Name: 시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 학습하세요 시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포 무작위 마이그레이션 정량 분석 방법입니다. 콜라겐 코팅 및 상처 유도 후 실시간 이미지 촬영으로 이동 속도와 변위를 측정하여 암세포 이동성 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 실험과 초기 도움 아만다 Struckhoff 감사드립니다. 이 작품은 NIH 5RO1CA115706에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. 접시의 준비는 콜라겐으로 코팅 <ol><li> 10 μg / Opti-가상 미디어 ML의 최종 농도로 콜라겐을 희석. </li><li> 1 단계에서 각도에 1.5 ML를 추가하여 콜라겐과 코트 6 잘 접시. 4에서 하룻밤 품어 ° C. </li><li> 다음 날, 1X 인산 2 번 식염수 (PBS)를 버퍼 접시를 씻고 PBS에 그들을 저장합니다. </li></ol> 2. 6 - 잘 접시에 세포 준비 및 심는 참고 : 세포의 움직임을위한 최적의 조건을 보장하기 위해 따뜻한 매체와 PBS를 사용 <ol><li> 성장 MDA-MB-231 (침입 유방암 세포주) 띄엄띄엄 10% 태아 소 혈청 (FBS)와 Dulbecco의 수정일 독수리 중간 (DMEM) 인치 이 예제에서, 우리는 MDA-MB-231을 사용하지만,이 방법은 어떤 자기편 종양과 비 종양 세포 라인에 적용할 수 있습니다. </li><li> 따뜻한 1X PBS로 두 번 세포를 씻고 trypsinization에 의해 수집합니다. 통화를 만들기 위해 현미경으로 세포를 검사세포가 제대로 트립신 처리에 의해 분리되는 재. </li><li> 10% FBS으로 DMEM 배지를 추가하여 세포를 수집, 부드럽게 5 분 1,000그램에서 세포를 다운 스핀. 10% FBS으로 DMEM 배지에 부드럽게 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 부드럽게 아래 위로 pipetting하여 세포 펠렛 봐라. 그것은 가능한 한 각 세포에 세포 클러스터를 무너뜨리는 것이 중요합니다. </li><li> 세포를 카운트와 10 % FBS와 50,000 세포 / DMEM 미디어 ML의 최종 농도로 희석. 각도에이 ML을 분배. </li><li> 촬영된 현미경을 시작할 때까지 하룻밤 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 마이 그 레이션을위한 충분한 공간을 확보하기 위해 피펫 팁을 사용하여 상처를 만들고, 파편 (상처의 결과로 형성) 제거와 10 % FBS으로 DMEM을 추가하는 1X PBS로 접시를 씻는다. 떠다니는 세포에 대한 현미경으로 확인합니다. 세포의 큰 숫자가 부동 경우 세척 절차를 반복합니다. 이제 음식에 설치가 될 준비가되어이미지 수집을위한 현미경. </li></ol> 3. 현미경의 설치 및 자동 이미지 인식 자동 이미지 수집을위한 현미경을 제어 여러 이미징 소프트웨어 패키지가 있습니다. 여기서는 Slidebook 5.0 이미징 소프트웨어를 사용하고 자동 인수는 인수와 최소한 phototoxicity 속도 답해야 라이브 셀 애플 리케이션에 뛰어난 EM-하마 마츠 C9100 카메라에 결합 올림푸스 현미경 (올림푸스 IX81)에서 수행됩니다. 시스템은 무대 최고 환경 제어 챔버 (Neue 라이브 셀) 및 자동 XY 스테이지 컨트롤러를 (사전 Proscan)가 포함되어 있습니다. 이미지가 정의된 시간 간격을 이용한 명시야 모드에서 10X UPLANFL Ph1/0.30 목표, 함께 찾았습니다. 다음 프로토콜은 이미지 수집에 대해 설명합니다. <ol><li> 현미경, 카메라, 그리고 라이브 세포 이미징 장치를 켭니다. 미세한 무대 위에 접시를 놓습니다. Neue 라이브 셀 envi에 의해 커버 플레이트CO 2 공급 및 온도 센서와 연결되어 ronmental 제어 챔버. 37 5 % ° C와 CO 2에서 온도 조절 장치를 설정합니다. </li><li> SlideBook 소프트웨어는 완전 자동화된 객관적인 선택, 파장 선택과 형광 및 명시야 기법간에 쉽게 전환이 가능합니다. 