Name: 수동 멀티플렉스 형광 면역성 화학의 최적화, 설계 및 함정 방지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 배우세요 수동 멀티플렉스 형광 면역조직화학법으로 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에서 여러 세포 유형을 동시에 시각화하는 방법을 익히세요. 이 기법은 종양 미세환경에서 면역 세포와 암 세포의 공간적 상호작용을 연구하는 데 필수적입니다.

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저자는 원래 멀티 플렉스 얼룩의 설정 및 최적화에 대한 그의 도움, 퍼킨 엘머에서 이전에 에드 스택에 감사드립니다. 저자는 또한 분석 소프트웨어를 사용하여 팁 아코야 바이오 사이언스에서 크리스틴 슈미트에게 감사하고 싶습니다. 이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 P30CA046592의 밑에 건강의 국가 암 학회에 의해 지원되었습니다, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA1515807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 추가 지원은 제프리 A. 콜비 결장암과 톰 리우 기념 연구 기금에 의해 제공되었다.

모든 작업은 미시간 대학의 내부 검토 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 1 차 항체 및 슬라이드 준비 최적화
<ol><li>기존의 IHC를 사용하여 멀티플렉스용 항체의 이상적인 농도를 결정합니다.<ol>
<li>기존의 면역화학(IHC) (IHC)13을수동하여 멀티플렉스에 대한 항체를 시험한다.</li>
<li>CD3 항체 시험을 위해 편도선 조직을 사용하는 것과 같이 시험된 각 항체를 위한 풍부한 세포 모형이 있는 특정 조직을 사용하십시오.</li>
<li>회사에서 권장하는 IHC에 대한 기준 농도를 사용한 다음 권장 농도 와 권장 농도 이하의 농도에서 항체 농도로 IHC를 완료하십시오.</li>
</ol>
</li>
<li>슬라이드에 포르말린 고정 파라핀 내장 조직을 준비합니다.<ol>
<li>마이크로토메를 사용하여 FFPE 조직의 블록을 4~6 μm 두께로 자르고 충전된 슬라이드에 적용합니다. 참고: 증류수를 사용하면 멀티플렉스 전체에 적절한 조직 장착 및 준수가 보장됩니다.</li>
<li>슬라이드를 평평하게, 티슈 쪽을 위로 올려 놓고, 밤새 37°C에서 건조시키십시오.</li>
<li>멀티플렉스를 완료할 준비가 될 때까지 슬라이드 상자에 극단적인 온도에서 멀리 보관하십시오.</li>
</ol>
</li>
</ol>2. 일반적인 염색 방법
<ol><li>세척 및 항원 회수 솔루션의 준비<ol>
<li>9L의 탈이온수, 1L의 트리스 완충식염수(TBS) 및 10 mL의 폴리소르베이트 20을 혼합하여 0.1% TBST의 세척 용액을 준비한다.</li>
<li>항원 회수 액(pH 6 및 pH 9) 모두 준비; 재료표) 탈이온수로 1배로 희석하여</li>
</ol></li>
<li>탈파화 및 수화<ol>
<li>하이브리드화 오븐에서 1 시간 동안 60 °C에서 평평하게 누워있는슬라이드를 굽습니다. 오븐에서 슬라이드를 제거하고 적어도 5-10 분 동안 식힌 다음 수직 슬라이드 랙에 놓습니다.</li>
<li>다음 용액에서 슬라이드를 순차적으로 처리한다: 삼중항에 자일렌, 100% 에탄올, 95% 에탄올, 및 마지막으로 70% 에탄올을 슬라이드염색 세트를 사용하여 10분 동안 단일 처리한다.</li>
<li>30 분13에 대한 중립 버퍼 드 포르말린으로 채워진 플라스틱 슬라이드 상자에 침수에 의해 고정 다음 플라스틱 슬라이드 상자에 침수에 의해 탈이온 물로 2 분 동안 슬라이드의 랙을 씻어. 탈이온수에서 슬라이드를 2분 간 세척한 다음 항원 회수를 진행합니다.</li>
</ol></li>
<li>항원 회수<ol>
<li>슬라이드 랙을 pH 6 또는 pH 9 항원 회수 버퍼가 있는 내부 라인(약 300mL)에 채워진 내열 상자에 넣습니다. 참고: 항원 회수 완충제는 pH 6 또는 pH 9일 수 있으며 이는 에피토프당 최적화되어야 할 수도 있다. 그러나, 핵 에피토프및 pH6에 결합하는 항체에 대해 다른 모든 항체에 대해 pH 9를 사용하여 시작한다.</li>
<li>비닐 랩으로 상자를 덮고 고무 밴드를 사용하여 고정하십시오. 상자를 회전 판 가장자리의 전자레인지에 넣습니다(전자레인지는 가열을 위해 인버터 기술을 갖추어야 합니다). 100 % 전력에서 45 s의 슬라이드를 가열한 다음 20 % 전력13에서15 분 동안 가열하십시오. 참고: 전자레인지 처리는 사용되는 전자레인지에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.</li>
