Tali 이미지 기반 Cytometer를 사용하여 GFP의 표현과 생존 능력의 평가
2011년 11월 17일
이 프로토콜은 Tali 이미지 기반 Cytometer를 사용하여 세포 생존 능력과 형광 표현 assays를 수행하는 방법을 설명합니다.
이 동영상은 탈리 이미지 기반 세포분석기를 사용하여 GFP를 발현하는 세포에서 세포 생존율을 측정하는 절차를 보여줍니다. GFP 형질도입된 세포는 모든 사세포를 프로피듐 요오드화물로 붉게 염색하는 탈리 생존도 키트 사세포 빨간색을 사용하여 염색하고, 세포를 탈리 세포 분석 슬라이드에 피펫으로 삽입하여 명시야와 적색 및 녹색 형광 이미지를 획득하고 분석하는 세포분석기에 로드합니다. 그런 다음 히스토그램을 생성하여 기존 유세포 분석과 비교할 때 세포 수, 세포 크기, PI 형광 강도 및 GFP 형광 강도를 표시합니다.
Tali는 세포 생존율 및 발현에 관한 유사한 데이터를 제공할 수 있습니다. 그러나 이 이미지 기반 세포 분석은 검사 중인 세포 집단에 대한 추가적인 시각적 정보를 제공합니다. 유세포 분석 또는 형광 현미경 검사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 탈리 이미지 기반 유세포 분석기가 세포 샘플에 대한 정량적 및 시각적 정보를 동시에 제공한다는 것입니다.
또한 탈리 기기는 유세포 분석기 또는 형광 현미경보다 사용하기 쉽고 저렴하며 설치 공간이 작습니다. 이를 통해 연구자는 벤치탑에서 세포를 발현하는 GFP의 생존율과 같은 정량적 분석을 신속하게 수행할 수 있습니다. 이 절차에서, 밀리리터당 6개 세포의 농도가 1배 1인 U2 OS 세포를 핵 표적 세포 광 GFP 바이러스 구조체로 형질전환하여 프로피듐 요오드화물로 죽은 세포를 유지하고, 세포 현탁액 100마이크로리터를 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 전달했습니다.
1 곱하기 10에서 5번째 농도, 10 곱하기 10 곱하기 밀리리터당 7번째 세포의 농도가 분석에 권장되지만 농도가 정확할 필요는 없습니다. 다음으로, 1마이크로리터의 탈리 데드 셀 레드 시약을 추가합니다. 그런 다음 염색 시약과 세포 혼합물을 잠시 혼합하고 실온에서 1-5 분 동안 암흑 속에서 배양합니다.
배양 후 즉시 탈리 이미지 기반 세포분석기에 대한 분석을 진행하십시오. 이 집계는 기기용으로 특별히 설계된 일회용 플라스틱 세포 분석 슬라이드를 사용합니다. 슬라이드를 로드하려면 항상 슬라이드의 가장자리를 잡으십시오.
25마이크로리터의 샘플을 반달 모양의 샘플 로딩 영역 중 하나에 천천히 피펫팅합니다. 여기서, 염색되지 않은 nont 형질도입 대조 세포는 챔버 A에 로드되고 염색된 GFP 발현 세포는 챔버에 로드 B.To GFP 발현 세포에서 생존율 분석을 수행하고 세포분석기의 홈 화면에서 G-F-P-R-F-P를 터치합니다. 그러면 분석 옵션이 오른쪽에 나타나고 GFP와 생존력을 선택합니다.
그런 다음 기기는 샘플 시리즈의 이름을 지정하기 위해 샘플 시리즈의 이름을 지정해야 하는지 여부를 묻습니다. 지금 이름을 누릅니다. 그런 다음 터치 스크린을 사용하여 샘플 시리즈의 이름을 입력하고 저장을 누르면 집계 세포분석기가 자동으로 측정 화면으로 이동합니다.
다음으로, 배경 형광을 측정하려면 여기에서 볼 수 있듯이 측정 화면의 오른쪽 하단에 있는 배경 탭을 누릅니다. 기본 설정은 9개의 셀 필드가 이미지화됨을 나타냅니다. 이제 제어 샘플이 기기에서 반대쪽을 향하게 하고 슬라이드가 멈출 때까지 로딩 포트에 슬라이드를 삽입합니다.
배경 화면에 힘을 가하지 마십시오. 터치를 눌러 얼룩지지 않은 새 셀 컨트롤을 삽입하십시오. 슬라이드가 자동으로 기기로 당겨지고 셀의 라이브 이미지가 화면에 표시됩니다. 초점 손잡이를 사용하여 초점을 맞추는 동안 세포를 적절한 시야로 가져옵니다.
