Name: 마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: 배우세요 마우스 망막 신경절 세포의 생체내 전기천공법을 이용한 유전자 전달 기법을. 이 방법은 시각계 발달 연구와 망막 생물학 연구에 정확한 시공간 제어를 제공합니다.

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pCAG - gapEGFP 플라스미드 박사 S. 맥코넬 (스탠포드, CA)에서 선물했다. pCAG - tdTomato 플라스미드 박사 M. 펠러 (버클리, CA)에서 선물했다. 우리는 기술 지원을위한 시험 연구와 Crair 연구소 회원에 두 개의 플라스미드 Cre 호텔 / loxP 전략을 검증을위한 단일 셀 라벨 앤 Schohl (몬트리올, QC)에 대한 두 플라스미드 전략의 사용을 제안 박사의 에드워드 Ruthazer 감사합니다. R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC)와 NIH P30 EY000785 (MC) 지원.

1. 설정 Electroporation을위한 장비 <ol><li> 전극 : 우리는 더몬트에게 전극으로 사용하기 # 5 포셉을 수정했습니다. <ol><li> 분리와 포셉을 따로 휴식. </li><li> 각 단자의 넓은 끝에 솔더 와이어. 전선 연결 및 절연 테이프와 접지 단자가 노출 접지 단자의 끝에 약 25~30밀리미터 떠나을 바꿈. </li><li> 스프링 동작을 제공하기 위해 두 접지 단자 사이에 적당한 플라스틱 스페이서 (예 : 단추)와 다시 함께 수정된 포셉 놔. </li></ol></li><li> 전기 장비 : 우리는 배달되는 펄스의 파형과 번호를 확인 electroporation과 오실로 스코프 및 오디오 모니터링에 대한 현재 펄스를 전달하기 위해 전기 자극기를 사용합니다. <ol><li> 또한 자극기와 직렬로 연결된 발을 페달에 포셉 중 한 단자에서 와이어를 연결합니다. 발 페달은 스위치 역할을합니다. 언제 우울 그것은 electroporation을 위해 회로를 완료합니다. </li><li> 다른 접지 단자에서 전기 자극기에 와이어를 연결합니다. </li><li> 오실로 스코프 및 오디오 모니터 자극기를 연결합니다. </li></ol></li><li> 설정 Micropipette 및 분사기 : 우리가 직접 망막에 염료 또는 DNA 솔루션의 아주 작은 볼륨을 삽입하는 날카로운 뽑아 유리 pipettes 및 Nanoinject II 연료 분사 시스템을 사용합니다. <ol><li> 3 축 micromanipulator에 마운트 인젝터 시스템. </li><li> 긴 테이퍼 작은 팁과 유리 pipettes을 당기세요. </li><li> 위로 (자세한 내용은 Nanoinect II 지침 설명서를 참조)을 광유 및 주입기 확보로 뽑아 피펫을 입력합니다. </li><li> 날카로운 microdissecting 가위를 사용하여이 작은 오프닝 (~ 2-3 μm의)를 작성, 피펫의 끝을 잘라. </li><li> 피펫의 팁을 통해 사출 솔루션의 원하는 금액으로 피펫을 입력합니다. 마찬가지로 긴 팁의 무결성이 유지로, 그것은 여러 주입과 동물에 사용할 수 있습니다. 참고 : I) 충분한 사출 솔루션 backfilled 미네랄 오일이 눈 안으로 주입되지 않습니다 그러한 조언에로드되어 있는지 확인. II) Nanoinject II 시스템과이 동영상에서 사용되는 특정 전자 장비는 RGCs의 성공 라벨 달성을위한 중요하지 않습니다. 