자동화 모​​듈 높은 처리량 엑소 폴리 사카 라이드 심사 플랫폼은 매우 민감한 탄수화물 지문 분석과 결합

이 접근 방식의 전반적인 목표는 미생물 외다당류 생산자에 대한 빠르고 신뢰할 수 있는 스크리닝과 탄수화물 지문 식별입니다. 이것은 아직 밝혀지지 않은 다양한 외다당류를 활용하기 위한 필수 단계입니다. 우리의 방법은 미생물 외다당류 분야에서 고분자 연구를 가속화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이를 통해 특정 응용 분야에 대해 다양한 특성을 가진 새로운 다당류 변형체를 빠르게 식별할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 서로 다른 외다당류 검출 시스템을 모듈식의 완전 자동화된 스크리닝 개념에 결합한다는 것입니다. 이것은 매우 빠르고 신뢰할 수 있습니다.

이 기술은 자동화 플랫폼을 사용할 수 없는 실험실에서 수동으로 수행할 수도 있으므로 사용이 매우 유연하며 다양한 스크리닝 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다. 이 외다당류 또는 EPS 스크리닝 플랫폼은 모듈식 설정을 갖추고 있어 프로토콜을 Automated Screening과 Carbohydrate Fingerprinting의 두 가지 주요 부분으로 분리할 수 있습니다. 첫 번째 작업은 스크리닝을 위해 균주를 배양하고 원심분리로 세포를 제거하는 것입니다.

균주는 섭씨 30도 및 1, 000 RPM에서 마이크로 역가 플레이트 셰이커에서 통기성 밀봉 필름으로 덮인 96웰 플레이트의 탄소원으로 포도당에서 배양됩니다. 상영 당일에는 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 로봇 작업대와 보관 캐러셀을 준비합니다. 플레이트에서 통기성 밀봉 필름을 제거하고 캐러셀 위치 1-1에서 1-4에 주요 배양물을 할당합니다.

자동화된 로봇 프로그램을 시작합니다. 배양 후 세포를 제거하려면 캐러셀의 주요 배양 딥 웰 플레이트를 원심분리기로 옮기고 4, 300 x g 및 섭씨 20도에서 30분 동안 원심분리합니다. 여과 전 침전을 위해 마이크로 역가 플레이트와 pH 지시자 마이크로 역가 플레이트를 캐러셀에서 작업대로 이동합니다.

또한 모든 박테리아 세포를 완전히 제거할 수 있는 여과 플레이트를 수집기 플레이트와 함께 작업대 위치로 옮깁니다. 원심분리 후 180마이크로리터의 주배양 상층액을 여과판으로 이송합니다. 주 배양 상층액에서 150마이크로리터를 흡입하고 여과 전 침전을 위해 마이크로 역가 플레이트에 50마이크로리터를 분주하고 pH 지시 플레이트에 100마이크로리터를 분주합니다.

EPS 생산을 평가하기 위해 2-프로판올을 사용한 상등액의 침전을 수행합니다. 12.5ml 다단계 피펫을 사용하여 각 웰에 150마이크로리터의 2-프로판올을 수동으로 추가합니다. 마이크로 역가 플레이트를 실온에서 900RPM으로 10분 동안 흔든 후 EPS 생성을 나타내는 섬유 또는 플레이크 형성을 육안으로 관찰합니다.

주요 배양 플레이트를 캐러셀에 다시 보관한 후 발효 국물을 검사하면 원심분리 후 침전이 감소해야 합니다. 점도의 증가는 EPS 생산의 또 다른 지표입니다. 두 번째 작업은 96웰 여과를 통해 점성이 있는 발효 배지에서 세포를 완전히 제거하는 것입니다.

여과판을 3, 000 x g 및 섭씨 20도에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 플레이트를 캐러셀 홈 위치로 되돌리고 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 겔 여과의 평형을 수행합니다. 다음으로, 35마이크로리터의 여과액을 평형 겔 여과판의 중앙에 피펫팅하고, 50마이크로리터를 침전에 사용되는 마이크로 역가 플레이트에 피펫

겔 여과 플레이트를 원심분리기로 옮기고 작업대의 다른 모든 플레이트를 캐러셀의 홈 위치로 다시 이동합니다. 모든 플레이트를 캐러셀에 다시 보관한 후 필터 플레이트의 잔류물로 표시된 대로 점성이 높은 상등액을 기록해 두십시오. 여과액이 부족하면 다음 분석 모듈에서 위음성 결과가 발생할 수 있습니다.

자동 스크리닝의 세 번째 작업은 96웰 겔 여과를 통해 성장 배지에서 남아 있는 단량체 당을 제거하는 것입니다. 젤 여과 플레이트를 1, 000 x g 및 섭씨 20도에서 2분 동안 원심분리합니다. 겔 여과액을 처리하기 위해 로봇 매니퓰레이터를 통해 작업대를 준비합니다.

겔 여과 후 남아 있는 포도당을 감지하기 위해 50마이크로리터 팁을 사용하여 25마이크로리터의 이중 증류수를 새 마이크로 역가 플레이트로 옮깁니다. 20마이크로리터의 이중 증류수, 5마이크로리터의 공기, 5마이크로리터의 겔 여과액을 흡입하고 동일한 플레이트에 분배합니다. 200마이크로리터 팁을 취하고 작업대 위치 1-2에서 50마이크로리터의 포도당 분석 시약 혼합물을 흡입하여 첫 번째 분석을 시작합니다.

마이크로 타이터 플레이트를 인큐베이터로 옮깁니다. 30분 배양 후 플레이트를 인큐베이터에서 마이크로 역가 리더로 옮기고 418 및 480 나노미터에서 흡광도를 기록합니다. 페놀-황산법으로 총 탄수화물 함량을 측정하려면 20마이크로리터의 겔 여과액을 마이크로 역가 플레이트에 피펫팅합니다.