빨간색 확대/축소 버튼을 4 x 또는 16 x로 밉니다. 세포 집단을 더 잘 보려면 세포가 균일하게 어둡고 각 세포 주위에 밝은 후광이 있어야 합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 셀의 배경과 가장자리 사이의 전이가 흐릿하여 셀 경계가 잘 정의되지 않은 경우 셀이 과소 계산될 수 있습니다.
세포는 중심이 밝고 둘레가 어두울 때 과도하게 계수될 수 있습니다. 세포에 초점이 맞춰지면 터치하고 눌러 염색되지 않은 세포 제어를 실행합니다. 배경 형광을 측정하기 위해 세포 분석기는 자동으로 이미지를 캡처하고 각 시야의 썸네일을 표시합니다.
진행률 표시줄은 분석의 지속적인 업데이트를 제공합니다. 이미지 캡처가 완료되면 세포분석기는 자동으로 슬라이드를 배출하고 캡처된 이미지 분석에서 데이터를 제공합니다. 저장된 데이터는 백그라운드 탭의 드롭다운 메뉴에 표시됩니다.
배경 대조군 샘플에는 실험에 지정된 것과 동일한 이름이 할당됩니다. PI 염색된 GFP 형질주입 샘플을 실행하려면 기기에서 슬라이드를 제거하고 뒤집은 다음 형질주입된 샘플이 기기 반대쪽을 향하도록 하여 다시 삽입합니다. s를 누르십시오ample 탭을 누른 다음 누르기를 터치하여 새 s를 삽입합니다.amp르.
이미지가 화면에 나타나면 초점 노브를 사용하여 셀에 초점을 맞춥니다. 이전과 마찬가지로 터치 누름을 실행하여 sample. 이미지 캡처가 완료되면 분석 데이터가 샘플 탭 아래에 나타나고 유세포 분석기가 슬라이드를 적절하게 자동으로 배출합니다.
탈리 세포 분석 슬라이드를 폐기합니다. 생물학적 유해 폐기물로서 이러한 슬라이드는 재사용할 수 없습니다. 샘플이 실행되면 샘플에 임계값을 적용할 수 있습니다.
여기에서 특정 세포 집단을 분석하기 위해 임계값을 조정하여 살아있는 세포와 죽은 세포의 비율을 결정합니다. Sample 탭 아래의 GFP 발현 세포에서 GFP 살아있는 세포를 발현하는 세포와 GFP 총 생존율을 발현하는 사세포의 수와 비율. 평균, 세포 크기, 계수된 세포 수 및 세포 농도가 표시됩니다.
또한 세포 크기, 녹색 형광 및 적색 형광을 표시하는 히스토그램 플롯이 화면 하단에 표시됩니다. 셀 크기 게이트를 설정하려면 셀 크기 썸네일을 터치하여 셀 크기 히스토그램을 열고 이물질을 제외합니다. 파란색 슬라이더 막대를 이동하여 큰 이벤트와 작은 이벤트를 모두 제외합니다.
적용을 터치하여 게이트 내의 셀을 포함합니다. GFP 형광을 분석에 추가하려면 GFP 히스토그램 썸네일을 터치합니다. 그것을 엽니다.
파란색 슬라이더 막대를 이동하여 가장 어두운 피크의 바로 오른쪽에 임계값을 설정합니다. 컨트롤 샘플을 가이드로 사용합니다. 이를 통해 분석에 GFP 양성 세포는 포함하지만 자가형광 세포는 제외할 수 있습니다.
자가형광은 세포 내의 생물학적 분자가 터치 적용을 능가하고 확인하고 이전 화면으로 돌아갈 때 자주 관찰됩니다. Sample 탭 아래에 표시되는 데이터는 이제 두 형광 채널에 대해 설정된 게이트와 임계값을 반영해야 합니다. 다음으로, PI 염색 세포를 자가형광 또는 샘플에 존재하는 배경에서 분리하려면 PI 히스토그램 썸네일을 눌러 다시 엽니다.
제어 샘플 피크는 히스토그램에 회색 피크로 표시됩니다. 빨간색 피크는 샘플 형광입니다. 배경 형광은 이 기기에서 0 RFU 값에 가장 가까운 피크로 표시됩니다.
