Name: 방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 배우세요 단백질 키나아제 활성 측정 방법을 방사성 표지된 ATP를 사용하여 정량적으로 분석하는 기술입니다. 이 실험은 세포 신호 전달 연구에 필수적인 도구로 활용됩니다.

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저자는 귀중한 업무 및 토론을 위해 Cobb 연구소의 모든 현재 및 전 회원들과 관리 지원을 담당 한 Dionne Ware에게 감사드립니다. 이러한 연구는 국립 보건원 R37 DK34128 및 웰치 재단 그랜트 I1243에 의해 MHC

1. 키나아제 정제 자원 및 일반 면역 침전 파이프 라인 참고 :이 분석과 함께 사용하기위한 키나제는 교양 세포의 immunoprecipitates 또는 친화력 태그 정제 6 와 같은 재조합 수단에 의해 공급 수 있습니다. 다음은 관심 키나아제에 따라 변형 될 수있는 flag-tagged immunoprecipitation에 대한 일반적인 프로토콜입니다. 가능한 모든 것은 얼음에 보관해야합니다. <ol><li> 락 할 동안 세포 용 해물 200 μL에 1 mg / mL 항체 2 μL (일반적으로 ~ 1 mg / mL 총 단백질 농도)를 첨가하고 4 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오. </li><li> 단백질 A 세파 로즈 비즈를 4 ℃에서 짧게 회전하여 5000 xg ( &quot;터치 스핀&quot;)에서 1 분간 1 분간 방치하여 용해 완충액 (아래 참조)으로 2 ~ 3 회 세척하고 피펫으로 상등액을 제거하고 완충액에 비즈를 resuspending . <ol><li> 용해 버퍼 준비 : 50 MM HEPES 산도 7.7, 150 MM NaCl, 1.5 MM MgCl 2, 1 mM EGTA, 10 % 글리세롤, 0.2 mM 나트륨 오르토 바나 데이트, 100 mM 플루오르 화 나트륨, 50 mM β- 글리세로 포스페이트, 0.1 % 트리톤 X 100 또는 0.1 % NP-40. </li></ol></li><li> lysates에 용해 버퍼에 단백질 A sepharose 구슬의 50 % 슬러리 30 μL를 추가합니다; 4 ℃에서 1 시간 동안 배양하면서 흔들어 준다. </li><li> 4 ° C에서 스핀을 터치하여 비드를 펠렛 화하고 상층 액을 제거합니다. </li><li> 비드 세척 완충액 (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7.4) 1 mL로 3 번 씻는다. </li><li> 1X 키나제 반응 완충액 (10mM HEPES pH 8.0, 10mM MgCl 2 )으로 1 회 씻는다. 구슬을 제거하지 않고 가능한 많은 버퍼를 제거하십시오. </li></ol> 2. 키니 아제 반응의 초기화 참고 : IP 키나제 검사의 경우, 일시 중지되지 않은 비드 ~ 15 μL가 일반적인 시작 시료입니다. 재조합 단백질 키나아제 분석의 경우, 일반적인 시작 량은 최종 반응 부피 25-50 μL에 대해 1-10에서 0.1-1.0 μg 범위입니다. 재조합 단백질 시료의 부피 조절s는 분석을 초기화하기 전에 저장되는 버퍼와 동일해야합니다. 대량의 키나아제를 사용하는 경우 분석 기간 동안 단백질 안정성을 유지하는 데 도움이되는 BSA와 같은 담체 단백질을 포함하십시오. <ol><li> 아래에 주어진 5x 키나아제 반응 버퍼를 준비하십시오 : 50 mM HEPES pH 8.0 50 mM MgCl2 50 mM 벤 자미 딘 (프로테아제 억제제) 50 mM DTT (환원제) 250 μM ATP (레이블이 지정되지 않았거나 &quot;저온&quot;) </li><li> 키나아제 샘플을 1.5 mL 튜브에 얼음에 보관하십시오. 별도의 냉각 된 1.5 mL 튜브에서 다음 반응 혼합물을 조제하십시오 : H 2 O 21 μL 6 μL 5x 키나아제 반응 완충액 1 μL 방사성 표지 ( &quot;핫&quot;) ATP 2 μL 기질 (~ 5 mg / mL) 참고 : 재조합 키나아제 분석의 경우, 정제 된 단백질을 수용하기 위해 부피를 조절할 수 있습니다. 최종 반응 부피가 30 μL가되도록 계산한다. 이 조리법을 사용하여 마스터 준비혼합. 