Polyanhydride의 Nanoparticles의 높은 처리량 탄수화물의 합성과 작용화

이 비디오 기사에서는 올리고당의 자동화된 용액상 합성과 폴리 anhy 나노 입자의 기능화를 위한 새로운 하이드로 풋 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 탄수화물 기반 표적화제를 사용하면 고체상 합성기 대신 용액상 합성을 활용하는 자동화 시스템을 사용하여 첫 번째 탄수화물 분자를 합성할 수 있습니다. 다음으로, 올리고당 중간체는 플로리스트, 고체상 추출 또는 FSPE에 의해 정제됩니다.

생성된 탄수화물 분자는 NMR을 특징으로 한 다음 탄수화물 IDE 접합에 의해 폴리 무수물 나노 입자에 부착됩니다. 마지막으로, 탄수화물 기능화 나노 입자는 X 선 광 전자 분광법과 하이드로 퍼트 페닐 황산 분석법으로 특징 지어집니다. 궁극적으로, 여기에 설명된 하이드로 풋 방법론을 활용하여 입자 표면의 나노 입자 형태 및 탄수화물 밀도를 최적화하기 위한 반응 조건을 얻었습니다.

고체 표면 올리고당 합성과 같은 기존 방법에 비해 이 방법의 주요 장점은 이 방법에서 훨씬 더 적은 양의 빌딩 블록을 사용한다는 것입니다.이 방법에서는 일반적으로 10-20개의 등가물 대신 2-3개의 등가물을 사용합니다. 우리는 표면 효과의 효능, 폴리 하이드로 나노 입자의 기능화, 탄수화물을 사용하여 덴팅 방지 세포의 ceep 수용체를 표적으로 삼는 효능을 입증할 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 그런 다음 우리는 이러한 새로운 캐리어의 제조 및 적용과 관련된 여러 매개변수를 스크리닝할 수 있는 고처리량 시스템을 설계하고 싶었습니다.

이 방법의 시각적 시연은 올리고당의 고처리량 합성 및 고분자 입자에 대한 부착을 위한 자동화 플랫폼의 개발이 디아노산의 자동 합성 이전에 사용할 수 있는 문서가 많지 않은 새로운 연구 영역이기 때문에 매우 중요합니다. 적절하게 보호된 설탕 공여체, 일반적으로 트리 클로로 아세트아미드는 주로 Alcon, 불소 알코올을 벤치탑에서 합성하고 클로로 메탄에서 제조하며 또한 트리메틸 사일로, 클로로 메탄, 80% 메탄올 및 100% 메탄올 중 트리플루오로 메탄 설포네이트를 제조합니다. 자동화 챔버에서 실내의 상대 습도가 30% 이하인지 확인하십시오.

높은 습도는 당화(glycosylation) 반응에 해롭습니다. 다음 단계는 자동화 플랫폼을 사용하여 수행됩니다. 첫 번째 당화는 공여자와 플로리스트 알코올로 수행됩니다.

완료되면 생성된 플로리스트 태그 설탕 분자는 FSPE에 의해 정제됩니다. 그런 다음 임시 보호 그룹은 나트륨, 메타민 산화물 및 메탄올에 의해 제거되고 다시 한 번 FSPE에 의해 생성물이 정제됩니다. 그 후, 플로리스트 태그 설탕은 수용체로 사용되며 이당류를 얻기 위해 동일한 기증자에 결합되며, 이당류는 FSPE에 의해 정제되어 시작됩니다.

로봇 플랫폼에 공여체 수용체 프로모터, 80% 메탄올 물, 100% 메탄올, 메탐산나트륨을 포함한 시약을 놓고 프로그램을 시작합니다. 로봇 팔은 바이알에서 기증자와 수용체를 빼내어 반응 바이알로 옮깁니다. 그런 다음 공여체와 수용체의 혼합물을 30 분 동안 교반합니다.