초점 제어의 여러 매개 변수를 설정하기 위해서는 오픈 SlideBook 소프트웨어&gt; 클릭하여 메뉴 모음&gt; 선택 초점 컨트롤로 이동&gt; <img alt="0 버튼 1을 그림" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn1.jpg" /> 그리고 다음 매개 변수를 선택 <ol><li> 에서 &#39;대상 상자에서 &quot;창 드롭 다운에서 선택하여 목표를 정의합니다. 우리는 위상 목적을 사용하고 수동으로 콘덴서에 적절한 위상 링을 선택합니다. 자동 콘덴서와 시스템을 사용하는 경우이 자동으로 소프트웨어 프로그램을 통해 설정됩니다. 도 객관적인 포탑이나 콘덴서를 자동화하는 경우 또는, 그것들은 사용 설명서를 각각 선택해야합니다그겁니다. </li><li> : &#39;필터 설정&#39;상자 <ol><li> 사용 가능한 필터 (Google 시스템에서 카메라에 대해 &quot;Widefield&quot;, 접안 렌즈에 대해 &quot;라이브&quot;)를 참조하기 위해 드롭 다운 상자에서 접안 렌즈 또는 카메라 중 하나에 빛이 경로를 지시하는 설정을 선택합니다. </li><li> brightfield 조명에 적합한 필터를 선택합니다 (우리의 함정에서이 옵션 brightfield 광 경로에 대해 열린 입장을 대표하는 &#39;DIC&#39;(으)로 분류합니다.) </li><li> 명시야 셔터를 엽니다 &quot;열기 밝은&quot;를 클릭하여 광원을 선택합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 눈 조각 아래에 샘플을 보려면 포탑에서 명시야 필터 (Google 시스템에서 찾을 위치 &quot;6&quot;)를 선택합니다. 초기에 적절한 필드를 찾아 초점 (단계 3.2.1로 3.2.2.3)로 샘플을 가져 접안 렌즈를 통해 샘플을보고 나서. 이미지 캡처 (위치에 Google 시스템에서 &quot;1&quot;)를 카메라에 빛의 경로를 변경하려면 필터 터렛을 이동합니다. </li><li> 자동화된 단계는 있습니다 다른 XY coordina의 선택이미지 수집 중 관심있는 여러 분야를 캡처하기 위해 오셨. SlideBook 소프트웨어에 초점 컨트롤로 이동 접안경하지만 다른 위치를 선택, &quot;XY&quot;를 선택 후 이미지 캡쳐 (그림 1) 각 지역에서 &#39;세트 포인트&#39;잠금을 클릭합니다. </li><li> 미세 조정 화면에 표시될 카메라 이미지의 초점. 이것은 어느 정도 미세한 단위로 초점을 조정할 수 현미경이나 컴퓨터 컨트롤에 수동 컨트롤을 사용하여 수행할 수 있습니다. </li><li> &quot;초점 컨트롤&quot;창에서 컨트롤을 사용하여 무대의 Z 위치를 조정합니다. 최상의 결과를 얻으려면 플레이트와 접촉 근처 평평한 세포 라고나 초점을 맞춥니다. </li><li> 초점에 대한 적절한 범위에 있어야 노출 시간을 조정 슬라이더를 사용하여 초점과 투입. 여러 XY 위치가 선택되었을 경우, 각 위치에 대해 초점을 조정 초점 조절&gt; XY&gt; 방문 지점에서. 참고 : 이것은 확실히 회를 만들기 위해 수행됩니다입력란에 정확하게 최적의 스냅샷을 위해 주력하고있다. </li><li> 캡쳐 창 매개 변수를 설정하는 소프트웨어를 사용합니다. SlideBook에서 선택하여 캡처를 여십시오 <img alt="0 버튼 2를 그림" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn2.jpg" /> 메뉴 표시줄에서. 그림 2를 참조하십시오. 우리는 다음 매개 변수를 확인하십시오. <ol><li> 저속과 같은 형식&gt; 캡쳐 확인합니다. </li><li> 와이드 필드 : DIC (명시야 이미지) 필터 집합을 확인합니다. </li><li> &quot;시간 저속 캡처는&quot;(이것은 세포 종류에 따라 다를 수 있음) 캡처됩니다 시간 포인트의 번호입니다. 기간의 실험을위한 시간의 총 길이입니다. 시간의 단위 [밀리초 (MS), 초 (들), 분 (M) 또는 시간 (H)의이] 드롭 다운 메뉴에서 선택할 수 있습니다. </li><li> &quot;간격&quot;하나 timepoint의 시작과 다음 timepoint의 시작 사이의 지연이다. 여러분이 이러한 가치관의 두 입력으로 세 번째 필드는 자동으로 계산됩니다. </li><li> 다중 XY 캡처 : &quot;멀티를 선택하십시오1 이상 XY 위치에 대한 포인트 목록 &quot;. </li><li> 파일의 이름을 지정하십시오. 주어진 예제에서, 우리는 &#39;그것을 &#39;231라는했습니다. </li></ol></li><li> 때문에 여러 개의 이미지로 컴퓨터가 예기치 않게 종료되지 않도록하려면 파일을 저장하기 위해 &quot;스풀 옵션&quot;을 사용합니다. 