표지 된 ATP를 받으면 반응 혼합물에 첨가하기 전에 0.01 Mci / μL의 비 활동으로 H2O의 원료를 희석한다. </li><li> 분석을 초기화하려면 전체 반응 혼합물을 키나제 샘플에 첨가하고 분석 할 키나아제 활성에 따라 30 분에서 1 분간 5 분간 반응을 일으킨다. 참고 : 이전에 활성을 측정하지 않은 키나아제로 작업 할 때는 시간 간격 사이에 5 분 간격으로 키나아제 활동의 시간 경과를 수행하십시오. </li></ol> 3. 반응 종결 및 SDS-PAGE <ol><li> 얼음에 넣고 7.5 μL 5x Laemmli 샘플 버퍼 6 을 추가하여 반응을 중지하십시오. </li><li> 가열 블록에서 100 ° C에서 30 초에서 2 분간 가열하십시오. </li><li> 10-15 % SDS-PAGE 젤에서 스핀을 터치하고 웰 당 20 μL을로드하십시오. 겔을 키나아제와 기질을 분리 할 수있을만큼 충분히 길게하십시오 (일반적으로 5W의 일정한 출력에서 ​​1 시간). 겔 장치를 보호하여 32 노출을 제한하십시오 </sup&gt; P. <ol><li> 여기에는 수제 젤 장치를 사용하지만 표준 상업적으로 판매되는 미니 젤은 완벽하게 적합합니다. 다음과 같이 치수를 사용하십시오. 젤 : 폭 8 cm, 길이 5.5 cm (해상), 1.5 mm 두께. 콤브 : 15 개의 우물, 1.5mm 두께, 2.9mm 폭, 16mm 깊이 </li></ol></li></ol> 4. 젤 염색 및 건조 주의 : 모든 단계에서 방사성 차폐를 사용하고 개인 보호 장비를 착용하여 개인 피폭을 32 P로 줄이십시오. 특정 단계에 대한 자세한 내용은 유용한 참고 자료가 포함되어 있습니다. <ol><li> 유리 / 알루미나 판에서 겔을 제거하고 50 rpm으로 설정 한 궤도 진탕 기에서 1 시간 동안 50 mL의 쿠마시 스테인 (10 % 빙초산, 50 % 메탄올, 0.25 % R-250 염료)에 넣습니다. 이 단계에서는 젤 자체보다 약간 큰 용기를 사용하십시오. 8 </li><li> 젤을 얼룩에서 고정 용액 (10 % 빙초산d, 20 % 메탄올)를 사용하여 탈색시켰다. 50 rpm의 궤도 진탕 기에서 밤새 고형 용액 600-700 mL로 겔을 잠급니다. 쿠마시 염료 8 , 9 를 흡수하기 위해 젤이 들어있는 용기에 거품 조각 또는 매듭 된 실험용 물티슈를 놓습니다. </li><li> 정착액에서 겔을 제거하고 젤이 유백색으로 변할 때까지 약하게 흔들어 주면서 1-2 분 동안 메탄올 200 mL에 담급니다. 이렇게하면 건조 단계에서 균열을 방지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 14 cm x 14 cm 크기의 정성 여과지를 메탄올로 적셔 슬라브 젤 진공 건조기 위에 놓습니다. 젤을 필터 종이 앞면이 위로 향하게 놓으십시오. </li><li> 주름과 기포를 방지하기 위해 조심스럽게 플라스틱 랩으로 젤을 덮으십시오. 건조기를 80 ° C에서 1.5 시간 동안 작동시킨다. 진공이 이루어지면 뚜껑을 열고 필요하면 부드러운 고무 판을 사용하여 공기 방울을 굴립니다. </li></ol> 5. Autoradiogram 및 섬광 계수 <ol><li> dri 제거인 겔을 부착하고 자동 끈 마커, 인광 성 눈금자 또는 도트를 겔의 측면에있는 여과지에 붙이십시오. 도트를 사용하는 경우 점들이 비대칭 패턴으로되어 있는지 확인하십시오. 이것은 노광 및 현상 후 겔을 필름과 정렬시킵니다. </li><li> Geiger 카운터를 사용하여 신호의 강도를 확인하십시오. 강화 된 화면에서 약 -70 ° C ~ -80 ° C의 약한 신호 노출의 경우 필름 밴드 밀도가 증가합니다. </li><li> 어두운 방에서 젤, 필름, 강화 스크린을 위에서 아래로 순서대로 필름과 강화 스크린이있는 필름 카세트에 말린 젤을 넣습니다. </li><li> 카세트의 뚜껑에 강화 스크린을 부착하고이 단계를보다 쉽게하기 위해 젤을 테이프로 붙이십시오. 강화 스크린은 32P에서 베타 입자에 의해 조사 될 때 빛을 방출합니다. 이러한 빛 방출은 베타 입자보다 더 효율적으로 필름을 관통합니다. <ol><li> 강화 화면에서 방출되는 파장이필름이 가장 민감한 파장의 연못. </li><li> 가이거 계수기를 사용하여 노출 시간을 결정하십시오 : cpm 수가 ~ 100 이하이면 -70 ° C에서 하룻밤 시험하십시오. 카운트가 ~ 10,000이면 1 시간 노출로 시작하여 거기에서 최적화하십시오. </li></ol></li><li> 노출이 끝나면 필름을 제거하고 의료 / X- 레이 필름 프로세서로 현상합니다. 