30분이 지난 후. 로봇 팔은 촉매 트리메틸 사일로, 트리 플루오로, 메탄 설포네이트를 혼합물로 전달합니다. 그런 다음 용액을 추가로 30분 동안 교반합니다.교반이 완료된 후 프로그램이 일시 중지됩니다.

10마이크로리터의 부분 표본을 제거하여 박층 크로마토그래피로 반응이 완료되었는지 확인합니다. 반응이 완료되면 수용체 분자가 보이지 않습니다. 반응이 완료되지 않은 경우 TLC의 수용체가 계속 표시됩니다.

이 경우 프로그램을 중지하고 당화 타이밍을 약 30분 동안 재설정한 다음 프로모터 트리메틸 사일로, 트리플루오로, 메탄 설포네이트를 초과량 첨가하십시오. 반응이 완료되면 다음 단계를 계속합니다. 반응이 완료되면 로봇은 정제를 위해 반응 혼합물을 C nine F 17 변형 실리카겔이 포함된 FSPE 카트리지로 옮깁니다.

다음으로, 카트리지를 8 밀리리터의 80 % 메탄올로 세척 한 다음 8 밀리리터의 100 % 메탄올로 세척합니다. 비 floris 분획을 삭제하기 위하여는, 교류는 원한 florist 표를 붙인 제품을 얻기 위하여 유리병에서 모아집니다. 추가 정제가 필요한 경우 로봇을 일시 중지하고 적절한 반응 생성물을 제거하십시오.

구조에 따라 공여자는 매우 무반응일 수 있으며 충분한 프로모터를 추가한 후에도 일부 플로리스트 수용체 분자가 남게 됩니다. 이 경우 FSPE는 정제에 충분히 효율적이지 않으며 정제 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통한 추가 정제를 수행할 수 있습니다. 정제 후 로봇 팔이 반응 바이알에 메트옥수소를 분주합니다. 그런 다음 로봇 플랫폼에서 2시간 동안 반응을 교반하고, TLC에 의해 결정된 대로 완료되지 않은 경우 배양 기간을 약 1시간 연장합니다.

반응 완료 후, 생성물은 이전과 같이 FSPE에 의해 정제됩니다. 다음으로, 로봇과 무수 톨루엔에 용해된 벤치탑에서 반응 생성물을 제거한 다음 증발시켜 잔류 수분을 제거합니다. 샘플이 건조되면 FSPE에 의한 당화(glycosylation) 정제를 포함한 동일한 주기 동안 로봇에 다시 넣습니다.

자동화에서 얻은 보호 제품을 보호하기 위해 대상 분자에 대해 원하는 사슬 길이를 얻을 때까지 임시 보호 그룹의 깊은 보호 후 글리코실화를 반복하고 로봇에서 바이알을 제거합니다. 절차의 마지막 단계는 폭발성 수소 가스를 사용하며 자동화 플랫폼 외부에서 수행해야 합니다. 탁상용 온스에서 플로리스트 태그의 이중 결합의 용해가 발생하고 생성된 알데히드가 카르복실산으로 산화됩니다.

결과 생성물을 디클로로 메탄에 30% 메탄올의 혼합물을 사용하여 벤치 탑에서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제합니다. 마지막으로, 팔라듐 촉매 수소화에 의해 벤조 에테르 그룹을 보호하기 위해, 팔라듐을 제거하기 위해 위성 패드를 통해 제품을 통과시켜 순수한 최종 제품을 얻으십시오. 핵 자기 공명 또는 NMR 분광법을 사용하여 제품을 완전히 특성화합니다.

고당률 고분자 합성 및 나노 입자 제조는 Peterson et al.에 의해 설명된 프로토콜에 따라 수행됩니다. 첨부 문서에서 언급된 바와 같이, 입자 기능화에 사용되는 자동 증착 장치는 3개의 ne 1000 펌프, 2개의 액추에이터에 의해 통합된 로봇 스테이지, 하나는 X 방향으로의 이동을 위한 것이고 다른 하나는 Y 방향으로의 이동을 위한 것이고, 3개의 액추에이터로 구성된 2개의 인접한 랙을 갖는 두 번째 로봇 스테이지로 구성되며, 각 방향에 하나씩 펌프와 총 5개의 액추에이터가 연결됩니다. 직렬 액추에이터와 펌프는 랩 뷰 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터에 의해 작동됩니다.