그것은 선택 사항입니다, 그러나 그것은 매우 권장합니다. 이를 위해 캡처 아래 contro 나&gt; 선택 고급&gt; 스풀&gt; 메모리에 캡처하고 각 시간 지점 이후에 스풀 파일에 저장합니다. 슬라이드 도서 파일 (그림 3)을 저장할 위치를 찾습니다. 생성된 영화가 나중에 지정된 위치에서 가져올 수 있습니다. 현미경 설정의 단계에 요약되어 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/Figure_3.1_merged.pdf" target="_blank">파일 3.1</a> . </li></ol> 4. 마이 그 레이션의 이미지 처리 및 분석 : 속도와 배기량의 산출 이 예제에서는 이미지 처리가 SlideBo 이루어집니다확인 5, 6 5.0 소프트웨어. 영상 처리 및 분석을위한 같은 ImageJ 7 등 다양한 다른 프로그램이있다. <ol><li> 다양한 시간 지점에서 다양한 분야의 이미지에서 생성된 SlideBook 파일을 가져옵니다. 메뉴 표시줄로 이동&gt; 이미지 아래에&gt; 가져오기&gt; 슬라이드 도서 스풀&gt; 원하는 파일 (그림 4A)를 선택합니다. </li><li> 여기에서 우리의 목표는 개별 세포의 움직임을 추적하는 것입니다. 그것은 자동 추적이나 개별 추적을 사용하여 수행할 수 있습니다. 예제에서 우리는 수동 추적을 사용한,이 용이 이후는 자동 추적과 어느것이 더 어려 운지 쉽게 유물을 배제할. </li><li> 우리가 추적을 수행하기 위해 보유하고있는 SlideBook 파일을 엽니다. 메뉴 아래에 : 선택 마스크&gt; 입자 추적 프로토콜&gt; 매뉴얼 입자 추적 프로토콜 (그림 4B). 창이 시작과 끝 시간 점 (그림 4c)와 함께 나타납니다. </li><li> Begi각 세포 (핵)의 중앙을 클릭하여 개별 세포의 움직임을 추적할 수 그렇죠. 약 30 세포가 하나의 실험에서 분석할 수 있도록 각 영화의 약 10 세포 적어도 세 가지 다른 영화를 추적은 서로 다른 위치에서 선택해야합니다. 각 실험은 세 번 반복해야합니다. 불편 접근을 허용하려면 같은 전선에서 일부 세포 등 다양한 위치에서 셀을 선택, 중, 구석 등이 &quot;OK&quot;를 클릭 한 번 추적이 이루어집니다. </li><li> 랜덤 마이 그 레이션은 메뉴 아래 자료&gt; 선택 마스크&gt; 입자 추적&gt; 입자 추적 프로토콜을 분석 속도, 속도 또는 변위 등의 변화를 측정하여 분석할 수 있습니다. (그림 5A) : 아래 설명된대로 추적 매개 변수를 선택하십시오 : <ol><li> 로 추적 - 당신이 드롭 다운 목록에서 추적하고자하는 매개 변수를 선택합니다. 면적이 예제에서 우리가 사용한, 센터 (오브의 중심의 좌표ject). </li><li> &quot;추적 및 계속&quot;을 클릭하십시오. 추적이 완료되면,이 자동으로 다음 단계로 진행됩니다. </li></ol></li><li> 같은 변위와 평균 속도 (그림 5B 참조) 각 경로에 대한 원하는 통계를 선택하세요 : <ol><li> 평균 속도 - 총 거리가 그 거리를 여행하는 데 필요한 시간으로 나눈 여행. </li><li> 총 배기량 - 객체에 의해 여행 총 거리. </li><li> &quot;계산하고 계속&quot;당신이 다음 단계로 진행하고자하는 경우, 또는 단순히 당신이 다음 단계로가는없이 통계를보고자하는 경우에는 &quot;계산&quot;을 선택 클릭합니다. 파일은 텍스트 파일로 저장할 수있는 생성되며 나중에 Excel로 내보낼 수 있습니다. </li></ol></li><li> 자동 추적 프로토콜을 사용하여 객체를 추적하기 위해서는, 먼저 마스크가 생성되어야한다. <ol><li> &gt; 세그먼트 이미지&gt; 세그먼트 창이 나타납니다 마스크를 선택&gt; 임계값을 얻을 때까지 선택 등 그 9월다른 사람에서 한 물체를 arating 것은&gt; (그림 5c를 참조)&gt; 확인을 적용합니다. 단계 4.5.1은 동일합니다. </li><li> 이상의 객체가 작은 제거 - 선택적으로 지정된 크기보다 작은 물체가 제거하려면이 확인란을 선택합니다. 편집 필드의 크기를 입력하고 단위로 미크론 또는 픽셀 중 하나를 선택합니다. 이것은 자주 파편으로 인한 아티팩트를 제거하는 데 사용됩니다. </li><li> 최소 운동 - 경로를 확인하기 위해 추적해야 시간 포인트의 최소 숫자를 입력합니다. </li><li> 최대 운동 - 한 시점에서 특정 개체에서 다음을 기대하는 최대 운동을 입력하십시오. </li><li> 데이터를 분석하는 단계 (4.6.2 단계 4.5.2 참조) 수동 추적과 동일합니다. </li></ol></li></ol> 5. 