Name: Polyanhydride의 Nanoparticles의 높은 처리량 탄수화물의 합성과 작용화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: 배우세요 고처리량 자동화 올리고당 합성 및 폴리무수 나노입자 기능화 방법을. 탄수화물 표적화를 통해 항원제시세포 수용체에 대한 특이적 결합을 극대화하여 신경과학 및 약물전달 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 미국 육군 의학 연구 및 Materiel 명령을 감사드립니다 (권한 부여 # W81XWH-10-1-0806)와 재정 지원을위한 국립 보건원 (권한 부여 # U19 AI091031-01 및 권한 부여 # 1R01GM090280)는 것이다. BN은 화학 및 생물 공학 Balloun 교수를 인정하고 NLBP은 학제간 공학 윌킨슨의 교수로 인정한다. 우리는 nanoparticle의 작용화 실험을 수행하는 그녀의 도움 줄리아 벨라 감사드립니다.

1. 높은 처리량 탄수화물 합성 <ol><li> 이전 dimannoside의 자동화 합성, 적절한 보호 설탕 기증자, 일반적으로 trichloroacetimidate 및 수용체 주로 알케닐 fluorous 알코올에이 벤치 위에 합성됩니다. </li><li> 프로그램 dimannoside의 자동 합성을 위해 쓰여집니다. 기본적인 자동화된 절차의 도식 표현은 그림 2에 표시됩니다. 프로그램에서, 그것은 발기인의 추가하기 전에 기증자와 수용체의 혼합물은 최소 30 분 동안 흔들 것을 보장합니다. </li><li> 합성 기증자, 수용체 및 trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate의 솔루션은 dichloromethane으로 만들어집니다. 톨루엔과 dichloromethane는 글리코 실화 반응을 위해 가장 자주 사용됩니다. </li><li> 또한, 80 % 메탄올 및 100 %의 메탄올에 임시 보호 그룹 deprotection위한 시약의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 프로그램의 시작하기 전에되도록 그 relat방에있는 필자 습도는 자동화 챔버 30 % 이하이다. 높은 습도는 글리코 실화 반응에 대한 해로운 것입니다. </li><li> 프로그램이 시작되면 로봇 팔이 순차적으로 반응 유리병에 기증자와 수용체의 솔루션을 전송합니다. 그런 다음 혼합물은 30 분 동안 흔들 수 있습니다. </li><li> 로봇 팔이 혼합물로 trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate의 0.2-0.3 등가물를 전송 다음으로, 일반적으로 상온에서 -20와 같은 낮은 온도 ° C는 획득 수 있지만. 반응 혼합물은 30 분 동안 흔들 수 있습니다. </li><li> 30 분 후 반응이 멈춘 작은 나누어지는는 반응 진행을 모니터링하기 위해 제거됩니다. 완료되지 않은 경우, 반응은 계속 수 있으며 궁극적으로 필요한 시간을 수정할 수 있습니다. </li><li> 반응이 완료되면 반응 혼합물은 정화를 위해 C 8 F 17-수정된 실리카 겔을 포함 fluorous 고체 상 추출 (FSPE) 카트리지로 전송됩니다. </li><li> 장바구니산등성이 먼저 비 fluorous 분수를 떼어 버리려고 80 % 메탄올 - 물 혼합 (8 ML)로 씻어 있습니다. </li><li> 그러면 카트리지는 원하는 fluorous 태그가 추가된 제품을 얻기 위해 100 % 메탄올로 씻어 있습니다. 추가적인 정화가 필요한 경우 컴퓨터가 정지하고 반응 생성물 (들)은 추가적인 방법으로 정화를 위해 제거할 수 있습니다. </li><li> 정화 사이클 후 로봇 팔이 반응 유리병에 나트륨 methoxide을 dispenses. 반응은 2 시간 동안 흔들 수 있습니다. 완료되지 않은 경우, 반응은 다시 긴 기간 동안 계속 수 있으며 궁극적으로 필요한 프로그램의 시간은 수정할 수 있습니다. </li><li> 반응의 완료 후, 제품은 FSPE에 의해 정화되어 후 잔류 수분을 제거하는 증발 다음에 무수 톨루엔에 용해에 노출. </li><li> 원하는 체인 길이 대상 분자에 대해 얻은 것입 때까지 그 다음주기가 (6 단계 13 일부터) 반복됩니다. </li><li> 자동화에서 얻은 보호되는 제품은 일입니다도중에 더 정화와 완전히 같은 핵 자기 공명 (NMR) 분광법과 같은 기술이 특징. 그것은 보통 폭발성 수소 가스와 팔라듐을 포함하기 때문에 최종 목표 분자의 완전한 deprotection은 (모든 남아있는 보호 그룹의 삭제) 후 원칙적으로 자동화 플랫폼 밖 완료됩니다. 최종 deprotection 단계는 자동화 플랫폼 밖 벤치 위에 실시되었다. 