노출을 -70 ~ -80 ° C에서 수행하는 경우 카세트를 실온으로 따뜻하게하여 응축이 발생하기 직전에 필름의 결로를 최소화하거나 필름을 제거하십시오. </li><li> 건조 된 젤 / 여과지 위에 필름을 놓고 마커 / 도트의 이미지를 마른 젤의 마커 / 점에 맞 춥니 다. 필름 표준에 해당하는 밴드를 표시하십시오. 단백질 기준에 라벨을 붙이고 나중에 참조 할 수 있도록 반응이 어떤 차선인지 표시하십시오. </li><li> 필름에서 관심있는 밴드에 해당하는 젤에서 밴드를 잘라내어 놓습니다.7 mL 신틸레이션 바이알에 넣었다. 신틸레이션 액 4 mL를 넣고 액체 섬광 계수기로 계산하십시오. 32P에 대한 올바른 에너지 스펙트럼 창을 모니터링하도록 카운터가 설정되어 있는지 확인하십시오. 참고 : 노 키네아제 대조 레인에서 기질에 해당하는 밴드도 반드시 제거해야합니다. 이 값은 모든 샘플 신틸레이션 카운트에서 뺄 배경 방사선을 계산하는 데 사용됩니다. </li></ol> 6. 결과 분석 참고 : 오토 라디오 그램은 결과를 질적으로 시각화합니다. 정확한 정량을 위해 32 P의 결합은 섬광 계수기로 측정 할 수 있습니다. 데이터는 일반적으로 그림 1B 와 같이 상대 활동으로 표시됩니다. 모든 샘플에 대해 균일 한 조건이 유지되는 한, 비 활동을 상대적으로 측정하면 치료를 비교할 수 있습니다. <ol><li> 절대 특정 활동 값을 계산할 때는 엄격함을 수행하십시오.시간 경과에 따른 선형 활성 범위 ( 예 : 2 x [kinase] = 2 x specific activity)를 보장하기 위해 키나제, 기질 및 콜드 ATP 농도를 포함한 모든 반응 조건의 최적화. 높은 비 활동성 키나아제의 경우 키나아제 활성이 기질의 양에 의해 제한되는 경우 증가 된 기질 농도로 분석을 수행하십시오. </li><li> kinase 1mg / min 당 인산염 나노 몰 단위의 특정 키나아제 활성을 계산하시오. <ol><li> 계산 된 대역의 cpm에서 공백을 뺍니다. </li><li> 뜨거운 ATP의 붕괴를 계산합니다 : [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0.95 여기서 t 는 기준 날짜 이후의 일 수입니다 (공급 업체가 제공해야 함), t 1/2 는 32 P의 반감기는 14.3 일이며, 0.95는 섬광 계수기의 효율을 반영합니다. 예 : 28 일 된 고온 ATP를 사용하는 경우, 감소 값은 0.245 여야합니다. </li><li> Calc(일반적으로 이것은 반응에서 감기 ATP의 양과 동일하다) : 분석 용적 (μL) × [냉 ATP] (μM) = 전체 ATP (pmols). 예 : 30 μL x 50 μM = 1500 pmol </li><li> cpm / pmol ATP를 계산하시오 : [cold ATP x (2.2 x 107) x decay factor] / cold ATP의 pmol. 참고 : 2.2 x 10 7 값은 0.01 mCi / μL의 ATP를 cpm으로 변환합니다. </li><li> 분석에서 키나아제의 양을 mg 단위로 계산하십시오. 재조합 키나아제 및 면역 침전 된 키나아제 모두, BCA 분석법과 같은 표준 방법이 출발 농도를 결정하는 데 적합하다. 예 : 50μL 키나아제 반응에서 wtERK2 0.0002 μg / μL은 0.01 μg 또는 1 x 10-5 mg입니다. </li><li> 분석에서 총 cpm을 계산하십시오. 30 μL 반응을 조립하고 젤의 각 반응에서 20 μL를 실행하십시오. 계산 된 cpm (공백 빼기 후)에 총 분석 용적 / 적재량 계수를 곱하십시오. 위의 계속하기예를 들어 모든 계수에 1.5를 곱하거나 30/20을 곱합니다. </li><li> 분석 된 키나아제의 특정 활성을 계산하십시오 : 분석에서 총 cpm) / (cpm / pmol ATP) / (분석 시간 (분)) / (키나아제의 양) 참고 : 위의 값을 1,000으로 나눈 값은 나노 몰 / 분 / mg </li></ol></li><li> 기질에 얼마나 많은 인산이 포함되어 있는지 계산합니다 (분자량이 알려진 한). 이것은 일단 반응이 완료되면 특정 단백질의 포스 포 사이트 수를 결정하는 데 사용됩니다. 분석에서 총 cpm) / (cpm / pmol ATP)] / (pmole에서 기질의 양) </li></ol>