같은 다른 일반적인 stimulators와 picospritzer과 electroporation과 같은 다른 장치로 만든 주사는 레이블 RGCs에도 사용할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 2. RGC 라벨링에 대한 플라스미드 솔루션 <ol><li> RGCs 작은 클러스터를 라벨의 경우 : 우리는 우리 편대의 편대 장 모터 (CMV 즉시 초기 확장기와 닭고기 β - 굴지 프로 모터)의 제어하에 구조 인코딩 EGFP를 (~ 2-3 μg / μL) 향상된 녹색 형광 단백질)을 사용합니다. EGFP는 세포막 (mut4EGFP) 12 그것을 대상으로 GAP - 43의 palmitoylation 순서 (성장 단백질 - 43 관련) 태그가 있습니다. 이 구조는 pCAG - gapEGFP이라고합니다. </li><li> 단세포 라벨의 경우 : 두 가지 구성의 조합을 사용합니다. 첫 번째 벡터는 Cre 호텔 recombinase (pCAG - Cre 호텔, Addgene [캠브리지, MA] 플라스미드 13775) 13 번째 벡터 EGFP (pCAG - LNL - gapEGFP)를 타겟으로 막 다음 floxed STOP 카세트를 포함 운전 편대의 편대 장 발기인이다. pCAG - Cre 호텔은 (~ 0.15-ng/μL) (의 미덕에 의해 세포의 소수에 강한 EGFP 식을 confining, pCAG - LNL - gapEGFP (~ 1-2 μgμL)보다 약 1,000-10,000 배 낮은 농도에서 사용 상대적으로 낮은 pCAG - Cre 호텔의 농도). </li></ol> 3. 망막 사출 및 Electroporation 프로토콜 <ol><li> P5 세 이상 쥐가 마취제 (4.28 MG / ML), xylazine (0.82 MG / ML)의 칵테일의 intraperitoneal 주사 (0.7 ML / kg)과 anesthetized하는 동안 출생 후의 일 P5의 새끼 0 (P0)는 저체온증으로 anesthetized 아르 하고, acepromazine (0.07mg/ml) 14. </li><li> 뜨거운 비드 살균기의 모든 수술기구 및 전극 팁 소독. 눈에 열 손상을 방지하기 위해 사용하기 전에 멸균 생리에 모두 연속적으로 냉각. </li><li> 절개 범위와 위치에 따라 인젝터 플레이스 마우스. </li><li> P14 (눈 열기 전에)보다 어린 생쥐의 경우, 수술 해부 마이크로 스프링 가위 B와 함께 미래를 여는 눈꺼풀의 전체 길이에 따라 절단하여 눈꺼풀을 엽니다. </li><li> 눈알 부분적으로 부드럽게 포셉 C의 도움말로 눈 주위에 압력을 적용하여 내다합니다. </li><li> 부드럽게 안구 주변의 피부를 곤란하게하여 장소에 시선을 잡아. </li><li> micromanipulator를 조정하고 안구에 가까운 피펫을 가지고. </li><li> 사출 솔루션의 몇 방울을 추방하기 때문에 피펫이 막힌 아니라는 것을 확인 Nanoinject II 시스템에 연결되어 보도 풋 페달. </li><li> 눈알을 안정화 한손으로, 유리 피펫의 끝은 망막 안료 상피를 통해 피어와 망막를 입력 이러한 micromanipulator 이동합니다. </li><li> 데스을 주사Nanoinject II 시스템을위한 발 페달을 눌러 솔루션을 ired 금액입니다. 예를 들어, 우리는 2.3 - 4.6nL의 단일 주사를 단일 RGCs 레이블을합니다. </li><li> 피펫을 접어야 조심스럽게 사출 현장에 직접 전극 팁을 배치하고 회로를 작성하여 눈을 electroporate에 자극기를위한 발 페달을 놓으면 되죠. 우리는 일반적으로 25V 강도, 50msec 기간, 간격 1sec의 설정을 사용하여 사각형 펄스를 사용합니다. 10 펄스 (각 극성의 5 펄스)이 P4보다 오래된 6 펄스 (각 극성 3 펄스)가 P3 마우스로 P0에 대해 적용되는 생쥐에 대해 적용됩니다. </li><li> 부드럽게 소켓에 다시 눈알을 밀고 컷 눈꺼풀 이상 살균 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 온도 제어 열 패드 및 적절한 rewarming와 이동성을 포함하여 완벽한 복구에 플레이스 동물은 그들의 어머니 동물을 반환합니다. </li><li> 동물에게 이러한 이동성의 손실, 신랑에 비정상적인 자세 또는 실패로 고통, 고통 또는 불편의 흔적을 위해 매 12 시간 모니터링합니다. 