입자 제조에 사용되는 공중 합체 시스템은 SEBA 산 또는 SA 및 1 6 bis, 파라 카르복시, 옥실 히안 또는 CPH 및 1 8 BIS 파라 카르복시 페녹시 3 6 다이옥산 또는 CP Teeg를 기본으로합니다. 나노입자 제조 장소에 이어, 나노입자 라이브러리가 있는 1.7 ml의 원심분리관을 담은 랙을 리니어 액추에이터 스테이지에 올려 폴리항안 입자 표면에 탄수화물을 부착하고, 1차 반응에 대해 2회 연속 반응으로 구성된 평균 카르복실산 결합 반응을 수행한다. 프로그래밍 가능한 주사기 펌프의 주사기에 나노 입자 1mg당 2mg과 나노 입자 1mg당 0.6mg의 농도로 EDC와 에틸렌 디아민 수용액을 채웁니다.

프로그래밍 가능한 주사기 펌프에 두 번째 주사기에 나노 입자 샘플당 총 12개의 NHSA 입자 1mg당 2.5mg을 채웁니다. 다음으로, lab view 프로그램을 사용하여 로봇에게 시약 현탁액을 나노 입자 라이브러리에 증착하도록 지시합니다. 그런 다음 로봇 액추에이터는 솔루션, EDC 및 NHS의 분배를 위해 튜브 홀더를 플랫폼의 올바른 위치로 이동합니다.

폴리 무수물 나노 입자의 표면에서 카르 복실 산기를 활성화하고 평균 커플 링을 허용합니다. 다음으로, 초음파 처리 프로브를 각 튜브에 담그고 40 헤르츠에서 30 초 동안 각 샘플을 초음파 처리합니다. 다음 샘플로 이동하기 전에 아세톤으로 프로브를 청소하십시오.

모든 샘플이 충족되면 튜브 홀더가 로봇 플랫폼에서 분리됩니다. 나노 입자 현탁액을 섭씨 4도에서 일정한 회전으로 9시간 동안 배양합니다. 첫 번째 및 두 번째 반응에 대한 반응 시간을 변경하여 최종 당류 농도를 조정할 수 있습니다.

반응이 완료된 후에, 12, 5 분 동안 000 시간 G에 관을 분리기. 추운 환경에서는 로봇 스테이션으로 돌아갑니다. 튜브 홀더를 로봇 팔에 다시 부착하고 로봇 플랫폼에 두 번째 주사기를 채웁니다.

찬물을 사용하면 첫 번째 주사기는 비어 있어야 합니다. 로봇을 시작합니다. 각 튜브의 상등액은 빈 주사기로 빼내고 두 번째 펌프는 튜브에 냉수를 침전합니다.

이 단계는 나노입자 현탁액에서 불반응성 시약을 제거하기 위해 수행됩니다. 다음으로, 앞에서 설명한 바와 같이 초음파 처리에 의해 나노 입자 현탁액을 균질화합니다. 다음 12, 5 분 동안 000 시간 G에 관을 분리기하십시오.

두 번째 반응을 위해 로봇 장치를 사용하여 찬물로 두 번째 세척을 수행하고 EDC의 나노 입자 샘플당 12등가물을 첫 번째 펌프에 로드하고 NHS의 나노 입자 샘플당 12 등가물을 두 번째 펌프에 로드합니다. 로봇 플랫폼을 시작하여 나노 입자가 들어 있는 튜브에 적절한 부피를 분배합니다. EDC와 NHS의 존재는 이미 나노 입자 표면에 부착 된 에틸렌 다이트의 아민 그룹과 깊은 보호 설탕의 카르 복실 산 그룹 사이에 아미드 결합을 형성 할 수 있습니다.