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키나아제는 다양한 환경에서 광범위한 기능을 발휘하는 다양한 단백질 군으로 키나아제 분석법은 여러 가지 신호 전달 단백질을 연구하는데 매우 유용하며 세포 통신에 대한 현재의 이해에 크게 기여했습니다. 특히, 구조 및 활성의 주요한 차이에도 불구하고 2 개의 상이한 키나아제를 특성화하는데 동일한 기본 분석이 사용되었다. WNK1 키나아제는 중요한 리신이 독특한 위치로 이동 한 비정형 촉매 포켓을 포함하고 키나아제와 스캐 폴딩 기능을 통해 양이온 - 염화물 공동 수송기의 조절에서 역할을하는 것으로 알려져있다. WNK1의 키나제 활성은 단백질 키나아제 산화 스트레스 반응성 1 (OSR1) 및 SPS / STE20- 관련 프롤린 알라닌 - 리치 키나아제 (SPAK)에서도 가장 특징적인 기질 에서조차도 낮은 전환율을 갖는 것으로 알려져있다. 대조적으로, 밀접하게 관련된 키나아제 ERK1과 함께 ERK2는 활성화되었을 때 강력한 키나아제 활성을 나타낸다 <em&gt;을 가지고 있고 세포 13 <s...

단백질 키나아제는 세포 신호를 적절한 반응으로 전달하는 데 중요한 정교한 효소입니다 1 . 항상성 유지와 질병 상태의 예방 또는 증진에있어 역할을 감안할 때, 키나아제 활성을 평가하는 생화학 적 방법은 진핵 세포 신호 전달의 세부 사항을 묘사하기위한 강력한 도구가되고있다. 포스 포 - 특이 적 항체를 이용하는 전략이 세포 신호 상태 4 에 대한 상이한 처리 조건의 영향을 측정하는 관점에서 매우 유익 하였지만, 키나아제 분석은 상이한 처리 조건의 영향을 직접적으로 다른 키나아제의 효소 활성의 관점에서 측정 할 수있게한다 관심. 방사성 물질을 사용하지 않는 유사한 분석법에 대한 몇 가지 옵션이 있지만, 우리는 결과의 견고한 정량화를 위해이 방법을 계속 사용합니다. 그곳에면역 침전 된 (IP) 키나아제 분석 ( 그림 1 )과 재조합 단백질 키나아제 ( 그림 2 )의 두 가지 일반적인 용도로 사용됩니다. IP 키니 아제 분석은 특정 단백질 키나아제를 활성화 할 수있는 요인을 확인하고 측정 억제 조건을 측정하는 데 매우 유용합니다. 간단히 말하면, 관심있는 에피토프 - 표지 된 키나아제를 배양 된 진핵 세포에 형질 감염시키고, 다양한 처리를 실시하고, 면역 침강시키고, 방사성 표지 된 인산염을 모델 기질 ( 예를 들어, 미엘린 염기성 단백질 (MBP))에 혼입시키는 능력에 대해 분석한다. IP 키나아제 분석은 또한 내인성 단백질의 면역 침전 또는 임의의 수의 게놈 편집 기술에 의한 과발현에 의하지 않고 수행 될 수있다. 처리가 배양 물에서 수행되기 때문에,이 방법은 다수의 상류 인자를 통해 전달 된 자극을 검출 할 수있다또는 평행 경로 에 대한 정보를 제공합니다. 이 방법의 한 가지 주요 이점은 직접 상류 ​​또는 하류의 인자 또는 인산화 부위에 대한 사전 지식이 필요 없다는 것이다. 또한 관심 키나아제에 대한 특정 기질이 확인되면 동일한 키나아제 분석 프로토콜을 재조합 성분과 함께 사용하여 천연 기질에 대한 특정 활성을 측정하고 질량 분석기와 결합 할 때 특정 인산화 부위를 식별 할 수 있습니다. 이러한 방식으로 동정 된 부위는 기질 돌연변이 체를 이용하는 키나아제 검정으로 더 검증 될 수있다. 마지막으로,이 방법은 또한자가 인산화를 검출하고 측정하는데 사용될 수있다. 여기서 제공된 프로토콜은 배양 된 세포에서 관심있는 친 화성 태그 키나아제를 발현하기위한 최적화 된 단백질 정제 방법 또는 형질 감염 방법을 가정한다. 형질 감염, 용해, 면역 침전 및 단백질 정제에 대한보다 자세한 설명은ocols, 우리는 콜드 스프링 하버 프로토콜 6 을 추천하는 것이 좋습니다. 분석법 개발 및 변형에 관한 더 자세한 정보는 단백질 인산화 : 효소학의 선정 된 방법 7 을 참조하십시오.

