Name: 자동화 모듈 높은 처리량 엑소 폴리 사카 라이드 심사 플랫폼은 매우 민감한 탄수화물 지문 분석과 결합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 배우세요 자동화 고처리량 엑소폴리사카라이드 선별법으로 미생물 다당류 생산균을 신속하게 식별하고 탄수화물 지문을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 중합체 연구를 가속화합니다.

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액체 처리 시스템에 대한 프로그래밍 및 기술 지원을 제공해 주신 Thomas Howe와 Jörg Carsten에게 진심으로 감사드립니다.

<ol><li>Milani, J., Maleki, G. Ch. 2, Hydrocolloids in Food Industry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMilani%2C+J+%22Food+Industrial+Processes+-+Methods+and+Equipment%22">Food Industrial Processes - Methods and Equipment</a>. Valdez, B. 2, InTech. (2012).</li>
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<li>Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+carbohydrate+analysis+via+liquid+chromatography+coupled+with+ultra+violet+and+electrospray+ionization+ion+trap+detection+in+96-well+format%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Fast carbohydrate analysis via liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection in 96-well format.</a> J. Chromatogr. A. 1350, 44-50 (2014).</li>
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우리는 공개할 것이 없습니다.

페놀 - 황산 방법 다당류 감지 : 다른 단당류는이 방법 (9)를 이용하여 서로 다른 최대 흡수와 몰 흡광 계수를 보여줍니다. 이것은 상이한 양의 여러 당류를 함유 중합체, 다양한 최대 흡수를 초래한다. 16 다른 시판 중합체의 최대 흡수의 상이한 파장을 표 5에 나타내었다. 중합체 (1 ㎍ / L)에 용해시켰다 DDH 2 O로 (150 RPM) 밤새 교반 페놀 황산 - 방법으로 측정 . Diutan 검 470 nm 내지 scleroglucan 히알루 론산 484 nm에서 최고 최저 최대 흡수를 보였다. 이러한 결과를 바탕으로 480 nm의이 선별 플랫폼에 대한 선택되었다. 중합체의 상대적인 흡광도 (100 %로 설정) 1g / L의 글루코스 얻어진 흡광도에 기초하여 산출 하였다. 최저 결과는 92 %로 모두 scleroglucan 및 succinoglycan 수득 하였다. 이 특급했다scleroglucan는 포도당을 포함하고 succinoglycan 7의 비율로 포도당과 갈락토오스가 포함되어 있기 때문에 반사된다 : 1. 상업용 폴리머 건조 및 다른 회분 함량 다른 손실을 가지고, 이것은 ~ 110 %의 이론적 인 값에 도달하지 않은 이유이다. 자일란 311 %의 높은 상대 흡광도를 나타냈다. 이러한 이유 때문에 보이면서 퓨 라노스 형태 자일 로스로 달성 높은 몰 흡광 계수이다. 0.1 g / L의 글루코스의 수준 정량 한계에 도달하고,뿐만 아니라 농도 &lt;0.05 g / L의 검출 한계. 그러나, 스크리닝에서 양성 균주에 대한 검출 한계 이상 0.7 g / L이고, 따라서, 상기 분석은 우수한 성능을 보였다. 신뢰성있는 결과를 얻기 위해, 겔 여과 후 남은 글루코스는 글루코스 세이로 측정하고,이 값은 페놀 - 황산 방법의 값으로부터 감산한다. 자동화 된 포도당 분석 희석 : 성능재배 (희석 1 : 100) 후에 글루코스 판정 조사 하였다. 이를 위해, 10 μL의 상등액을 흡인하고,이 희석액 180 ㎕를 디스 펜싱을 통하여 열 배 깊은 웰 플레이트 DDH 2 O 990 μL에 옮기고, 혼합 하였다. 두번째 중요한 단계는 겔 여과 후 글루코오스 분석에서 1시 10분 희석 5 μL 분취 정확한 피펫 팅 하였다. DDH 2 O의 희석액 25 μl를 생성하기 위해 제 50 μL 팁으로 옮기고, DDH 2 O 5 ㎕를 겔 여과 후 20 μL 함께 흡입 하였다. 이것은 선단에서 5 μL 분취 더 나은 제거를 보장한다. 두 희석 단계가 포도당 분석을 통해 다양한 포도당 표준을 확인 하였다. 두 실시 농도에 대한 결과를 표 6에 제시되어있다 : 1. 100 희석 포도당 함량의 측정을위한 배양은 CV &amp; # 함께 모두 표준 고정밀 나타났다 후에60 1.2 %. 