에서 복제와 베타 세포 기능을 평가 Adenovirally-transduced 절연 쥐 Islets

이 절차의 전반적인 목표는 기능적 베타 세포 질량의 변화를 조절하는 신호 경로를 식별하는 것입니다. 이는 고립된 쥐 구멍에서 아데노바이러스 벡터를 사용하여 유전자의 발현을 과도하게 발현하거나 억제함으로써 이루어집니다. 이 조작 후, 베타 세포 기능은 인슐린 분비와 삼중화 티미딘 통합에 의해 측정된 작은 구멍 복제에 의해 평가됩니다.

궁극적으로 이러한 분석은 관심 유전자가 베타 세포 증식을 조절하는지 및/또는 in vitro 기능을 수행하는지 여부를 보여줄 수 있습니다. 이 방법은 신호 경로의 특정 구성 요소가 베타 세포의 성장과 기능에 영향을 미치는가와 같은 눈꺼풀 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 필요한 수의 웰에 2ml의 변형 배지를 추가하여 6웰 비조직 배양 코팅 플레이트를 준비합니다.

예를 들어, 일반적인 실험에는 바이러스 없는 통제와 바이러스 통제를 위해 각각 하나씩 3개의 웰이 필요할 수 있으며, 실험 그룹은 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 섭씨 37도로 최소 30분 동안 예열합니다. 쥐의 작은 구멍을 분리한 직후, 준비된 플레이트의 각 웰에 200개의 구멍을 하나씩 놓습니다. 60개의 구멍은 생화학적 분석에 사용되며 나머지 구멍은 유전자 발현 연구 또는 면역 블로팅에 사용할 수 있으며 플레이트를 부드럽게 팽창시켜 구멍을 각각의 중심으로 가져올 수 있습니다.

그런 다음 즉시 아데노바이러스를 구멍에 직접 피펫으로 분사합니다. 접시의 중앙에. 아데노바이러스의 효과에 따라 1에서 500 배의 감염을 사용하여 관심 단백질을 과도하게 발현하거나 떨어뜨립니다.

눈꺼풀 중심부까지 아데노바이러스가 효율적으로 침투하면 결과의 일관성이 높아집니다. 눈꺼풀 직후 눈꺼풀을 이식합니다. 격리는 필수적입니다.

플레이트를 5분 동안 방해하지 말고 24시간 동안 인큐베이터로 옮기십시오. 다음날 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 구멍을 웰 중앙까지 부드럽게 부풀립니다. 200마이크로리터 마이크로 피펫을 사용하여 새로운 매체가 들어 있는 새 웰로 구멍을 옮깁니다.

구멍이 플레이트에 부착되면 파이펫 팁으로 부드럽게 제거할 수 있습니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 아데노바이러스가 섬 코어 배양액으로 침투하는 것을 시각화함으로써 적절한 transduction efficiency를 확인하기 위해 GFP를 발현하는 control 바이러스를 사용하는 것이 도움이 됩니다. 이 섬들은 하루에서 사흘 더 지내며 매일 매체를 바꾼다.

배양 시간은 파일럿 연구를 통해 최적화해야 하며 실험 목표에 따라 달라집니다. 마지막 24시간 동안, 트리치화된 티미딘을 배지 밀리미터당 1마이크로 퀴리 농도로 배지에 통합합니다. 먼저 50리터 원뿔형 튜브에 50ml의 작업 SAB를 갓 준비하고 섭씨 37도의 수조에서 예열합니다.

10 밀리리터의 작업 SAB를 15 밀리리터 원추형 튜브에 피펫팅하고 66.8 마이크로리터의 2.5 몰 D 포도당을 추가합니다. 고포도당 SAB를 준비하려면 나머지 40ml의 작업 SAB에 44.8마이크로리터의 2.5 monolo D 포도당을 추가합니다. 저포도당 SAB를 준비하려면 1.7ml 마이크로 원심분리 튜브 3개를 레이블로 지정합니다.