마취, 주사 및 electroporation의 반복 도는이 같은 동물에서 수행해서는 안됩니다. </li></ol> 4. 노트 <ol><li> 이 동영상에서 설명하는 주입의 방법은 '맹인'주입니다. 그것은 흰둥이 마우스 및 색상 솔루션 (DiI 또는 빠른 푸른 미량의와 플라스미드 용액)로 작업할 때 주입의 양과 위치를 시각화 할 수 있습니다. 그러나, 색소 쥐 종자와 함께 사출 위치 직접 시각되지 않을 수 있으며, 따라서 그것은 구두로 한 의도 망막 위치를 도달하거나 얼마나 하나가 특별히 RGC 계층을 대상으로 피펫으로 이동할지 여부를 설명하기가 어렵습니다. 따라서, 우리는 강력하게 이러한 주사는 망막에 즉시 시각 될 수 있기 때문에 첫번째 흰둥이 마우스의 DiI 주사와 함께 시작하는 새 사용자를 조언하고 RGC 망막에 투영 및 두뇌의 상표는 사출의 품질을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 초점 주사에 대한 N에서 10 % DiI, N - Dimethylformamide (100 %)를 준비합니다. 일단이 절차가 마스터는 사용자가 지속적으로 색소 생쥐의 명확한 DNA 플라스미드 솔루션 RGCs를 타겟팅할 수 있어야합니다. </li><li> 이 동영상에서 설명하는 주입의 방법은 retinotopy (4.6nL 라벨 몇 백 RGCS) 14을 공부하고 복합 fluorophores (Alexa555, 488 등)와 함께 대량 레이블 RGCs로하는 세포의 작은 인구를 라벨에 초점 DiI 주사를 만들기 위해 사용할 수 있습니다 콜레라 독소의 subunit B는 위의 10 electroporation 단계 제외한 눈 특정 분리를 연구하기 위해 서요. 모든 솔루션의 P14 미만 마우스에 대한 P14 1 - 2uL보다 나이가 생쥐를위한 2 - 3uL의 최대한의 총 주사 량을 권장합니다. </li><li> Pipettes는 인젝터에 피펫을 장착하고 팁을을 깨고 전에 광유와 backfilling하여 주입을 따라하는 솔루션 backfilled 수 있습니다. 피펫의 팁을에서로드하는 것은 매우 점성하고 어려운 일반적으로 높은 농도의 DNA 솔루션 (~ 6ug/uL), 사용할 때 특히 유용합니다. </li><li> 유리 피펫은 막힌되면, 염료 (DiI) 솔루션을위한 DNA 솔루션과 에탄올 (100 %) 물에 젖었을 면봉으로 피펫 팁을 조심스럽게 닦으십시오. </li><li> 눈에 주입 후 안구의 피펫 팁을 철회하고 다시 삽입하기 위해 발 페달을 누르십시오. 이것은 팁는 사출 과정에서 막힌 못 있는지 확인하는 것입니다. 어떤 해결 방법이 적절하지 않으면, 그것은 분사가 성공적으로 완료되지 않은 것을 매우 가능성이 높습니다. 그러나, 이것은 주사가 성공적으로 완료되지 않은 것을 절대 기호로 이동해서는 안됩니다. 여러 분사 사이트와 세포의 큰 숫자 라벨이 원하는 경우 실험자 다시 같은 눈을 주입 수 있습니다. </li><li> 단일 RGCs을 라벨 들어, Nanoinject 제어 상자에서 속도를 사출 속도를 설정합니다. 이것은 더 이상은 유리 pipettes의 동시 끝에이 안구에서 신속하게 철회하는 동안 시스템이 솔루션을 하는걸이 설정에 더 많은 시간을 소요로 망막에 주입 용액의 양을 줄여줍니다. </li><li> 그것이 (이것은 복구의 몇 일 후에 확실한되고, 눈이 정상보다 명백히 작은 경우) 눈에 손상을 매우 쉽게되어 있기 때문에 출생 후의 오늘의 Electroporation 0으로 3 (P0 P3)을 마우스 추가 관리가 필요합니다. 