중개 연구를 위한 High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assay

우리는 빠르고 민감한 다중 면역형광 분석을 위한 키트를 개발하고 있습니다. 여기서 목표는 연구자들이 FFPE 조직에 나타나는 다양한 세포 유형을 프로파일링하도록 돕는 것입니다

면역형광은 일반적으로 염료 표지 또는 과산화효소 표지 2차 항체를 사용하여 수행됩니다. 면역조직화학은 플렉스가 낮은 경향이 있습니다. 염료 표지 2차 항체는 신호가 낮습니다. 티라마이드 신호 증폭 분석은 최적화하는 데 힘들고 실행하는 데 몇 시간에서 며칠이 걸립니다.

분석의 마커는 사전 최적화되어 제공되며 다른 기술보다 훨씬 빠릅니다. 4개의 마커를 세우는 데는 8시간도 채 걸리지 않으며, 4개의 바이오마커가 추가될 때마다 약 3시간이 더 걸립니다.

다중 면역형광을 더 빠르게 실행할 수 있는 능력은 공간 단백질체학을 보다 널리 적용할 수 있게 하고 조직의 공간적 질감을 이해하는 데 장벽을 줄일 것입니다.

[해설자] 시작하려면 모든 키트 시약을 실온에서 해동합니다. 항체 접합체, 증폭 효소, 교환 개시제 및 교환 중화제는 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 해동된 항체 희석제인 Vortex. 항체 희석제를 용기에 피펫팅합니다. 잠시 원심분리하여 모든 항체를 항체 염색액 1 용기에 첨가합니다. 제공된 항체 희석액을 1 내지 100 희석으로 첨가한다. 그런 다음 피펫을 사용하여 소용돌이를 피하면서 용액을 부드럽게 혼합합니다. 해동 후 사전 증폭 혼합 용액을 소용돌이치어 완전히 혼합합니다. 그런 다음 용액을 해당 혼합 용기에 추가합니다. 증폭 완충액을 소용돌이치고 피펫은 증폭 효소를 혼합합니다. 증폭 완충액에서 증폭 효소를 1 대 10 비율로 희석하여 증폭 완충액을 만듭니다. 소용돌이를 피하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합하십시오. 그런 다음 제공된 핵 대책 용액을 소용돌이 및 원심분리하고 초순수에 1에서 100으로 희석합니다. 다음으로, 형광 프로브 1 용액을 프로브 버퍼에 1 대 20 비율로 희석합니다. 전체 시약 봉을 기기에 삽입하여 시약 부피를 측정할 수 있습니다. 모든 시약이 준비되면 자동 염색기 소프트웨어 상단의 슬라이드 설정 탭으로 이동합니다. 연구 추가 버튼을 클릭하고 필요에 따라 연구 ID, 연구 이름 및 연구 주석을 입력합니다. 분배 용량에서 150마이크로리터를 선택하고 준비 방법으로 *Dewax 4 Steps를 선택합니다. 드롭다운에서 사용할 수 없는 경우 프로토콜 설정 메뉴를 열고 기본 확인란을 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 연구가 생성되면 슬라이드 설정 화면의 오른쪽에 있는 슬라이드 추가 버튼을 클릭합니다. 슬라이드 주석 아래에 슬라이드의 고유한 이름을 입력합니다. 적절한 필드에서 조직 유형을 테스트 조직으로 설정합니다. 그런 다음 디스펜스 볼륨으로 150마이크로리터를 선택하고 염색 모드를 왼쪽 드롭다운에서 단일로, 오른쪽 드롭다운에서 루틴으로 설정합니다. Process(프로세스)에서 IHC(IHC)를 선택하고 Marker(마커)를 항체 염색 용액으로 설정합니다. 슬라이드 추가 창의 프로토콜 섹션에서 염색을 위한 염색 분석 1, 준비를 위한 *탈랍 4단계 및 HIER용 ER2를 사용한 *HIER 20분을 선택합니다. 효소 프로토콜을 별표 대시로 설정한 상태로 두고 모든 필드가 완료되면 슬라이드 추가를 클릭합니다. 