6개의 웰 플레이트의 각 웰에 대해 각 튜브에 1밀리리터의 PBS를 추가합니다. 방사성 구멍의 취급 및 폐기에 대한 제도적 프로토콜을 따르는 것을 잊지 마십시오. 실체경 또는 표준 현미경을 사용하여 비슷한 크기의 구멍 20개를 선택하여 각 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

예를 들어, 각 튜브에는 5개의 작은 구멍, 10개의 중간 구멍 및 5개의 큰 구멍이 포함될 수 있습니다. 실험이 끝날 때 결과가 총 단백질 함량으로 정규화되지만 그룹 간의 구멍을 크기 조정하는 것이 중요합니다. 구멍이 중력 또는 원심분리에 의해 튜브 바닥에 가라앉도록 한 후 흡입하고 마이크로 피펫으로 PBS의 무게를 측정한 다음 생화학 분석을 위한 구멍 준비를 진행합니다.

인슐린 분비 분석을 위해 구멍을 준비하려면 먼저 저포도당 SAB로 미리 배양해야 합니다. 이렇게하려면 400 마이크로 리터의 저포도당 SAB를 튜브에 추가하고 캡을 씌운 상태로 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다 한 시간 후 60 분 동안 배양 전 저당 SAB를 흡입하여 기초 인슐린 분비를 측정합니다. 배양 전 절차를 반복합니다.

그러나 자극된 인슐린 분비를 측정하려면 저포도당 SAB 대신 400마이크로리터의 고혈당 SAB를 사용하고 이전과 같이 고포도당 또는 저혈당 SAB 흡인에서 배양 후 60분 동안 구멍을 배양하고 SAB는 인슐린 전파 면역 분석을 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 실행됩니다. 그런 다음 동일한 구멍 모음을 사용하여 티미딘 혼입 분석을 진행합니다. 인슐린 분비 분석에 방금 사용된 구멍부터 시작하십시오.

PBS 1ml를 넣고 구멍이 중력에 의해 가라앉도록 합니다. 그런 다음 마이크로 피펫으로 PBS를 흡입합니다. 이 단계를 취소하고 한 번 더 반복합니다.

다음으로 얼음처럼 차가운 트리클로로아세트산 500마이크로리터를 구멍에 넣고 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 튜브를 원심 분리하십시오. 그런 다음 열망, TCA를 버리십시오.

다음으로, 80 마이크로 리터의 0.3 일반 수산화 나트륨을 넣고 구멍을 실온에서 30 분 동안 배양합니다. 이 배양 동안 10분마다 5-10초 동안 샘플을 격렬하게 소용돌이칩니다. 동시에 4ml의 conno safe counting cocktail을 7ml 액체 섬광 계수 튜브에 추가합니다.

구멍의 배양이 끝나면 섬광 튜브에 구멍 50 마이크로 리터를 추가합니다. 뚜껑이 있는 튜브를 짧게 흔들고 액체 섬광 계수기에서 샘플 방사능을 측정합니다. 또한 단백질 농도를 측정하려면 10마이크로리터의 빌라를 상용 바이오닉산 분석법으로 옮기고 제조업체의 프로토콜을 따릅니다.

나중에 데이터 분석 중에 설명된 프로토콜을 사용하여 결과를 단백질 농도로 정규화합니다. 아일릿 복제 및 베타 세포 기능. 쥐의 구멍에서 베타 세포 기능을 변경하지 않고 6개의 강력하게 자극된 구멍 복제가 가상 유전자의 아데노바이러스 과발현을 평가했습니다.

유전자 6의 발현 증가, 쥐 구멍에 있는 대부분의 세포가 베타 세포이기 때문에 티미딘의 통합에 의해 측정된 DNA 합성 증가. 추가 실험은 이러한 티미딘 통합의 증가가 베타 세포 복제의 증가에 기인한다는 것을 보여줄 수 있습니다. 인슐린 분비 분석법은 유전자 6의 과발현이 저혈당과 고혈당에서 인슐린 분비의 주요 베타 세포 기능 중 하나를 변경하지 않는다는 것을 입증했습니다.

포도당 농도가 낮거나 높을 때 인슐린 분비가 증가하는 것은 아데노바이러스 치료 후 구멍의 건강을 반영합니다. 유전자 6의 발현이 베타 세포 기능을 손상시키는 경우, 이는 높은 자극 포도당 농도에서 분비되는 인슐린의 감소로 반영될 가능성이 높습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 특정 유전자가 베타 세포 성장 또는 기능에 영향을 미치는지 확인하기 위해 베타 세포 복제 및 인슐린 분비를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.