적용 및 전압 펄스의 수를 줄이는 것은 조기 신생아 생쥐에 대한 것이 좋습니다. P4 후, 눈알은 electroporation 피해에 더 탄력있다. </li><li> EGFP 또는 RFP 우리의 경험을 막 타겟 버전에서는 ( 'gapEGFP'가, 12 참조) 뇌로 retinofugal 계획을 조사를 위해 수정되지 않은 GFP보다 훨씬 월등합니다. 그러나, 수정을 대상으로 막을 부족 pCAG - tdTomato는 또한 잘 작동 (그림 1E). 또한, dextran 복합 형광 염료는 위에서 설명한 electroporation 프로토콜을 사용하여 레이블 RGCs하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 일반적으로, 10 주사 9 밖은 듀얼 플라스미드 방식으로, 표시 RGCs에 주사의 생각만이 약 15 %를 이끌 것이다표시되는 단 하나의 RGC의 결과. 성공적으로 가지 경우의 수는 한 눈에 여러 위치에 DNA를 주사하거나 각각의 눈 안으로 다른 형광 단백질을 인코딩 plasmids 주입을 증가 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 RGC 라벨은 electroporation 후 24 시간에 의해 RGCs에서 EGFP 라벨과 P2에서 P25에 이르기까지 모든 연령대에서 준수하고 transfection 후 최소한 세 주 동안 표정을 유지했다. 찬란 분류 dendrites (그림 1A, B)와 단일 RGCs의 axonal 아보스 (그림 1 층)은 명확하게 시각 및 복원하실 수 있습니다. 외에도 RGCs에서이 기술은 같은 수평 세포, 양극 세포 및 다양한 amacrine 세포 subtypes (그림 1C) 등 다른 망막 세포 유형을 분류하는 데 사용할 수 있습니다 이 방법은 SC (그림 1E)에서 정상 retinotopy에 의해 입증 시각적인지도를 다듬 는다 정상적인 시간 과정을 방해하지 않습니다. 모든 연령대에서에서 가지 경우 90 %, pCAG - gapEGFP의 작은 볼륨 분사 (~ 2.3 - 4.6nL)는 몇 RGCs (그림 1D)에 표현되었다. RGCs (그림 1A, B, D)와 같은 amacrine 같은 다른 세포 유형을 포함하는 하나의 망막 신경 세포의 라벨에 LED pCAG - Cre 호텔과 동물마다 pCAG - LNL - gapEGFP 조합 plasmids의 단일 주사를 사용하여 실험의 약 15 %에 세포 (그림 1C). <img src="/files/ftp_upload/2678/2678fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 - A, EGFP의 B. 예를 게시할 수 - 나탈 일 14 일 (P14)에서 평면 마운트 망막에있는 하나의 망막 신경절 세포를 (애로우 헤드가 축삭을 가리키는) 표시 P8에서 단일 스타 버스트 amacrine 세포의 C. 예 D.. . 오른쪽 눈이 인치 E. 도설 및 복부 RGCs P14에서 평면 마운트 망막에 RGCs 및 amacrine 세포를 포함하여 EGFP 분류 망막 뉴런의 클러스터는 electroporated와 EGFP와 왼쪽 눈 관자놀이와 복부 RGCs으로 표시 전기되었으며되었습니다 P1에서 tdTomato으로 표시. 라벨 RGCs에 의해 형성된 대상 지역 (별표)는 자신의 topographically 정확한 P9에서 SC의 위치 (전체 마운트, 흰색 개요)에서 볼 수 있습니다.에서는 RGC 아버 (2 - D 투영)라는 하나의 EGFP의 F. 예은 SC의 화살 섹션 (250 μm의 두께) (점선). 지혜로움에 대해에 이미지 (D)와 (F) 변환되었습니다 그레이 스케일과 반전합니다. 스케일 바 (μm의) : (A) - (D), (F) : 100, (E) : 500