동시에, 높은 표준 정확도는 11.6 (% 에러)까지이다. 글루코오스 판정 배양 후에 만​​ 남은 글루코스 콘텐츠를 나타내고, 따라서 중합체 검출 중요하지 않다하지만, 이는 무시할 수있다. 겔 여과 후 남은 포도당의 1시 10분 희석은 CV &lt;1.4 %와 정확도 &lt;2.1 %의 오류와 함​​께 매우 신뢰할 수있는 결과를 보여 주었다. 증발의 고려 사항 : 심사는 최초의 포도당 분석하는 첫 번째 단계에서 3.5 시간이 필요합니다. 이 기간은 캡핑 MTP 저장소에 영향을 미치는 것인지, 알아 내기 위해, 글루코오스 분석 교정 표준의 50 μL 함께 로봇 컨베이어에서 3.5 시간 동안 커버없이 저장 하였다. 교정 범위 (45-4.5 ㎎ / ℓ)에서 시료 농도는 거의 증가하지 않는다. 증가 - 증발에 의해 발생은 - 2.1 % 이하 만이 가장 낮은 농도 (1.8 및 0.9 ㎎ / ℓ)은 12.4 %까지 도달 (위해이었다 <str옹&gt; 표 7). 겔 여과 : 비 글루코스 대사의 많은 양이 가수 분해 중합체 글루코오스 정량 검출을 방해. 따라서, 겔 여과 단계 배양 후 남은 글루코스를 제거해야한다. 또한, 겔 여과 단량체 분석 분석 백그라운드를 최소화하기 위해, 글루코스보다 염 및 탄수화물 단량체 화합물 등으로부터 상층 액을 함유하는 중합체를 정화한다. 겔 여과 단계에서 여과 액 35 μL를 웰의 중앙에 배치했다. 자동화 된 시스템의 겔 여과의 안정성 검증을 위해, 9g / L 포도당 최대 0.045에서 팔 교정 표준을 여과 하였다 (N = 8). 모든 농도의 글루코스는 항상 초기 값 (표 8)의 95 % 이상 감소 하였다. 이 과정에서 겔 여과 포도당의 다양한 농도에 매우 좋은 결과를 보여 주었다. 또한, 잔류 글루코스 겔 F 후iltration 또한 글루코오스 분석으로 결정되고 가수 분해 중합체 포도당 당량의 정확한 양을 수신 페놀 황산 판정로부터 감산 하였다. 피루 베이트 세이 : 첫째는, 상기 가수 분해 단계에서 중화 희석 (1시 10분) TFA 매트릭스는 효소 반응을 방해하는지 여부를 조사 하였다. 따라서, 전체 분석은 한 시간과 한 번 매트릭스없이, 두 번 수행하고 신뢰할 수있는 결과를 보여 주었다. 마지막으로, 16 개의 시판되는 중합체의 피루브산 콘텐츠 성공적 측정하고,도 3에 도시되어있다. 일반적으로 이들 중합체에서 16 만 succinoglycan 잔탄 자연스럽게 피루브산을 함유하는 것이 알려져있다. 우리 피루브산 시험 법으로 이들 중합체는 모두 정확하게 식별되었다. scleroglucan에서, 웰란 검 및 크 실란 피루 베이트는 상당한 양의 검출되었다. 전반적으로, 접근 방식의 기능을 검증하고, 피루 베이트 - 분석의 한높은 성능을 howed. 이 가수 분해 후, 다른 중합체의 피루브산을 검출 할 것을 알았다. 탄수화물 지문 : 자동화 된 검사의 모든 분석 모듈을 수행 한 후, 잠재적 EPS 생산은 탄수화물 지문 분석을 위해 선정되었다. 이를 위해 여러 가지 기준을 적용 하였다 : 점도 1) 포지티브 관찰 원심 분리 및 / 또는 여과 후. 2) 강수 전 여과 후. 관측 된 섬유 조각은 긍정적으로 평가 하였다. 페놀 - 황산 방법 3) 포도당 해당하는 값입니다. &gt; 700 ㎎ / ℓ 값은 긍정적으로 평가하고, 300 및 700 ㎎ / ℓ 사이의 값을 추정 EPS 생산 업체로 평가되었다. 두 개 또는 세 개의 기준이 포지티브로 계산 된 경우, 상기 균주 탄수화물 지문 분석을 위해 선별 하였다. 기준은 EPS 검사 (예를 들어 저점 EPS)의 개별 목적으로 사용자 정의 할 수 있습니다. 우리의 접근 방식은 effici 발견을 목표로엔트는 생산자 EPS. 단지 EPS 소량 생산 균주를 검색 할 때 포도당 당량의 평가 제한이 감소한다. 기술 이익과 미래의 응용 프로그램이 프로토콜의 한 가지 흥미로운 기능은 단계와 다른 분석 모듈의 모듈 식 문자입니다. 이들은 개별 요구 조정, 다양한 방식으로 조합 될 수 있고, 신규 모듈은 쉽게 구현 될 수있다. 또한, 상기 분석 모듈은 개별적으로 사용될 수있다 예를 들어 HT-PMP-유도체 모듈과 함께 가수 분해 모듈은 96 웰 포맷에서 다른 중합체 용액 (1g / L)에서 단량체 조성 분석을 수행 할 수있다. 전체 검사가 피펫 방식의 변경없이 직접 처리 할 수​​있는 액체 처리 시스템에 접속하지 않고도 실험실. 그러나, 액체 핸들링 시스템을 이용하여 최대 768 균주 (대신 screene 경우 192 균주 처리량을 증가하루에) 수동 d를. 여기에서 설명하는 프로토콜은 서로 다른 장군에 대한 선별 할 수 있고, 따라서, 신규 EPS 생산자를 확인하고 하나의 접근 방법 (그림 4)에서 자신의 탄수화물 지문을 분석하는 큰 변형 컬렉션의 심사합니다. 또한, 푸 코스 등 희소 당, 우 론산 또는 미지의 당을 함유 폴리 사카 라이드에 대한 표적 스크리닝 상세한 단당류 분석을 통해 수행 될 수있다. 또한, 정의 된 비율이 다른 당 조합을 검출 할 수있다. 이것은 이미 알려진 EPS 또는 새로운 EPS의 구조적으로 관련된 변종의 단순한 식별 할 수 있습니다.