대표 결과 무작위로 마이 그 레이션 분석의 예제는 속도와 변위 (그림 6)의 측면에서 계량. 파일 T를 수출 후O 엑셀은 데이터 상자와 수염의 음모를 꾸몄다 사용하고 있습니다. 테스트 및 제어 사이 총 변위와 평균 속도 비교 통계 분석은 맨 - 휘트니 테스트를 사용하여 수행됩니다. 테스트 샘플은 컨트롤에 비해 평균 속도 증가를 보여줍니다. 테스트 샘플은 컨트롤에 비해 총 변위의 증가를 보여줍니다. 제어 및 테스트의 영화 : 제어 MDA-MB-231 및 테스트 MDA-MB-231 세포는 하룻밤 사이에 콜라겐에 놓는되었다. 시간 경과 비디오 현미경은 올림푸스 현미경에 의해 수행 EM-하마 마츠 카메라에 결합되었다. 이미지가 무작위로 마이 그 레이션하는 동안 18시간 총 1 시간의 간격으로 촬영하고 있습니다. 영화 1, 제어 및 테스트 샘플에 대한 무작위로 마이 그 레이션의 영화 2를 참조하십시오. 현미경 설정 : <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig1.jpg" /> 그림 1. 이미지에 대해 여러 포인트 설정하기<html> 캡처. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig2.jpg" /> 그림 2. 캡쳐 제어를 묘사한 단계. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig3.jpg" /> 그림 3. 어떻게 여러 개의 이미지를 저장합니다. &quot;dflinebreak&gt; 마이 그 레이션의 이미지 프로세싱 및 분석. <img alt="그림 4A" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4a.jpg" /> 그림 4A. 데이터 분석을 위해 이미지를 가져오는 단계. <img alt="그림 4B" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4b.jpg" /> 그림 4B. 입자 추적 프로토콜을 사용하여 데이터를 분석하는 단계. <img alt = &quot;그림 4c&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/3585/3585fig4c.jpg&quot;/&gt; 그림 4c. 추적 입자의 창 묘사한 경로 길이. 데이터 분석의 단계. <img alt="그림 5A" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5a.jpg" /> 그림 5A. 입자 추적 프로토콜 매개 변수를 묘사하는 단계. <img alt="그림 5B" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5b.jpg" /> 그림 5B. 분석되는 경로 통계의 선택. <img alt="그림 5c" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5c.jpg" /> 그림 5c 있습니다. 자동 추적 프로토콜에 대한 마스크를 생성하는 단계. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig6.jpg" /> 그림 6. 평균 속도 (그림6A)와 변위 (그림 6B)는 수염의 음모를 꾸몄다됩니다. 제어하기 위해 비교로 테스트 샘플은 속도와 변위의 증가를 보여줍니다. 영화 영화 1. 제어 세포 마이 그 레이션이 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585movie1.avi" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 영화 2. 테스트 세포 마이 그 레이션이 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585movie2.avi" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 제어 MDA-MB-231 및 테스트 MDA-MB-231 세포는 하룻밤을위한 콜라겐에 띄엄띄엄 놓는되었다. 시간 경과 비디오 현미경은 올림푸스 현미경에 의해 수행 EM-하마 마츠 카메라에 결합되었다. 이미지가 무작위로 마이 그 레이션하는 동안 18 시간 동안 일시간의 간격으로 촬영하고 있습니다. 제어 및 테스트를 위해 임의 이주의 동영상을 참조하시기 바랍니다.