<table><tbody><tr><td>Protein A Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0963-03</td><td></td></tr><tr><td>방사선 표지 [&gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C010MC</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>방사성 차폐</td><td>Research Products International</td><td>BR-006</td><td></td></tr><tr><td>R-250 염료(Coomassie)</td><td>Thermo Fisher</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 등급 3 품질 필터 종이</td><td>Whatman</td><td>1003-917</td><td></td></tr><tr><td>슬랩 젤 진공 건조기</td><td>Bio-Rad</td><td>모델 583 젤 건조기 #1651745&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Autorad 마커</td><td>Agilent Technologies</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>인광 눈금자</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8133</td><td></td></tr><tr><td>인광 도트</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5149</td><td></td></tr><tr><td>가이거 카운터</td><td>Ludlum</td><td>Model 3 with 44-9 detector</td><td></td></tr><tr><td>BioMax Cassette 8 x 10"</td><td>Carestream Health</td><td>107 2263</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS 필름 8" x 10"</td><td>Carestream Health</td><td>829 4985</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS 강화 스크린 8" x 10"</td><td>Carestream Health</td><td>851 8706</td><td></td></tr><tr><td>의료/X-선 필름 프로세서</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>신틸레이션 바이알</td><td>Research Products International</td><td>125500</td><td></td></tr><tr><td>신틸레이션 플루이</td><td>드 MP Biomedicals</td><td>188245305</td><td></td></tr><tr><td>벡크 맨 LS 6500 섬광 카운터</td><td>벡크 만</td><td>LS 6500</td><td></td></tr></tbody></table>

방사성 표지 된 atp로 단백질 키나아제 활성 측정

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

단백질 키나아제는 복잡한 자극 배열에 반응하여 대규모 세포 변화를 조절할 수 있으며, 조절에 대한 알로 스테 릭 세부 사항을 밝히기 위해 많은 노력이 기울여왔다. 키나아제는 결함이 종종 여러 형태의 암 및 관련 질병의 특징 인 신호 전달 네트워크를 포함하여 상향 조절 인자의 조작 및 개선 된 치료법을 찾는 데 필수적인 반응 요구 사항의 확인에 적합한 분석 플랫폼을 만든다. 여기서 우리는 생화학 및 약리학 적 약제의 영향, 돌연변이 및 결실과 같은 유전 조작, 세포 배양 조건 및 프로브에 대한 처리를 시험하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 특정 실험 문제에 쉽게 적응할 수있는 기본적인 키나아제 분석을 기술한다 세포 신호 메커니즘. 이 분석법은 방사성 표지 된 [γ- 32 P] ATP를 사용하여 정량적 비교와 결과의 명확한 가시화가 가능하며 mod광범위한 반응 조건에 걸쳐 면역 침전 또는 재조합 키나아제, 특이 적 또는 전형적 기질과 함께 사용하기에 적합하다.