미생물 엑소 폴리 사카 라이드 (EPS)은 다양한 생물학적 기능을 수행 고분자의 구조적으로 매우 다양한 그룹입니다. 그들은 일반적으로 다른 단량체의 종류 (설탕, 설탕 유도체, 설탕 산), 이들 단량체 및 대체 사이의 결합에 의해 구별된다 복잡한 반복 단위의 내장되어 있습니다. 미생물 다당류의 구조적 다양성은 음식 1 등 다양한 분야에서 자신의 응용 프로그램을 수 있도록이 분자 클래스, 화장품, 3, 건설 화학 4 물 처리 (5)의 회원들에게 오히려 다른 특성을 부여한다. 상기 신규 한 자연 미생물 다당류의 식별뿐만 아니라 구조적 변형 엔지니어링 유망한 접근법을 대표 이러한 바이오 기초 및 지속 고분자의 응용 분야를 확장한다. 어느 쪽의 방법은, 빠른 스크리닝 방법을 신속하게 파묻혀에 대한 미생물 균주의 광대 한 수를 스캔하는 데 필요R 다당류 형성하고, 자신의 제품을 분석. 따라서, 최근 단량체 조성물 (6)의 식별을 포함하는 천연의 분리 물 또는 조작 된 변이체 균주의 미생물 다당류 생산의 분석을 위해 96- 웰 HT-스크리닝 플랫폼을 개발했다. ~ 500 천연 균주의 제 선별 라운드이 플랫폼에 적용하는 것은 우리가 EPS를 생성 할 수있는 바와 같이 약 10 %의 절연 균주 20를 식별 할 수 (데이터는 보이지 않음). 이 분석 균주 80-90 %의인가 조건하에 EPS 생성되지 않았고, 따라서, 상세한 탄수화물 지문의 추가적인 분석이 필요없는 것을 의미한다. 단량체 조성물이 고도의 식별로서 특히 데이터 분석을 위해 빠르고 사전 스크리닝 방법은, EPS 생산 양성 균주를 식별하는 효율을 대폭 증가하는 시간 소모적 인 과정이다. 또한, 시약,UHPLC-UV-ESI-MS에서 소모품 및 측정 시간을 단축 할 것이다. 한편 상기 방법은 매우 신뢰성있는 반면 또한, 상이한 분석 모듈, 병렬로 두 개 이상의 96- 웰 플레이트의 수동 조작이 복잡 한편이며, 같은 방법의 모든 가능성을 제한한다. 이러한 이유로, 우리는 자동 검사 플랫폼을 개발하기로 결정했다. 따라서 흡광도 측정에 기초하여, 전체 당 함량의 전자동 고속 검출 방법 기존 탄수화물 지문 기술의 모듈 형식 조합. 페놀 황산 방법은 아직 세균과 식물 다당류 7,8의 전체 탄수화물 함량의 빠른 측정을위한 선택의 방법을 나타낸다. 이 방법은 먼저 96 웰 플레이트 10, 11에서도 작은 규모에 대해, 다른 응용 프로그램 및 샘플 크기에 뒤부아 등. (9)에 의해 기술 및 적응했다. 프NOL - 황산 방법은 모든 모노머, 올리고머 및 폴리머 샘플의 탄수화물을 합하여, 하나의 값에 의해 전체 탄수화물 함량을 측정한다. 고려 이러한 측면을 고려하여 적합한 배양 배지의 선택은이 방법을 적용하는 것이 필수적이다. 올리고머 또는 효모 추출물 등의 탄수화물 고분자 화합물을 함유하는 복합 미디어 변경된 중합체 함량을 초래할 수도 있으므로, 엄밀 피해야한다. 또한, 설탕의 높은 금액은 균주의 배양을위한 C 소스로 사용됩니다. 배양 과정에서 남은 탄수화물 높은 수준의 부정적인 EPS 함량의 측정을 방해 할 수있다. 따라서, 정의 된 순수한 당류의 사용이 권장된다. 실험에서는 세포의 배양을 위해 포도당을 사용 하였다. 배양 후 남은 글루코스는 겔 여과를 통해 감소 및 혈당 분석을 통해 측정 하였다. 마지막으로, 포도당 당량다당류들 페놀 황산 방법에 의해 검출되었다 전체 탄수화물 함량에서 겔 여과 후 남은 글루코스를 뺌으로써 계산 하였다. 페놀 - 황산 방법과 함께 젤 여과 및 포도당 분석은 신뢰할 수있는 결과를 보장하고 우리의 첫 번째, 완전히 자동화 탐지 시스템 인 할 수있다. 침전 점도 증가의 관찰 : 두 개의 새로운 분석 모듈은 EPS 검출 시스템에서의 정보의 양을 증가시키기 위해 자동화 된 스크리닝 플랫폼으로 하였다. 다양한 EPS - succinoglycan 예, 크 산탄 및 결장 산 12 - 당 위치 C4 및 C6에 비 탄수화물 피루브산 케탈로 변형되는 것으로보고되어있다. (단 숙시 반 에스테르 또는 우 론산 등) 그 피루브산 케탈 물리적 prope에 따라서 음이온 성질에 기여2가 양이온의 다리 (13)를 통해 상호 작용함으로써 중합체 rties. 그 특정 중합체를 식별하기 위해서 피루 베이트의 결정은 또 다른 추가 분석 모듈로 설립되었다. 이 다당류 치환기 잠재적 거시적 성질에 대한 정보를 증가시킨다. 모든 모듈을 결합하면 다른 EPS의 식별뿐만 아니라 EPS 생산의 신속하고 효율적인 결정을 할 수 있습니다. 그 방법으로 심사 플랫폼은 두 개의 주요 부품 (그림 1)으로 구분 될 수있다. 자동 검사 (파트 I) 워크 플로가 완전 자동화 발생 이내 (표 1) 신속 균주를 생산하는 EPS를 미리 선택합니다. 탄수화물 지문 분석 (파트 II)를 정량적으로 미리 선택된 균주에 의해 생성 된 EPS의 단량체 조성물을 결정한다. 이에 따라, 데이터 분석은 큰 변형 모음 스크리닝을 최적화하기 위해 최소화되었다. 이하나의 자동화 된 검사 실행에 하루 768 균주의 하루 가능 2 실점으로 384 균주를 분석 할 수있는 가능성을 제공합니다. 또한, 탄수화물 지문 분석은 모든 확인 된 EPS의 더욱 상세한 개요를 제공합니다. 이 감독 분석 및 EPS의 이미 설명한 화학 구조에 비해 약간 다른 EPS 변형 또는 완전히 새로운 식별 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>96 웰 딥 웰 플레이트 2.0 ml (DWP)</td> <td>Greiner Bio-One</td><td>780271</td><td>메인 배양 (CP 1-1 to 1-4), 겔 여과 용 평형 플레이트 (CP 1-6, 1-7, 2-6 및 2-7), 포도당 분석 (CP 4-1 to 4-4)을위한 1:100 희석액 990&nbsp; &마이크로; l ddH2O</td></tr><tr><td>통기성 씰링 필름</td><td>Axygen</td><td>BF-400-S</td><td>사전 및 메인 배양 DWP 알루미늄 씰링 필름용 인큐베이션</td></tr><tr><td>필름</td><td>Axygen</td><td>PCR-AS-200-80</td> <td>&deg; 글리세롤 스톡 플레이트용 C 저장 필름</td></tr><tr><td>MCA96 중첩 일회용 팁 200 &마이크로; l</td><td>TECAN</td><td>30038619</td><td>작업대 위치 (WTP 2-1 to 2-4)</td></tr> <tr><td>A / B 유리 필터 플레이트 1&nbsp; &마이크로; m</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8031</td><td>수집기 플레이트에 보관 (CP 2-1 to 2-4)</td></tr> <tr><td>96 웰 마이크로 타이터 플레이트 V-Bottom</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651201</td><td>여과 플레이트 용 수집기 플레이트 (CP 2-1 to 2-4)</td></tr><tr><td>96-well SpinColumn G-25</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-5612</td><td>세척 DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 및 2-7)</td></tr><tr><td>에 보관 96 웰 마이크로 타이터 플레이트 V-Bottom</td><td>Nunc</td><td>249944</td><td>젤 여과 플레이트용 수집기 플레이트(CP 3-1 to 3-4)</td></tr><tr><td>중첩 일회용 