마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

다음 실험의 전반적인 목표는 망막 신경절 돌기의 발달을 연구하기 위해 출생 후 마우스에서 생체 내 전기천공법을 사용하여 망막 신경절 세포의 단일 또는 소규모 그룹을 transfection하는 것입니다. 이는 수술을 통해 안구를 노출시키고 소량의 혈장 DNA 용액을 망막에 직접 주입함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로, 주사 부위 바로 위의 안구에 전극을 삽입하고 전기 펄스를 가하여 혈장 DNA를 망막 뉴런으로 전달할 수 있습니다.

다음으로, 원하는 연령에서 전기로 가공된 망막과 뇌를 적출하여 형질주입된 망막 신경절 세포를 시각화하고, 다양한 피질하 표적 구조에서 표지된 망막 신경절 세포의 수상돌기 및 축삭 ARB 모두의 형광 표지를 보여주는 CNS 결과에 대한 투영을 얻습니다. 자궁 내 망막 전기천공법(in-utero retinal electroporation)과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술이 덜 침습적이고 시신경 카이즘에서 교차하는 것과 같은 초기 축삭 유도 이벤트를 방해하지 않는다는 것입니다. 또한 출생 후 마우스의 작은 집단 또는 단일 망막 신경절 세포를 정확한 공간 및 시간 제어로 라벨링할 수 있습니다.

전기천공용 전극을 만들려면 한 쌍의 dumont number five 집게에서 한 갈래를 끊은 다음 각 갈래의 바닥에 와이어를 납땜합니다. 베이스를 절연체, 테이프로 와이어로 감싸고 갈래 사이에 플라스틱 스페이서를 끼워 스프링 작용을 제공합니다. 전극이 결합되면 한 갈래의 와이어를 전기 자극기에 직렬로 연결된 풋 페달에 연결합니다.

풋 페달을 밟으면 전극을 통해 전류가 흐릅니다. 그런 다음 다른 단자의 전선을 전기 자극기에 연결합니다. 마지막으로 전기 자극기를 오실로스코프와 오디오 모니터에 연결합니다.

피펫 풀러를 사용하여 인젝터 시스템을 벤치의 3축 마이크로 매니퓰레이터에 장착합니다. nano Inject two와 함께 제공된 바늘을 사용하여 긴 테이퍼와 작은 팁으로 당겨진 유리 피펫을 만듭니다. 당겨진 피펫에 미네랄 오일을 다시 채우고 마이크로 인젝터에 고정합니다.

날카로운 현미해부 가위를 사용합니다. 장착된 피펫의 끝을 잘라 2-3마이크로미터의 구멍을 만듭니다. 열린 팁을 통해 피펫을 끌어 올려 주입 용액으로 피펫을 채웁니다.

마취 마우스 팝 H 4-5 일 후 저체온증에 의해. 그리고 발가락 꼬집음을 사용하여 마취 상태를 확인합니다. 마취된 마우스를 해부 내시경 아래에 놓고 미래 눈꺼풀의 길이를 따라 잘라 수술로 눈꺼풀을 엽니다.현저가위로 열고 한 쌍의 집게로 눈구멍 주위를 부드럽게 눌러 안구를 돌출시킵니다.

마이크로 매니퓰레이터를 조정하여 피펫을 안구 근처에 놓습니다. 미세주입 시스템의 풋 페달을 밟아 피펫 팁이 한 손으로 막히지 않도록 합니다. 튀어나온 안구를 다른 안구와 집게로 눈구멍 주위의 피부를 꼬집어 안정시킵니다.

피펫이 망막 색소, 상피를 뚫고 망막으로 들어가도록 마이크로 매니퓰레이터를 움직입니다. 풋 페달을 밟아 원하는 양의 용액을 분주하고, 피펫을 집어넣고, 전극 팁을 주입 부위 바로 위에 놓습니다. 표면에 닿는 안구의 양쪽에서 자극기에 부착된 풋 페달을 밟으면 회로가 완성되고 안구가 전기 퍼레이드됩니다.

안구를 안구에 부드럽게 밀어 넣고 상처 위에 안과 연고를 바릅니다. 쥐가 의식을 되찾을 때까지 섭씨 36도로 유지되는 가열 패드에 쥐를 놓고 RG CS만 수혈된 상태로 어미에게 돌려줍니다. Cree Recombinase 및 flock stop에 대한 플라스미드 및 코딩을 모두 사용하여 EGFP는 발현할 수 있습니다.

EGFP 단일 세포 라벨링은 EGFP 표지된 단일 망막 신경절, 세포 수상돌기 및 축삭을 사용하여 상대적으로 낮은 농도의 Cree 플라스미드 덕분에 달성되며, 평평한 망막에서 세포 수상돌기 및 축삭을 시각화할 수 있습니다. 스타버스트 오미크론 세포와 같은 다른 망막 세포 유형도 이 기술로 표지할 수 있습니다. 여기에서 우리는 출생 후 14일째에 편평한 산 망막에서 RG CS 및 오미크론 세포를 포함하여 EGFP로 표지된 망막 뉴런 클러스터의 예를 볼 수 있습니다.

이 기술을 사용하여 동일한 마우스의 4가지 주요 망막 좌표 모두에서 전체 마운트 상대장에서 RG CS의 망막 주제 표적화를 분석할 수 있습니다. 이 기술은 제대로 수행되면 4-5분 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 혈장 DNA와 같은 용액을 산후 망막에 국소 주입하는 방법과 전기천공법을 사용하여 망막 뉴런을 생체 내 형질 주입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.