Name: 중개 연구를 위한 High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assay (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 고처리량 자동화 다중 면역형광 분석법으로 FFPE 조직의 세포 유형을 프로파일링하는 방법입니다. 이 프로토콜은 공간 단백질체학 연구에서 재현성과 효율성을 높여 중개 연구에 활용할 수 있습니다.

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<ol><li>McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+research+applications+of+multiplexed+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> J Pathol. 254 (4), 405-417 (2021).</li>
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고도의 다중화 면역형광(mIF)은 단일 조직 섹션 내에서 여러 단백질 바이오마커를 동시에 시각화할 수 있도록 하여 조직 분석 분야에 혁명을 일으키고 있는 고급 기술입니다 1,2. 이 기능은 타의 추종을 불허하는 수준의 세부 정보와 공간 해상도를 제공하며, 이는 여러 공간 규모에 걸쳐 조직 미세환경 내에서 복잡한 형태를 가진 세포 유형 간의 상호 작용을 이해하는 데 종종 중요합니다3. 이 기술은 종양 바이오마커, 단백질 약물 표적, 국소 면역 및 체크포인트 상태, 서로 다른 세포 유형 간의 상호 작용, 심지어 조직 내 약물 대사와 관련된 세포 내 공동 국소화 패턴을 공동 국소화하는 데 사용할 수 있는 종양학 연구에서 특히 가치가 있습니다 4,5,6.
잠재력에도 불구하고 대부분의 mIF 기술은 특히 다중화 기능과 감도 및 처리량의 균형을 맞추는 데 있어 여전히 중요한 문제에 직면해 있습니다. 이러한 제한은 HER2 및 PD-L1과 같이 매우 낮은 발현을 보일 수 있는 임상 바이오마커의 검출에 특히 중요합니다 7,8,9. 그 이유를 확인하려면 mIF의 다른 방식을 이해하는 것이 중요합니다. 이러한 전통적인 방법은 보다 정교한 mIF 플랫폼을 위한 길을 열었지만 고유한 장점과 한계가 있습니다.
직접 면역형광(DIF)은 형광단 또는 형광단을 모집할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 직접 접합된 항체를 사용합니다10. 이 방법은 멀티플렉스에 간단하지만 감도가 낮고 조직 배경 또는 염색 아티팩트의 신호를 분해하는 데 어려움이 있습니다.
간접 면역형광(IIF)은 1차 항체에 결합하는 2차 항체를 사용합니다. 이는 1차 기반 DIF에 비해 신호가 증가했습니다. 개선된 플로우 셀(flow cell) 설계와 결합하면 순차 IIF는 한 번의 분석에서 최대 40개의 바이오마커를 검출할 수 있습니다 2,11. 그러나 이러한 기술은 면역조직화학(IHC) 기술에서 볼 수 있는 것과 같은 신호 증폭을 위한 효소 기반 전략에 비해 민감도가 상대적으로 부족합니다.
효소 촉매 기반 면역형광은 발색(DAB) 또는 형광 염료 증착(예: 티라미드 신호 증폭(TSA))을 위해 양고추냉이 과산화효소(HRP)를 사용하는 IHC 방법에서 가장 자주 볼 수 있습니다. 이러한 분석은 동일한 촉매 효소를 기반으로 하기 때문에 검출 감도가 유사하여 다중 스펙트럼 TSA 기반 mIF 분석이 임상 응용 분야에 적합합니다 2,12. DNA 기반 신호 증폭의 장점은 우수한 신호 증폭 및 모듈성을 유지하면서 높은 수준의 다중화가 가능하다는 것입니다. 반면, HRP 기반 방법은 모듈화가 덜 되고 최적화가 어렵기 때문에 추가 패널 개발 및 테스트 주기가 필요합니다.
DNA 바코드 항체 면역형광 여기에서 시연된 mIF 분석은 DNA 중합효소를 사용하여 DNA 바코드 항체를 동시에 증폭한 다음, 이미징 라운드당 4개의 형광 올리고뉴클레오티드를 사용하여 리포터 프로브 염색 및 탈색 주기를 수행합니다(그림 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig01.jpg"> 
그림 1: 멀티플렉스 면역형광 분석 프로토콜의 그래픽 그림. 바코드 접합 항체는 한 단계로 추가되며 바코드는 동시에 증폭됩니다. 각 사이클에 4개의 형광 프로브 그룹이 추가되어 4개의 마커를 한 번에 시각화할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 single-round 항체 추가 및 single-step 증폭은 분석 프로토콜을 크게 단순화합니다. 이 공정은 자동화된 고처리량 염색 및 스캐닝 시스템을 통해 촉진되며, 이는 임상 연구에 활용된 많은 수의 샘플에 걸쳐 슬라이드 간 및 배치 간 모두에서 재현 가능한 결과를 보장합니다13.
이 기술의 주요 장점 중 하나는 광범위한 다중화를 허용하면서 높은 감도를 유지할 수 있다는 것입니다2. 또한 워크플로우는 이미징 처리량이 높게 유지되도록 보장하여 임상 연구를 위한 고도로 멀티플렉싱된 mIF 기술(예: &gt; 8개의 바이오마커)의 주요 한계 중 하나를 해결합니다. 이는 환자 전반에 걸쳐 저농도 약물 표적(예: 낮은 HER2)의 미묘한 차이가 치료 반응에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있는 임상 연구에서 특히 중요합니다.
이러한 주요 속성 외에도 이 분석은 패널 구성 가능성, 고처리량 전체 슬라이드 이미징 기능, 대식세포 및 수지상 세포와 관련된 세포 돌출부뿐만 아니라 세포 내 프로세스 및 구획을 조사하는 데 필요한 광학 해상도를 제공합니다. 여러 공간 규모에 걸쳐 복잡한 세포 표현형을 조사할 수 있는 능력은 질량 세포 분석(IMC) 기반 분석법과 광학 이미징의 중요한 이점입니다2.
