시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 비디오 타임 랩스 현미경을 사용하여 실시간으로 세포의 이동을 정량적으로 측정하는 것입니다. 이는 먼저 6웰 배양 플레이트에 콜라겐을 코팅한 다음 관심 세포를 코팅된 플레이트에 드물게 파종함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 피펫 팁을 사용하여 플레이트에 상처를 만들어 마이그레이션을 위한 충분한 공간을 확보합니다.

다음으로, 현미경을 설정하고 온도 제어 시스템을 사용하여 일정한 간격으로 이미지를 캡처하여 이동하는 세포를 실시간으로 지속적으로 모니터링할 수 있습니다. 궁극적으로 입자 추적 프로토콜은 테스트 및 제어 셀의 평균 속도와 총 변위의 차이를 평가하는 데 사용됩니다. 회피형 챔버 이동 분석법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 종말점 정량적 이동 측정을 기반으로 하지 않는다는 것입니다.

대신 다양한 매개변수를 지속적으로 모니터링하고 계산할 수 있습니다. 이 방법은 특정 유전자 또는 약물이 종양 세포 이동에 어떤 영향을 미치는지와 같은 암 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 절차 2 일 전에 6 개의 좋은 배양 판의 각 우물에 opti 매체에서 묽게 된 교원질의 1.5 밀리리터를 추가하고, 그 후에 절차 1 일 전에 4 섭씨 온도에 밤새 판을 배양하십시오.

웰당 2밀리리터의 DMEM과 FBS에 관심 세포를 재현탁시키고 세포를 콜라겐 ENC 코팅 플레이트의 각 웰로 옮겨 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다. 시술 당일. 피펫 팁을 사용하여 하룻밤 동안 배양된 세포에 상처를 만들고 PBS로 각 웰을 세척하여 상처로 인해 형성된 파편을 제거합니다.

헹궈낸 웰에 DMEM plus FBS를 첨가한 다음 현미경으로 깨끗한 상처 공간이 생성되었는지 확인합니다. 현미경 카메라와 라이브 셀 이미징 장치를 켠 후 현미경 위에 플레이트를 배치합니다.tage. 새로운 라이브 셀 환경 제어 챔버로 플레이트를 덮고 온도 조절기를 섭씨 37도로 설정하고 이산화탄소를 5%로 설정합니다.이제 메뉴 표시줄에서 슬라이드 북 소프트웨어를 엽니다.

원 버튼 안의 F를 클릭하여 초점 제어를 선택합니다. Objective 상자에서 드롭다운 창을 사용하여 Objective를 정의합니다 filter set 상자에서 light path를 I piece로 향하게 하는 설정을 선택합니다. Bright Field Illumination에 적합한 필터를 선택한 다음 open Bright를 클릭합니다.

명시야 셔터를 엽니다. 이제 포탑에서 명시야 필터를 선택하고 접안렌즈를 통해 샘플을 보고 적절한 자기장을 찾고 샘플에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 필터 터렛을 이동하여 카메라로의 광 경로를 변경합니다. 슬라이드 북 소프트웨어에서 이미지를 캡처하려면 초점 제어를 클릭하고 XY를 선택하여 I 조각을 통해 다른 위치를 선택한 다음 설정점을 클릭하여 각 위치를 고정합니다.

이미지 캡처의 경우 화면에 표시되는 카메라 이미지의 초점을 수동으로 미세 조정한 다음 초점 제어 창의 도구를 사용하여 스테이지의 Z 위치를 조정합니다. 최상의 결과를 얻으려면 플레이트와 접촉하는 곳 근처의 평평한 세포 돌출부에 초점을 맞추면 초점을 맞추는 데 도움이 됩니다. 슬라이더를 사용하여 초점을 맞추기에 적절한 범위로 노출 시간을 조정합니다.

여러 XY 위치를 선택한 경우 초점 제어를 선택하여 각 개별 위치에 대한 초점을 조정합니다. 그런 다음 xy, 방문 지점. 슬라이드 북의 메뉴 모음에서 카메라 그래픽을 선택하고 캡처 유형을 선택한 다음 시간 경과를 선택하여 실험 시간을 선택합니다.

드롭다운 메뉴에서 한 시점의 시작과 다음 시점의 시작 사이에 원하는 지연을 입력합니다. interval 필드에서 세 번째 필드는 수동으로 입력한 값에서 자동으로 계산됩니다. 다중 XY 캡처에서 둘 이상의 XY 위치가 있는 실험에 대한 다중점 목록을 선택합니다.

마지막으로 파일을 저장할 파일의 이름을 지정하고 Capture Control(캡처 제어)로 이동하여 Advanced(고급)를 선택한 다음 Spool(스풀)을 선택합니다. 그런 다음 메모리에 캡처하고 각 시점 이후에 스풀 파일에 저장합니다. 이미지를 클릭하여 시작하십시오.

슬라이드 북 메뉴 모음의 드롭다운 메뉴에서 가져오기를 선택한 다음 슬라이드 북 스풀을 클릭합니다. 다양한 필드 및 시점에 대해 마이그레이션 실험에서 생성된 원하는 슬라이드 북 파일을 선택합니다. 첫 번째 파일을 연 다음 메뉴 표시줄에서 마스크를 선택하고 드롭다운 메뉴에서 입자 추적 프로토콜을 선택합니다.

particle tracking(파티클 추적) 메뉴에서 manual particle tracking protocol(수동 파티클 추적 프로토콜)을 선택합니다. 시작 및 종료 시점이 있는 창이 나타납니다.무작위 마이그레이션을 분석하려면 마스크를 선택한 다음 입자 추적 프로토콜을 선택합니다. 다시 말하지만, 개체 중심의 좌표를 결정하려면 영역 중심을 선택합니다.

그런 다음 추적 및 계속을 클릭합니다. 이제 변위 및 평균 속도와 같은 각 경로에 대해 원하는 통계를 선택합니다. 여기에 표시된 대로 계산을 클릭하여 통계를 봅니다.

속도 측면에서 정량화된 무작위 마이그레이션 분석의 예가 이 상자에 표시되어 있습니다. Whiskers 그래프에서, 이 실험에서, 종양 억제 유전자가 넉다운된 M-D-A-M-B 2 31 세포의 평균 속도가 증가했습니다. 여기에서 대조군 M-D-A-M-B 2 31 세포와 비교하여 첫 번째 그림에서 세포의 무작위 이동을 세포 변위 측면에서 분석했습니다.

다시 말하지만, 전체 종양 억제 유전자 녹다운 그룹은 대조군 M-D-A-M-B 2 에 비해 세포 변위가 증가했다 31. 이 타임 랩스 비디오 현미경 영화 제어 MDA MB 2 31 세포의 세포는 밤새 콜라겐에 앉았습니다. 그런 다음 무작위 마이그레이션 동안 총 18시간 동안 1시간 간격으로 이미지를 촬영했습니다.

시간이 지남에 따라 셀이 원래 위치에서 어떻게 멀어지는지 확인합니다. 이 동영상에서는 콜라겐에 하룻밤 파종한 후 테스트 M-D-A-M-B 2 31 세포의 이동을 기록하고 분석했습니다. 테스트 셀은 이전 동영상의 대조 셀에 비해 더 이동한다는 점에 유의하십시오.

이 절차에 따라 세포 침입 및 다이나스와 같은 다른 방법을 수행하여 암 전이에서 발병 후 세포의 역할은 무엇입니까? 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구자들이 분리된 암 세포주를 사용하여 세포 이동을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.