팁 SBS 50 &마이크로; l 팁</td><td>TECAN</td><td>30038609</td><td>캐러셀 위치 (CP 4-6, 4-7 및 5-1 to 5-6)</td></tr><tr><td>트로프 250 ml</td><td>Axygen</td><td>Res-SW96-HP</td><td>Water WTP 1-1, 포도당 분석 시약 혼합 WPT 1-2, 암모늄-아세테이트 완충액 pH 5.6 (CP 5-7)</td></tr><tr><td>96-well micro titer plate F-Bottom (MTP)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>침전 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-값 (CP 7-1 to 7-4), 침전 2 (CP 8-1 to 8-4), 페놀-황산 방법 (CP 8-5 to 8-8), 포도당 분석 (CP 9-1 to 9-9), 더미 플레이트 (WTP 3-1, 3-2)</td></tr><tr><td>96-well silicon cap mat&nbsp;</td><td>Whatmann</td><td>7704-0105</td><td>MTP</td></tr><tr><td>200 및 마이크로용 커버 매트; l 피펫 팁</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.002</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &micro 수동 핸들링용; l 피펫 팁</td><td>Sarstedt</td><td>70.762</td><td></td></tr><tr><td>96-well-PCR 마이크로 역가 플레이트를 수동으로 처리하기 위해&nbsp;</td><td>브랜드</td><td>781350</td><td>가수분해, PMP-파생상품</td></tr><tr><td>TPE (열가소성 엘라스토머) 캡 매트&nbsp;</td><td>브랜드</td><td>781405</td><td>가수분해, PMP-유도체화</td></tr><tr><td>필터 플레이트 0.2&nbsp; &마이크로; m Supor</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8019</td><td>MTP 수집기 플레이트를 사용한 UHPLC-ESI-MS 분석을 위한 샘플 여과</td></tr><tr><td>피펫 팁 LHS 5-300&nbsp; &마이크로; l</td><td>브랜드</td><td>732150</td><td>브랜드 LHS 시스템</td></tr><tr><td>포도당 산화효소&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td>포도당 분석</td></tr><tr><td>홀스래디쉬 퍼옥시다제&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6782</td><td>포도당 분석, 피루바트 분석</td></tr><tr><td>DA-64 (N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4.4'-bis(디메틸아미노)-디페닐아민 나트륨 염)</td><td>Wako Chemicals GmbH</td><td>043-22351</td><td>피루바트 분석</td></tr><tr><td>피루베이트 산화효소&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4591</td><td>Pyruvat-assay</td></tr><tr><td>Potassium 인산염 이염기</td>성 <td>Carl-Roth</td><td>P749.3</td><td>Pyruvat- 및 포도당 분석</td></tr> 인<tr><td>산칼륨 일염기</td>성 <td>Carl-Roth</td><td>3904.3</td><td>Pyruvat- 및 포도당 분석</td></tr><tr><td>Thiamine pyrophosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754</td><td>Pyruvat-assay</td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31413</td><td>Pyruvat-assay</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWR</td><td>20922.466</td><td>침전</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>VWR</td><td>20599.231</td><td>페놀-황산법</td></tr><tr><td>황산</td><td>Carl-Roth</td><td>4623.4</td><td>페놀-황산법</td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>가수분해</td></tr><tr><td>암모늄 용액</td><td>Carl-Roth</td><td>P093.1</td><td>가수분해, PMP-유도체화</td></tr><tr><td>에탄올 앱솔루트</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>가수분해, PMP-유도체화</td></tr><tr><td>페놀 레드&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21710</td><td>가수분해, PMP-유도체화</td></tr><tr><td>1-페닐-3-메틸-5-피라졸론</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M70800</td><td>PMP-유도체화</td></tr><tr><td>메탄올 LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.320</td><td>PMP-유도체화</td></tr><tr><td>아세토니트릴 LC-MS</td><td>VWR</td><td>83040.320</td><td>PMP-유도체화</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338826</td><td>PMP-유도체화</td></tr><tr><td>에탄올 앱솔루트</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>PMP-유도체화</td></tr><tr><td>메틸 레드</td><td>알파 Aesar</td><td>36667</td><td>pH-값</td></tr><tr><td>로봇 액체 처리 시스템&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Freedom EVO</td><td>작업대 설정 그림 2</td></tr><tr><td>Liquid handling station LHS</td><td>브랜드</td><td>709400</td><td>작업대 설정 그림 2</td></tr><tr><td>Tip-Adapter</td><td>브랜드</td><td>709434</td><td>작업대 설정 그림 2</td></tr><tr><td>Liquid Ends MC 20-300&nbsp; &마이크로; l</td><td>브랜드</td><td>709416 <</td><td>strong>그림 2어댑터의 작업대 설정</td></tr> <tr><td>60mm</td><td>브랜드</td><td>709430</td><td>그림 2</strong의 작업대 설정></td></tr></tbody></table>