WNK1 IP 키나제 검정 Myc- 표지 된 WNK1을 HEK293 세포로 형질 감염시키고 항 -IcC 항체 11로 면역 침전시켰다. 면역 침전물은 모델 기질 MBP뿐만 아니라 그 자체로 키나아제 활성을 나타내었다 ( 도 1A ). WNK1 돌연변이 체는 MBP에 대한 키나아제 활성을 동일한 방법으로 시험하였고, 이번에는 GST- 태깅 된 구조물을 사용 하였다 ( 도 1B ). 야생형과 관련된 돌연변이 키나아제의 분석은 최적의 WNK1 활동에 중요한 잔기를 나타냈다. HEK293 세포는 약리학 적 및 생화학 적 처리에 노출되었다. WNK1 N- 말단 펩타...

단백질 키나아제는 고도의 진화 된 신호 효소 및 세포 내 및 세포 내 신호 전달에 중요한 발판이다. 우리는 세포 표지 조절의 해명에 도움이되는 신뢰할 수있는 방법 인 방사성 표지 된 아데노신 3 인산염 ([γ- 32 P] ATP)의 사용을 통해 키나아제 활성을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다.

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

이 분석법의 전반적인 목표는 단백질 인산화효소(protein kinase)의 효소 활성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 인산화효소 또는 인산화효소 돌연변이체의 활성 정도, 특이성, 그리고 활성이 다양한 세포 처리 조건에 민감하게 반응하는지 등 인산화효소 신호 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다용도이며 정량적이라는 점입니다.본 절차의 시연은 이 분석법에 풍부한 경험을 가진 Cobb Laboratory의 연구원인 Steve Stippec가 진행하겠습니다. 우선, 1 mg/mL 농도의 항체 2 µL를 200 µL의 세포 용해물(cell lysates)에 첨가하고, 4 °C에서 1시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 단백질 A-Sepharose 비드에 용해 버퍼(lysis buffer)를 추가하여 2~3회 세척한 다음, 4 °C에서 5000 ×g로 30초에서 1분 동안 원심분리합니다. 그 후 피펫으로 상층액을 제거하고 비드를 버퍼에 재현탁합니다.다음으로, 50% protein A-Sepharose bead 슬러리와 용해 완충액을 혼합하여 30 µL를 용해물에 첨가합니다. 용해물을 4 °C에서 1시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 4 °C에서 짧게 원심분리(touch spin)하여 비드를 침전시킨 후 상층액을 제거합니다.비드 세척 완충액 1 mL로 비드를 세 번 세척하고 짧게 원심분리한 다음, 1X 키나아제 반응 완충액으로 비드를 한 번 더 세척하십시오. 짧게 원심분리한 후, 비드가 제거되지 않도록 주의하며 가능한 한 많은 양의 완충액을 제거하십시오. 분석을 시작하려면 반응 혼합물 전체를 키나아제 샘플에 첨가하십시오.분석하려는 kinase의 활성에 따라 반응물을 30 °C에서 5분에서 1시간 동안 배양합니다. 반응물을 얼음에 두고 5X Laemmli 샘플 버퍼 7.5 µL를 첨가하여 반응을 중단시킨 다음, 히트 블록을 사용하여 100 °C에서 3분에서 5분 동안 가열합니다. 샘플을 가볍게 원심 분리한 후, 10~15% SDS-PAGE 겔의 웰당 20 µL씩 로딩합니다.phosphorus-32는 고에너지 베타 방출체이므로, 노출을 제한하기 위해 겔 장치를 차폐 상태로 유지하십시오. kinase와 substrate가 분리될 때까지 충분한 시간 동안 겔을 전기영동하십시오. 전기영동 후, 유리 및 알루미늄 플레이트에서 겔을 분리한 다음, 50 RPM으로 설정된 오비탈 셰이커 위에서 50 milliliters의 Coomassie 염색액에 1시간 동안 담가 두십시오.이 단계에서는 겔 자체보다 약간 더 큰 용기를 사용하십시오. 겔의 염색약을 제거하려면 겔을 염색액에서 고정액으로 옮깁니다. Coomassie 염료를 흡수할 수 있도록 겔이 담긴 용기에 폼 조각이나 매듭을 지은 실험용 와이프를 넣으십시오.궤도 쉐이커(orbital shaker)를 사용하여 50 RPM으로 600~700 mL의 고정액에서 겔을 하룻밤 동안 흔들어 줍니다. 