레이트를 준비한 후 다음으로 메조 로봇을 설정하고 사용하는 단계로 이동합니다. 다음에서 언급했듯이 메조 로봇에서 세 가지를 사용하는 방법을 보여줍니다.

표시된 모든 사례에서 로봇은 이 비디오에서 시연될 최초의 메소 로봇인 메소 로봇 1에서 섭씨 20도로 설정된 온도 제어실에서 설정 및 사용됩니다. 이 논문은 PI의 실험실에서 개발되었으며 현재 상업적으로 이용 가능합니다. 자세한 내용은 참조 섹션에서 확인할 수 있습니다.

로봇으로 결정화 시험을 설정하는 데 필요한 재료와 장비가 여기에 나와 있습니다. 여기에는 실험실 노트, 단백질이 함유된 미즈, 1 7 1 2의 Jo에 설명된 대로 신선하게 준비되고 Hamilton 주사기에 보관된 것이 포함됩니다. 스페이서와 그에 어울리는 커버 유리, 물병 및 티슈, 그리고 in 된장 로봇이 있는 사일로화된 베이스 플레이트.

첫 번째 보기는 데크가 비어 있는 로봇입니다. 다음 모습은 가습기 파크 스테이션, 결정화 베이스 플레이트 및 침전제 용액을 포함하는 깊은 우물 블록이 완비된 로봇입니다. 로봇 데크에 베이스 플레이트를 배치하여 설정을 시작합니다.

자체 플랫폼이 있으며 베이스 플레이트 정렬을 위해 우물 위치가 명확하게 표시되어 있습니다. 플레이트는 식별을 위해 명확하게 라벨을 부착해야 합니다. 침전제 용액을 포함하는 96개의 웰 블록은 결정화 플레이트 옆에 있는 로봇 데크의 자체 플랫폼에 고정됩니다.

블록은 플라스틱 천장 뚜껑을 조심스럽게 벗겨내면 열립니다. 가습기의 습도 흐름은 로봇 데크의 베이스 플레이트 위와 가로질러 흐르도록 지시됩니다. 로봇은 제조업체의 지침에 따라 초기화됩니다.

정확한 프로토콜은 시간이 지남에 따라 변경되므로 여기서는 자세히 설명하지 않습니다. 근본적으로 초기화 중에 일어나는 일은 로봇의 디스펜싱 아암에 x, Y 및 Z의 3개의 직교 방향의 기준 위치가 제공된다는 것입니다.다음으로, 디스펜싱 바늘이 완비된 해밀턴 주사기의 단백질 함유 메자상이 로봇 중 하나에 부착되어 메자상 및 주사기를 준비하는 방법에 대한 자세한 내용은 제1조 7 1 2호의 Jo 및 참고 문헌 1에 설명되어 있습니다. 디스펜싱 주사기의 바늘 끝은 이제 결정화 플레이트의 왼쪽 모서리에 있는 맨 위 웰의 하단 및 중앙과 정렬되어야 합니다. 이것은 우물 식별자 A, 우물 A의 바닥과 정렬되는 하나, 비즈니스의 첫 번째 순서에 해당합니다.

이것은 바늘 끝이 웰 바닥에 얼마나 가까이 오는지 관찰하면서 암을 분배한 후 높이 또는 Z 좌표를 조정하여 수행됩니다. 팁이 웰의 바닥에 닿는 것만으로도 판을 플랫폼에서 좌우로 손으로 움직여 판단할 수 있으며, 투입구의 플레이트와 플레이트가 접촉하는 투입 암의 Z 좌표는 이 기준 Z 위치에서 수 마이크로미터의 바늘 선단으로 발생하도록 프로그래밍되어 있습니다. 베이스 플레이트의 표면에 해당합니다. 다음으로 로봇이 활성화되어 사용자가 바늘 끝을 웰 A 1의 중앙에 배치하도록 지시하는 일련의 단계를 거칩니다.

팁이 중앙에 있는 디스펜싱 암의 기준 XY 좌표는 로봇을 제어하는 컴퓨터에 저장됩니다. 플레이트에 남아 있는 웰의 중심을 정의하는 데 사용됩니다. 컴퓨터에서 이러한 참조 좌표를 설정하면 mease 디스펜싱 암은 시작 위치로 돌아가 주사기를 프라이밍하도록 지시됩니다.

이제 디스펜싱 주사기를 프라이밍해야 합니다. 이는 새로운 메이즈가 디스펜싱 바늘을 채우고 플레이트의 첫 번째 웰이 메이즈의 완전한 보완을 받도록 하기 위해 수행됩니다. 로봇을 활성화하는 프로그램을 실행하는 프라이밍 명령이 있습니다.