자동화 모​​듈 높은 처리량 엑소 폴리 사카 라이드 심사 플랫폼은 매우 민감한 탄수화물 지문 분석과 결합

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

많은 미생물 생산 및 의료 분야, 식품 응용 프로그램 또는 석유 기반 화학 물질의 교체에 중요한 영향을 미칠 엑소 폴리 사카 라이드 (EPS)을 분비 할 수있다. 우리는 유형 및 미생물에 의해 생성 된 EPS 량의 빠르고 신뢰성 분석을 가능하게하는 액체 핸들링 시스템을 자동화 할 수있는 분석 플랫폼을 기술한다. 이것은 사용자가 새로운 천연 미생물 엑소 폴리 사카 라이드의 생산을 확인하는 고 처리율 (HT)에 하루 내에 해당 중합체의 탄수화물 지문 분석을 가능하게한다. 이 플랫폼을 사용, 엔지니어링 접근 방법에서 얻을 수 있습니다 변형 컬렉션뿐만 아니라 변형 변종의 라이브러리를 스크리닝 할 수있다. 이 플랫폼은 두 개의 주요 부분으로 프로토콜의 분리를 할 수있는 모듈 설정을 가지고 있습니다. 첫째, 다른 다당류 검출 모듈을 결합한 자동 선별 시스템이있다 : viscosit의 반 정량 분석원심 분리 공정과, 알코올 침전 법을 통해 형성 중합체의 분석 및 페놀 황산 변환을 통해 총 탄수화물 함량의 측정을 통해 Y 형성. 여기서, 실행 당 384 균주까지 선별 할 수있다. 두 번째 부분은 두 개의 핵심 모듈을 조합하여 처음 부분에서 식별 된 모든 선택된 EPS 생산자 상세한 단당류 분석을 제공한다 : 자외선 및 전기 분무 이온화 이온 트랩 검출 (결합 초 고성능 액체 크로마토 그래피를 통해 전체 단량체 조성물의 분석 UHPLC-UV-ESI-MS) 및 색상 형성에 결합되는 효소 적 산화를 통해 중합체 치환기 (피루브산 케탈 존재)로서 피루브산의 결정. 이 스크리닝 플랫폼의 전체 분석 모듈은 다른 방법으로 결합 된 개별 요건에 조정될 수있다. 또한, 그들 모두는 수동으로 처리되거나 액체 핸들링 시스템으로 수행 될 수있다. 이에 따라, 심사 괞 찮아다양한 EPS에서 폼을 식별하기 위해 큰 유연성을 가능하게한다.