다음 날, 고정액에서 겔을 꺼내어 200 mL의 methanol에 넣고 겔이 우윳빛 흰색으로 변할 때까지 1~2분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 이 과정은 건조 단계에서 겔이 갈라지는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.다음으로, 약 14 centimeter x 14 centimeter 크기의 정성 여과지를 메탄올로 적신 후 슬래브 겔 진공 건조기 위에 놓습니다. 겔의 앞면이 위를 향하도록 여과지 위에 올립니다. 겔을 랩으로 조심스럽게 덮은 다음, 건조기를 켜고 진공을 가합니다.단 몇 초 만에 진공 상태가 되면, 부드러운 고무 브레이어로 공기 방울을 밀어내어 제거합니다. 90분 동안 가동을 계속합니다. 건조된 젤을 꺼내고, 인광 자나 같이 phosphorescent ruler 또는 점 형태의 autorad 마커를 젤 측면의 여과지에 부착한 후, 증폭 스크린이 들어 있는 카세트에 넣습니다.가이거 계수기를 사용하여 신호의 강도를 확인하십시오. 신호가 약한 경우, 증감 스크린과 함께 -70 °C에서 -80 °C로 노출시키면 필름 밴드 밀도가 증가합니다. 암실에서 증감 스크린이 포함된 필름 카세트 내부의 건조된 겔 위에 필름 한 조각을 놓으십시오.CPM 수치가 100 이하인 경우, -70°C에서 -80°C 사이에서 하룻밤 동안 노출해 보십시오. 반대로 수치가 10,000에 가까운 경우에는 1시간 노출부터 시작하여 최적화하십시오. 노출이 끝나면 필름을 꺼내 의료용 또는 X-ray 필름 현상기에서 현상하십시오.필름에서 단백질 표준물질에 해당하는 밴드를 표시하십시오. 또한, 나중에 참조할 수 있도록 단백질 표준물질과 반응 레인을 라벨링하십시오. 필름의 관심 밴드에 해당하는 밴드를 겔에서 절제하십시오.밴드를 7 mL 신틸레이션 바이알에 넣고 4 mL의 신틸레이션 용액을 추가합니다. 액체 신틸레이션 카운터로 밴드를 측정합니다. 카운터가 phosphorus-32에 맞는 에너지 스펙트럼 윈도우를 모니터링하도록 설정되었는지 확인하십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 결과를 분석하십시오. 정제된 ERK2 분획을 MEK1R4F(ERK2 키나아제 활성의 상시 활성 자극제)의 존재 또는 부재 하에 MBP를 이용한 키나아제 분석(kinase assay)에 사용하였습니다. 유사한 실험에서, 박테리아 배양액으로부터 정제된 재조합 ERK2 돌연변이체의 활성을 야생형 단백질과 비교하여 측정하기 위해 MBP 키나아제 분석을 사용하였습니다.ERK2는 MEK1R4F에 의해 자극되었을 때 MBP를 인산화할 수 있었으나, 촉매 라이신 또는 이중 인산화의 표준 부위와 인접한 트레오닌 중 하나가 돌연변이되면 ERK2 키나아제 활성이 급격히 폐쇄됩니다. ERK2 T188D 및 ERK2 T188E는 작은 유연한 펩타이드에 대해 미미한 키나아제 활성을 보입니다. 그러나 이들은 야생형 ERK2에서 관찰되는 것과 달리, 알려진 ERK2 기질인 Nup153 및 PDX1을 강력하게 인산화하지 못합니다.이 기술을 완전히 익히면, 적절하게 수행할 경우 1~2일 만에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 방사성 표지 ATP를 사용하여 단백질 인산화효소의 활성을 측정함으로써, 해당 효소들이 속한 신호 전달 네트워크를 더 잘 이해하는 방법에 대해 충분히 파악하게 될 것입니다. 이 실험 과정을 시도할 때, 동일한 단백질 양을 확보하기 위해 관심 있는 인산화효소를 침전시키는 아미노 침전 프로토콜을 최적화하고, 인산화효소 활성의 정확한 비교를 위해 재조합 단백질의 농도를 측정하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.이 기술은 개발 이후 세포 신호 전달 분야의 연구자들이 특정 신호 전달 경로와 그것이 항상성 조절에서 하는 역할, 그리고 질병 진행에 기여하는 바를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 방사성 물질을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 개인 보호 장구 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