PI 채널에서 배경 형광을 제거하려면 파란색 슬라이더 막대를 이동하여 임계값을 조정하십시오. 이 피크를 제외하려면 컨트롤 샘플의 회색 피크를 참조로 사용하십시오. PI 채널의 임계값이 적절하게 설정되면 적용을 터치하여 확인하고 이전 화면으로 돌아가면 탈리 기기가 다시 자동으로 데이터를 다시 분석하고 샘플 탭에서 결과를 업데이트합니다.
다음으로, 각 셀이 제대로 할당되었는지 시각적으로 확인하려면 확대/축소 탭을 누른 다음 이미지의 썸네일을 눌러 검토할 캡처된 시야를 선택합니다. 그런 다음 레이어 탭을 누릅니다. 그런 다음 GFP 또는 PI 버튼을 눌러 해당 채널을 통해 캡처된 이미지를 표시합니다.
동일한 버튼을 다시 눌러 디스플레이에서 레이어를 제거하거나 레이어를 중첩하려면 각 채널에 해당하는 터치 버튼을 눌러 특정 채널을 통해 셀이 계산되는 방식을 식별합니다. 터치 서클은 형광을 발현하지 않는 명시야 채널을 통해서만 계수된 세포가 파란색 원으로 표시됩니다. 이는 특정 세포가 녹색 채널에서 발현하는 살아있는 세포임을 나타냅니다.
GFP는 빨간색 채널에서 발현되는 녹색 세포로 원형으로 표시됩니다. 파이로 염색된 것은 빨간색으로 원으로 표시되며 둘 다에서 계산된 죽은 세포입니다. 빨간색과 녹색 채널은 노란색 원으로 표시됩니다.
이것은 세포가 GFP를 발현하지만 pi로 염색되어 죽어 있음을 나타냅니다. 때때로 화면에 검은색 원이 나타납니다. 이들은 식별되었지만 세포 크기에 따라 분석에서 제외된 개체입니다.
형광을발현하는 각 세포가 적절한 색상으로 원으로 표시될 때까지 방금 설명한 단계를 사용하여 형광 히스토그램의 임계값을 계속 미세 조정합니다. 모든 분석 파라미터는 기기에 자동으로 저장됩니다. 데이터 아래에서 탭합니다.
집계는 500개의 샘플 실행에서 데이터 파일을 저장할 수 있습니다. 데이터 탭에 저장된 각 파일은 재분석에 사용할 수 있습니다. 데이터 탭에서 파일을 선택하면 파일이 다시 열리고 모든 히스토그램과 레이어가 활성화되어 데이터를 보관하고 보고서를 생성합니다.
기기에 저장된 데이터는 USB 드라이브를 사용하여 컴퓨터로 전송할 수 있습니다. 4가지 대표적인 세포 유형을 핵 표적 세포 광으로 형질도입하고, dead cell red 시약을 사용하여 tally viability kit로 염색한 GFP 바이러스 구조체를 사용하여 transduction하고 여기에 표시된 바와 같이 유세포 분석기에서 tally로 분석했습니다. 두 방법 다 GFP를 발현하고 있는 각 세포 유형을 위한 집단의 대략 동일한 백분율을 viable하고 GFP를 발현하는 총 인구의 백분율과 함께 보고했습니다.
이러한 데이터는 Tali 유세포분석기가 집단의 총 GFP 발현과 살아있는 집단의 GFP 발현을 구별할 수 있음을 보여줍니다. 탈리 이미지 기반 유세포 분석기를 사용하여 세포 샘플의 형광 발현 및 생존율을 평가하는 방법을 시연했습니다. 이 기술은 개별 세포 연구와 집단 세포 연구 간의 격차를 해소합니다.
탈리 이미지 기반 유세포 분석기를 사용하면 개별 세포와 더 큰 세포 집단에 대한 정량적 및 정성적 시각적 정보를 수집할 수 있습니다. 동일한 절차를 사용하여 세포사멸, RFP 발현 및 세포 생존율을 포함한 여러 다른 분석을 수행할 수 있습니다.비발현 세포의 경우, 잠재적인 응용 분야에는 약물 효능 연구에 대한 유전자 발현 평가가 포함됩니다.
개요
이 프로토콜은 Tali 이미지 기반 사이토미터를 사용하여 세포 생존율 및 형광 발현 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 통해 연구자들은 정량적 및 시각적 데이터로 세포 집단을 분석할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 형광 현미경
- 사이토미터리
배경
- Tali 이미지 기반 사이토미터는 기존의 유세포 분석법에 대한 대안을 제공합니다.