우리는 소규모로 미생물 외다당류의 식별 및 특성화를 위한 자동화된 모듈식 고처리량 방법을 제시합니다. 이 방법은 빠른 사전 선택을 결합하여 분비된 다당류의 총량을 상세한 탄수화물 지문과 결합하여 새로 분리된 박테리아 균주 또는 전체 균주 수집을 빠르게 스크리닝할 수 있습니다.

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

이 접근 방식의 전반적인 목표는 미생물 외다당류 생산자에 대한 빠르고 신뢰할 수 있는 스크리닝과 탄수화물 지문 식별입니다. 이것은 아직 밝혀지지 않은 다양한 외다당류를 활용하기 위한 필수 단계입니다. 우리의 방법은 미생물 외다당류 분야에서 고분자 연구를 가속화하는 데 도움이 될 수 있습니다.이를 통해 특정 응용 분야에 대해 다양한 특성을 가진 새로운 다당류 변형체를 빠르게 식별할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 서로 다른 외다당류 검출 시스템을 모듈식의 완전 자동화된 스크리닝 개념에 결합한다는 것입니다. 이것은 매우 빠르고 신뢰할 수 있습니다.이 기술은 자동화 플랫폼을 사용할 수 없는 실험실에서 수동으로 수행할 수도 있으므로 사용이 매우 유연하며 다양한 스크리닝 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다. 이 외다당류 또는 EPS 스크리닝 플랫폼은 모듈식 설정을 갖추고 있어 프로토콜을 Automated Screening과 Carbohydrate Fingerprinting의 두 가지 주요 부분으로 분리할 수 있습니다. 첫 번째 작업은 스크리닝을 위해 균주를 배양하고 원심분리로 세포를 제거하는 것입니다.균주는 섭씨 30도 및 1, 000 RPM에서 마이크로 역가 플레이트 셰이커에서 통기성 밀봉 필름으로 덮인 96웰 플레이트의 탄소원으로 포도당에서 배양됩니다. 상영 당일에는 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 로봇 작업대와 보관 캐러셀을 준비합니다. 플레이트에서 통기성 밀봉 필름을 제거하고 캐러셀 위치 1-1에서 1-4에 주요 배양물을 할당합니다.자동화된 로봇 프로그램을 시작합니다. 배양 후 세포를 제거하려면 캐러셀의 주요 배양 딥 웰 플레이트를 원심분리기로 옮기고 4, 300 x g 및 섭씨 20도에서 30분 동안 원심분리합니다. 여과 전 침전을 위해 마이크로 역가 플레이트와 pH 지시자 마이크로 역가 플레이트를 캐러셀에서 작업대로 이동합니다.또한 모든 박테리아 세포를 완전히 제거할 수 있는 여과 플레이트를 수집기 플레이트와 함께 작업대 위치로 옮깁니다. 원심분리 후 180마이크로리터의 주배양 상층액을 여과판으로 이송합니다. 주 배양 상층액에서 150마이크로리터를 흡입하고 여과 전 침전을 위해 마이크로 역가 플레이트에 50마이크로리터를 분주하고 pH 지시 플레이트에 100마이크로리터를 분주합니다.EPS 생산을 평가하기 위해 2-프로판올을 사용한 상등액의 침전을 수행합니다. 12.5ml 다단계 피펫을 사용하여 각 웰에 150마이크로리터의 2-프로판올을 수동으로 추가합니다. 마이크로 역가 플레이트를 실온에서 900RPM으로 10분 동안 흔든 후 EPS 생성을 나타내는 섬유 또는 플레이크 형성을 육안으로 관찰합니다.주요 배양 플레이트를 캐러셀에 다시 보관한 후 발효 국물을 검사하면 원심분리 후 침전이 감소해야 합니다. 점도의 증가는 EPS 생산의 또 다른 지표입니다. 두 번째 작업은 96웰 여과를 통해 점성이 있는 발효 배지에서 세포를 완전히 제거하는 것입니다.여과판을 3, 000 x g 및 섭씨 20도에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 플레이트를 캐러셀 홈 위치로 되돌리고 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 겔 여과의 평형을 수행합니다. 다음으로, 35마이크로리터의 여과액을 평형 겔 여과판의 중앙에 피펫팅하고, 50마이크로리터를 침전에 사용되는 마이크로 역가 플레이트에 피펫팅합니다.겔 여과 플레이트를 원심분리기로 옮기고 작업대의 다른 모든 플레이트를 캐러셀의 홈 위치로 다시 이동합니다. 모든 플레이트를 캐러셀에 다시 보관한 후 필터 플레이트의 잔류물로 표시된 대로 점성이 높은 상등액을 기록해 두십시오. 여과액이 부족하면 다음 분석 모듈에서 위음성 결과가 발생할 수 있습니다.자동 스크리닝의 세 번째 작업은 96웰 겔 여과를 통해 성장 배지에서 남아 있는 단량체 당을 제거하는 것입니다. 젤 여과 플레이트를 1, 000 x g 및 섭씨 20도에서 2분 동안 원심분리합니다. 겔 여과액을 처리하기 위해 로봇 매니퓰레이터를 통해 작업대를 준비합니다.겔 여과 후 남아 있는 포도당을 감지하기 위해 50마이크로리터 팁을 사용하여 25마이크로리터의 이중 증류수를 새 마이크로 역가 플레이트로 옮깁니다. 20마이크로리터의 이중 증류수, 5마이크로리터의 공기, 5마이크로리터의 겔 여과액을 흡입하고 동일한 플레이트에 분배합니다. 200마이크로리터 팁을 취하고 작업대 위치 1-2에서 50마이크로리터의 포도당 분석 시약 혼합물을 흡입하여 첫 번째 분석을 시작합니다.