첫 번째 단계는 카르복실산로 제작 알데히드의 산화 다음 fluorous 태그에 이중 결합의 온존 분해했습니다. 제품은 칼럼 크로마 토그래피에 의해 정화되었다. 마지막 단계는 팔라듐 - 촉매의 첨가에 의한 벤질 에테르 그룹 deprotection했습니다. 제품은 순수하게 최종 제품을 얻기 위해 팔라듐 없애 celite 패드 통과되었다. </li></ol> 2. 높은 처리량 Nanoparticle 표면 작용화 <ol><li> 높은 처리량 고분자 합성과 nanoparticle의 제조는 동일한 PR에 따라 수행됩니다otocol과 로보트가 피터슨 외 19에 기술된 설정합니다. 입자 제조에 사용되는 공중 합체 시스템이 sebacic 산성 (SA)과 1,6 - 비스 (파라 carboxyphenoxy) 헥산 (CPH) 및 1,8 - 비스 (를 기준으로합니다 패러 carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) 및 CPH. 활용 로봇 증착 장치의 개략도 표현은 그림 1B에 표시됩니다. </li><li> nanoparticle 제조 따라 nanoparticle 라이브러리와 튜브를 포함하는 홀더는 선형 액추에이터 무대 reattached 있습니다. </li><li> polyanhydride 입자의 표면에 탄수화물의 첨부 파일이 들어 연속 2 반응으로 구성된 아민 - 카르복실산 커플링 반응 20 수행됩니다. </li><li> 첫 번째 반응 들어, 첫 번째 프로그램 주사기 펌프에 주사기를 1 - 에​​틸 -3 - (3 - 디메틸) 10 등가물 (eq.) (입자 표면의 평균 어금니 카르복실산 농도의 등가물)으로 가득합니다-CArbodiimide 하이드로 클로라이드 (EDC)와 10 EQ. 수용액에서의 에틸렌의 두 번째 프로그램 주사기 펌프의 주사기는 12 EQ와 함께로드되는 동안. 수용액에서 N-hydroxysuccinimide (보건국)의. </li><li> LabVIEW 프로그램을 사용하면, 시약의 현탁액은 nanoparticle 라이브러리 *로 입금됩니다. </li><li> 다음 각 예제는 sonicated됩니다 (40 Hz에서 30들)과 튜브 홀더는 로봇 플랫폼에서 분리됩니다. </li><li> Nanoparticle의 현탁액은 4 ° C.에 일정한 회전 구 H에 **에 대한 incubated있다 </li><li> 반응 시간이 완료되면 튜브는 centrifuged (5 분 12,000 XG)와 두 세척 단계를 수행할 수있는 로봇 스테이션에 반환됩니다. </li><li> 두 번째 주사기 펌프의 주사기는 차가운 물로 채워진 상태에서 세척 들어, 주사기는 비어와 최초의 프로그램 가능한 주사기 펌프에 로드된 남아 있습니다. 각 튜브의 표면에 뜨는는 빈 주사기와 보조 펌프의 예금 찬물에​​ 철회된다. </li><li> 나노의 균질화2.6 단계에서 설명한대로 입자 현탁액이 수행됩니다. 튜브 그때 centrifuged됩니다 (5 분 12,000 XG)와 단계 2.9에 설명된 두 번째 세척 단계가 수행됩니다. </li><li> 두 번째 반응의 경우, 두 증착 단계가 사용됩니다. 최초의 증착 단계에서, 12 EQ. EDC 중 한 펌프 및 12 개의 EQ와 함께로드됩니다. 의 보건국은 보조 펌프와 함께로드됩니다. </li><li> 두 번째 증착 단계는 10 EQ를 포함합니다. 첫 번째와 두 번째 펌프 (즉, 갈락토 오스, 유당 또는 디 - mannose) *** 10 EQ와 삼분의 일 펌프에 대한 구체적인 saccharide니다. 의 glycolic 산 (제어로 사용 ****). </li><li> 4 ° C.에서 단계 2.6에 설명된 지속적인 회전 구 H 위해 incubated로 Nanoparticle의 현탁액이 균질하고 있습니다 </li><li> 반응 시간이 완료되면 단계 2.8, 2.9 및 2.10에 설명한 바와 같이, 세탁 단계가 수행됩니다. </li><li> 작용 nanoparticle 라이브러리 후 적어도 2 시간 동안 건조 진공 챔버에 배치됩니다. </li><li> 작용 nanoparticles 그런 다음 문자 위치X 선 광전자 분광법 각각 표면 조성과 saccharide의 농도를 결정하는 높은 처리량 페놀 - 황산 분석하여 ized. 전자 현미경 및 동적 광 산란을 스캐닝하는 것은 입자 크기, 크기 분포 및 표면 요금을 결정하기 위해 활용됩니다. </li></ol> 주 : * 증착 볼륨이 각 튜브에 포함된 nanoparticles의 질량에 따라 다릅니다. 첫 번째와 두 번째 반응을위한 ** 반응 시간은 최종 saccharide 농도를 조정하도록 변경할 수 있습니다. *** 각 saccharide이 원하는 그룹에 따라 테스트 튜브로 입금됩니다. deprotected saccharides 이미 nanoparticle의 표면에 대한 부착을 허용 covalently 연결이 분자를 가지고 있기 때문에 **** 탄수화물의 첨부 파일이 연구에 사용된 구체적인 반응의 경우, glycolic 산은 링커 컨트롤로 사용됩니다. 