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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

실시간으로 무작위로 마이 그 레이션 분석은 속도와 변위와 같은 세포 이주 매개 변수 중 정확하고 민감한, 분석을 가능하게합니다. 이 방법은 포인트 측정 값을 끝낼 국한되지 않고, 따라서 그것은 더 많은 양적입니다. 이후 세포는 혈청과 정상 DMEM 배지에서 모니터링되며 그것은 혈청 무료 미디어 이상 인큐베이션의 해로운 효과를 감소시킵니다. 이것은 세포 마이 그 레이션이 서식하기 때문에이 방법은 이전에 다른 substrata의 효과를 연구하는 데 사용할 수있는 하층 8로 세포 연락처를 위반에 의존하는 것으로 나타났습니다. 중요한 단계 중 하나는 최적의 마이 그 레이션을 보장하기 위해 37 5 % ° C와 CO 2로 온도의 적절한 통제를 포함한다. 분석은 원하는 시간 지점에서 철새 반응을 모니터링하기 위해 유연성을 허용하지만, 그것은 시간 포인트의 수를 최적화가 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 낮은 마이 그 레이션 속도를 갖는 일부 세포가...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 써모 과학 </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> 제미 나이 바이오 제품 </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-가상 </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> 콜라겐 </td><td> BD </td><td> 354,231 </td><td></td></tr><tr><td> 라이브 셀 챔버 및 자동 XY 스테이지 컨트롤러와 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> 올림푸스 1X81 </td><td></td></tr><tr><td> 환경 제어 챔버 </td><td> Neue </td><td> Neue 라이브 셀 회의소 </td><td> 와우 챔버의 상단을 통해 적절한 광학 정의 지어진 사각형 유리 플레이트 상단 있습니다. 직사각형 모양의 experimen 많은에 사용되는 멀티 잘 번호판을 수용TS. </td></tr><tr><td> 자동 XY 스테이지 </td><td> 이전에 </td><td> 이전 Proscan </td><td> 이것은 정확한 반환 시간 저속 현미경 중에 선택한 XY 위치를 곱하면 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 카메라 </td><td></td><td> 하마 마츠 EM 카메라 C9100 </td><td></td></tr><tr><td> 소프트웨어 </td><td> 일반적으로 이러한 올림푸스 현미경 같은 공급 업체를 통해 구입 </td><td> 슬라이드 도서 5 </td><td></td></tr></tbody></table>

