Name: 에서 복제와 베타 세포 기능을 평가 Adenovirally-transduced 절연 쥐 Islets (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 학습하세요 아데노바이러스 벡터를 이용한 유전자 조작으로 격리된 쥐 섬에서 베타 세포 복제와 기능을 평가하는 방법을. 인슐린 분비 및 트리티움 표식 티미딘 삽입법을 통해 당뇨병 치료 표적을 식별합니다.

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이 작품은 NIH (PTF까지)에서 부여 DK078732에 의해 지원되었다.

1. 쥐 Islets의 Adenoviral 형질 도입 및 Culturing <ol><li> 의 필요한 번호 미디어 2 ML (8 MM 포도당 10 % 태아 소 혈청, 50 단위 / ML 페니실린, 50 μg / ML의 스트렙토 마이신을 포함하는 RPMI 1640 미디어)를 추가하여 6 개 잘 아닌 조직 문화 코팅 플레이트를 준비 웰스. 노 바이러스 제어를위한 한 대씩, 바이러스 컨트롤 (예 : GFP-표현 아데노 바이러스)과 실험 집단 - 예를 들어, 일반적인 실험은 세 우물이 필요할 수 있습니다. </li><li> 적어도 30 분 동안 조직 문화 인큐베이터에 그것을 배치하여 37 ° C로 접시를 따뜻하게. </li><li> 바로 6 - 잘 아닌 조직 문화 코팅 플레이트의 개별 우물에 쥐 섬 절연 18,19, 장소 100-200 islets에 따라. 육십 islets은 인슐린 분비 및 thymidine의 정관 assays가 필요합니다. 남은 islets는 유전자 발현 연구 또는 immunoblotting을위한 단백질 분리를위한 RNA 분리에 사용할 수 있습니다. </li></ol> [참고 :이 시점부터, biohazardous 재료의 취급, 사용 및 처분을위한 제도적 절차를 따르시기 바랍니다.] <ol start="4"><li> 부드럽게 소용돌이도의 중심에 islets를 가져올 수있는 판. </li><li> 직접 접시의 중앙에 islets에 아데노 바이러스를 피펫. 감염 100-500 multiplicities을 (입니다만, 바이러스성 상패 - 성형 단위로 목표 세포의 비율)를 사용합니다. </li><li> 5 분 동안 islets을 방치 했죠. </li><li> 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C에서 5 % CO 2)의 접시를 놓습니다. </li><li> 24 H 후, 부드럽게 소용돌이 우물의 센터로 islets 가지고 잘 신선한 매체를 포함하는 새에 P200 micropipette를 사용 islets를 전송하는 판. islets가 접시에 첨부되어있다면, 그들은 부드럽게 피펫 팁과 dislodged 수 있습니다. </li></ol> [주 : 적절한 형질 도입의 efficien을 확인하려면islets 그때 섬 핵심으로 아데노 바이러스의 침투를 확인하기 위해 공촛점 현미경을 통해 몇 군데 할 수있는 싸이, 제어 바이러스 표현 GFP의 사용이 유용합니다.] <ol start="9"><li> 최적화 파일럿 연구에서 실험 원하는 타이밍에 따라 추가로 24-72 H에 대한 문화 islets. 예를 들어, proliferative 반응의 유도는 24-72에서 H 또는 관심있는 유전자의 최저 48 또는 72 시간 요구할 수 이르기까지 시간이 필요할 수 있습니다. 새로운 미디어에 매일에 islets를 전송합니다. </li><li> 실험 1을 포함하는 미디어 문화 islets을의 마지막 24 H 들어 μCi [메틸-3 H] -thymidine/ml 매체 (일반적으로 1 μl thymidine / ML 미디어). </li></ol> [참고 :이 시점부터, 방사성 물질의 취급, 사용 및 처분을위한 제도적 절차를 따르시기 바랍니다.] 2. 인슐린 분비 분석 <ol><li> 준비분비 분석 완충액 (SAB) 10X 주식 용액 (1.14 M NaCl, 47 MM KCl, 12 MM KH 2 PO 4, 11.6 MM MgSO 4)와 CaCl 2 100X 주식 용액 (0.25 M CaCl 2). 이러한 주식 솔루션은 미리 준비하고 상온에서 저장할 수 있습니다. </li><li> 갓에서 작동 SAB (10X SAB, 1 M의 HEPES, 100X CaCl 2 0.5 ML 35 % BSA, 0.11 g NaHCO 3의 0.28 ML 1 ML 및 멸균 물 50 ML의 5 ML)의 50 ML 준비 50-ML 튜브 원뿔 따뜻한 37에 ° C ~ 37 ° C waterbath에 배치하여. </li><li> 피펫 10 15 ML 원뿔 튜브로 작업 SAB의 ML하고 높은 포도당 (16.7 ㎜) SAB를 준비하기 위해 2.5 M D-글루코오스의 66.8 μl를 추가합니다. </li><li> 낮은 포도당 (2.8 ㎜) SAB를 준비하는 작업 SAB의 나머지 40 ML에 2.5 M D-글루코오스의 44.8 μl를 추가합니다. </li><li> 라벨 세 1.7-ML microcentrifuge의 6 잘 플레이트의 각 잘위한 튜브하고 인산 버퍼 식염수 (PBS) 1 ML을 추가합니다. </li></oL&gt; [주 : islets는 방사성들에 따라, 방사성 물질의 취급, 사용 및 처분을위한 제도적 절차를 따르시기 바랍니다.] <ol start="6"><li> 각 microcentrifuge 튜브로 20 islets를 놓습니다. 각 microcentrifuge 튜브에 comparably 크기의 islets을 추가하는 모든 시도를 확인하십시오. 