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 비디오에서 우리는 생체내의 electroporation 프로토콜에을 입증되는 형광 단백질을 인코딩 DNA 구조와 출생 후의 생쥐의 망막 뉴런의 단일 또는 작은 클러스터의 라벨을 초래합니다. 이전 연구 그 electroporation 정상 RGC 축삭 아버 상세 검색을 방해하지 않았 의미, lipophilic 염료와 RGC 라벨을 사용하는 것과 dLGN와 SC에 찬란 분류 RGC 예측의 작은 클러스터는 유사한 프로젝션 패턴을 재현. 우리는 정상과 방해 영상지도와 함께 다양한 마우스 모델에서 단일 및 RGCs 그룹 모두의 수준에 retinotopic지도를 분석하는이 프로토콜을 이용합니다. 우리의 결과는 출생 후의 망막에있는 차별화된 망막 신경이 안정적으로 생체내 electroporation을 사용하여 transfected 수있다는 것을 보여준다. 생체내 electroporation 프로토콜의 출생...

<table border="1"><tbody><tr><th> 자료 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 더몬트 # 5 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> 전기 자극기 </td><td> 그라스 악기 </td><td> 모델 S4 </td></tr><tr><td> 오실로 스코프 </td><td> 애질런트 </td><td> 모델 54621A </td></tr><tr><td> 오디오 모니터 </td><td> 그라스 악기 </td><td> 모델 AM8B </td></tr><tr><td> 끌어당기는 것 </td><td> 서터 인 스트 루먼트 </td><td> 모델 P - 97 </td></tr><tr><td> Vannas 가위 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 14,003 </td></tr><tr><td> 마이크로 가위 B </td><td> 테드 펠라 </td><td> 1347 </td></tr><tr><td> 더몬트 AA 집게 C </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11210-20 </td></tr><tr><td> II 시스템 Nanoinject </td><td> 드루먼드 과학 </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> 유리 Pipettes </td><td> 드루먼드 과학 </td><td> 3 - 000-203 - G / X </td></tr><tr><td> 풋 페달 </td><td> 드루먼드 과학 </td><td> 3-000-026 </td></tr><tr><td> 미네랄 오일 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M3516 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen </td><td> D - 383 </td></tr><tr><td> N, N - Dimethylformamide </td><td> 시그마 </td><td> D4551 </td></tr></tbody></table>