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

세포 이주는 배아 개발, 조직 복구, 면역 체계 기능, 그리고 종양 침공 1, 2를 위해 중요하다 역동적인 과정이다. 방향 마이 그 레이션하는 동안 세포는 세포외 chemotactic 신호에 대응하거나, 기본적인 운동성 기계에서 제공하는 본질적인 단서 3 응답으로 급속하게 이동합니다. 세포는 세포가 자신의 로컬 환경을 탐험 있도록 낮은 본질적인 방향성을 가지고하면 랜덤 마이 그 레이션이 발생합니다. 세포 이주는 초기 응답 세포에서 복잡한 과정이다 분극을 거쳐 및 마이 그 레이션 2의 방향으로 라고나을 확장합니다. 이러한 Boyden 챔버 마이 그 레이션 분석과 같은 마이 그 레이션을 측정하는 전통적인 방법은 끝점 결과로 마이 그 레이션을 측정하는 수 체외에서 chemotaxis를 측정하기위한 쉬운 방법입니다. 그러나,이 접근법은 역시 개별적인 마이 그 레이션 매개 변수의 측정을 허용하지 않으며 그것은 visua 수 있습니까세포가 마이 그 레이션하는 동안 겪습하는 형태학의 변경 lization. 저속 현미경 - 여기, 우리는 비디오를 사용하여 실시간으로 이주하는 세포를 관찰 할 수 있습니다 방법을 제시한다. 세포 이주와 침략이 암의 특징이기 때문에이 방법은 체외에서 암 세포 이주와 침략을 연구에 적용 될 것입니다. 혈소판의 무작위 마이 그 레이션은 혈소판 기능 4의 매개 변수 중 하나로서 간주되었으며, 따라서이 방법은 또한 혈소판 기능을 공부에 많은 도움이 될 수 있습니다. 이 분석은 신속하고 안정적​​인 재현성 적의를 가지고 있으며, 세포 숫자의 최적화가 필요하지 않습니다. 세포 생리학을위한 적합한 조건을 유지하기 위해서는 현미경이 CO 2 공급 및 온도 자동 온도 조절 장치를 갖추고 있습니다. 세포 운동은 정기적으로 현미경에 장착 카메라를 사용하여 사진을 찍고 의해 모니터링된다. 세포 이주는 측정 평균 속도로 계산할 수Slidebook 소프트웨어에 의해 계산됩니다 verage 변위.

이 방법은 실제 시간과 같은 속도, 변위와 속도 등 다양한 세포 이주 매개 변수의 양적 측정에 세포의 모니터링이 가능합니다. 전통적인 방법과는 달리,이 실시간 접근법 끝점 양적 마이 그 레이션 측정에 기초하지 않고 대신 그것은 모니터링하고 지속적으로 서로 다른 매개 변수를 계산할 수 있습니다.