예를 들어, 각각의 튜브는 5 소형, 10 중간, 5 대형 islets합니다 (그림 1 참조)가 포함될 수 있습니다. </li></ol> [주 : Islets는 해부 입체경 또는 표준 현미경을 사용하여 시각하실 수 있습니다.] <ol start="7"><li> islets 중력 (~ 2 분)에 의해 튜브의 바닥에 정착 후 micropipette으로 PBS를 대기음 및 폐기. </li></ol> [주 : 중력에 의해 침강에 대한 대안으로 튜브는 1 분 300 XG에 centrifuged 수 있습니다.] <ol start="8"><li> 사전 배양은 낮은 GLU 400 μl를 추가할편안히 앉다 SAB는 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C에서 5 % CO 2), 60 분 미리 품어으로 튜브를 (그들의 뚜껑 열린 포함) 넣습니다. 사전 인큐베이션 낮은 포도당 SAB 및 폐기를 기음. </li><li> 기저 인슐린 분비의 경우 낮은 포도당 SAB 400 μl를 추가, 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C에서 5 % CO 2)로 튜브를 (그들의 뚜껑 열고 사용) 배치하고, 60 분 동안 품어. 낮은 포도당 SAB를 수집하고 인슐린 radioimmunoassay 저장. </li><li> 자극 인슐린 분비의 경우 높은 포도당 SAB 400 μl를 추가, 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C에서 5 % CO 2)로 튜브를 (그들의 뚜껑 열고 사용) 배치하고, 60 분 동안 품어. 높은 포도당 SAB를 수집하고 인슐린 radioimmunoassay 저장. </li></ol> 3. Thymidine의 설립 분석 <ol><li> 한 ML PBS를 추가, islets 중력에 의한 튜브의 바닥에 정착 후, micropipette으로 PBS를 대기음 폐기하고, 이것을 반복한 단계. </li><li> 500 μl 얼음 추위 trichloroacetic 산 (TCA 10 % W / V)를 추가하고 30 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 4에 3 분 ° C. 16 000 XG에 튜브를 원심 분리기 </li><li> TCA를 대기음, 0.3 N NaOH 80 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 품어. 이 기간 동안 5-10 s에 대한 노골적인 와동 샘플을 매 10 분. </li><li> 7 ML 액체 섬광 계수 튜브로 이코노 안전 계수 칵테일 4 ML을 추가합니다. </li><li> 섬광 계수 튜브에 시료 50 μl를 추가, 튜브를 쏠 잠깐 흔들 및 액체 신틸레이션 계수기로 계산됩니다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 bicinchoninic 산성 (BCA) 분석 및 시료 10 μl를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 인슐린 radioimmunoassay를 수행합니다. </li><li> 단백질 conc로 인슐린 분비 및 thymidine의 설립 데이터를 정규화entration. </li></ol> 5. 대표 결과 쥐 islets의 섬 복제 및 베타 세포 기능을 평가하기위한 실험의 예는 그림 2에 표시됩니다. 이 예제는 robustly 베타 세포 기능을 변경하지 않고도 섬 복제를 자극 가상 &quot;# 6 진&quot;의 adenoviral overexpression를 보여줍니다. 상단 패널에서 thymidine 결합 분석의 결과는 &#39;진 # 6 &quot;의 표현을 증가하는 등 thymidine의 결합에 의해 측정의 DNA 합성을 증가 것을 보여줍니다. 쥐 섬에있는 세포의 대부분은 베타 세포이기 때문에, 그것은 thymidine의 설립이 증가 베타 세포 복제의 증가를 나타내는 가능성이 높습니다. 그러나 확실한 실험은 단단히 이것을 수립 실시되어야합니다. 하단 패널에서 인슐린 분비 분석의 결과는 &#39;진 # 6 &quot;나, 즉, 기본 베타 세포 기능 중 하나를 변경하지 않은의 overexpression을 보여주낮은 높은 포도당에서 nsulin 분비. adenoviruses과 치료에 따라 islets의 섬 격리와 건강의 품질이 낮은 높은 포도당 농도의 인슐린 분비의 배 증가로 표시됩니다. &#39;진 # 6 &quot;장애인 베타 세포 기능의 표현을 증가하는 경우, 이것은 가능성이 높은 stimulatory 포도당 농도 (16.7 ㎜)에서 분비 인슐린의 감소로 반영됩니다. 포도당 농도를 변화를위한 선량 - 반응 곡선도 수행할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/4080/4080fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 유전자 발현의 adenoviral-매개 변경에 따라 분리된 쥐의 islets에 섬 복제 및 베타 세포 기능을 평가하기위한 프로토콜의 개요. 갓 고립된 쥐 islets 24 H 위해 adenoviruses에 노출된 후 96 H까지 배양해 있습니다. Thymidine의 설립이에서 인슐린 분비의 측정 다음, 마지막 24 H로 평가된다낮은 높은 포도당. <img src="/files/ftp_upload/4080/4080fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 제어 아데노 바이러스와 아데노 바이러스 overexpressing &#39;진 # 6 &quot;으로 표시된 가상의 유전자를 사용하여 실험의 결과. 상단 패널 thymidine의 설립과 하단 패널 인슐린 분비를 보여줍니다.