이 작업에서는 오토스테인너와 전체 슬라이드 스캐너를 사용하여 8-plex mIF 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석에는 CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 및 pan-Cytokeratin14의 8가지 1차 항체 패널이 포함됩니다. 이 마커 패널을 통해 종양 조직의 면역 프로파일링과 종양 또는 기질 환경에서 발견되는 세포를 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기 염색 및 프로브 교환 라운드에 자동 슬라이드 염색기를 사용하며 염색 및 이미징은 2일 이내에 완료할 수 있습니다. mIF 분석을 검증하고 결과 이미지를 분석하는 방법도 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>항-CD3</td><td>Ultivue</td><td></td><td>클론 BC33(BioCare). ULT50801</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone SP35(Abcam)의 일부입니다. ULT50801</td></tr><tr><td>항-CD68</td><td>Ultivue</td><td></td><td>클론 KP1(BioCare)의 일부입니다. ULT50801</td></tr><tr><td>항-CD8</td><td>Ultivue</td><td></td><td>클론 C8/144B(BioCare)의 일부입니다. ULT50801</td></tr><tr><td>항-사이토케라틴 + 항-SOX10</td><td>Ultivue</td><td></td><td>클론 AE1/AE3(Bethyl Labs) 및 BC34(BioCare)의 일부입니다. 혼합물로 제공되는 ULT50801의 일부</td></tr>: <tr><td>Anti-FOXP3</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone 236A/E7(Thermo). ULT50801</td></tr><tr><td>항-PD1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>클론 CAL20(Abcam)의 일부입니다. ULT50801</td></tr><tr><td>항-PDL1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>클론 73-10(Abcam)의 일부입니다. </td></tr><tr><td>Axioscan.Z1 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td>의 일부ULT50801 <td>형광 현미경 텍스트 본</td></tr>드 <tr><td>탈랍 용액</td><td>라이카</td><td>AR9222</td><td></td></tr><tr><td>본드 에피토프 회출 용액 2</td><td>라이카</td><td>AR9640</td><td></td></tr><tr><td>본드 오픈 용기, 30mL</td><td>라이카</td><td>OP309700</td><td></td></tr><tr><td>본드 연구 검출 키트</td><td>라이카</td><td>DS9455</td><td></td></tr><tr><td>본드 적정 인서트</td><td>라이카</td><td>OPT9049</td><td></td></tr><tr><td>본드 적정 키트</td><td>라이카</td><td>OPT9719</td><td></td></tr><tr><td>본드 유니버설 커버타일</td><td>라이카</td><td>S21.4611</td><td></td></tr><tr><td>본드 세척액 10x 농축액</td><td>라이카</td><td>AR9590</td><td></td></tr><tr><td>BondRX 자동 염색기</td> 라이<td>카</td><td></td>는 <td>텍스트에서 "자동 염색기"라고 불립니다</td></tr>. <tr><td>BondRX 소프트웨어</td><td>라이카</td><td></td><td>버전 6.0 이상</td></tr><tr><td>커버슬립, #1.5 두께</td><td>Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 200 프루프</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>FFPE 조직 블록</td><td>BioIVT</td><td></td><td>조직 유형은 다양합니다</td></tr><tr><td>. OmniVUE 8-plex 분석(CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, pan-Cytokeratin/SOX10)</td><td>Ultivue</td><td>ULT50801</td>에는 <td>다른 모든 Ultivue 성분이 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Boston BioProducts</td><td>C-9911F</td><td>(pH 7.4, 2.7mM KCl 및 137mM NaCl)</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo</td><td>P10144는</td> Ultivue UltiAnalyzer.AI UltiStacker.AI Ultivue Ultivue <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplification Buffer</td><td>Ultivue</td> 텍스트에서 "마운팅 매체"라고 불립니다.<td></td><td></td></tr><tr><td>ULT50801 Ultivue 항체 희석제</td>의 일부 <td>Ultivue Ultivue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultivue Exchange 완충액</td>ULT50801 <td>Ultivue Ultivue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exchange Initiator</td>의 일부 <td>Ultivue</td><td></td> ULT50801 <td>ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Exchange Neutralizer</td>의 일부 <td>Ultivue</td><td></td><td>ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue 형광 프로브 1</td><td>Ultivue</td>의 일부<td></td><td>ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue 형광 프로브</td>의 일부 2 <td>Ultivue</td><td></td><td>ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Pre-Amplification Mix</td>의 일부 <td>Ultivue Ultivue</td><td></td> Probe의 일부 <td></td></tr><tr><td>Buffer</td><td>Ultivue</td><td></td> ULT50801 <td>ULT50801</td></tr><tr><td>초순수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr>의 일부</tbody></table>