<li>슬라이드를 약 15-20분 동안 식힙니다.</li>
</ol></li>
<li>차가운 슬라이드 동안 항체와 형광단의 작동 솔루션을 준비합니다.<ol>
<li>0.5 g의 소 혈청 알부민 과립을 TBST의 50 mL로 용해시킴으로써 1차 항체 희석제를 준비한다. 또는, 과립을 용해시키기 위해 1x 인산완충식염수(PBS)의 50 mL를 사용한다.</li>
<li>각 1차 항체 작동 액을 제1절에서 결정된 최적화된 농도로, 1차 항체 희석제에서 만든다. 슬라이드당 약 200 μL을 예상합니다.</li>
<li>1:100의 농도로 불소 희석제내의 각 형광포를 희석시켜 형광공 작용액을 준비한다. 참고: 이것은 항체에 따라서 낙관한되어야 할 수도 있습니다. 슬라이드당 약 100 μL을 예상합니다.</li>
<li>염색의 마지막 날에, 준비 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) TBST의 1 mL에 DAPI의 3 방울을 추가 하 여 작업 솔루션.</li>
</ol></li>
<li>슬라이드 염색(세탁 및 차단)<ol>
<li>냉각 후 전자 레인지에서 상자를 제거하고 플라스틱 랩을 벗고 2 분 동안 탈이온물로 슬라이드를 씻은 다음 TBST13을채워진 플라스틱 슬라이드 상자에 2 분 세척하십시오.</li>
<li>각 슬라이드를 섬세한 작업으로 티슈 주위로 건조한 후 조직이 마르지 않도록 조심스럽게 닦아 내고 소수성 장벽 펜을 사용하여 조직 외부를 추적합니다. 섬세한 작업 으로 티슈를 만지지 마십시오.</li>
<li>각 슬라이드를 가습 챔버에 넣고 차단 용액 (약 4 방울)을 조직에 추가하십시오. 실온(RT)에서 10분 동안 배양합니다.</li>
</ol></li>
<li>슬라이드 염색 (1 차 항체 응용 프로그램)<ol>
<li>각 슬라이드를 가지고 종이 타월 의 스택에 슬라이드의 측면을 누르고 조직 주위에서 과잉 차단 에이전트를 제거하기 위해 섬세한 작업 닦아하여 차단 솔루션을 제거합니다.</li>
<li>슬라이드를 다시 가습 챔버에 놓고 작동 1 차 항체의 약 200 μL을 추가합니다. RT에서 1 시간 동안 가습 챔버에서 배양하십시오.</li>
<li>TBST로 2분간 3배에 잠기면13. 참고: 각 세탁 단계 후에 TBST를 변경하면 더 깨끗한 이미지를 보장하는 데 도움이 됩니다.</li>
</ol></li>
<li>슬라이드 염색(이차 항체 적용)<ol>
<li>각 슬라이드로부터 나머지 TBST를 dab하고 약 3~4방울의 이차 항체(토끼 및 마우스 이차 HRP 공액 항체의 혼합물)를 적용한다. RT13에서가습 챔버에서 10 분 동안 배양하십시오. 참고: 마우스 나 토끼 이외의 이차 항체를 필요로하는 1 차 항체를 사용하거나 대체 이차 항체를 사용하기로 결정한 경우, 슬라이드에 적절한 HRP 컨쥬게이션 보조를 적용하고 RT에서 45 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 시간은 대체 보조14에필요할 수 있습니다.</li>
<li>배양 후, TBST로 2 분 동안삼중 13로 씻어.</li>
</ol></li>
<li>슬라이드 염색(형광포응용)<ol>
<li>약 100 μL의 불소 작동 용액을 적용하고 10 분13동안 RT에서 가습 챔버에서 배양하십시오.</li>
<li>TBST로 2 분 동안 삼중 13로 씻으하십시오.</li>
</ol></li>
<li>항체의 제거<ol>
<li>전자레인지 슬라이드(45초에서 100%, 20분에서 15분) 내열 상자 (단계 2.3.2 참조)에서 항체 의 제거13,14. 참고 : 이것은 멀티 플렉스의 한 라운드를 완료합니다. 프로토콜을 일시 중지할 수 있는 유일한 지점입니다. 프로토콜을 일시 중지하려면, 슬라이드가 실온에서 밤새 항원 검색 버퍼에 잠긴 상태로 둡니다.</li>
</ol></li>
<li>염색의 추가 라운드를 계속합니다. 나머지 항체 형광부 쌍에 대해 2.5.1-2.9.1 단계를 반복합니다. 모든 항체와 형광단이 사용되면 섹션 2.11로 진행하십시오.</li>
<li>DAPI 애플리케이션 및 마운팅<ol>
<li>멀티플렉스에서 마지막 염색 라운드 후, 항원 회수 용액 pH 613으로마지막 항체 적용을 제거한다. 탈이온수로 세척한 다음 TBST를2분당 13분씩 세척합니다.</li>
<li>RT1에서10 분 동안 가습 챔버에서 슬라이드 및 배양에 작동하는 DAPI 용액의 약 150 μL을 적용하십시오.</li>
<li>TBST로 약 30초 동안 세척하고 안티페이드 마운트로 커버슬립을 장착합니다. 커버슬립을 고정하기 위해 마운팅 매체가 건조되면 커버슬립의 네 모서리에 투명한 손톱 광택을 바치게 합니다(선택 사항).</li>
</ol></li>
</ol>3. 라이브러리, 모노플렉스 및 멀티플렉스에 대한 세부 정보