마우스 망막 신경절 세포 transfection로 생체내에 electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

midbrain에 RGC 예측의 대상 및 개선 개발하는 동안 신경 연결 양식의 방법은 정확한 패턴을 공부에 대한 인기있는 강력한 모델 시스템입니다. 생쥐에서 retinofugal 전망은 시상 및 우수 Colliculus (SC)의 래터럴 Geniculate 핵의 지형 방식과 양식 눈 특정 레이어 (dLGN)에 정렬됩니다. retinofugal 예측 이러한 정확한 패턴의 개발은 일반적으로 같은 양고추냉이 퍼옥시데이즈 1-4로 형광 염료와 추적기와 RGCs의 인구를 분류하여 연구되었습니다. 그러나 이러한 방법은 retinotopic지도 형성의 기초있는 개별 RGC axonal 아버 형태의 발달 변화에 대한 통찰력을 제공하기 위해 너무 거칠어. 또한 RGCs의 유전자 조작에 대한 허용하지 않습니다. 최근 electroporation은 망막 5-11로 청구 분자의 제공을위한 정확한 공간과 시간적 제어를 제공하는 효과적인 방법이되었다. 현재 망막 electroporation 프로토콜은 유전자 조작을 허용하고 출생 후의 생쥐에 RGCs의 단일 또는 작은 클러스터의 retinofugal 예측을 추적하지 않습니다. 그것은 생체내의 electroporation에 출생 후의이 상표 효율이 매우 낮은이기 때문에 RGCs를 transfecting위한 가능한 방법이 아니므로 그러므로 RGC progenitors가 분화 및 증식 6 겪고 아르 배아 연령 타겟팅에 필요하다는 주장했습니다. 이 비디오에서 우리는 타겟 유전자의 전달, shRNA, 및 postnatally murine RGCs에 형광 dextrans에 대한 생체내의 electroporation 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술은 분기, 라미네이션, 재생 및 회로 개발의 다양한 단계에서 버렸네 형성, 축삭의 철회를 포함한 신경 발달의 여러 측면에 관련된 후보 유전자의 효율적인 심사를위한 빠르고 효율적인 비용과 상대적으로 쉬운 플랫폼을 제공합니다. 요약 우리는 여기에 감각지도 개발을 기본 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 것입니다 가치있는 도구를 설명합니다.

우리는를 보여<em&gt; 생체내에</em망막 신경절 세포 (RGCs)과 연령대의 넓은 범위에서 출생 후의 생쥐의 다른 망막 세포 유형의 단일 또는 소규모 클러스터를 transfecting위한&gt; electroporation 프로토콜. 라벨과 유전 출생 후의 RGCs를 조작하는 능력<em&gt; 생체내에</em&gt; 발달 연구를위한 강력한 도구입니다.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

중뇌로 향하는 망막 신경절 세포(RGC) 투사의 타겟팅 및 정교화 과정은 신경...의 정밀한 패턴이 어떻게 형성되는지를 연구하기 위한 대중적이고 강력한 모델 시스템입니다.