마이크로 타이터 플레이트를 인큐베이터로 옮깁니다. 30분 배양 후 플레이트를 인큐베이터에서 마이크로 역가 리더로 옮기고 418 및 480 나노미터에서 흡광도를 기록합니다. 페놀-황산법으로 총 탄수화물 함량을 측정하려면 20마이크로리터의 겔 여과액을 마이크로 역가 플레이트에 피펫팅합니다.캐러셀에서 플레이트를 수동으로 제거하고 액체 취급 스테이션에 놓습니다. 서로 다른 포도당 농도의 20마이크로리터가 있는 교정 플레이트를 삼중으로 포함합니다. 위치 1에는 폐기물 용기를, 위치 2에는 300마이크로리터 팁 상자를, 위치 3에는 갓 준비한 페놀-황산 110밀리리터가 들어 있는 250밀리리터 물통을 놓습니다.300마이크로리터 팁이 있는 8채널 피펫을 사용하여 180마이크로리터의 페놀-황산을 모든 플레이트의 각 행으로 옮깁니다. 모든 마이크로 역가 플레이트를 뚜껑으로 덮고 실온에서 900RPM으로 5분 동안 흔들어 혼합합니다. 색 반응을 위해 오븐에서 섭씨 80도에서 35분 동안 배양합니다.흄 후드 아래에서 플레이트를 냉각시킨 후 480나노미터에서 소멸을 측정합니다. 자동 스크리닝의 균주는 다음 세 가지 기준 중 두 가지 이상을 충족하는 경우 EPS 양성으로 지정됩니다. 점도 제어, 폴리머 검출 및 계산된 포도당 등가물.포도당 당량은 이 방정식을 사용하여 계산됩니다. 스크리닝 플랫폼의 Carbohydrate Fingerprint에는 수동으로 수행되는 마지막 세 가지 작업이 포함되어 있습니다. 작업 2에서 positive hits의 나머지 여과액은 작업 5에서 gel-filtrate의 기초를 제공합니다.여섯 번째 작업은 겔 여과액의 96웰 마이크로 하이드분해입니다. 이를 위해 먼저 12채널 50마이크로리터 피펫을 사용하여 20마이크로리터의 겔 여과액을 새 PCR 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 1.25ml의 다단계 피펫을 사용하여 각 웰에 4몰 트리플루오로아세트산 20마이크로리터를 추가합니다.PCR 플레이트를 열가소성 엘라스토머 캡 매트로 덮고 PCR 플레이트를 특수 CL에 놓습니다.amp잉 장치. cl을 반전하여 용액을 혼합합니다.amping 장치를 10회 반복합니다. PCR 플레이트를 원심 분리하고 클램핑 장치에 고정한 후 고정된 클램핑 장치를 예열된 모래 수조에 넣고 섭씨 121도에서 90분 동안 배양합니다.12채널 200마이크로리터 피펫을 사용하여 3.2% 암모니아 용액을 추가하여 pH를 약 8로 조정합니다. PCR 플레이트를 열가소성 엘라스토머 캡 매트로 덮고 클램핑 장치를 사용하여 수동으로 흔듭니다. 마지막 작업은 high-throughput-1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone 또는 HTPMP 방법을 통해 탄수화물 지문을 분석하는 것입니다.이 절차를 시작하려면 12채널 50마이크로리터 피펫을 사용하여 25마이크로리터의 중화된 가수분해물을 새 PCR 플레이트로 옮깁니다. 75마이크로리터의 유도체화 시약 혼합물을 추가하고 열가소성 엘라스토머 캡 매트로 플레이트를 덮습니다. PCR 플레이트를 섭씨 70도의 PCR 사이클러에 100분 동안 놓고 섭씨 20도까지 냉각합니다.20마이크로리터 분취액을 새 마이크로 타이터 플레이트로 옮긴 다음 12채널 200마이크로리터 피펫을 사용하여 각 라인에 130마이크로리터의 19.23밀리몰 아세트산을 추가합니다. 흡입 및 분주를 통해 최소 6회 직접 혼합하고 모든 액체를 마이크로 적정 수집기 플레이트가 있는 0.2마이크로미터 필터 플레이트로 옮깁니다. 1, 000 x g에서 5분 동안 플레이트를 원심분리하고 필터 플레이트를 제거한 다음 마이크로 타이터 수집기 플레이트를 실리콘 캡 매트로 밀봉합니다.탄수화물 지문을 측정하기 위해 마이크로 역가 플레이트를 UHPLC-UV-ESI-MS에 놓습니다. 이 표는 이 스크리닝 플랫폼으로 성공적으로 확인된 세 가지 예시적인 새로운 균주의 결과를 보여줍니다. 표의 왼쪽 부분에는 점도 형성, 폴리머 생산 및 총 가수분해로 인한 포도당 당량에 관한 자동 스크리닝 모듈의 결과가 표시되며, 이는 상세한 탄수화물 지문 분석을 위한 평가 매개변수로 사용되었습니다.보정된 당과 알려지지 않은 당, 이량체 및 치환체를 기반으로 하는 탄수화물 지문은 표의 오른쪽 부분에 나와 있습니다. 이 정보를 사용하여 단량체 조성을 계산하고 이미 알려진 고분자 구조와 비교할 수 있습니다. 또한, 흥미로운 단량체 조성물 및 희귀 탄수화물에 대한 표적 스크리닝을 수행할 수 있습니다.이 기술을 마스터하면 단 5시간 이내에 386개의 균주에 대해 수행할 수 있습니다. 이 절차에 따라 이미 존재하는 피루브산과 같은 추가 분석 또는 아세테이트 또는 인산염에 대한 추가 분석을 포함하여 외다당류 선언에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 높은 감도로 인해 유전자 공학, 미생물 외다당류 생산자 분야에서 변형된 외다당류 생합성 경로가 존재하는 화학 구조에 미치는 영향을 탐구하기 위한 연구의 길을 열었습니다.이 동영상을 시청한 후에는 매우 빠르고 신뢰할 수 있는 방식으로 새로운 외다당류 생산자를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