<ol><li>형광포어 라이브러리를 작성하기 위한 슬라이드를 선택합니다.<ol>
<li>7색 멀티플렉스를 위해 라이브러리를 위한 7개의 면역 세포가 풍부한 조직 슬라이드(즉, 편도선, 비장 등)를 수집한다. 참고: 멀티플렉스에서 사용될 각 고유형 플루오로폴을 나타내는 각 슬라이드가 있는 형광부 라이브러리에 사용할 컨트롤 슬라이드를 선택합니다. 대조군 슬라이드는 선택의 풍부한 에피토프를 가져야 하며 각 형광단에 대해 동일한 유형의 조직일 수 있다.</li>
</ol></li>
<li>모노플렉스 및 멀티플렉스와 함께 사용할 수 있는 얼룩 및 이미지 라이브러리 슬라이드.<ol>
<li>2.1-2.9.1 단계를 따라 제어 슬라이드를 사용하여 선택한 조직 슬라이드를 제어합니다. 각 슬라이드에 1:100의 농도로 다른 형광을 놓습니다. 하나의 슬라이드에는 DAPI만 포함되어야 합니다.</li>
<li>DAPI 염색을 생략하는 것을 제외하고 섹션 2.11로 진행하고 대신 설명된 대로 TBST 및 마운트를 사용하십시오.</li>
<li>슬라이드를 하룻밤 건조시키는 후, 모든 채널DAPI, CY3, CY5, CY7, 텍사스 레드, 반도체 양자점 및 플루오레세인 이소티옥시아네이트(FITC)를 사용하여 이미지 포화보호 기능 1을 사용하여 250ms로 노출을 설정한다. 참고 : 노출 시간은 50-250 ms13로설정할 수 있습니다.</li>
<li>라이브러리 이미지를 소프트웨어에 업로드하고 모노플렉스 및 멀티플렉스 분석에 사용합니다.</li>
</ol></li>
<li>모노플렉스에 대한 슬라이드를 선택합니다.<ol>
<li>최적화된 항체(섹션 1)를 기반으로 풍부한 에피토프를 가진 컨트롤 슬라이드를 선택합니다. 멀티플렉스에서 수행할 모든 얼룩의 경우 해당 컨트롤 슬라이드 수를 선택하여 모노플렉스를 만듭니다. 참고: 모노플렉스의 목적은 멀티플렉스에서 사용되는 각 항체에 대해 최적의 위치(order)를 결정하는 것이다.</li>
</ol></li>
<li>얼룩 모노 플렉스.<ol>
<li>각 슬라이드에 대해 상이한 순서(위치)로 1차 항체를 사용하여 2.1-2.11 섹션을 따르십시오. 각 슬라이드는 다른 슬라이드와 다른 순서(위치)로 하나의 기본 항체만 적용되어야 합니다. 참고: 라운드가 1차 항체 또는 불소가 없는 각 슬라이드에 대해, 대신 1차 항체 희석제 및 형광성 희석제를 사용한다13.</li>
</ol></li>
<li>이미지 슬라이드 및 모노 플렉스를 분석합니다.<ol>
<li>현미경을 사용하고 모든 채널에 대해 노출 시간을 250ms로 설정하여 DAPI를 활용하여 각 이미지를 캡처하여 초점을 맞춥니다. 참고 : 노출 시간은 50-250 ms14로설정할 수 있습니다.</li>
<li>분석 소프트웨어를 사용하여 스테인드 마커의 형광 강도를 보고 각 단일플렉스 슬라이드를 평가한다.</li>
<li>이 강도를 배경과 비교합니다. 배경보다 5~10배 이상 높으면 해당 슬라이드의 위치는 최종 멀티플렉스에서 사용하기에 최적의 위치입니다.</li>
</ol></li>
<li>멀티플렉스용 슬라이드를 선택합니다.<ol>
<li>관심 있는 슬라이드를 선택하고 염색 및 이미징 후 자동 형광을 빼기 위한 빈 슬라이드로 사용할 추가 슬라이드를 추가합니다.</li>
</ol></li>
<li>멀티플렉스에 얼룩을 지입니다.<ol>
<li>모노플렉스 결과에 기초하여, 단계 3.5.3에 기초하여 각 항체에 대한 적절한 순서(위치)를 선택한다. 각 형광포를 항체에 할당합니다. 참고: 최적화가 필요할 수 있습니다. 그러나, 덜 풍부한 마커 1에 대한밝은 항체를 사용하는 계획, 공동 국소화 항체는 서로 13에서멀리 스펙트럼에서 형광단과 일치해야하며, 스펙트럼 540 및 570을 가진 형광단은 공동 국소화되어서는 안됩니다. 에 스펙트럼 중복 문제1.</li>
<li>2.1-2.11 섹션을 진행하여 빈 슬라이드가 1차 항체, 형광포, 또는 DAPI를 수신하지 않도록 하고, 대신 항체 희석제, 형광환성 희석제 및 TBST를 그 자리에 각각 사용한다.</li>
</ol></li>
<li>이미지 멀티플렉스 및 염색의 무결성 분석<ol>
<li>현미경을 사용하여 모든 채널에 대해 노출 시간을 250ms로 설정하고 DAPI를 사용하여 각 이미지를 캡처하여 초점을 맞춥니다.</li>
<li>분석 소프트웨어(재료표)를사용하여 각 멀티플렉스를 형광 거짓 색상으로 평가합니다. 참고: 선명한 이미지는 각 마커를 명확하게 보여줘야 합니다. 마커가 확산되고 거칠어보이거나 존재하지 않는 경우 마커가 작동하지 않아 다시 최적화해야 할 수 있습니다.</li>
<li>분석 소프트웨어를 사용하여 병리학 적 보기별로 각 멀티플렉스를 평가합니다. 병리학 보기는 각 마커의 특이성을 확인할 것이다. 이전에 최적화된 IHC와 비교합니다(섹션 1).</li>
</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