이로 인해 주사기의 플런저가 사용자 제어하에 단계적으로 전진합니다. 이 과정에서 바늘 끝이 돌출된 것처럼 보이는지 검사하고 조직으로 메자상을 제거합니다. 이것으로 로봇을 실행하는 프라이밍 프로세스가 완료됩니다.

이제 로봇이 자동 모드로 실행하여 실행을 시작할 준비가 되었습니다. 로봇 XAP 프로그램은 로봇의 암 2에 있는 침전제 디스펜싱 팁을 세척하고 깊은 웰 블록에서 침전제 용액을 흡인할 준비를 하는 세척 단계를 시작하여 로봇의 디스펜스 기능을 활성화하고 단백질이 함유된 웰을 순차적으로 로딩하여 한 번에 처음 8개의 웰을 매진합니다. 배달 사이에 급진적인 해결책이 뒤따릅니다. 미즈 디스펜싱 암은 바늘 끝의 미즈가 마르는 것을 방지하기 위해 바늘 끝을 축축한 스폰지에 넣는 주차 위치로 돌아갑니다.

가장 일반적으로 멤브레인에서 수행되는 결정화 시험에 사용되는 값입니다. 구조와 기능적인 생물학 그룹은 50 나노리터의 미아와 800 나노리터의 침전제 해결책입니다. 이 데모에서 로봇을 실행하는 프로그램은 두 팔이 동시에 움직이도록 설정되었습니다.

이러한 방식으로 96웰 플레이트에 미즈와 침전제를 5분 안에 장전하는 것을 완료할 수 있습니다. 즉시 플레이트가 채워지고 로봇 팔이 주차 위치로 돌아갑니다. 플레이트는 로봇의 데크에서 제거되어 평평하고 단단한 표면에 놓입니다.

커버 유리는 스페이서의 상부 접착 표면과 접촉하여 베이스 플레이트 위에 부드럽게 놓입니다. 96개의 웰이 모두 완전히 덮여 있는지, 커버 유리가 베이스 플레이트와 직각으로 정렬되어 있는지, 커버 유리가 베이스 플레이트의 발자국을 벗어나지 않는지 확인하는 것이 중요합니다. 롤러 또는 브레이어는 커버 유리와 스페이서 사이에 단단하고 균일한 밀봉을 만드는 데 사용됩니다.

이 단계에서 플레이트를 검사하여 설정이 제대로 진행되었는지 확인해야 합니다. 사람이 찾고있는 것은 팬 모양에 계란 후라이입니다. 각 우물에서 계란의 멍에는 메자 단계에 해당합니다.

달걀의 흰자는 침전제 용액이고 팬의 가장자리는 결정화의 둘레입니다. 글쎄요, 이상적으로 세 가지는 동심입니다. 이제 플레이트를 결정 성장을 위해 온도 조절이 가능한 보관 영역에 배치할 준비가 되었습니다.

더 이상 플레이트를 설치할 필요가 없는 경우 침전제 블록을 로봇 데크에서 제거하고 적절하게 밀봉한 다음 다시 보관해야 합니다. 미즈가 들어있는 주사기는 로봇의 분배 암에서 제거되고 분배 바늘 및 흰 동물을 포함한 다양한 부품을 분해됩니다. 메탄올로 조심스럽게 씻고 다음 메소 로봇 2 개의 모기 LCP를 사용하기 위해 건조시킵니다.

다음 비디오 클립은 메조 결정화 시험의 설정에 사용할 수 있는 모기 LCP 로봇을 보여줍니다. 이 기사에서 이전에 설명한 것과 유사한 meph 위상 디스펜싱 시스템을 통합합니다. 그러나 로봇 1의 경우 일회용 팁을 사용하여 침전제를 분사합니다.

악기 자체가 여기에 표시됩니다. 여기에는 결정화판과 침전제 블록이 습도 제어를 위한 창문이 있는 챔버를 설정하는 데크가 포함되어 있습니다. 이 보기에서 습도 챔버의 창은 디스펜싱 팁이 있는 스풀, 미즈 디스펜싱 암, 메프 위상 디스펜싱 바늘의 위치를 설정하기 위한 레이저 기반 센서가 열려 있습니다.

결정화판이 침전제 스크린 블록을 고정하기 위한 움푹 들어간 플랫폼이 있는 돌출된 플랫폼. 이 시퀀스에서 로봇은 기기가 켜져 있을 때 초기화 작업 시퀀스를 거치는 것을 보았습니다. 프로그래밍 소프트웨어는 특정 결정화 플레이트 및 침전제 블록으로 작업하기 위해 기기를 설정하고 지정된 순서로 설정된 부피의 미화제 및 침전물을 분배하는 데 사용됩니다.