3. 대표 결과 ful그림 2에 표시된 요 보호 dimannoside은 자동화 플랫폼을 사용하여 합성되었다. 합성 화합물은 용매로 CDCl 3을 사용 VXR 400 MHz의 분광계에 1 H NMR에 의해 특징되었습니다. NMR 스펙트럼은 그림 3에 표시됩니다. polyanhydride의 높은 처리량 nanoparticle의 제조 및 작용화을 이용하는 것은 본 설명한 nanoparticles, dimannose, 락토 오스 및 갈락토 오스의 첨부 파일이 성공적으로 10, 11 실시되었습니다. 이 설정을 사용하여 최적의 반응 조건 (즉, 반응 온도 및 시간) 원하는 nanoparticle의 작용화 조직 형태를 달성하는 확인되었다. 반응이 4 시에 실시되었을 때 ° C ~ 대신 상온의, nanoparticle의 집합의 감소가 SEM에서 관찰되었다 (데이터가 표시되지 않음). 디 - mannose이나 자중 CPH의 nanoparticles : 표 1은 작용 50:50 CPTEG의 특성을 대표하는 결과를 보여줍니다4에서 합성 유당, ° C. 데이터 작용화로 인해 평균 nanoparticle 직경의 작은 증가를 나타냅니다. 비 작용 nanoparticles는 약 부정적인 제타 잠재력을 가지고 있지만. -20 MV는 작용 입자 nanoparticle 표면의 성공 작용화 보여주 긍정 제타 잠재적인 가치를 보여주었다. 락토 오스 및 디-mannose는 모두 중립 설탕되지만 에틸렌 무료로 아민 그룹 saccharides를 연결 활용 링커가 긍정적인 제타 전위의 책임 수도 디아민. 반응 시간은 nanoparticles의 최종 형태와 달성 설탕 첨부의 학위를 모두 영향을 미칠 수있는 또 다른 변수입니다. 반응 시간을 조정하여, nanoparticles 표면에 부착된 최종 설탕 농도는 그림 4A와 같이 제어할 수 있습니다. 예상했던대로 50:50 CPTEG의 표면에 dimannose의 농도 : CPH는 nanoparticles가 함께 증가반응의 전체 시간과 18 시간 후 최대에 도달했습니다. 24 시간 총 반응 시간과 기능화 Nanoparticles은 마우스 뼈 - 골수 파생 돌기 세포 (DC가)에 CLRs을 타겟팅하는 능력을 평가하는 데 사용되었다. 유동세포계측법 두 CL 수용체 (즉, CIRE (CD209, DC-로그인) 및 mannose 수용체 (CD206)) 이외의 작용과 자극 후, 그리고 유당 및 DI-mannose 작용 nanoparticles (그림 4B)의 표현을 평가하는 데 사용되었다. 세포가 락토 오스 및 디-mannose 작용 nanoparticles 모두 함께 자극했을 때 효과적인 타겟팅을 나타내는 것입니다 두 수용체의 높은 표현은, 얻은 것입니다. 그러나, 디-mannose-작용 입자 공부했다 수용체이 리간드의 특이성을 나타내는 표현의 높은 수준을 보여주었다. <table border="1"><tbody><tr><td> Nanoparticle 유형 </td><td> 평균 입자 직경 (NM) </td><td> 번가분노의 입자 ζ-잠재적인 (MV) </td></tr><tr><td> 비 작용 </td><td> 162 ± 43 </td><td> -20 ± 0.6 </td></tr><tr><td> 락토 오스 </td><td> 235 ± 34 </td><td> 26 ± 2.4 </td></tr><tr><td> 디 - mannose </td><td> 243 ± 32 </td><td> 30 ± 4.2 </td></tr></tbody></table> 표 1. Nanoparticle 특성화. 비 작용과 작용이 유사 탄성 광 산란 및 제타 잠재력 측정을 특징으로했다. 입자 크기 데이터는 평균 값이 ± 세 독립적인 실험에서 수집한 동적 광 산란 데이터의 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. 제타 잠재적인 데이터는 평균 값이 ± SD 세 독립적인 신호를 나타냅니다. CPH nanoparticle의 표면 :​​ 제타 전위의 기호의 변화는 설탕 50:50 CPTEG에 효율적으로 복합했습니다 보여줍니다. <img alt="그림 1" src<html> = &quot;/ files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg&quot;/&gt; 그림 1. 