고형 종양 생검 및 외과 절제술에서 온전한 조직 견본은 환자 예후 뿐만 아니라 질병 분석을 위한 중요한 진단 그리고 예측 공구 남아 있습니다. 멀티플렉스 형광 면역히스토화학(mfIHC)은 면역성화학(IHC), 면역형광(IF) 및 유세포분석의 이점을 결합한 새로운 기술이다. 이전에는 세포가 있는 장소에서 세포를 프로브하는 방법들은 조직 환경에서 세포 간배열의 평가를 허용하였다 8, 그러나, 조사될 수 있는 에피토프의 수가 적어 복잡한 분석이 제한된다. 유세포분석은 시편에서 많은 세포 유형을 분석하는데 유용하지만, 단일 세포 현탁액으로 샘플을준비하는 덕택에 공간적 맥락을 잃는다 9,10. mfIHC는 이러한 기술을 세포 미세 환경의 공간 적 맥락을 유지하고 표지된 에피토프(11)당 신호를 증폭시키면서라벨링할 수 있는 에피토프의 수를 증가시킴으로...

손상되지 않은 종양 미세 환경 (TME)의 가시화는 고체 악성종양에서뿐만 아니라 세포 상호 작용에 세포 침투뿐만 아니라 세포 침투를 평가하는 데 필수적입니다. 멀티플렉스 형광 면역성화학(mfIHC)은 암 및 관련 질환의 연구에서 세포의 다항원 자형질에 효과적인 도구로부상하고 있다 1,2,3,4, 5,6,7. 이것은, 큰 데이터 세트를 분석하도록 설계된 새로운 소프트웨어 및 프로그램과 결합하여, 세포 사이의 복잡한 상호 작용의 관찰을 가능하게1,2,4. 데이터 수집의 속도 제한 요인은 종종 분석 전에 염색된 조직의 품질입니다.
TME에 있는 표현형 세포에 이용된 이전 기술은 면역성 결합 (IHC), 면역 형광 (IF) 및 유세포 세포 분석 이 모두 중요한 한계를 제시포함합니다. IHC는 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 조직 섹션을 사용하여 가장 자주 하나의 항체에 의해 염색되기 전에 분리되고 재수화됩니다. 고추냉이 과산화아제(HRP)의 사용은 이차 항체와 화학 반응을 결합하여 단일 항원 에피토프8의 가시화를 가능하게 한다. IHC는 신뢰할 수 있고 작동하기 쉬운 FFPE 조직에서 수행되지만, 가시광 스펙트럼에 대한 제한은 하나 또는 두 개의 마커만이신뢰할 수 있는 구별및 항원의 동국화가 매우 어렵다는 것을 의미한다. 단일 섹션에서 조사할 수 있는 사용 가능한 마커 및 따라서 항원을 확장하는 방법은 더 넓은 범위의 시각 스펙트럼을 사용할 수 있도록 형광으로 변경하는 것입니다. IF의 경우, 동결 또는 FFPE 조직은 다양한 형광체에 공액되는 슬라이드 및 항체로 옮겨질 수 있다. 이것은 조사될 수 있는 항원의 수를 증가하는 동안, 몇몇 중요한 한계가 있습니다. 첫째, 각 항체는 전형적으로 하나의 형광공만 부착되어 있기 때문에, 밝기는 종종 조직 자가형광을 극복할 만큼 충분히 강하지 않다. 이러한 이유로, 대부분의 IF는 저장 비용이 많이 들고 작업하기 어려운 냉동 조직에서 수행됩니다. 특히 비공액 항체가 사용될 때 스펙트럼 중복 및 교차 종 반응성으로 인해 제한된 수의 형광 태그를 사용할 수 있습니다. 단일 세포 현탁액으로 신선한 조직 처리및 형광 항체로 라벨링으로 구성된 유세포분석은 수십 년 동안 면역phenotaing을 위한 금 본위제9,10. 유세포 분석의 이점은 대부분의 것이 공액화되기 때문에 종 교차 반응성에 대한 우려없이 여러 항체에 라벨을 붙일 수 있다는 것입니다. 세포는 기계에 의해 "시각화"되고 인간의 눈이 아니기 때문에 훨씬 더 많은 형광단이 사용할 수 있지만 이것은 비용이 함께 제공됩니다. 보상은 거짓 긍정 및 부정적인 인구를 생성하는 결과를 크게 바꿀 수 있는 수동으로 수행해야 합니다. 유세포분석의 가장 중요한 한계는 조직 구조와 이후에 모든 공간 정보가 단일 세포 현탁액에 대한 필요성에 의해 손실된다는 것입니다.
새로운 소프트웨어와 결합된 자동 형광 현미경을 이용한 멀티플렉스 형광 면역조직화학(mfIHC)은 신호 증폭과 함께 다중 항원 조직 염색을 허용함으로써 IHC, IF 및 유세포분석의 이점을 결합하고 보상할 필요 없이 공간 관계를 유지합니다. FFPE 조직은 항원 검색 후 IHC와 유사한 HRP 화학 태그를 가진 이차 항체가 관심있는 표적 항원에게 1 차 항체 적용의 라운드를 거치는 충전 된 슬라이드에 배치됩니다. 이차 항체의 배치 후, HRP 특이적 반응은 관심있는 에피토프에 공유결합하여 형광공자(11)를 초래한다. 일단 조직이 표지되면, 슬라이드를 가열하는 또 다른 라운드는 조직 에피토프(11)에 결합된 형광 태그만을남기고 이전에 적용된 1차 및 2차 항체 복합체를 제거하는 것으로 완성된다. 이것은 교차 반응성11,12에대한 염려없이 임의의 종의 다중 항체가 재적용될 수 있게 한다. 다중 형광 염료의 수동 보상에 대한 필요성을 최소화하기 위해 핵 카운터 얼룩을 포함하여 스펙트럼이 거의 겹치는 형광단 컬렉션을 사용하여 mfIHC를 완료합니다. FFPE 조직과 마주치는 자가형광을 설명하기 위해 소프트웨어는 불소 후 항원 특이형광의 강도 때문에 가능한 빈 슬라이드에서 이미지를 사용하여 최종 이미지에서 자가형광을 뺍니다. 신호 증폭. 대용량 데이터 세트를 위해 설계된 새로운 프로그램을 사용하여 공간컨텍스트 1,2,4에대해 셀 위치를 식별하고 분석할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 제한사항은 최적화 시간입니다. 실험 설계 및 염색 및 이미징 전략에 대한 지침이 포함된 자세한 방법론이 여기에서 확인할 수 있습니다. mfIHC는 현재 수동 기술을 사용하여 본래 FFPE 조직에서 세포 간 상호 작용의 공간 적 맥락을 더 잘 이해하고 자하는 최적화 된 자동 염색 시스템이없는 실험실에 유용 할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>100% 에탄올</td><td>Fisher</td><td>HC8001GAL</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>Fisher</td><td>HC10001GL</td><td></td></tr><tr><td>95% 에탄올</td><td>Fisher</td><td>HC11001GL</td><td></td></tr><tr><td>분석 소프트웨어</td><td>Akoya