세포 이동은 배아 발달, 조직 수복, 면역 체계 기능 및 종양 침습에 중요한 역동적인 과정입니다 1, 2. ... 동안

다음 실험의 전체적인 목표는 비디오 타임랩스 현미경을 사용하여 세포의 이동을 실시간으로 정량적으로 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 6-웰 배양 플레이트에 콜라겐을 코팅한 다음, 코팅된 플레이트에 대상 세포를 저밀도로 파종합니다. 두 번째 단계로, 피펫 팁을 사용하여 플레이트에 상처를 만들어 세포가 이동할 수 있는 충분한 공간을 확보합니다.다음으로, 온도를 제어하는 시스템을 사용하여 현미경을 설정하고 일정한 간격으로 이미지를 캡처함으로써 이동하는 세포를 실시간으로 지속적으로 모니터링합니다. 최종적으로, 파티클 트래킹 프로토콜을 사용하여 실험군 세포와 대조군 세포의 평균 속도 및 총 변위의 차이를 평가합니다. 회피 챔버 이동 분석(avoidant chamber migration assay)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 최종 시점의 정량적 이동 측정에 기반하지 않는다는 점입니다.대신, 이 방법은 다양한 파라미터를 지속적으로 모니터링하고 계산할 수 있게 해줍니다. 이러한 방식은 특정 유전자나 약물이 종양 세포 이동에 어떤 영향을 미치는가와 같이 암 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 실험 수행 2일 전에 opti media에 희석한 콜라겐 1.5 milliliters를 6-well culture plate의 각 웰에 넣고, 실험 전날에 4 °C에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양합니다.관심 세포를 웰당 2 mL의 FBS가 포함된 DMEM에 다시 현탁하여 콜라겐 ENC가 코팅된 플레이트의 각 웰에 옮기고, 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 실험 당일, 피펫 팁을 사용하여 하룻밤 동안 배양된 세포에 상처를 내고, 각 웰을 PBS로 세척하여 상처로 인해 발생한 잔해를 제거합니다.헹궈낸 웰에 FBS가 포함된 DMEM을 추가한 후, 현미경으로 관찰하여 깨끗한 상처 부위가 형성되었는지 확인합니다. 현미경 카메라와 라이브 셀 이미징 장치를 켠 다음, 플레이트를 현미경 스테이지 위에 배치합니다. 새 라이브 셀 환경 제어 챔버로 플레이트를 덮고, 온도 조절기의 온도를 37°C로, 이산화탄소 농도를 5%로 설정합니다. 이제 메뉴 바에서 슬라이드 북 소프트웨어를 엽니다.원형 안의 F 버튼을 클릭하여 초점 제어를 선택하십시오. 대물렌즈 상자에서 드롭다운 창을 사용하여 대물렌즈를 정의하십시오. 필터 세트 상자에서 광로를 I 피스로 유도하도록 설정을 선택하십시오. 명시야 조명(Bright Field Illumination)에 적합한 필터를 선택한 다음, open Bright를 클릭하십시오.명시야 셔터를 엽니다. 이제 터렛에서 명시야 필터를 선택하고 접안렌즈를 통해 샘플을 관찰하여 적절한 시야를 찾고 샘플의 초점을 맞춥니다. 그런 다음 필터 터렛을 이동하여 광로를 카메라로 변경합니다. 슬라이드 북 소프트웨어에서 이미지를 캡처하려면 초점 제어(focus control)를 클릭하고 XY를 선택하여 접안렌즈를 통해 다양한 위치를 선택한 다음, 설정 지점(set point)을 클릭하여 각 위치를 고정합니다.이미지 캡처를 위해, 화면에 표시되는 카메라 이미지의 초점을 수동으로 미세 조정하고, 초점 제어 창의 도구를 사용하여 스테이지의 Z 위치를 조정하십시오. 최상의 결과를 얻으려면, 초점 맞추기에 도움이 되도록 플레이트 접촉면 근처의 평평한 세포 돌출부에 초점을 맞추십시오. 슬라이더를 사용하여 노출 시간을 초점 조절에 적절한 범위로 조정하십시오.여러 개의 XY 위치가 선택된 경우, 포커스 제어를 선택하여 각 개별 위치의 초점을 조정하십시오. 그 다음 xy를 선택하고 visit point를 선택하십시오. slide book의 메뉴 바에서 카메라 그래픽을 선택하고, capture type을 선택한 후 time lapse를 선택하여 실험 시간을 설정하십시오.드롭다운 메뉴에서 한 시점의 시작부터 다음 시점의 시작까지의 원하는 지연 시간을 입력하십시오. 간격 필드에서 세 번째 필드는 수동으로 입력된 값으로부터 자동으로 계산됩니다. 다중 XY 캡처(multiple XY capture) 항목에서, XY 위치가 두 곳 이상인 실험의 경우 다중 지점 목록(multi-point list)을 선택하십시오.마지막으로, 저장할 파일 이름을 지정하고 캡처 컨트롤(capture control)로 이동하여 어드밴스드(advanced)를 선택한 후 스풀(spool)을 선택합니다. 그런 다음 각 시점마다 메모리에 캡처하고 스풀 파일로 저장하십시오. 이미지 클릭부터 시작합니다.슬라이드 북 메뉴 바에서 드롭다운 메뉴의 import를 선택한 다음, slide book spool을 클릭합니다. 다양한 영역과 시점에서 마이그레이션 실험을 통해 생성된 원하는 슬라이드 북 파일들을 선택합니다. 첫 번째 파일을 열고, 메뉴 바에서 mask를 선택한 후 드롭다운 메뉴에서 particle tracking protocol을 선택합니다.입자 추적(particle tracking) 메뉴에서 수동 입자 추적 프로토콜을 선택합니다. 시작 및 종료 시점이 표시된 창이 나타납니다. 무작위 이동을 분석하려면 마스크(mask)를 선택한 다음 입자 추적 프로토콜을 선택하십시오. 다시, 객체 중심의 좌표를 결정하기 위해 영역 중심(center of area)을 선택합니다.그 다음 track 및 continue를 클릭합니다. 이제 변위 및 평균 속도와 같이 각 경로에 대해 원하는 통계 항목을 선택하십시오. 여기에서 보는 바와 같이, calculate를 클릭하여 통계치를 확인합니다.속도로 정량화한 무작위 이동 분석의 예가 이 상자에 나타나 있습니다. Whiskers 그래프를 보면, 본 실험에서 종양 억제 유전자가 녹다운된 M-D-A-M-B 2 31 세포의 평균 속도가 증가했음을 알 수 있습니다. 대조군인 M-D-A-M-B 2 31 세포와 비교하여, 첫 번째 그림에 제시된 세포의 무작위 이동이 세포 변위 관점에서 분석되었습니다.다시 한번, 전체 종양 억제 유전자 넉다운 그룹은 대조군 M-D-A-M-B 2 31에 비해 세포 변위가 증가했습니다. 이 타임랩스 비디오 현미경 영상의 세포들은 대조군 MDA MB 2 31 세포로, 밤새 콜라겐 위에 안착시켰습니다. 그 후 무작위 이동 과정 동안 총 18시간 동안 1시간 간격으로 이미지를 촬영했습니다.시간이 지남에 따라 세포들이 원래 위치에서 어떻게 멀어지는지 관찰하십시오. 이 영상에서는 콜라겐 상에 하룻밤 동안 파종한 후 M-D-A-M-B 2 31 테스트 세포의 이동을 기록하고 분석하였습니다. 테스트 세포가 이전 영상의 대조군 세포보다 더 활발하게 이동한다는 점에 유의하십시오.이 절차 이후, 암 전이 발생 후 세포의 역할은 무엇인가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 세포 침습(cell invasion) 및 dynas와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구자들이 분리된 암 세포주를 사용하여 세포 이동을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