탄수화물 polyanhydride의 nanoparticles의 작용화 및 설명 높은 처리량 방식으로 설계할 수있는 작용 nanoparticle 라이브러리의 예제를 통해 추구하는 접근법 (A) 그래픽 표현. (B) 자동 증착 장치의 도식 표현는 (i) 세 NE 1,000 펌프로 구성되어 입자 작용화, 활용, (ii) 본 로봇 무대는 두 액츄에이터 (Zaber)에 의해 통합 : X 방향의 움직임을위한 하나의 다른 두 인접한 랙에은 (튜브 및 cuvettes에 적합한) 세 액츄에이터, 각 방향에 대해 하나 (X, Y 및 Z)으로 구성된과 (3) 두 번째 로봇 무대, Y 방향의 운동입니다. 펌프 다섯 액츄에이터의 총 시리즈에 연결되어 있습니다. 발전소 펌프는 LabVIEW 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터에 의해 운영됩니다. 이 그림은 규모에 없습니다.arge.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig2.jpg" /> 그림 2. 자동의 그래픽 표현은 예로 mannose를 사용하여 탄수화물의 합성을 반복. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig3.jpg" /> 그림 3. 보호 dimannoside의 1 H NMR. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig4.jpg" /> 그림 4. () saccharide의 nanoparticle의 표면 농도에 대한 반응 시간의 영향. 표시된 데이터에 50:50 CPTEG : CPH의 nanoparticles는 서로 다른 반응 시간에 dimannose으로 기능화되었으며 반응은 4 시에 진행되었습니다 ° C. 두 개의 독립적인 작용화 실험의 평균 및 표준 오류가 표시됩니다. (B) 유당과 디 - mannose 작용 nanoparticles취득 표현에 비해 CPH nanoparticles : 뼈 작용 50:50 CPTEG로 자극 후이 두 마커의 향상된 표현에 의해 증명으로 골수 파생 돌기 세포에 효과적으로 대상 DC-기호 (CIRE, CD209)와 mannose 수용체 (CD206) 비 작용 입자로.

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<li>Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+solid-+phase+synthesis+of+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Automated solid- phase synthesis of oligosaccharides.</a> Science. 291, 1523-1527 (2001).</li>
<li>Ko, K. -S., Park, G., Yu, Y., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+group-based+colorimetric+monitoring+of+fluorous-phase+and+solid-phase+synthesis+of+oligoglucosamines%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protecting group-based colorimetric monitoring of fluorous-phase and solid-phase synthesis of oligoglucosamines.</a> Org. Lett. 10, 5381-5384 (2008).</li>
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</ol>

NLBP는 cofounder이며 탄수화물 회사 LuCella Biosciences 주식 회사의 지분을 보유하고

면역 세포에 직접 nanoparticle의 상호 작용에 에이전트를 대상으로 같은 탄수화물의 약효는 이전 10, 11을 입증되었습니다. 우리 실험실에서 이전 연구는이를 더욱 T 세포 활성화 10, 11 중요할 수도 면역 세포의 활성을 향상 polyanhydride의 nanoparticles에 연결된 특정 설탕은 항원 제시 세포 (APCs)에 다른 CLRs를 타겟팅할 수있는 것으로 나타났습니다. 그러나 몇 가지 매개 변수 - 같은 polyanhydride 화학, 크기, 설탕이나 표면 설탕의 종류 밀도 - 필요 최적화되어야하므로 이러한 다중 파라메 트릭 시스템과 관련된 복잡 발굴에 제조 방법에 처리량을 증대 등을 대상으로 최적의 달성을 위해 큰 도움이 될 것입니다. 또한, biosensing, 효소 고정 및 foodb의 검출을 포함하여 연구의 다른 관련 분야에 큰 가치를 지닌 경우 작용 nanoparticles의 사용오른의 병원체. 