Biosciences</td><td>CLS135783</td><td>inForm 버전 2.3.0</td></tr><tr><td>Antifade mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36961</td><td>ProLong Diamond</td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td>Vector</td><td>SP-6000</td><td>Bloxall</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>Fisher</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>섬세한 작업 와이프</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>형광 희석제</td><td>Akoya Biosciences</td><td>ARD1A01EA</td><td>Opal TSA 희석제</td></tr><tr><td>Fluorophore 520</td><td>Akoya 생명과학</td><td>FP1487001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>형광단 540</td><td>아코야 생명과학</td><td>FP1494001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>형광단 570</td><td>아코야 생명과학</td><td>FP1488001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>형광단 620</td><td>아코야 생명과학</td><td>FP1495001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>형광단 650</td><td>아코야 생명과학</td><td>FP1496001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>형광단 690</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1497001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>형광단 DAPI</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1490</td><td>TBST 또는 PBS</td></tr><tr><td>내열 상자에</td> 3방울 <td>Tissue-Tek</td><td>25608-904</td><td>플라스틱 슬라이드 박스-녹색</td></tr><tr><td>가습 챔버</td><td>Ibi Scientific</td><td>AT-12</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 오븐</td><td>FisherBiotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소수성 배리어 펜</td><td>Vector</td><td>H-4000</td><td>ImmEdge</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS140089</td><td>Mantra 정량 병리학 워크스테이션</td></tr><tr><td>마이크로파</td><td>Panasonic</td><td>NN-A661S</td><td>인버터 기술</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>10% 중성 완충 포르말린</td></tr><tr><td>pH 6 항원 검색 완충액</td><td>Akoya Biosciences</td><td>AR600</td><td>AR6</td></tr><tr><td>pH 9 항원 회수 버퍼</td><td>Akoya Biosciences</td><td>AR900</td><td>AR9</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td>PBS</td></tr><tr><td>플라스틱 슬라이드 박스</td><td>Tissue-Tek</td><td>25608-906</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 랩</td><td>Fisher</td><td>NC9070936</td><td></td></tr><tr><td>폴리소르베이트 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-800</td><td>트윈 20</td></tr><tr><td>기본 항체 CD163</td><td>Lecia</td><td>NCL-LCD163</td><td>1:400</td></tr><tr><td>1차 항체 CD3</td><td>Dako</td><td>A0452</td><td>1:400 1차</td></tr><tr><td>항체 CD8</td><td>Spring Bio</td><td>M5390</td><td>1:400 1차</td></tr><tr><td>항체 FOXP3</td><td>Dako</td><td>M3515</td><td>1:400</td></tr><tr><td>1차 항체 판시토케라틴</td><td>세포 신호 12653</td><td></td><td>1:500</td></tr><tr><td>1차 항체 PD-L1</td><td>세포 신호</td><td>13684</td><td>1:200</td></tr><tr><td>2 차 항체</td><td>Akoya Biosciences</td><td>ARH1001EA</td><td>오팔 폴리머</td></tr><tr><td>슬라이드 염색 세트</td><td>전자 현미경 과학</td><td>6254001</td><td></td></tr><tr><td>Tris 완충 식염수</td><td>Corning</td><td>46-012-CM</td><td>TBS</td></tr><tr><td>수직 슬라이드 랙</td><td>전자 현미경 과학</td><td>50-294-72</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>X3P1GAL</tr></tbody></table>