캐러셀에서 플레이트를 수동으로 제거하고 액체 취급 스테이션에 놓습니다. 서로 다른 포도당 농도의 20마이크로리터가 있는 교정 플레이트를 삼중으로 포함합니다. 위치 1에는 폐기물 용기를, 위치 2에는 300마이크로리터 팁 상자를, 위치 3에는 갓 준비한 페놀-황산 110밀리리터가 들어 있는 250밀리리터 물통을 놓습니다.

300마이크로리터 팁이 있는 8채널 피펫을 사용하여 180마이크로리터의 페놀-황산을 모든 플레이트의 각 행으로 옮깁니다. 모든 마이크로 역가 플레이트를 뚜껑으로 덮고 실온에서 900RPM으로 5분 동안 흔들어 혼합합니다. 색 반응을 위해 오븐에서 섭씨 80도에서 35분 동안 배양합니다.

흄 후드 아래에서 플레이트를 냉각시킨 후 480나노미터에서 소멸을 측정합니다. 자동 스크리닝의 균주는 다음 세 가지 기준 중 두 가지 이상을 충족하는 경우 EPS 양성으로 지정됩니다. 점도 제어, 폴리머 검출 및 계산된 포도당 등가물.

포도당 당량은 이 방정식을 사용하여 계산됩니다. 스크리닝 플랫폼의 Carbohydrate Fingerprint에는 수동으로 수행되는 마지막 세 가지 작업이 포함되어 있습니다. 작업 2에서 positive hits의 나머지 여과액은 작업 5에서 gel-filtrate의 기초를 제공합니다.

여섯 번째 작업은 겔 여과액의 96웰 마이크로 하이드분해입니다. 이를 위해 먼저 12채널 50마이크로리터 피펫을 사용하여 20마이크로리터의 겔 여과액을 새 PCR 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 1.25ml의 다단계 피펫을 사용하여 각 웰에 4몰 트리플루오로아세트산 20마이크로리터를 추가합니다.

PCR 플레이트를 열가소성 엘라스토머 캡 매트로 덮고 PCR 플레이트를 특수 CL에 놓습니다.amp잉 장치. cl을 반전하여 용액을 혼합합니다.amping 장치를 10회 반복합니다. PCR 플레이트를 원심 분리하고 클램핑 장치에 고정한 후 고정된 클램핑 장치를 예열된 모래 수조에 넣고 섭씨 121도에서 90분 동안 배양합니다.

12채널 200마이크로리터 피펫을 사용하여 3.2% 암모니아 용액을 추가하여 pH를 약 8로 조정합니다. PCR 플레이트를 열가소성 엘라스토머 캡 매트로 덮고 클램핑 장치를 사용하여 수동으로 흔듭니다. 마지막 작업은 high-throughput-1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone 또는 HTPMP 방법을 통해 탄수화물 지문을 분석하는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 12채널 50마이크로리터 피펫을 사용하여 25마이크로리터의 중화된 가수분해물을 새 PCR 플레이트로 옮깁니다. 75마이크로리터의 유도체화 시약 혼합물을 추가하고 열가소성 엘라스토머 캡 매트로 플레이트를 덮습니다. PCR 플레이트를 섭씨 70도의 PCR 사이클러에 100분 동안 놓고 섭씨 20도까지 냉각합니다.

20마이크로리터 분취액을 새 마이크로 타이터 플레이트로 옮긴 다음 12채널 200마이크로리터 피펫을 사용하여 각 라인에 130마이크로리터의 19.23밀리몰 아세트산을 추가합니다. 흡입 및 분주를 통해 최소 6회 직접 혼합하고 모든 액체를 마이크로 적정 수집기 플레이트가 있는 0.2마이크로미터 필터 플레이트로 옮깁니다. 1, 000 x g에서 5분 동안 플레이트를 원심분리하고 필터 플레이트를 제거한 다음 마이크로 타이터 수집기 플레이트를 실리콘 캡 매트로 밀봉합니다.

탄수화물 지문을 측정하기 위해 마이크로 역가 플레이트를 UHPLC-UV-ESI-MS에 놓습니다. 이 표는 이 스크리닝 플랫폼으로 성공적으로 확인된 세 가지 예시적인 새로운 균주의 결과를 보여줍니다. 표의 왼쪽 부분에는 점도 형성, 폴리머 생산 및 총 가수분해로 인한 포도당 당량에 관한 자동 스크리닝 모듈의 결과가 표시되며, 이는 상세한 탄수화물 지문 분석을 위한 평가 매개변수로 사용되었습니다.

보정된 당과 알려지지 않은 당, 이량체 및 치환체를 기반으로 하는 탄수화물 지문은 표의 오른쪽 부분에 나와 있습니다. 이 정보를 사용하여 단량체 조성을 계산하고 이미 알려진 고분자 구조와 비교할 수 있습니다. 또한, 흥미로운 단량체 조성물 및 희귀 탄수화물에 대한 표적 스크리닝을 수행할 수 있습니다.

이 기술을 마스터하면 단 5시간 이내에 386개의 균주에 대해 수행할 수 있습니다. 이 절차에 따라 이미 존재하는 피루브산과 같은 추가 분석 또는 아세테이트 또는 인산염에 대한 추가 분석을 포함하여 외다당류 선언에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 높은 감도로 인해 유전자 공학, 미생물 외다당류 생산자 분야에서 변형된 외다당류 생합성 경로가 존재하는 화학 구조에 미치는 영향을 탐구하기 위한 연구의 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 매우 빠르고 신뢰할 수 있는 방식으로 새로운 외다당류 생산자를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.