탄수화물 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 동력 XYZ 스테이지 : 배 T-LSM050A, 축 당 50 밀리미터 여행 </td><td> Zaber 기술 </td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> NE-1000 단일 주사기 펌프 </td><td> 새로운 시대 펌프 시스템 </td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td> Pyrex * 비스타 * 무테 재사용 유리 문화 튜브 </td><td> 코닝 </td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> ASW 1000 </td><td> Chemspeed 기술 </td><td></td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> 내쇼날 인 스트 루먼트 </td><td> 776671-35 </td></tr><tr><td> SGE 가스 타이트 주사기, Luer Loc 데이 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 509,507 </td></tr><tr><td> XL-2000 Sonicator </td><td> Qsonica </td><td> Q55 </td></tr><tr><td> 미니 튜브 회전 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 05-450-127 </td></tr></tbody></table>

polyanhydride의 nanoparticles의 높은 처리량 탄수화물의 합성과 작용화

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

이러한 자료 디자인, 나노 테크놀로지, 화학, 면역학 등의 분야를 포함 Transdisciplinary 방법은 이성적 효능 백신 캐리어를 디자인하는 데 활용해야합니다. Nanoparticle 기반 플랫폼은 백신에게 immunogenicity 1을 향상시킬 수있는 백신 항원의 지속성을 연장하실 수 있습니다. 여러 생분해성 폴리머는 백신 배달 차량 1로 연구되어, 특히 polyanhydride 입자는 안정적인 단백질 항원의 지속적인 출시를 제공하고 항원 제시 세포를 활성화하고 면역 반응에게 2-12를 조절하는 능력을 증명하고있다. 이러한 백신 운반선의 분자 설계 폴리머 속성의 합리적인 선택뿐만 아니라 적절한 타겟팅 대리인의 법인을 통합해야합니다. 리간드와 작용 입자를 대상으로 높은 처리량을 자동으로 지어낸 다양한 R을 공부하는 능력을 향상시킬 수있는 강력한 도구입니다속성의 엔지와 재현성 백신 전달 장치의 디자인으로 이어질 것입니다. 면역 세포의 특정 수용체에 의해 인식되는 수있는 리간드를 타겟팅 이외는 10,11,13 C 형 렉틴 수용체 (CLRs가)에 탄수화물이 존재 인식 패턴 인식 수용체 (PRRs)입니다 변조 및 재단사 면역 반응을 보여줘왔다 병원균의 표면. CLRs 통해 면역 세포의 자극은 항원과 더욱 T 세포 활성화 14,15위한 후속 프레 젠 테이션의 향상된 내면화을 허용합니다. 따라서 탄수화물 분자는 면역 반응의 연구에 중요한 역할을하지만, 이러한 biomolecules의 사용은 종종 구조적으로 잘 정의되고 순수한 탄수화물의 가용성의 부족을 앓고. 솔루션 위상 반응을 반복을 바탕으로 자동화 플랫폼은 크게 낮은 B를 사용하여 이러한 synthetically 도전 분자의 신속하고 제어 합성을 활성화할 수 있습니다전통적인 고체 상 16,17 방법보다 블록 수량 uilding. 여기에 우리는 이러한 중간 정화를위한 fluorous 고체 상 추출과 mannose 기반 타겟팅 리간드로서 oligosaccharides의 자동화 솔루션 상 합성을위한 프로토콜을보고합니다. 탄수화물 기반 타겟팅 요원이되기 위해 자동화된 방법을 개발 후, 우리는 이전에 10 설명된대로 LabVIEW에서 운영하는 자동화된 로봇 세트를 고용 polyanhydride nanoparticles의 표면에 그들의 부착을위한 방법을 설명합니다. 탄수화물과 표면 작용화는 CLRs에게 10,11을 대상으로하고 발굴 다중 파라메 트릭 시스템과 관련된 복잡 아주 가치 (그림 1A)이 될에게 제조 방법의 처리량 증가에 효험을 보이지 않고있다.

이 문서에서는 높은 처리량 방법은 항원 제시 세포의 특정 수용체​​를 타겟에 더 이상 사용할 수 polyanhydride의 nanoparticles의 표면에 oligosaccharides과 첨부 파일의 합성을 위해 제공됩니다.

Polyanhydride의 Nanoparticles의 높은 처리량 탄수화물의 합성과 작용화

재료 설계, 나노기술, 화학, 면역학 등의 분야를 포함하는 학제 간 접근 방식을 활용하여 ...를 합리적으로 설계해야 합니다.