다음 실험의 전반적인 목적은 생후 마우스의 생체 내(in vivo) 전기천공법을 사용하여 단일 또는 소수의 망막 신경절 세포에 형질전환을 유도함으로써 망막 신경 투사의 발달을 연구하는 것입니다. 이는 안구를 외과적으로 노출시킨 후 소량의 플라스마 DNA 용액을 망막에 직접 주입함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로, 주입 부위 바로 위의 안구 표면에 전극을 배치하고 전기 펄스를 가하여 플라스마 DNA가 망막 뉴런으로 전달되도록 합니다.다음으로, 원하는 연령이 되면 전기천공된 망막과 뇌를 적출하여 형질전환된 망막 신경절 세포와 중추신경계(CNS)로의 투사를 시각화합니다. 그 결과, 다양한 피질하 표적 구조에서 표지된 망막 신경절 세포의 수지상 돌기와 축삭 ARB 모두가 형광 표지된 것을 확인할 수 있습니다. 자궁 내 망막 전기천공법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 침습성이 낮으며, 시신경 교차에서의 교차와 같은 초기 축삭 유도 과정에 영향을 주지 않는다는 점입니다. 또한, 이 방법은 정밀한 공간적 및 시간적 제어를 통해 출생 후 생쥐의 소수 또는 단일 망막 신경절 세포를 표지할 수 있게 해줍니다.전기천공법용 전극을 제작하려면, dumont 5번 포셉 한 쌍에서 한쪽 프롱을 제거한 다음, 각 프롱의 하단에 전선을 납땜합니다. 전선이 연결된 하단부를 절연 테이프로 감고, 프롱 사이에 플라스틱 스페이서를 끼워 스프링 작용이 가능하게 합니다. 전극 조립이 완료되면, 한쪽 프롱의 전선을 전기 자극기와 직렬로 연결된 풋 페달에 연결합니다.풋 페달을 누르면 전극을 통해 전류가 흐릅니다. 다음으로, 다른 프롱의 전선을 전기 자극기에 연결하십시오. 마지막으로, 전기 자극기를 오실로스코프와 오디오 모니터에 연결하십시오.피펫 풀러를 사용하여 벤치의 3축 마이크로 매니퓰레이터에 인젝터 시스템을 장착하십시오. nano Inject Two와 함께 제공된 니들을 사용하여 테이퍼가 길고 팁이 작은 유리 피펫을 제작하십시오. 제작된 피펫에 미네랄 오일을 역충전(backfill)한 후 마이크로 인젝터에 고정하십시오.날카로운 미세해부 가위를 사용하여 장착된 피펫의 끝부분을 잘라 2~3 µm 크기의 구멍을 만듭니다. 열린 끝부분을 통해 주입액을 빨아들여 피펫을 채웁니다.생후 4~5일 된 마우스 퍼프(pops)를 저체온법으로 마취합니다. 발가락 꼬집기 검사를 통해 마취 상태를 확인합니다. 마취된 마우스를 해부 현미경 아래에 두고, 미세 해부 가위로 향후 눈꺼풀 개구부가 될 길이 방향을 따라 절개하여 눈꺼풀을 외과적으로 엽니다. 핀셋으로 안와 주변에 부드럽게 압력을 가하여 안구를 돌출시킵니다.마이크로 조작기를 조정하여 피펫을 안구 근처에 위치시킵니다. 한 손으로 미세주입 시스템의 풋 페달을 눌러 피펫 팁이 막히지 않았는지 확인합니다. 다른 한 손으로는 핀셋을 사용하여 안와 주변의 피부를 집어 돌출된 안구를 고정합니다.마이크로 조작기를 이동시켜 피펫이 망막 색소 상피를 관통하여 망막으로 진입하게 합니다. 풋 페달을 눌러 원하는 양의 용액을 분주한 후, 피펫을 회수하고 전극 팁을 주입 부위 바로 위에 배치합니다. 안구 표면에 닿도록 안구 양측에 배치한 후, 자극기에 연결된 풋 페달을 눌러 회로를 완성하고 안구에 전기 자극을 줍니다.안구를 소켓 안으로 조심스럽게 밀어 넣고 절개 부위에 안연고를 도포합니다. 생쥐가 의식을 회복할 때까지 36°C로 유지되는 가열 패드 위에 올려두었다가, RG CS가 형질전환된 개체만 어미에게 돌려보냅니다. Cre Recombinase와 flock stop EGFP를 코딩하는 두 플라스미드 모두 발현이 가능합니다.EGFP 단일 세포 라벨링은 상대적으로 낮은 농도의 Cree 플라스미드를 사용하여 달성됩니다. EGFP로 라벨링된 단일 망막 신경절 세포, 세포 수지상 돌기 및 축삭은 평평하게 펼친 망막(flat mount retina)에서 시각화할 수 있습니다. 스타버스트 오미크론 세포(starburst omicron cells)와 같은 다른 망막 세포 유형 또한 이 기술로 라벨링할 수 있습니다. 여기에서는 생후 14일째 평평하게 펼친 망막에서 RG CS 및 오미크론 세포를 포함하여 EGFP로 라벨링된 망막 뉴런 클러스터의 예를 확인할 수 있습니다.이 기술을 사용하면, 숙련된 경우 동일한 생쥐의 전체 마운트 상구(superior colliculus)에서 4가지 주요 망막 좌표 모두의 RG CS 망막 주제 표적화를 분석할 수 있습니다. 적절하게 수행한다면 이 기술은 4~5분 만에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 플라스마 DNA와 같은 용액을 출생 후 망막에 국소 주입하는 방법과 전기천공법을 이용해 망막 뉴런을 생체 내(in vivo) 전이시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

transfection-mouse-retinal-ganglion-cells-vivo

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기에서 망막 신경절 murine 세포 (RGCs)의 유전자 발현을 조작 두 가지 기법을...