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<li>Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O'Doherty, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+overexpressed+hexokinases+in+liver+and+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells.</a> Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).</li>
<li>Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+hexokinase+I+in+isolated+islets+of+Langerhans+via+recombinant+adenovirus.+Enhancement+of+glucose+metabolism+and+insulin+secretion+at+basal+but+not+stimulatory+glucose+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels.</a> J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).</li>
<li>Csete, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+gene+transfer+to+pancreatic+islets+does+not+alter+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function.</a> Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).</li>
<li>Csete, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+to+pancreatic+islets+mediated+by+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors.</a> Transplantation. 59, 263-268 (1995).</li>
<li>Meng, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+liver+X+receptors+inhibits+pancreatic+islet+beta+cell+proliferation+through+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest.</a> Diabetologia. 52, 125-135 (2009).</li>
<li>Ronnebaum, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyruvate+cycling+pathway+involving+cytosolic+NADP-dependent+isocitrate+dehydrogenase+regulates+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion.</a> J. Biol. Chem. , (2006).</li>
<li>Milburn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta-cells+in+obesity.+Evidence+for+induction+of+functional%2C+morphologic%2C+and+metabolic+abnormalities+by+increased+long+chain+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids.</a> J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).</li>
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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

복제를 자극하고 베타 세포의 기능을 향상시키기 위해 변조된 수 수립 경로는 당뇨병의 두 주요 형태와 관련이 있습니다. 기능적인 베타 세포 질량이 determinants을 평가, 인슐린 - secreting 세포의 존재와 기능에 종속되어 있기 때문에 동시에 그것의 장점이 있습니다. 이 프로토콜은 단백질의 overexpression 또는 억제 그러면 생체내에 효능에 대해 테스트할 수 체외에서 기능적인 베타 세포 질량의 변화로 연결 여부 확인을위한 간소화된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜 중 하나는 제한이 섬을 포함하여 여러 세포 유형으로 구성된 마이크로 기관이지만, 알파, 베타, 델타, 엡실론, 그​​리고 PP 세포에 국한되지한다는 것입니다. 쥐 섬에있는 세포의 80-90%은 베타 세포이기 때문에 섬 복제의 변경 내용이 완전히 베타 세포 복제의 변화로 번역되지 않을 수 있습니다. 가능성을 그 섬에서 관찰된 변화복제가 아닌 베타 세포 복제 존재 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 미디어 </td><td> Gibco </td><td> 11,879 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 15,140 </td><td></td></tr><tr><td> 6 - 잘 플레이트 </td><td> BD-팔콘 </td><td> 35-1146 </td><td> 비 TC 처리 </td></tr><tr><td> [메틸-3 H]-thymidine </td><td> Perkin 엘머 </td><td> NET027Z001MC </td><td> 한 MCI / ML </td></tr><tr><td> 마이크로 원심 분리기 튜브 </td><td> Denville </td><td> C2170 </td><td> 1.7 ML </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 시그마 </td><td> 59,888 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Acros </td><td> 42,409 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 &lt;/ 서브&gt; PO 4 </td><td> Acros </td><td> 20,592 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Acros </td><td> 41,348 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Acros </td><td> 34,961 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 </td><td> H0887 </td><td> 1 M 솔루션 </td></tr><tr><td> 35% BSA </td><td> 시그마 </td><td> A7979 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Acros </td><td> 42,427 </td><td></td></tr><tr><td> D-글루코오스 </td><td> 시그마 </td><td> G8769 </td><td></td></tr><tr><td> TCA </td><td> 피셔 과학 </td><td> SA9410-1 </td><td> 10% W / V </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Acros </td><td> 12,426 </td><td></td></tr><tr><td> 섬광은 튜브를 센다 </td><td> Sarstedt </td><td> 58.536 </td><td> 7 ML, PP </td&gt; </tr><tr><td> 섬광 계수 튜브 캡 </td><td> Sarstedt </td><td> 65.816 </td><td></td></tr><tr><td> 이코노 - 안전 계수 칵테일 </td><td> RPI </td><td> 111,175 </td><td></td></tr><tr><td> 인슐린 RIA </td><td> 지멘스 </td><td> TKIN2 </td><td></td></tr><tr><td> BCA 분석 키트 </td><td> 써모 과학 </td><td> 23,250 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 5415R </td><td></td></tr><tr><td> 섬광은 튜브 랙을 계산 </td><td> Sarstedt </td><td> 93.1431.001 </td><td></td></tr><tr><td> 액체 섬광 계수기 </td><td> Perkin 엘머 </td><td> 트라이 수화물 2910TR </td><td></td></tr></tbody></table>