이러한 세부 정보는 제조업체에서 제공하며 여기에 표시되지 않습니다. 결정화 플레이트를 설정하기 위해 로봇을 사용하는 것은 다음과 같이 시작되며, 바늘로 완성되고 단백질이 함유된 미즈로 채워진 해밀턴 주사기는 메조 로봇 1 및 1 7 1 2의 Jo에서 위에서 설명한 바와 같이 준비됩니다. 주사기는 로봇의 디스펜싱 암 아래 위치에 고정됩니다.

디스펜싱 주사기에 있는 바늘의 X 및 y 좌표는 데크에 장착된 레이저 센서를 사용하여 설정됩니다. 이는 결정화 플레이트의 각 웰 중앙에서 미즈가 정확하게 디스펜싱되도록 하는 데 필요한 중요한 단계입니다. 제어판의 버튼을 누르면 주사기가 바늘 끝에서 미즈를 배출할 준비가 됩니다.

그런 다음 로봇의 데크에 결정화 플레이트를 장착하기 전에 로봇을 사용하여 웰을 적재하기 위한 준비로 압출된 마이즈를 티슈로 제거합니다. 플랫폼의 표면은 플레이트를 제자리에 고정하기 위해 몇 방울의 물로 적셔집니다. 모세관을 통해 보호 커버가 플레이트에서 제거되고 플레이트가 플랫폼에 단단히 배치되어 우수한 접착력을 보장합니다.

디스펜싱 니들 팁에 대한 플레이트의 적절한 위치를 보장하기 위해 3개의 모서리 웰이 곧 중앙에 배치되는 플랫폼에는 3개의 기준점이 있으며, 기기는 이제 설정 주기에 들어갈 준비가 되었습니다. 이것은 플레이트에 새로운 메이즈를 넣기 직전에 Mease를 작은 유리판에 분배하는 두 번째 프라이밍 단계로 시작됩니다. 이 시퀀스에서 우리는 로봇이 먼저 플레이트에 8개의 웰로 구성된 수직 기둥인 mease를 적재한 다음 일회용 팁을 사용하여 mease bolus 위에 침전제 용액을 분배하는 것을 봅니다.

이 과정은 모든 웰이 채워질 때까지 플레이트의 길이를 따라 11회 반복됩니다. 전체 프로세스를 완료하는 데 약 5분이 걸립니다. 이 특정 비디오에서는 50나노리터의 Mease와 800나노리터의 침전제 용액을 각 웰에 주입했습니다.

채워진 플레이트는 벤치에 놓인 로봇의 플랫폼에서 제거됩니다. 커버 유리가 적용되고 플레이트는 미소 로봇 1에서 위에서 설명한 대로 브래지어로 밀봉됩니다. 적절하게 라벨링된 플레이트는 이제 Meso 로봇 3인 Griffin LCP의 결정 성장을 위해 온도 제어 환경에 배치할 수 있습니다.

이 마지막 비디오 클립은 메조 결정화 시험에서 사용 중인 Griffin LCP 로봇을 보여줍니다. Griffin은 로봇 1에 대해 위에서 설명한 것과 유사한 메프 위상 디스펜싱 시스템을 통합합니다. 그러나 이 경우 96개의 침전제 용액이 모두 동시에 분주됩니다.

악기 자체가 여기에 표시됩니다. 여기에는 결정화 플레이트와 침전제 블록이 있는 데크, 미즈 디스펜싱 암 및 Phoenix 96 팁 헤드가 포함됩니다. 침전제 용액 디스펜싱의 경우, 작동 중인 로봇이 이 최종 비디오 시퀀스에 표시됩니다.

96 팁 헤드에는 먼저 침전제 용액이 적재됩니다. 점성 침전물 흡입을 용이하게 하기 위해 사용자 정의 지연이 제공됩니다. MEA 단계는 완료하는 데 약 1분이 소요되는 공정에서 96개의 웰에 순차적으로 분배됩니다.

마지막으로, 96개의 팁 헤드는 결정화 웰의 MEA 상 볼러스 위에 96개의 침전제 용액을 모두 동시에 분배합니다. 전체 플레이트 로딩 공정은 2분 안에 완료됩니다. 채워진 플레이트는 로봇의 데크에서 제거되고 플레이트는 커버 유리로 밀봉되고 결정 성장을 위해 제어된 온도 조건에서 보관됩니다.

고분자 결정학에 의한 구조화된 결정의 전체 공정에서 다음 단계는 결정을 수확 및 극저온 냉각하고 이로부터 X선 회절을 기록 및 처리하는 것입니다. 이러한 주제는 이 시리즈의 별도 작업 문서에서 다룹니다.I.