마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 Electroporation에

이 프로토콜은 explant의 electroporation을 통해 마우스 망막 생활 CIS - 규제 요소의 활동 (즉, 확장기 / 발기인)를 수치 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. DNA의 준비, 망막 절개, electroporation, 망막 explant의 문화, 포스트 고정 분석과 부량이 설명되어 있습니다.

의 활동을 Quantifying CIS</emExplant Electroporation하여 마우스 망막에서> - 규제 요소

이득 또는 기능 연구의 손실 중 하나를 수행하기위한 목적으로 murine 망막 세포에 플라스미드 DNA의 결합을위한...

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

이 문서는 그대로 마우스 망막에서 찬란 태그의 연결 인구에서 각각의 세포의 녹음을 묘사. 두 광자 여기 적외선을 사용하여 transgenetically 라벨이 세포들은 빛의 반응, 수용 필드 속성 및 형태학을 연구하기 위해 패치 - 클램프 녹음 대상으로했다.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

조건부 성인 zebrafish의 망막에서 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법은 intravitreally 안티 센스 morpholinos를 주입하여 망막에 그들을 electroporating 포함하는, 설명되어 있습니다. 그 결과 단백질은 재생이나 그대로 망막에있는 단백질의 역할을 테스트 수 며칠에 대한 무너뜨렸다입니다.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

이 비디오의 전반적인 목표는 타겟 망막 주사를 수행하는 방법을...

배아 칙의 망막에서 비켜 Electroporation에

출처: Denaxa, M., el al., 초기 출생 후 마우스 뇌에 화학유전적으로 조작된 피질 중간 뉴런 전구 세포의 이식. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 관심 유전자를 운반하는 플라스미드 벡터를 배아 뇌 절편의 중간 뉴런 전구 세포에 주입한 후 플라스미드 진입 및 유전자 발현을 위한 전기천공법을 시사하는 절차를 보여줍니다. 이러한 변형된 전구 세포는 나중에 뇌 장애 치료에 사용될 수 있습니다.

마우스 피질 중간 뉴런 전구세포에서 아가로스 포매 전기천공 보조 유전자 전달

이 절차는 자궁 내 전기천공법을 통해 발달 중인 마우스 전뇌의 인터뉴런을 표적으로 삼는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 피질의 표재층으로 향하는 중간뉴런 아형에서 선택적 유전자 발현을 달성하는 데 특히 효율적이었습니다.

두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로

배아 병아리 망막 세포 배양은 광 수용체 생물학의 연구에 유용한 도구를 구성한다. 우리는 이전에 배양 망막의 플라스미드 일렉트로 오보 EX에 기초한 효율적인 유전자 전달 기술을 개발했다. 이 기술은 상당히이 시스템에 대한 가능한 유전자 조작을하고, 현재 사용 가능한 프로토콜을 통해 형질 전환 효율을 증가시킨다.

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 : 전 비켜 Electroporation에 접근

이 프로토콜은, 해부 실험 조작과 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법을 설명합니다. 높은 성공률, 효능 및 재현성은 전기 및 / 또는 시약의 물질, 즉, 효소 억제제 플라스미드의 효과를 테스트하기 위해 필요할 때 이식편 배양 물은 유용하다.

일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants

망막하 주사는 광수용체 및 RPE 질환에 대한 치료제의 전임상 개발에 없어서는 안 될 기술입니다. 우리는 수술 중 성공률을 향상시키고 망막 손상을 최소화하는 마우스에서 최적화된 경공막 망막하 주사 기술을 설명합니다.

마우스에서 최적화된 최소 침습 경공막 망막하 주사 기술

배우세요 마우스 망막 신경절 세포의 생체내 전기천공법을 이용한 유전자 전달 기법을. 이 방법은 시각계 발달 연구와 망막 생물학 연구에 정확한 시공간 제어를 제공합니다.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

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