본 비디오 논문에서는 올리고당의 자동화된 용액상 합성 및 폴리 안하이드라이드 나노입자의 기능화를 위한 새로운 하이드로 풋(hydro put) 프로토콜을 설명합니다. 이러한 탄수화물 기반 표적제 제작을 위해, 먼저 고상 합성기 대신 용액상 합성을 이용하는 자동화 시스템을 사용하여 탄수화물 분자를 합성합니다. 그다음, 올리고당 중간체들을 플로리스트(florist) 고상 추출 또는 FSPE를 통해 정제합니다.생성된 탄수화물 분자는 NMR로 특성을 분석한 후, 카바이드(carbo IDE) 결합을 통해 폴리 안하이드라이드 나노입자에 부착됩니다. 마지막으로, 탄수화물이 기능화된 나노입자는 X선 광전자 분광법(XPS)과 하이드로풋 페닐 황산 에세이(hydro putt phenyl sulfuric acid assay)를 통해 특성을 분석합니다. 궁극적으로, 여기에 기술된 하이드로풋 방법론을 활용하여 나노입자의 형태와 입자 표면의 탄수화물 밀도를 최적화하기 위한 반응 조건을 확보하였습니다.고체상 올리고당 합성과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 방법의 주요 장점은 빌딩 블록의 사용량을 상당히 줄일 수 있다는 것입니다. 이 방법에서는 일반적으로 10~20 당량이 아닌 2~3 당량을 사용합니다. 저희는 탄수화물을 사용하여 항-치성 세포의 특정 수용체를 표적화함으로써 폴리 하이드로 나노입자의 기능화 및 표면 효과의 효능을 입증했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 그 후, 이러한 새로운 운반체의 제작 및 적용에 관여하는 여러 매개변수를 스크리닝할 수 있는 고처리량 시스템을 설계하고자 했습니다.올리고당의 고처리량 합성과 이를 고분자 입자에 부착시키기 위한 자동화 플랫폼 개발은 가용한 문서 자료가 많지 않은 새로운 연구 분야이므로, 본 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. diano acid의 자동 합성 이전에, 일반적으로 tri chloro acetamide인 적절히 보호된 당 공여체와 주로 Alcon, fluorous alcohol인 수용체를 벤치탑에서 합성하여 chloro methane에 준비합니다. 또한 trimethyl silo, tri fluoro methane sulfonate를 chloro methane, 80%methanol 및 100%methanol에 준비합니다. 자동화 챔버 내 실내 상대 습도가 30% 이하인지 확인하십시오.높은 습도는 당화 반응에 해롭습니다. 다음 단계들은 자동화 플랫폼을 사용하여 수행됩니다. 첫 번째 당화는 공여체와 florist alcohol을 사용하여 수행됩니다.완료 후, 생성된 florist tag 당 분자를 FSPE로 정제합니다. 그런 다음 sodium methoxide와 methanol을 사용하여 일시적 보호기를 제거하며, 제품을 다시 FSPE로 정제합니다. 이후 florist tag 당을 수용체(acceptor)로 사용하여 동일한 공여체(donor)와 결합시켜 이당류를 얻고, 이당류를 FSPE로 정제하여 준비합니다.공여체-수용체 프로모터, 80% methanol water, 100% methanol, sodium meth oxide를 포함한 시약들을 로봇 플랫폼에 배치하고 프로그램을 시작합니다. 로봇 팔이 바이알에서 공여체와 수용체를 순차적으로 취해 반응 바이알로 옮깁니다. 그 후, 공여체와 수용체의 혼합물을 30분 동안 교반합니다.30분이 경과한 후, 로봇 팔이 촉매인 trimethylsily trifluoromethanesulfonate를 혼합물에 투입합니다. 그 후 용액을 30분 동안 추가로 교반합니다. 교반이 완료되면 프로그램이 일시 정지됩니다.10 µL의 분취액을 취하여 박층 크로마토그래피(TLC)로 반응 완결 여부를 확인하십시오. 반응이 완료되었다면 수용체 분자가 관찰되지 않을 것입니다. 반응이 완료되지 않았다면 TLC 상에서 수용체가 여전히 관찰됩니다.이러한 경우 프로그램을 중단하고 당화(glycosylation) 타이밍을 약 30분으로 재설정한 후, 프로모터인 trimethyl silo, tri fluoro, methane sulfonate를 과량으로 첨가합니다. 반응이 완료되면 다음 단계로 진행하십시오. 반응이 끝나면 로봇이 정제를 위해 C nine F 17 변형 실리카 겔이 포함된 FSPE 카트리지로 반응 혼합물을 옮깁니다.다음으로, 카트리지를 80% methanol 8 mL로 세척한 후, 100% methanol 8 mL로 세척합니다. non floris 분획을 제거하기 위해, 통과액을 바이알에 수집하여 원하는 florist 태그 제품을 얻습니다. 추가 정제가 필요한 경우, 로봇을 일시 중지하고 적절한 반응 생성물을 제거하십시오.