류신 리치 반복 키나제 2 큰 multidomain의 키나제이며, 돌연변이가있는 파킨슨병의 가​​장 흔한 유전적 원인이됩니다. 이 단백질 키나제의 활동 분석은이 단백질의 생물학과 장애를 이해하는 중요한 도구로 입증되었습니다. 본...

LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서</em

호흡과 산화 인산화와와 세포 생존에 관련된 mitochondrial 기능에 단백질 키나제 C (PKC) isozymes의 활성화 효과가 설명되어 있습니다. 접근 방식은 선택적으로 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 결정하는 주요 세포 배양 및 assays의 다양한 PKC isozymes을 overexpress하는 adenoviral 기술을 적응.

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

이 비디오는 방사성 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 피로포스포키나제 활성을 결정하기 위한 박층 크로마토그래피 기반 효소 분석을 보여줍니다. 이 방법은 뉴클레오티드 합성 및 인산 전달 반응에 대한 통찰력을 제공합니다.

박층 크로마토그래피 기반 효소 활성 분석: 박층 크로마토그래피를 사용하여 체외 피로포스포키나제 활성을 측정하는 기술

류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2는) GTPase의 키나제 도메인을 모두 인코딩 세포에서 인산화되는 멀티 도메인 단백질입니다. 여기, 우리는 따라서 전반적인 휴대 phophorylation 수준을 측정 할 수있는 수단을 제공, 32 P 오르토와 세포 LRRK1 및 LRRK2 레이블을하는 프로토콜을 제시한다.

류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

여기에서는 ATP 의존성 염색질 리모델링 효소의 능력을 특성화하는 데 사용할 수 있는 생화학적 분석법을 설명합니다. 1) ATP 의존성 뉴클레오솜 슬라이딩을 촉매하고, 2) 뉴클레오솜 기질과 결합하고, 3) 뉴클레오솜 또는 DNA 의존성 방식으로 ATP를 가수분해합니다.

ATP에 의존 염색질 리모델링 효소의 활동을 분석하는 생화학 분석 실험

체외 ATPase 활성을 정량화하기 위한 기본 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 주어진 정제된 ATPase에 대한 활성 수준 및 요구 사항에 따라 최적화할 수 있습니다.

자질<em&gt; 체외</em효소 특성에 대한&gt; ATP 아제 활동

우리는 정제된 박테리아 히스티딘 키나아제의 자가인산화를 정량화하는 데 사용할 수 있는 최적화된 니트로셀룰로오스 결합 분석을 보고하고 시연합니다. 우리의 방법은 전통적인 SDS-PAGE 기반 기술에 비해 몇 가지 장점이 있어 이러한 중요한 단백질을 특성화하기 위한 귀중한 대안을 제공합니다.

니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

펩타이드 경쟁 분석은 다양한 분자 및 면역 학적 실험에 널리 사용됩니다. 이 논문은 in vitro 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석 및 특정 인산화 부위를 찾는 데 유용한 관련 검증 절차에 대한 상세한 방법을 기술한다.

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

우리는 강력한 생화확적인 접근을 사용하여 새로운 키나아제 단백질을 특징으로 했습니다: 다른 세포주 및 조직에 있는 전용적인 항체를 가진 서쪽 얼룩 분석, coimmunocipation 실험에 의하여 상호 작용, 서쪽에 의해 검출된 키나아제 활동 인광 특이적 항체를 사용하여 블롯[32 P] ATP 라벨링에 의해.

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

이 프로토콜은 작은 DNA와 RNA 기판에 폴리 뉴클레오티드 키나아제 (PNKs)의 키나아제 활성을 측정하는 비 방사성 분석기를 설명합니다.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

배우세요 단백질 키나아제 활성 측정 방법을 방사성 표지된 ATP를 사용하여 정량적으로 분석하는 기술입니다. 이 실험은 세포 신호 전달 연구에 필수적인 도구로 활용됩니다.

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

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