모든 슬라이드를 추가한 후 슬라이드 추가 창을 닫고 슬라이드 라벨을 인쇄하여 각 라벨을 해당 티슈 섹션에 부착합니다. 라벨이 붙은 각 슬라이드를 트레이에 넣고 각 조직 섹션 위에 커버 타일을 놓습니다. 슬라이드 트레이를 기기에 삽입하고 소프트웨어 화면 오른쪽에서 해당 자동 염색기를 선택합니다. 3개의 슬라이드 트레이와 벌크 및 준비된 시약을 포함한 모든 시약 정보가 모두 표시되는지 확인합니다. 벌크 시약 용기가 적절하게 채워졌는지, 폐기물 용기에 실행을 완료하기에 충분한 부피가 있는지 확인하십시오. 그런 다음 재생 버튼을 눌러 염색 실행을 시작하고 절차가 완료되면 자동 염색기에서 슬라이드를 적시에 제거하도록 합니다. 염색된 슬라이드를 PBS 완충액에 넣고 마운팅 매체를 사용하여 커버 슬립을 도포합니다. 형광 현미경 또는 분석 염료와 호환되는 필터가 있는 전체 슬라이드 스캐너를 사용하여 슬라이드를 이미지화합니다. 교환 분석의 경우 교환 완충액을 실온에서 해동합니다. 교환 중화제와 교환 개시제는 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. 시약 적정 용기 2개를 준비하고 교환 프로토콜 중에 사용할 검출 키트를 회수합니다. 교환 버퍼를 소용돌이치게 합니다. 그리고 피펫은 교환 개시제를 혼합합니다. 필요한 양의 교환 개시제와 교환 완충액을 혼합하여 지정된 용기에 교환 용액을 준비합니다. 피펫팅만으로 내용물을 혼합하십시오. 이제 형광 프로브 2 용액을 각 용기에 희석된 교환 완충액과 결합합니다. 프로브 버퍼와 형광 프로브 혼합 및 피펫만 최종 용액을 소용돌이치게 합니다. 준비된 모든 시약과 함께 전체 시약 봉을 자동 염색기에 놓습니다. 기계가 모든 시약에 대해 딥 테스트를 수행할 수 있도록 합니다. 슬라이드를 추가한 후 마커를 *음수로 설정합니다. 그리고 Preparation, HIER 및 Enzyme의 경우 교환 프로토콜에 탈랍 또는 항원 회수가 필요하지 않으므로 별표 대시 옵션을 선택합니다. 완료되면 슬라이드 추가를 클릭합니다. 모든 슬라이드가 추가된 후 슬라이드 추가 창을 닫고 각 해당 조직 섹션에 부착할 슬라이드 라벨을 인쇄합니다. 트레이를 자동 염색기에 넣기 전에 각 슬라이드를 트레이에 넣고 각 조직 섹션 위에 커버 타일을 놓습니다. 이제 재생 버튼을 눌러 실행을 시작합니다. 8-플렉스 면역형광 프로토콜을 사용하여 두 번의 염색 라운드에 걸쳐 캡처된 조직 마이크로어레이 코어의 이미지는 각 라운드에서 뚜렷한 면역 마커를 보여주었으며, 두 라운드를 통합된 복합물로 결합한 성공적인 이미지 공동 등록을 보여주었습니다. 대장암 조직의 전체 슬라이드 이미징을 통해 조절 T 세포, 고갈된 T 세포 및 면역 억제 대식세포를 포함한 마커의 공동 국소화를 기반으로 면역 표현형을 식별할 수 있었습니다. 면역형광 염색은 조절 T 세포에서 CD3, CD4 및 FoxP3의 공동 발현을 보여주었습니다. 종양 및 간질 세포의 PD1 및 PDL1. 고갈된 세포독성 T 세포의 CD3, CD8 및 PD1. 면역 억제 대식세포의 CD 68 및 PDL1. 단일 마커 면역조직화학과 단일 또는 다중 면역형광의 비교는 모든 마커에 걸쳐 염색 패턴의 질적 일치를 확인했습니다. 다양한 조직 유형에 대한 연속 절편 염색은 대표적인 조직 코어를 가진 면역 마커의 일관된 발현 패턴을 확인하여 성공적인 염색과 최소한의 변동성을 보여주었습니다. CD8에 대해 6개의 연속 슬라이드에서 염색된 편도선 절편은 모든 이미지에서 거의 동일한 신호 분포로 높은 재현성을 보여주었습니다. 조직 유형에 걸친 마커 양성 세포 밀도의 정량화는 편도선과 림프절에서 가장 높은 밀도를 보여주었고 흑색종과 결장에서 가장 낮은 밀도를 보여주었습니다.