수동 멀티플렉스 형광 면역성 화학의 최적화, 설계 및 함정 방지

Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry

세포 침투 및 공간 조직의 분석을 위한 손상되지 않은 조직의 미세 환경 평가는 질병 과정의 복잡성을 이해하는 데 필수적입니다. 과거에 사용된 원리 기술은 1과 4 마커 사이를 사용하여 시간에 스냅샷으로 세포의 가시화를 가능하게 하는 면역성 결합 (IHC) 및 면역 형광 (IF)를 포함합니다. 두 기술 모두 불량 항원 표적 염색 어려움 및 종 간 반응성과 관련된 한계를 포함한 단점이 있습니다. IHC는 신뢰할 수 있고 재현 가능하지만 화학의 특성과 가시광선 스펙트럼에 대한 의존도는 소수의 마커만 사용할 수 있게 해주며 공동 현지화를 어렵게 만듭니다. IF의 사용은 잠재적인 마커를 넓히지 만 일반적으로 포르말린 고정 다음 광범위한 조직 자가 형광으로 인해 냉동 조직에 의존합니다. 유세포분석법은 여러 에피토프의 동시 라벨링을 가능하게 하는 기술로, IF와 IHC의 많은 결핍을 폐지하지만, 단일 세포 현탁액으로 세포를 검사할 필요성은 중요한 생물학적 제제를 버리는 세포의 공간적 맥락을 상실한다. 관계. 멀티플렉스 형광 면역조직화학(mfIHC)은 이러한 기술을 통해 전체적인 미세환경 구조및 공간적 구조를 보존하면서 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 조직에서 다중 에피토프 세포 자형질짝을 허용합니다. 그대로 중단되지 않은 조직 내의 세포의 관계. 조직 에피토프에 공유적으로 결합하는 높은 형광 강도 형광은 이차 항체에 의한 종 특정 교차 반응성에 대한 걱정없이 1 차 항체의 여러 응용 프로그램을 가능하게합니다. 이 기술은 질병 연구를 위해 신뢰할 수 있고 정확한 이미지를 생성하는 것으로 입증되었지만, 유용한 mfIHC 염색 전략을 만드는 과정은 광범위한 최적화 및 설계로 인해 시간과 정확할 수 있습니다. 현장에서 정확한 세포 상호 작용을 나타내는 견고한 이미지를 만들고 수동 분석을 위한 최적화 기간을 완화하기 위해 슬라이드 준비, 항체 최적화, 멀티플렉스 설계 및 오류를 위한 방법이 여기에 제시되어 있습니다. 염색 과정에서 일반적으로 발생합니다.

7색 멀티플렉스 분석법획득의 전체적인 과정은 반복적인 패턴을 따른다. 그림 1은 다이어그램 형식으로 프로세스를 설명합니다. 일단 슬라이드가 절단되고 건조되거나 실험실에서 수신되고 60°C에서 혼성화 오븐에서 1시간 동안 구운 후, 탈파피화 및 재수화를 진행한 다음, 다시 포르말린에서 슬라이드를 고치고 항원 회수에 이어 다시 고쳐낸다. 다중화의 각 라운드는 항원 회수에서 시작하고 항체제거에서 끝납니다 (그림 1).
프로세스의 각 단계를 최적화하는 것은 명확하고 사용 가능한 이미지를 달성하는 데 가장 중요합니다. 항체는 특정 항체와 가장 잘 작동하는 항원 회수 완충액을 가시화하기 위하여 각 항체를 위한 pH 6 및 pH 9를 가진 항원 회수 완충장치를 사용하여 IHC에 의해 첫째로 시험되어야 합니다. 일반적으로 핵 표적은 완충제 pH 9로 항원 검색에 반응한다. 예를 들어, F...

멀티플렉스 형광 면역 조직 화학은 그대로 포르말린 고정, 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 내에서 여러 세포 유형의 시각화를 가능하게하는 새로운 기술이다. 제시된 7색 멀티플렉스는 항체 및 시약을 최적화하고, 슬라이드를 준비하고, 일반적인 문제를 피하기 위한 설계 및 팁을 준비하기 위한 지침이 제시되어 있습니다.

Microenvironment evaluation of intact tissue for analysis of cell infiltration and spatial organization are essential in understanding the complexity of ...