중개 연구를 위한 high-throughput automated multiplex immunofluorescence assay

High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assays for Translational Research

위의 프로토콜에 따라 FFPE 조직은 여러 표적으로 염색되고 4개 그룹의 모든 마커에 대한 고품질 이미지가 얻어졌습니다(그림 3A, B). 이미지 공동 정합 소프트웨어를 사용하면 그림 3C에서 볼 수 있듯이 동일한 슬라이드의 이미지를 결합하고 공동 정합할 수 있습니다. 그림 4 에는 결장직장암(CRC) 조직 슬라이드에 대한 유사한 결과가 나와 있습니다.
프로토콜의 성공 여부는 예상되는 염색 패턴을 평가하여 결정해야 합니다. 도시된 CRC 예시에서, 염색된 각 표적은 예상되는 세포 내 구획(subcellular compartment)에서 발현됩니다(예: 핵 FoxP3, 막질 CD3, 세포질 CD68)(그림 4B-D). PD1 및 CD3 또는 PDL-1 및 CD68의 공동 국소화 예에서 알 수 있듯이 각 기능 표적은 적절한 세포 유형에 따라 발현되며, 이는 각각 소진된 T 세포와 면역 억제 대식세포를 보여줍니다. 양호한 신호 대 배경 비율의 평가는 일반적으로 병리학자 또는 이미지 분석 전문가가 정성적으로 수행하여 염색 품질을 확인하여 성공적인 이미지 분석을 가능하게 합니다. 염색 품질 및 성능을 추가로 확인하기 위해 연속 절편에 대한 골드 스탠다드 IHC(발색 DAB)와의 비교를 추가할 수 있으며(그림 5의 예 참조) 대부분의 면역 표적에 대해 염색 실행의 성공을 확인하는 데 유용할 수 있는 인간 편도선과 같은 양성 대조군 조직 샘플을 추가할 수 있습니다. 암은 인간 편도선보다 표적의 발현이 낮을 수 있다는 점에 유의하라16.
결과를 정성적으로 확인한 후 정량 분석을 수행할 수 있습니다. 이 연구에서는 주로 특정 표적을 발현하는 다양한 표현형(세포 수/mm2)의 세포 밀도를 계산하고 광범위한 발현 범위를 보여줄 수 있는 기능적 표적의 평균 강도 수준을 계산하는 것으로 구성됩니다. mIF 분석의 정밀도를 평가할 때 동일한 마커로 염색된 연속 절편은 그림 6에서 정성적으로 볼 수 있듯이 슬라이드 간에 유사한 신호를 표시해야 합니다. 다양한 조직 유형에서 단일 마커 밀도의 정량적 결과의 예가 그림 7에 나와 있습니다. 이러한 이미지에 대한 이미지 분석을 통해 양성 세포를 식별할 수 있으며, 각 마커에 대해 해당 양성 세포 밀도와 양성 세포당 평균 신호 강도를 계산할 수 있습니다. 이를 통해 각 마커에 대해 변동성 계수(CV)를 계산하여 다중화 분석의 정밀도를 평가할 수 있습니다(표 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig03.jpg"> 
그림 3: 8-plex 면역형광 프로토콜에서 연속적인 염색 라운드에서 얻은 TMA(Tissue Microarray) 코어의 이미지. (A) 마커 CD8, PD1, PD-L1 및 CD68을 특징으로 하는 첫 번째 이미징에서 얻은 이미지. 교환 프로토콜 후, (B)는 마커 CD3, CD4, FoxP3 및 CK/SOX10의 두 번째 라운드에 대한 동일한 슬라이드에 대한 두 번째 이미징을 보여주고, (C)는 이미지 (A) 및 (B)를 결합한 공동 등록 이미지를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig04.jpg"> 
그림 4: 8-plex 면역형광 염색을 통한 대장암(CRC) 조직의 대표적인 염색. 이 그림은 동일한 세포에서 여러 표적을 공동 국소화하여 식별할 수 있는 세포 표현형을 보여줍니다. (맨 위) CRC 조직의 전체 슬라이드 이미지. (아래) (A) T-reg 세포(CD3+/CD4+/FOXP3+), (B) 종양 및 기질 내 PD-1 및 PD-L1 발현 세포, (C) 소진된 세포독성 T 세포(CD3+/CD8+/PD-1), (D) 면역 회피 종양 세포(PD-L1+/CK+) 및 면역 억제 대식세포(CD68+/PDL1+). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig05.jpg"> 
그림 5: 면역조직화학(IHC)과 면역형광(IF) 염색의 정성적 비교. 단일 마커 면역조직화학 염색(DAB, 맨 윗줄), 단일 마커 면역형광(ISP monoplex) 및 다중 면역형광의 단일 채널 보기(ISP multiplex)로 염색된 연속 절편은 다양한 염색 방법 간의 정성적 일치를 보여줍니다. 스케일 바 = 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig06.jpg"> 
그림 6: 연속 단면 염색. (A) 다조직 TMA의 레이아웃을 보여주는 다이어그램. (B) TMA에서 각 조직 유형의 조직 코어의 대표 8-plex 이미지. (C) 한 번의 실행으로 염색된 6개의 연속 TMA 절편에 걸친 편도선의 CD8 대표 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig07.jpg"> 
그림 7: TMA에 포함된 조직 유형별 단일 마커 밀도 정량화. 조직당 밀도는 TMA 슬라이드에서 각 조직 유형의 3개 대표 코어에 걸친 평균 밀도입니다. y축은 x축의 다양한 조직 유형에서 단일 마커 밀도를 양성 세포/mm2 단위로 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig08.jpg"> 
그림 8: 이 프로토콜에 설명된 증폭된 ISP mIF와 간접 IF를 비교하는 상대 형광 신호의 관심 영역(ROI) 분석. (A) 5개의 ROI가 표시된 CK(왼쪽) 또는 PD-L1(오른쪽)에 대해 염색된 대표 슬라이드. (B) CK(위)와 PD-L1(아래)의 대표적인 ROI 이미지. 각각 100μm x 100μm를 측정하고 약 200개의 셀을 포함하는 5개의 ROI에서 (C) CK 및 (D) PD-L1에 대해 증폭된 mIF(보라색) 및 간접 IF(파란색)로 달성한 평균 신호 강도. Y축 값은 임의의 형광 단위를 나타내고 오차 막대는 표준 편차(n=3)를 나타냅니다. (E) 증폭된 ISP mIF(보라색) 및 간접 IF(파란색)로 달성된 상대 신호 강도는 모든 ROI에서 평균 간접 IF 신호에 대한 평균 증폭된 mIF 신호의 비율을 취하여 계산되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 4: 계산된 분산 계수(CV). 편도선 이미지에 대한 positive cell density와 mean signal intensity의 CV는 그림 6에 나와 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/Table04_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