일차원 국한 미세 환경에서 세포의 자발적인 이동을 연구하는 정량적 방법이 설명된다. 이 방법은 미세 채널을 활용하고 번의 실험에서 서로 다른 조건 하에서 세포의 다수의 이동을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

미세 채널에서 세포의 이동에 관한 연구

세포 이동은 암과 같은 상처 치료 및 면역 반응 및 병태 생리 학적 과정으로, 생리의 과다에 관여하는 생물학적 현상이다. 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 3 차원 형상의 생리적 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 특성을 분석하는 다용도 공구이다.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

기계적 특성 및 세포 외 매트릭스의 미세 강하게 세포의 3 차원 이동에 영향을 미칩니다. 시험 관내 방법은 개별 세포 집단 수준에서 모두 biophysically 변수 환경에서 시공간 세포 이동 동작을 연구하기 위해, 설명한다.

동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

세포 이식, 세포골격 라벨링 및 기능 손실/이득 접근법을 결합한 이 프로토콜은 생체 내 세포 이동에서 후보 유전자의 기능을 분석하기 위해 이동하는 제브라피시 전향 prechordal plate를 사용하는 방법을 설명합니다.

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

이 프로토콜은 또한 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 결정하기 위해 사용될 수있다 화학 유인 물질에 응답하여 세포 이동을 측정하는 방법을 자세히 맞춤형.

측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소

렌즈 무료 비디오 현미경 셀 문화 인큐베이터 안에 직접 모니터링할 수 있습니다. 여기 우리가 획득 하 고 배양된 HeLa 세포의 2.7 하루 종일 수집 분석 하는 데 사용 하는 전체 프로토콜 설명, 개별 셀 형태학 및 10584 세포 주기6 측정 추적 2.2 x 10의 데이터 집합에 지도.

동적에 대 한 렌즈 무료 비디오 현미경 및 부착 세포 배양의 정량 분석

휴면 및 활성 암 세포 고기 양적 위상 이미징 사용 하 여 특징 이었다. 셀 확산, 마이그레이션, 및 형태 분석 통합 되었고 한 간단한 방법을 분석.

시간 레이블, 양적 위상 이미징 휴면 하 고 적극적인 인간 암 세포의 연구

가장자리 지역 B 세포 (MZBs) 다시 흐름을 그들의 마이그레이션 경로 향하는 여 전단 흐름의 힘에 응답할. 이 프로토콜에는 기록 하 고 분석 응용 장치, 펌프, 현미경 이미징 시스템, 그리고 무료 소프트웨어를 사용 하 여 마이그레이션 방법을 보여 줍니다.

분석 Murine 가장자리 지역 B 세포 생체 외에서의 전단 흐름 유도 마이그레이션

이 절차에서는 Acanthamoeba spp  를 시각화, 추적 및 정량화하는 방법에 대해 설명합니다.운동성.

Acanthamoeba spp.의 정량화 운동성

이 프로토콜은 정량 분석을 통해 특정 환경 조건에서 T 세포 이동의 일차 쥐 T 세포 분리 및 타임 랩스 현미경 검사 방법을 제공합니다.

일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay

학습하세요 시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포 무작위 마이그레이션 정량 분석 방법입니다. 콜라겐 코팅 및 상처 유도 후 실시간 이미지 촬영으로 이동 속도와 변위를 측정하여 암세포 이동성 연구에 활용할 수 있습니다.

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

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