구조에 따라 공여체(donor)의 반응성이 매우 낮을 수 있으며, 충분한 촉진제(promoter)를 첨가한 후에도 일부 꽃집 수용체(florist accepter) 분자가 남아 있을 수 있습니다. 이런 경우 FSPE만으로는 정제 효율이 충분하지 않을 수 있으므로, 정제 후 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 통한 추가 정제를 수행할 수 있습니다. 로봇 암이 반응 바이알에 소듐 메톡사이드(sodium meth oxide)를 분주합니다. 이후 로봇 플랫폼에서 2시간 동안 반응물을 교반하며, TLC로 확인했을 때 반응이 완결되지 않았다면 배양 시간을 약 1시간 더 연장합니다.반응이 완료되면, 이전과 동일하게 FSPE로 생성물을 정제합니다. 다음으로, 로봇에서 반응 생성물을 꺼내 벤치탑에서 무수 톨루엔에 용해시킨 후, 증발시켜 잔류 수분을 제거합니다. 샘플이 건조되면, FSPE를 이용한 당화 정제 과정을 포함하여 동일한 사이클로 로봇에 다시 넣습니다.표적 분자에 대해 원하는 사슬 길이가 얻어질 때까지 일시적 보호기의 심층 보호와 글리코실화를 반복합니다. 자동화 장치에서 얻은 보호된 생성물을 탈보호하기 위해 로봇에서 바이알을 제거합니다. 절차의 마지막 단계는 폭발성 수소 가스를 사용하므로 자동화 플랫폼 외부에서 수행해야 합니다. 벤치탑에서 플로리스트 태그(florist tag) 내 이중 결합의 오존 분해가 일어나며, 이어 생성된 알데히드가 카르복실산으로 산화됩니다.디클로로메탄 내 30% 메탄올 혼합액을 사용하여 벤치톱 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 생성물을 정제합니다. 마지막으로, 팔라듐 촉매 수소화 반응을 통해 벤조 에테르 그룹을 탈보호하고, 팔라듐을 제거하기 위해 생성물을 새틀라이트 패드(satellite pad)에 통과시켜 순수한 최종 생성물을 얻습니다. 핵자기 공명 또는 NMR 분광법을 사용하여 생성물의 특성을 완전히 분석합니다.고처리량 폴리머 합성 및 나노입자 제조는 Peterson 등이 기술한 프로토콜에 따라 수행됩니다. 동봉된 문서에 언급된 바와 같이, 입자 기능화에 사용된 자동 증착 장치는 3개의 ne 1000 펌프, X 방향 이동용 액추에이터 하나와 Y 방향 이동용 액추에이터 하나로 통합된 로봇 스테이지, 그리고 펌프의 각 방향으로 하나씩 총 3개의 액추에이터로 구성된 2개의 인접 랙이 있는 두 번째 로봇 스테이지로 구성됩니다. 총 5개의 액추에이터가 직렬로 연결되어 있으며, 액추에이터와 펌프는 LabVIEW 소프트웨어를 사용하는 컴퓨터에 의해 작동됩니다.입자 제작에 사용된 공중합체 시스템은 SEBA 산 또는 SA와 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane(CPH) 및 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane(CPTeeg)을 기반으로 합니다. 나노입자 제작 후, 폴리무수물 입자 표면에 탄수화물을 부착시키기 위해 나노입자 라이브러리가 포함된 1.7 mL 원심분리 튜브 랙을 리니어 액추에이터 스테이지에 배치하고, 두 단계의 연속 반응으로 구성된 평균 카르복실산 결합 반응을 수행합니다. 첫 번째 반응을 위해, 프로그래밍 가능한 시린지 펌프의 시린지에 EDC 수용액과 에틸렌디아민 수용액을 나노입자 1 mg당 각각 2 mg 및 0.6 mg의 농도로 채웁니다.프로그래밍 가능한 시린지 펌프의 두 번째 시린지에 나노입자 샘플당 총 12당량에 해당하는 2.5 mg/mg 입자 농도의 NHSA 수용액을 채웁니다. 다음으로, LabVIEW 프로그램을 사용하여 로봇이 시약 현탁액을 나노입자 라이브러리에 분주하도록 지시합니다. 그러면 로봇 액추에이터가 튜브 홀더를 플랫폼의 정확한 위치로 이동시켜 EDC 및 NHS 용액을 분주합니다.폴리무수물 나노입자 표면의 카르복실산 그룹을 활성화하여 평균 결합이 가능하도록 합니다. 다음으로, 각 튜브에 초음파 처리 프로브를 담그고 각 시료를 40 hertz에서 30초 동안 초음파 처리합니다. 다음 시료로 넘어가기 전, 아세톤으로 프로브를 세척합니다.모든 샘플의 포화가 완료되면, 튜브 홀더를 로봇 플랫폼에서 분리합니다. 나노입자 현탁액을 4 °C에서 일정하게 회전시키며 9시간 동안 배양합니다. 최종 당 농도를 조절하기 위해 1차 및 2차 반응 시간을 변경할 수 있습니다.반응이 완료되면, 튜브를 12,000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 저온 환경을 유지하며 로봇 스테이션으로 복귀합니다. 튜브 홀더를 로봇 암에 다시 부착하고, 로봇 플랫폼의 두 번째 주사기를 채웁니다.냉수를 사용할 때, 첫 번째 시린지는 비어 있어야 합니다. 로봇을 작동시킵니다. 각 튜브의 상층액은 빈 시린지로 흡입되고, 두 번째 펌프가 튜브에 냉수를 주입합니다.