- 정량적 및 시각적 데이터를 동시에 획득할 수 있습니다.
- 이 방법은 사용자 친화적이고 비용 효율적입니다.
- GFP 발현 세포를 분석하는 데 적합합니다.
연구 목적
- GFP 발현 세포의 세포 생존율을 평가합니다.
- 이미지 기반 사이토미터리의 전통적 방법에 비한 장점을 입증합니다.
- Tali 이미지 기반 사이토미터 사용을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
사용된 방법
- GFP를 이용한 U2 OS 세포의 형질주입.
- Tali Dead Cell Red 시약을 사용한 염색.
- Tali 세포 분석 슬라이드에 샘플을 로드합니다.
- 분석을 위한 Tali 이미지 기반 사이토미터 사용.
주요 결과
- 세포 생존율 및 GFP 발현에 대한 정량적 데이터.
- 세포 집단의 시각적 표현.
- 세포 크기 및 형광 강도를 표시하는 히스토그램.
- 전통적 유세포 분석법과 결과 비교.
결론
- Tali 이미지 기반 사이토미터는 세포 생존율 평가에 효과적입니다.
- 세포 집단에 대한 추가 시각적 통찰력을 제공합니다.
- 이 방법은 연구 환경에서 벤치탑 사용을 위해 접근하기 쉽습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
The Tali Image-Based Cytometer bridges the gap between flow cytometry and fluorescence microscopy by delivering simultaneous quantitative and visual data for cell viability and GFP expression assays. This dual-output capability supports early discovery workflows where phenotypic confirmation and mechanistic de-risking require both population-level metrics and single-cell visualization. Its benchtop footprint, lower cost, and simplified operation enable decentralized use across discovery biology and assay development teams, reducing reliance on core facilities and accelerating go/no-go decisions in target validation pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating GFP expression with viability status in live-cell populations.
- Operational Value: Provides visual confirmation of transfection efficiency and protein localization alongside quantitative viability readouts.
- Predictive Value: Supports target confidence by distinguishing total GFP expression from expression in viable cells, reducing false-positive leads.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized histograms for cell size, PI fluorescence, and GFP intensity, enabling threshold-based gating for reproducible population analysis.
- Scalability: Processes thousands of cells per sample with consistent imaging and algorithmic analysis, supporting medium-throughput screening campaigns.
- Workflow Integration: Outputs are compatible with downstream analytics for hit selection and lead optimization in phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains assay consistency from discovery validation to preclinical models by providing comparable viability and expression data to flow cytometry.
- Mechanistic De-risking: Visual layering of brightfield, GFP, and PI signals confirms co-localization of transgene expression and cell death, clarifying mechanism of action.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by quantifying the fraction of live, transgene-expressing cells in heterogeneous populations.
Pipeline & Workflow Integration
The Tali cytometer fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification, where simultaneous viability and reporter gene assessment informs compound effects on cellular health and target engagement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking GFP reporter activity to cell survival, clarifying on-target versus off-target effects.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence and viability outputs with visual validation, enhancing assay reproducibility and hit confirmation.
- Analytics: Provides histogram-based readouts for cell size, GFP intensity, and PI intensity, enabling statistical comparison across conditions and replicates.
- Translational Research: Ensures data continuity with preclinical workflows by mirroring flow cytometry outputs while adding visual context for mechanistic interpretation.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared benchtop platform for multiple assays (viability, GFP/RFP expression, apoptosis), maximizing instrument utilization across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through correlated visual and quantitative data.
- Operational Value: Standardizes assay execution via disposable slides and automated image analysis, improving reproducibility and reducing user variability.
- Strategic Value: Accelerates discovery timelines by enabling rapid benchtop iteration without flow cytometry scheduling constraints.
- Portfolio Impact: Supports risk-based prioritization by quantifying live, transgene-positive cells, improving the quality of advancement candidates.
Implementation Considerations
- Requires basic training in fluorescence microscopy principles and threshold gating for fluorescence and scatter parameters.
- Depends on the Tali Image-Based Cytometer, Tali Cellular Analysis Slides, and Tali Viability Kit - Dead Cell Red reagent for PI-based viability detection.
- Necessitates standardization of staining protocols, incubation times, and focus procedures across users and sites for consistent results.
- Adaptation to other model systems may require optimization of cell concentration and staining conditions due to variations in size and autofluorescence.
- Practical limitations include inability to perform multi-parameter immunophenotyping beyond three channels and incompatibility with adherent cell assays without dissociation.