에서 복제와 베타 세포 기능을 평가 adenovirally-transduced 절연 쥐 islets

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

포도당 항상성은 주로 각각 췌장 베타와 알파 세포에서 분비 내분비 호르몬의 인슐린과 글루카곤에 의해 제어됩니다. 기능성 베타 세포 질량은 해부학 베타 세포 질량뿐만 아니라 영양 하중에 대응하는 베타 세포의 능력에 의해 결정됩니다. 기능적인 베타 세포 대량의 손실은 당뇨병 1-3의 두 주요 형태의 핵심이다. 제 1 형 당뇨병의 면역 공격의 감소 기능성 베타 세포 질량 결과 반해, 제 2 형 당뇨병에이 감소가 적절하게 인슐린을 분비하는 베타 세포의 무능력과 메커니즘의 간부로부터 베타 세포의 파괴 양쪽에서 개발하고 있습니다. 따라서 기능적인 베타 세포 질량을 복원하기위한 노력은보다 나은 치료 및 당뇨병에 대한 잠재적인 치료에 답해야합니다. 노력은 복제를 자극하고 베타 세포의 기능을 향상시키기 위해 악용될 수있는 분자 경로를 식별하는 진행되고 있습니다.이상적인 치료 목표는 베타 세포의 성장과 기능을 모두 향상시킬 것입니다. 하지만 아마도 더 중요한 베타 세포 성장을 자극 전략은 혼란 베타 세포 기능 (예 : 일부 oncogenes과 등)와 그 반대의 비용으로 오는지를 파악하는 것입니다. 고립된 쥐 islets에서 대상 유전자의 체계적 억제하거나 overexpressing 표현함으로써, 하나는 증가 기능성 베타 세포 대량 4-6에 대한 잠재적인 치료 표적을 식별할 수 있습니다. Adenoviral 벡터는 고립된 쥐 islets 4,7-15의 효율적 overexpress 또는 최저의 단백질로 근무하실 수 있습니다. 여기서는 adenoviral 형질 도입을 이용한 유전자 발현을 조작하고 고립된 쥐 islets (그림 1)의 섬 복제 및 베타 세포 기능을 평가하기위한 방법을 제시한다. 이 메소드는 베타 세포 복제 또는 기능 5,6,8,9,16,17 보죠 소설 대상을 식별하기 위해 이전에 사용되었습니다.

이 프로토콜은 하나가 당뇨병 치료를위한 잠재적인 치료 표적을 찾기 위해 기능성 베타 세포 질량을 조절 요소를 식별할 수 있습니다. 프로토콜은 adenoviruses과 유전자 발현의 조작에 따라 분리된 쥐의 islets에 섬 복제 및 베타 세포 기능을 평가하기위한 간소화된 방법으로 구성되어 있습니다.

에서 복제와 베타 세포 기능을 평가 Adenovirally-transduced 절연 쥐 Islets

포도당 항상성은 주로 췌장 베타 세포와 알파 세포에서 분비되는 내분비 호르몬인 인슐린과 글루카곤에 의해 조절되며, ...