증착이 완료되면 특정 당류에 해당하는 10개를 로드합니다. 이 경우, 유당이 사용되었고 글리콜산이 사용 가능한 두 개의 펌프에서 제어되었습니다. 각 당류는 각 튜브에서 달성하고자 하는 기능화에 따라 시험관에 증착되며, 이는 이전에 실험실 보기 프로그램에서 프로그래밍되어 특정 반응에 대한 액추에이터 및 펌프 기능을 작동하는 데 사용되며, 탄수화물의 부착을 위한 이 연구에서 글리콜산은 깊은 보호 당류가 이미 이 분자를 공유 결합으로 가지고 있기 때문에 링커 제어로 사용됩니다. 이는 나노 입자 표면에 더 부착 할 수 있습니다.

나노 입자 현탁액은 이전과 같이 초음파 처리에 의해 균질화 된 다음 섭씨 4도에서 일정한 회전으로 9 시간 동안 배양됩니다. 배양 후 상층액을 제거하여 나노 입자 현탁액을 원심 분리하여 세척 한 다음 Resus가 펠릿을 찬물에 현탁시키고 진공 챔버에 기능화 된 나노 입자 라이브러리를 포함하는 튜브를 음파 처리하여 최소 2 시간 동안 건조시킵니다. 기능화된 나노 입자는 동적 광 산란 및 표면 구성, 농도, 입자 크기, 크기 분포 및 표면 전하를 평가하는 기타 방법을 특징으로 합니다.

여기에 표시된 완전히 보호된 디아노 측은 자동화 플랫폼을 사용하여 합성되었습니다. 합성된 화합물은 VXR 400 메가헤르츠 분광계에서 양성자 NMR로 특성화되었습니다. CDC 13을 용매로 사용하면 몇 가지 특징적인 피크의 존재로부터 생성물의 형성을 확인할 수 있습니다.

양성자 NMR 다이어그램에서 1.79에서 2.21 사이의 4개의 양성자와 3.38의 2개의 양성자는 플로리스트 태그에서 가져온 것입니다. 2.16의 일중항 피크는 아세테이트 피크에 해당하고, 4.94 및 5.11의 피크는 나노 입자의 최종 형태에 대한 반응 시간의 영향과 달성된 당 부착 정도를 평가하기 위한 아노머 양성자입니다. 나노 입자는 반응 시간이 증가함에 따라 기능화되었으며, 50 50 CPT CPH 나노 입자의 표면 상의 디아 노 농도는 총 반응 시간에 따라 증가하여 18 시간 후에 최대에 도달했다.

그런 다음 총 반응 시간 24시간으로 기능화된 나노 입자를 사용하여 유세포 분석을 사용하여 마우스 골수 유래 수지상 세포에서 CLR을 표적으로 하는 능력을 평가했습니다. DC 징후 및 C형 렉틴 수용체에 대한 마노 수용체의 발현 증가는 비기능화 및 유당 및 다노 기능화된 나노 입자로 자극 후 관찰되었습니다. 이는 효과적인 타겟팅을 나타냅니다.

그러나 Diano 기능화 입자는 연구된 수용체에 대한 이 리간드의 특이성을 나타내는 더 높은 수준의 발현을 보여주었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 올리고당의 고처리량 자동 합성과 폴리 나노입자의 기능화를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 표적 에이전트에서 이러한 탄수화물 염기를 사용하여, 일단 기증자 수용체 보호 설탕의 합성을 마스터하고, 장치의 조립은 24-48 시간 내에 수행 할 수 있습니다.

물론 시간 길이는 라이브러리의 크기와 기능화 시간에 따라 달라집니다. 이 방법에 참석하는 동안 나노 입자 화학에 따라 생분해성 폴리 하이드로 입자의 기능화의 반응 조건을 최적화할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따르면 다양한 세포 수용체를 표적으로 하여 면역학적 결과에 영향을 미치기 위해 다양한 탄수화물 구조를 합성할 수 있습니다.