이 단계는 나노입자 현탁액에서 반응하지 않은 시약을 제거하기 위해 수행됩니다. 다음으로, 이전에 시연한 바와 같이 초음파 처리를 통해 나노입자 현탁액을 균질화합니다. 그 후 튜브를 12,000 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다.로봇 장치를 사용하여 냉수로 2차 세척을 수행합니다. 두 번째 반응 부하를 위해 나노입자 샘플당 12당량의 EDC를 첫 번째 펌프에, 나노입자 샘플당 12당량의 NHS를 두 번째 펌프에 넣습니다. 로봇 플랫폼을 작동시켜 나노입자가 포함된 튜브에 적절한 부피를 분주합니다. EDC와 NHS가 존재하면 나노입자 표면에 이미 부착된 ethylene dite의 아민기와 보호된 당의 카복실산기 사이에 아미드 결합이 형성됩니다.증착이 완료되면 특정 당류 10당량을 로드합니다. 본 실험에서는 유당(lactose)과 사용 가능한 두 개의 펌프에 글리콜산(glycolic acid) 대조군을 사용하였습니다. 각 당류는 각 튜브에서 달성하고자 하는 기능화 목적에 따라 시험관에 증착되며, 이는 해당 반응에 사용되는 액추에이터 및 펌프 기능을 작동시키기 위해 활용되는 lab view 프로그램에 사전에 프로그래밍되어 있습니다. 본 연구에서 탄수화물 부착을 위해 글리콜산을 링커 대조군으로 사용하는 이유는, 고도로 보호된 당류에 이미 이 분자가 공유 결합으로 연결되어 있어 나노입자 표면에 추가로 부착될 수 있기 때문입니다.나노입자 현탁액을 이전과 동일하게 초음파 처리하여 균질화한 후, 4°C에서 지속적으로 회전시키며 9시간 동안 배양합니다. 배양 후 나노입자 현탁액을 원심분리하여 상층액을 제거함으로써 세척하고, 펠렛을 차가운 물에 다시 현탁시킨 후 초음파 처리합니다. 기능화된 나노입자 라이브러리가 포함된 튜브를 진공 챔버에 넣고 최소 2시간 동안 건조합니다. 기능화된 나노입자는 동적 광산란법 및 기타 방법으로 분석하여 표면 조성, 농도, 입자 크기, 크기 분포 및 표면 전하를 평가합니다.여기에 표시된 완전히 보호된 diano 측쇄는 자동화 플랫폼을 사용하여 합성되었습니다. 합성된 화합물은 VXR 400 megahertz 분광계의 proton NMR을 통해 특성을 분석하였습니다. CDC 13을 용매로 사용하였으며, 몇 가지 특징적인 피크의 존재를 통해 생성물의 형성을 확인할 수 있습니다.프로톤 NMR 도표에서 1.79에서 2.21 사이의 프로톤 4개와 3.38의 프로톤 2개는 florist tag에서 유래한 것입니다. 2.16의 싱글렛 피크는 아세테이트 피크에 해당하며, 4.94와 5.11의 피크는 나노입자의 최종 형태와 당 결합 정도에 반응 시간이 미치는 영향을 평가하기 위한 아노머 프로톤(anomeric protons)입니다. 여기에서 보여지는 바와 같이 반응 시간을 늘림에 따라 나노입자가 기능화되었으며, 50 50 CPT CPH 나노입자 표면의 diano 농도는 총 반응 시간에 따라 증가하여 18시간 후에 최대치에 도달했습니다.총 반응 시간이 24시간인 기능화된 나노입자를 사용하여, 여기에서 보여주는 바와 같이 유세포 분석법을 통해 마우스 골수 유래 수지상 세포의 CLR 표적 능력을 평가했습니다. 기능화되지 않은 나노입자와 락토오스 및 다노로 기능화된 나노입자로 자극한 후, C형 렉틴 수용체에 대한 DC-SIGN 및 mannose 수용체의 발현 증가가 관찰되었습니다. 이는 효과적인 표적화가 이루어졌음을 나타냅니다.하지만 Diano로 기능화된 입자는 더 높은 발현 수준을 보였으며, 이는 연구된 수용체에 대해 이 리간드가 특이성을 가짐을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 올리고당의 고처리량 자동 합성뿐만 아니라 고분자 나노입자의 기능화 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 탄수화물 기반 표적 제제를 사용하여, 공여체 및 수용체 보호당의 합성과 장치 조립법을 숙달하면 24~48시간 이내에 완료할 수 있습니다.물론 소요 시간은 라이브러리의 크기와 기능화 시간에 따라 달라집니다. 이 방법을 수행할 때, 나노입자의 화학적 성질에 따라 생분해성 폴리 하이드로 입자의 기능화 반응 조건을 최적화할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따르면 다양한 구조의 탄수화물을 합성할 수 있으며, 이를 통해 서로 다른 세포 수용체를 표적으로 삼아 면역학적 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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Polyanhydride의 Nanoparticles의 높은 처리량 탄수화물의 합성과 작용화

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