본 절차의 전반적인 목적은 기능적 베타 세포 질량의 변화를 조절하는 신호 전달 경로를 식별하는 것입니다. 이는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 유전자를 과발현시키거나 발현을 억제함으로써 분리된 쥐의 췌도에서 수행됩니다. 이러한 조작 후, 인슐린 분비를 통해 베타 세포 기능을 평가하고, 삼중수소화 티미딘 통합 측정을 통해 췌도 복제를 측정합니다.궁극적으로, 이러한 분석법들은 관심 유전자가 인비트로(in vitro)에서 베타 세포의 증식 또는 기능을 조절하는지 여부를 보여줄 수 있습니다. 이 방법은 신호 전달 경로의 특정 성분이 베타 세포의 성장과 기능에 영향을 미치는지와 같이 눈꺼풀 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 필요한 수의 웰에 2 mL의 변형 배지를 첨가하여 조직 배양 코팅이 되지 않은 6-웰 플레이트를 준비하십시오.예를 들어, 일반적인 실험에서는 바이러스 미처리 대조군, 바이러스 대조군, 실험군을 위해 각각 하나의 웰을 포함하여 총 3개의 웰이 필요할 수 있습니다. 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 37 °C로 최소 30분 동안 가온합니다. 쥐의 안구(eyelet)를 분리한 즉시, 준비된 플레이트의 각 웰에 1~200개의 안구를 넣습니다. 60개의 안구는 생화학적 분석에 사용하고, 나머지 안구는 유전자 발현 연구 또는 면역 블롯팅(immuno blotting)에 사용할 수 있습니다. 플레이트를 가볍게 흔들어 안구가 각 웰의 중심에 오도록 합니다.그런 다음 아데노바이러스를 디쉬 중앙의 안구 부위에 즉시 직접 피펫팅하십시오. 관심 단백질의 과발현 또는 넉다운에 대한 아데노바이러스의 효능에 따라 1에서 500까지의 감염다중도(multiplicities of infection)를 사용하십시오.눈꺼풀 중심부까지 아데노바이러스를 효율적으로 침투시키면 결과의 일관성을 높일 수 있습니다. 눈꺼풀 분리 직후에 눈꺼풀에 형질전환을 수행하는 것이 필수적입니다.플레이트를 5분 동안 그대로 둔 후, 인큐베이터로 옮겨 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내어 아이렛(eyelet)을 웰의 중앙으로 부드럽게 확장시킵니다. 200 µL 마이크로 파이펫을 사용하여 아이렛을 신선한 배지가 담긴 새 웰로 옮깁니다.아이렛이 플레이트에 달라붙은 경우, 파이펫 팁을 사용하여 조심스럽게 떼어낼 수 있습니다. 공초점 현미경을 이용해 아데노바이러스가 섬 핵심 배양물로 침투했는지 시각화함으로써, GFP를 발현하는 대조군 바이러스를 사용하여 적절한 형질 도입 효율을 확인하는 것이 도움이 됩니다. 배지를 매일 교체하며 1~3일 더 섬을 배양합니다.배양 시간은 예비 연구를 통해 최적화해야 하며, 실험 목적에 따라 달라집니다. 마지막 24시간 동안, 배지 1밀리리터당 1\u00B5Ci 농도로 tritium-labeled thymidine을 배지에 첨가하십시오. 먼저 50mL 원뿔형 튜브에 SAB 작업액 50mL를 신선하게 조제하여 37°C 항온수조에서 가온하십시오.15 mL 원뿔형 튜브에 작동용 SAB 10 mL를 피펫으로 넣고 2.5 M D-glucose 66.8 µL를 첨가합니다. 고농도 glucose SAB를 준비하려면, 남은 작동용 SAB 40 mL에 2.5 M D-glucose 44.8 µL를 첨가합니다. 다음으로 저농도 glucose SAB를 준비하기 위해 1.7 mL 마이크로 원심분리 튜브 세 개에 라벨을 부착합니다.6웰 플레이트의 각 웰에 PBS 1mL를 추가합니다. 방사성 표지된 안구(eyelets)의 취급 및 폐기에 관한 기관 프로토콜을 반드시 준수하십시오. 실체현미경 또는 표준 현미경을 사용하여 크기가 비슷한 안구 20개를 선택해 각 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.예를 들어, 각 튜브에는 소형 아일렛 5개, 중형 10개, 대형 5개가 포함될 수 있습니다. 실험 종료 후 결과값을 총 단백질 함량으로 표준화하지만, 그룹 간 아일렛의 크기를 맞추는 것이 매우 중요합니다. 중력 또는 원심분리를 통해 아일렛이 튜브 바닥에 가라앉도록 한 후, 마이크로 피펫으로 PBS를 흡입하여 무게를 측정하고, 이어서 생화학 분석을 위한 아일렛 준비 과정을 진행합니다.