automated-modular-high-throughput-exopolysaccharide-screening

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

빠른 방법은 세포외 기질에서 다당류의 구조에 대한 통찰력을 얻을 수 설명되어 있습니다. 방법은 glycosylhydrolases의 특이성과 물질의 미세한을 분석 수 있도록 질량 분석계의 감도 활용합니다. 이 기술은 조직 자체에서 직접 사용할 수 적용할 수 있습니다.

세포외 다당류의 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP)

이 프로토콜은 대장균의 표현 metagenomic 도서관에서 cellulolytic 활동에 높은 처리량 화면을 설명합니다. 화면이 솔루션을 기반으로하고 고도의 자​​동화, 그리고 흡광도 측정으로 최종 판독과 384 잘 microplates에 한 냄비 화학을 사용합니다.

Metagenomic 도서관에서 Cellulase 활동 Biomining에 대해 높은 처리량 화면

식물 바이오 매스 샘플을 다수의 당화 잠재력을 결정하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다. 이 분석을 위해 자동화된 플랫폼은 96 접시와 잘 풀어 설탕의 전처리, 가수 분해 및 부량의 후속 성능 분석을위한 식물 바이오 매스의 준비를 포함한다.

리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

이 비디오에서는 불용성 발색 폴리머 하이드로겔 기질을 사용하여 탄수화물 활성 효소 스크리닝을 위한 고처리량 분석을 시연합니다. 효소는 이러한 기질을 용해성 착색 산물로 분해하며, 이는 산물의 색 강도를 측정하여 정량화할 수 있습니다.

발색 고분자 하이드로겔 기반 효소 스크리닝 분석: 합성 기질을 사용하여 탄수화물 활성 효소를 스크리닝하는 고처리량 방법

고처리량 프로토콜은 단백질체학 및 글리코믹스 정제와 혈장에서 LC-MS/MS 정량화를 결합하기 위해 개발되었습니다. N-linked glycosylation motifs의 탈아미드화 분석은 탈glycosylated 부위에 특이적이었습니다. N-글리칸의 정확한 정량화는 글리칸 히드라지드 태그 전략으로 라벨링할 때 필터 지원 N-글라이칸 분리를 개별성 정규화에 결합함으로써 달성되었습니다.

양적 글리코 믹스와 단백질 체학 복합 정제 전략

효소 스크리닝을 위한 고처리량 분석에 대해 설명합니다. 즉시 사용 가능한 이 멀티플렉스 분석 키트는 사전 선택된 Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) 기질과 complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) 기질로 구성됩니다. 표적 효소는 다당류를 분해하는 내효소(endo-enzymes)와 프로테아제(protease)입니다.

소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

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Fucosylated 인간 우유 Trisaccharides 유전자를 사용 하 여 바이오 컨텍스트에서 분석 인코딩된 바이오 센서

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자동 액상 마이크로플루이딕 플랫폼을 이용한 L-락산을 과생산하는 바실루스 응고 체 돌연변이체의 고처리량 스크리닝

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