멀티플렉스 형광 면역 조직 화학은 다중 세포 유형과 그 위치를 그대로 포르말린 고정 파라핀 임베디드 조직에서 식별하여 세포 식별뿐만 아니라 세포 공간 분석에세포도 허용합니다. 이 수동 기술의 주요 장점은 교차 반응성없이 동일한 종의 다중 항체를 사용하는 것입니다. 이 기술은 종양 마이크로 환경에서 면역 과 암 세포의 상호 작용에 깊이보기를 허용합니다.이 기술을 처음으로 시도할 때 약 3~4일 동안 염색을 하고 공정 중에 각 단계를 완전히 추적합니다. 염색 공정과 멀티플렉스 설계의 약한 방법은 일반 및 예상 함정을 줄이는 데 중요합니다. 먼저 슬라이드를 분리하고 재수화합니다.조직 측이 있는 혼성화 오븐에 놓고 한 시간 동안 섭씨 60도에서 굽습니다. 오븐에서 슬라이드를 꺼내 수직 슬라이드 랙에서 5~10분 동안 식힙니다. 그런 다음 슬라이드 염색 세트를 사용하여 자일렌으로 슬라이드를 세 번, 100% 에탄올, 95%에탄올, 70%에탄올을 각각 10분 동안 처리합니다.슬라이드 랙을 탈온화된 물로 씻은 다음 중립 버퍼링 된 포르말린에 30 분 동안 잠급하여 슬라이드를 수정합니다. 슬라이드를 물로 2분간 세척하고 항원 회수를 진행합니다. 슬라이드 랙을 pH 6.0 또는 pH 9.0 항원 검색 버퍼로 채워진 내열 상자에 넣습니다.플라스틱 랩으로 상자를 덮고 고무 밴드로 고정하십시오. 상자를 회전판 가장자리에 인버터가 장착한 전자레인지에 넣고 슬라이드를 100%의 전력으로 45초 동안 가열한 다음 20%의 출력으로 15분 간 가열합니다. 마이크로 웨이브 후 15~20분 동안 슬라이드를 식힙니다.한편, 항체와 형광의 작업 솔루션을 준비합니다. TBST 또는 1X PBS의 50 밀리리터에서 소 세럼 알부민 과립의 0.5 그램을 용해하여 1 차 적인 항체 희석제를 준비합니다. 이전에 결정된 최적화된 농도로 각 1차 항체 작동 용액을 희석시합니다.1-100의 농도로 불소소 희석제의 각 불소호를 희석시 희석시. 염색의 마지막 날에는 TBST의 1 밀리리터에 3방울의 DAPI를 추가하여 DAPI 작업 솔루션을 준비합니다. 슬라이드가 냉각되면 전자 레인지에서 제거하고 플라스틱 랩을 벗습니다.2분 간 탈이온물로 씻은 다음 TBST로 2분간 세척합니다. 세척 후, 섬세한 작업 으로 조직 주위슬라이드를 말리고 소수성 장벽 펜으로 조직 외부를 추적하여 조직을 만지지 않도록 주의하거나 건조시키십시오. 각 슬라이드를 가습기 챔버에 넣고 조직에 약 4방울의 차단 용액을 추가합니다.그런 다음 실온에서 10 분 동안 슬라이드를 배양하고 1 차 적인 항체 응용 프로그램을 진행합니다. 종이 타월 스택에 슬라이드의 측면을 눌러 각 슬라이드에서 차단 솔루션을 제거하고 나머지 솔루션을 제거하기 위해 섬세한 작업 닦아를 사용합니다. 슬라이드를 가습 챔버에 다시 놓고, 작업 1 차 항체의 약 200 마이크로 리터를 추가하고, 한 시간 동안 배양한다.인큐베이션 후, 세척당 2분 동안 TBST에 잠급으로써 슬라이드를 세 번 씻습니다. 각 슬라이드에서 나머지 TBST를 분리하고 이차 항체의 약 3 ~ 4 방울을 적용합니다. 가습 챔버에서 슬라이드를 10분 동안 배양합니다.TBST로 슬라이드를 다시 세척하고 약 100 마이크로리터의 플루오로포레 작동 용액을 적용합니다. 슬라이드를 가습 챔버로 되돌리고 10분 동안 배양합니다. TBST 세척을 반복한 다음 원고 지시에 따라 슬라이드를 전자 레인지에 전자 레인지하여 항체를 제거합니다.이 다일 염색 과정에서 기억해야 할 중요한 것은 마이크로 웨이브 단계 후 멈추고 밤새 항원 검색 버퍼에 슬라이드를 남기고 조직과 얼룩 무결성을 보장하는 것입니다. 항원 회수 용액으로 마지막 항체 응용 프로그램을 제거하고 산화 된 물로 슬라이드를 씻은 다음 TBST가 세척 당 2 분 동안 세척합니다. 항체 플루로포어 쌍의 나머지 부분에 대한 염색 단계를 반복한 다음 DAPI 응용 프로그램을 진행한다.각 슬라이드에 약 150마이크로리터의 작업 DAPI 솔루션을 적용하고 가습 챔버에서 10분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 TBST로 슬라이드를 약 30초 동안 세척하고 커버 슬립을 장착합니다. 마운팅 미디어가 건조되면 덮개 슬립의 네 모서리에 선명한 손톱 광택을 바르면 고정하십시오.모노플렉스를 분석하려면 DAPI를 사용하여 250밀리초 노출로 현미경의 슬라이드를 이미지하여 초점을 맞춥니다. 스테인드 마커의 형광 강도를 보고 각 모노플렉스 슬라이드를 평가하고 이 강도를 배경과 비교합니다. 스테인드 마커 강도가 배경보다 5배 이상 높은 경우 최종 멀티플렉스에서 슬라이드 위치를 사용합니다.멀티플렉스를 염색할 때 각 항체에 대한 적절한 순서를 선택하고 각 플루오로포를 항체에 할당합니다. 앞서 설명한 대로 멀티플렉스를 염색하고 1차 항체, 불소호또는 DAPI 대신 항체 희석제, 불소후 희석제 및 TBST를 받는 빈 슬라이드를 준비한다. 현미경에서 멀티플렉스를 이미지화할 준비가 되면 모든 채널에 대해 노출을 250밀리초로 설정하고 DAPI를 사용하여 각 이미지를 캡처하여 집중합니다.그런 다음 분석 소프트웨어를 사용하여 형광 거짓 색상및 병리학 보기로 각 멀티플렉스를 평가하여 각 마커의 특이성을 확인합니다. 멀티플렉스 분석의 성공을 보장하기 위해, 모노플렉스 분석은 각 항체의 순서를 결정하기 위해 수행되어야 한다. 예를 들어 Foxp3이 배열의 세 번째 위치에 있을 때 CD3를 통해 특이적이고 견고한 염색 및 공동 지역화가 입증됩니다.대조적으로 Foxp3이 첫 번째 위치에 있을 때 Foxp3의 비특이적 염색이 발생합니다. 빨간색의 거칠고 효능 영역은 대부분의 슬라이드에 존재하며, 이 지역의 형광 강도는 낮습니다. 이 분석의 또 다른 중요한 단계는 세포 식별 및 추가 분석의 기초인 DEPI 카운터스테인링입니다.작업 중인 이미지와 작동하지 않는 DAPI를 가진 이미지 간에 명확한 대비를 알 수 있습니다. 멀티플렉스 분석의 경우 아름다운 합성 이미지가 항상 정확한 얼룩을 반영하지는 않습니다. CD3가 시각화되고 특정 염색을 표시하는 동안, CD163의 병리학 밝은 필드 보기는 항체가 비특이적임을 증명한다.최적의 멀티플렉스 이미지는 복합 이미지에서 특정 염색을 나타내며, CD3 및 CD163 특이성은 병리학 밝은 필드 뷰로 확인된다. 이 절차에 따라 자가 현상 및 공간 분석 계산을 수행하여 세포와 세포 상호 작용을 더 분석할 수 있습니다. 이 기술은 연구원이 종양 면역 미세 환경에 대한 우리의 이해를 발전시키는 세포및 손상되지 않은 조직의 공간 패터닝을 탐구하는 길을 열었습니다.

