세포에서 방출되고 세포에 결합하는 인간 표피 성장 인자 수용체 2의 포괄적인 측정을 위한 검증된 면역화학 분석

우리는 시험관 내 배양 세포 및 환자 샘플에 대해 HER2 단백질의 세포 결합 및 방출된 세포외 도메인을 정밀하게 정량화할 수 있는 새로운 단클론 항체를 사용하여 검증된 샌드위치인 ELISA를 제시합니다.

이 프로토콜은 진단 및 연구에서 순환 HER2 단백질의 농도를 질병 임상 증상과 연관시키기 위한 정확하고 검증된 분석의 필요성을 해결합니다.

분석의 광범위한 작업 범위, 다양한 샘플 유형 및 결과의 신뢰성은 시험관 내 및 생체 내 모델에서 수용체 상태를 포괄적으로 분석할 수 있는 새로운 기회를 열어줄 수 있습니다.

개발된 ELISA는 암 조직에서 혈액, 복막액 또는 점액과 같은 다양한 인체 배설물로 방출되는 HER2를 정량화하는 데 사용될 것입니다.

[강사] 시작하려면 트립신을 사용하여 세포가 80% 합류에 도달한 후 세포를 분리하고 별도의 15밀리리터 원뿔형 튜브에 수집합니다. 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수한 후 1밀리리터의 성장 배지가 있는 12웰 플레이트에 웰당 5개의 세포의 거듭제곱으로 10의 세 번 시드합니다. 5% 이산화탄소를 함유한 가습 분위기에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 24시간 배양에서 각 세포주의 한 웰에서 배양 배지를 1.5밀리리터 튜브로 수집합니다. 수집된 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 10,000G에서 원심분리하고 상청액을 섭씨 영하 20도에서 보관하기 위해 새 튜브로 옮깁니다. 각 웰의 나머지 세포를 1밀리리터의 차가운 PBS로 세척하고 부드럽게 흡인한 다음 PBS를 버립니다. 그런 다음 1% 프로테아제 억제제가 보충된 200마이크로리터의 RIPA 완충액을 각 웰에 넣고 5분 동안 배양합니다. 이제 세포 스크레이퍼로 세포를 긁어내고 균질화하기 위해 여러 번 피펫팅하여 용해물을 혼합합니다. 용해된 세포를 새 튜브에 모으고 0.8 x 40mm 크기의 21 게이지 바늘이 장착된 2밀리리터 주사기로 샘플을 천천히 흡인합니다. 5-10회 흡인 후, 수집된 시료를 섭씨 4도에서 10분 동안 10,000G에서 원심분리한 후 상청액을 섭씨 영하 20도에서 보관하기 위해 새 튜브로 옮깁니다. 항-HER2 포획 항체를 코딩 완충액에서 밀리리터당 1마이크로그램으로 희석합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 96웰 ELISA 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 포획 항체 용액을 추가합니다. 밀봉 필름으로 플레이트를 덮습니다. 접시를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 플레이트를 수평 마이크로플레이트 셰이커에 실온에서 1시간 동안 놓습니다. 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 코팅 용액을 흡인하고 각 웰을 300마이크로리터의 PBST로 세 번 세척합니다. 그런 다음 다중 채널 피펫을 사용하여 PBS에 5% 무지방 분유를 함유한 100마이크로리터의 차단 완충액을 코팅된 각 웰에 첨가하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 이제 검량선과 양성 대조군을 준비합니다. 밀리리터당 1밀리그램 2마이크로리터, HER2 원액을 1,998마이크로리터의 PBS에 첨가하여 밀리리터당 1000나노그램의 작동 표준 용액을 만듭니다. 표준 2의 경우 표준 1 500마이크로리터를 PBS 500마이크로리터에 넣고 밀리리터당 50나노그램 농도를 달성하도록 완전히 혼합합니다. 표준물질 3-7을 생성하기 위해 연속 희석을 준비합니다. 다음으로, PBS 세포 용해물과 알려진 HER2 농도로 스파이크된 배양 배지를 사용하여 매트릭스 샘플을 준비합니다. 세포 용해물을 2.5마이크로리터의 용해물과 5밀리리터의 PBS로 1에서 2000으로 희석하여 검출 한계 미만의 HER2 수준을 얻습니다. 밀리리터당 2나노그램 용액을 준비하려면 표준 1 마이크로리터 8 마이크로리터를 PBS 배양 배지 또는 세포 용해물 392 마이크로리터에 넣고 완전히 혼합합니다. 단일 채널 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 표준 PBS 블랭크를 추가하고 샘플을 코팅 및 차단된 ELISA 플레이트의 해당 웰에 각각 세 번 테스트합니다. 습도 챔버에서 섭씨 37도에서 1시간 후 마이크로플레이트 와셔를 사용하여 플레이트를 세척합니다. 항체 결합을 검출하려면 PBS에서 비오티닐화된 검출 항체를 밀리리터당 1마이크로그램의 작동 농도로 희석합니다. 그런 다음 다중 채널 피펫을 사용하여 이 검출 항체 용액 100마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 다음으로 AVID 및 HRP 접합체 1을 40,000 밀리리터의 PBST 40 밀리리터에 희석합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 희석된 접합체 100마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 배양하고 세척한 후 다중 채널 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 3,3 5,5 테트라메틸벤지딘 기질을 각 웰에 첨가하여 컬러 메트릭 반응을 시작합니다. 그런 다음 밀봉 필름으로 플레이트를 덮습니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 1-5분 동안 배양하여 색상 발현을 모니터링하면서 빛으로부터 보호합니다. 원하는 색상 강도에 도달하면 각 웰에 100마이크로리터의 정지 용액을 추가하여 반응을 종료합니다. 마지막으로 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 4개의 파라미터 검량선을 사용하여 곡선 방정식을 기반으로 시료 농도를 계산합니다. 개발된 샌드위치인 ELISA는 밀리리터당 1.56에서 100나노그램의 HER2 단백질에 대한 작동 범위를 입증했으며 결정 계수는 1로 우수한 매칭을 나타냅니다. 배양 배지의 HER2 농도는 72시간에 가장 높은 값을 가진 모든 테스트된 세포주에 대해 시간이 지남에 따라 증가했습니다. SK-OV-3 및 SK-BR-3 세포는 24시간 동안 배양 배지에서 MDA-MB-231 세포에 비해 각각 약 10배 및 50배 더 높은 HER2 농도를 나타냈습니다. 유사하게, 용해물의 HER2 수준은 SK-OV-3 및 SK-BR-3에 대해 각각 약 3배 및 5배 더 높았습니다. 흥미롭게도, 세포 배양 배지는 전체 세포 용해물에서 발견되는 막 결합 단백질에 비해 1000배 낮은 농도의 테스트 항원을 함유했습니다.