중개 연구를 위한 High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assay

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연구

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작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

자세한 프로토콜 6-마커 멀티플렉스 면역 형광 패널 최적화 수행 위한 더 일관 된 결과를 짧은 절차 시간 자동된 염색기를 사용. 이 방법은 종양 면역 연구에 대 한 모든 실험실에 의해 직접 적응 될 수 있다.

포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널

여기 우리는 다중 형광 immunohistochemical 얼룩 및 여러 암 관련 항 림프 종에서의 동시 지역화에 대 한 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 모든 조직 섹션에서 생체의 colocalization 분석을 확장할 수 있습니다.

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이 기사에서는 이미지 분석 및 공간 분석과 결합된 수동 티라마이드 신호 증폭(TSA) 다중 면역형광(mIF)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 실험실에서 사용할 수 있는 슬라이드 스캐너에 따라 슬라이드당 2-6개의 항원을 염색하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 섹션과 함께 사용할 수 있습니다.

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수동 IBEX 방법을 사용하여 저비용의 다목적 광조사 기술을 구현하면 상당한 네이티브 자가형광으로 인체 조직을 최적으로 이미징할 수 있습니다. 이 프로토콜은 도립 현미경, 널리 사용 가능한 시약 및 이미지 정렬 및 처리를 위한 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 보관된 임상 샘플에서 다중화된 전체 슬라이드 이미지를 얻는 방법을 자세히 설명합니다.

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생체 내 노화 마커의 공간 평가를 위한 다중화 면역형광 분석법

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