인슐린 분비 분석을 위해 아일렛(eyelets)을 준비하려면, 먼저 저농도 포도당 SAB로 사전 배양해야 합니다. 이를 위해 튜브에 저농도 포도당 SAB 400 microliters를 넣고 캡을 닫은 채 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 60분 후, 사전 배양에 사용한 저농도 포도당 SAB를 흡입하여 제거합니다. 기저 인슐린 분비를 측정하려면 사전 배양 과정을 반복합니다.하지만 자극된 인슐린 분비를 측정하려면 저농도 포도당 SAB 대신 400 µL의 고농도 포도당 SAB를 사용하십시오. 이전과 마찬가지로 고농도 또는 저농도 포도당 SAB에서 배양한 후 60분 동안 eyelets를 배양하고, 제조사의 프로토콜에 따라 수행할 인슐린 방사면역측정법(radio immunoassay)을 위해 SAB를 흡입하여 제거하십시오. 그다음 동일한 eyelets 집단을 사용하여 티미딘 통합 분석(thymidine incorporation assay)을 진행하십시오. 인슐린 분비 분석에 바로 사용한 eyelets부터 시작하십시오.PBS 1 mL를 첨가하고 안구 주변부(eyelets)가 중력에 의해 가라앉도록 둡니다. 그 다음 마이크로 파이펫으로 PBS를 흡입하여 제거합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.다음으로, 안구 조직에 500 µL의 얼음처럼 차가운 trichloroacetic acid를 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 4 °C에서 튜브를 원심 분리합니다. 그 후 흡입하여 TCA를 제거합니다.다음으로, 0.3 normal 수산화나트륨 80 µL를 첨가하고 안구편(eyelets)을 상온에서 30분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 10분마다 5~10초간 샘플을 강하게 볼텍싱(vortex)합니다. 이와 동시에, 7 mL 액체 섬광 계수관에 ConoSafe counting cocktail 4 mL를 첨가합니다.아이렛(eyelets)의 배양이 완료되면, 50 µL의 아이렛을 신틸레이션 튜브에 넣습니다. 뚜껑을 닫은 튜브를 가볍게 흔든 후, 액체 신틸레이션 카운터로 시료의 방사능을 측정합니다. 또한, 단백질 농도를 측정하기 위해 10 µL의 vial을 상용 bionic acid assay에 옮기고 제조사의 프로토콜을 따릅니다.이후 데이터 분석 단계에서, 설명된 프로토콜을 사용하여 단백질 농도에 따라 결과를 정규화하십시오. 아일렛 복제 및 베타 세포 기능. 쥐 아일렛에서 가설 유전자 6의 아데노바이러스 과발현을 평가한 결과, 베타 세포 기능의 변화 없이 아일렛 복제가 강력하게 촉진되었습니다.쥐 소섬(eyelet) 내의 대부분의 세포가 베타 세포이기 때문에, gene six의 발현 증가와 함께 티미딘(thymidine) 통합으로 측정된 DNA 합성의 증가가 관찰되었습니다. 추가 실험을 통해 이러한 티미딘 통합의 증가가 베타 세포 복제의 증가로 인한 것임을 증명할 수 있을 것입니다. 인슐린 분비 분석 결과, gene six의 과발현이 저혈당 및 고혈당 상태에서의 인슐린 분비라는 베타 세포의 주요 기능 중 하나를 변화시키지 않았음을 확인하였습니다.낮은 포도당 농도와 높은 포도당 농도에서의 인슐린 분비 증가는 아데노바이러스 처리 후 췌도(islet)의 건강 상태를 반영합니다. 만약 gene six의 발현 증가가 베타 세포 기능을 손상시킨다면, 이는 높은 자극 포도당 농도에서 분비되는 인슐린의 감소로 나타날 가능성이 높습니다. 이 영상을 시청한 후에는 특정 유전자가 베타 세포의 성장이나 기능에 영향을 미치는지 판단하기 위해 베타 세포 복제와 인슐린 분비를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 간장 네오 작은 섬 STZ의 형성 (streptozotocin) 유도 도우미에 의존 adenoviral 벡터 (HDAd)과 고혈당증의 반전을 사용하여 유전자 Neurogenin3의 전송 (Ngn3)와 Betacellulin (Btc)에 의해 당뇨병 쥐를.을 설명 우리의 방법은 생체 전달하고 오래 지속 유전자 발현에서의 고효율과 도우미에 의존 adenoviral 벡터의 장점이 소요됩니다.