optimization-design-avoiding-pitfalls-manual-multiplex-fluorescent

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

자세한 프로토콜 6-마커 멀티플렉스 면역 형광 패널 최적화 수행 위한 더 일관 된 결과를 짧은 절차 시간 자동된 염색기를 사용. 이 방법은 종양 면역 연구에 대 한 모든 실험실에 의해 직접 적응 될 수 있다.

포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널

여기 우리는 다중 형광 immunohistochemical 얼룩 및 여러 암 관련 항 림프 종에서의 동시 지역화에 대 한 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 모든 조직 섹션에서 생체의 colocalization 분석을 확장할 수 있습니다.

멀티플렉스 형광 Immunohistochemical 얼룩, 이미징, 및 림프 종 조직학 샘플 분석

우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

멀티플렉스 면역히스토케및 다스펙트럼 이미징의 발전에도 불구하고, 자궁내막에서 동시에 주요 면역 세포의 밀도와 군집을 특성화하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이 논문은 자궁 내막에서 4개의 면역 세포 모형의 동시 국소화를 위한 상세한 멀티플렉스 염색 프로토콜 및 화상 진찰을 기술합니다.

재발성 유산에 있는 4개의 자궁내막 면역 세포 모형의 멀티플렉스 형광 면역히스토화학 염색

이 기사에서는 이미지 분석 및 공간 분석과 결합된 수동 티라마이드 신호 증폭(TSA) 다중 면역형광(mIF)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 실험실에서 사용할 수 있는 슬라이드 스캐너에 따라 슬라이드당 2-6개의 항원을 염색하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 섹션과 함께 사용할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

이 프로토콜은 다중 면역조직화학을 사용하여 종양 미세환경의 면역 세포 특성 분석을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다.

종양 미세환경의 공간 면역 세포 풍경에 대한 다중 면역조직화학적 분석

이 실험 프로토콜은 주로 단일 채널 항체 배양 조건을 최적화하고 항체 및 채널의 설정을 조정하여 임상 기원 폐암 조직의 자가형광 및 채널 누화 문제를 해결함으로써 다중 면역조직화학(IHC) 염색 방법을 설명하고 최적화합니다.

파라핀 포매된 폐암 조직을 위한 다중 면역조직화학 염색

다중 순환 면역조직화학은 반복적인 항원-항체 배양, 이미지 스캐닝, 이미지 정렬 및 통합을 사용하여 여러 마커를 동시에 현장에서 검출할 수 있습니다. 여기에서는 폐암과 쌍을 이루는 뇌 전이 샘플에서 이 기술로 면역 세포 기질을 식별하기 위한 운영 프로토콜을 제시합니다.

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry(다중 순환 형광 면역조직화학)

이 보고서는 자동 슬라이드 염색기에서 다중 면역형광(mIF) 분석을 위한 자동 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 표준 고처리량 조직 자동염색기 및 전체 슬라이드 형광 이미저에서 공간 단백질체학의 높은 재현성을 보여주며, 이는 중개 연구에서 많은 수의 조직 슬라이드에 걸친 맞춤형 mIF 분석에 이상적입니다.

중개 연구를 위한 High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assay

여기에서는 상업적으로 이용 가능한 자동 조직 염색기를 활용하는 IBEX(Iterative Bleaching Extends Multiplicity) 방법의 적용과 티라마이드 신호 증폭 기반 시약 사용에 대한 최적화 고려 사항을 설명합니다.

반복적 표백은 핵심 시설에 염색 자동화를 사용하여 다양성을 확장합니다.

다중화 면역형광은 단일 조직 절편 내에서 여러 항체 표지자를 순차적으로 표지하여 조직 구조와 세포 집단의 공간 분석을 지원합니다. 여기서는 노화 관련 마커, 구조적, 면역 마커의 다중성 검출 워크플로우를 제시하는데, 여기에는 수동 및 자동 슬라이드 준비, 반복 영상, 디지털 병리 소프트웨어를 이용한 단일 세포 분석이 포함됩니다.

생체 내 노화 마커의 공간 평가를 위한 다중화 면역형광 분석법

배우세요 수동 멀티플렉스 형광 면역조직화학법으로 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에서 여러 세포 유형을 동시에 시각화하는 방법을 익히세요. 이 기법은 종양 미세환경에서 면역 세포와 암 세포의 공간적 상호작용을 연구하는 데 필수적입니다.

수동 멀티플렉스 형광 면역성 화학의 최적화, 설계 및 함정 방지

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