도우미에 의존 Adenoviral 벡터로 인한 유전자의 전송에 의한 당뇨 쥐의 간에서 네오 - 작은 섬 형성

랑게르한스의 고립 된 마우스 독도를 이용하여 체외 β-세포 기능을 시금 당뇨병의 병태 생리 및 치료의 연구에 중요한 구성 요소입니다. 많은 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있지만,이 프로토콜은 특히 β-세포의 기능을 결정하는 중요한 매개 변수로 세포 내 순환 아데노신 monophosphate (캠프)의 측정에 대해 설명합니다.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

우리는 여기에서 제2형 당뇨병의 마우스 모델, Leprdb에서 섬을 분리하기 위한 프로토콜과 2개의 광자 현미경을 사용하는 온전한 섬에서 인슐린 분비를 측정하기 위한 라이브 셀 분석의 세부 정보를 제시합니다.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

자기 갱신 성인 쥐의 췌장으로부터 분리 전구 세포의 분화를 검출하는 시험 관내 콜로니 검정 고안되어있다. 이러한 분석에서, 췌장 전구 세포가 메틸 - 함유 반고체 배지에서 3 차원 공간에서 세포 콜로니를 야기. 단일 세포와 개별 식민지의 특성을 처리하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

당뇨병 연구 분야에 중요한 도전은 섬 β 세포 복제를 조절하고 β - 세포 재생을 자극하는 방법을 개발하는 분자 메커니즘을 이해한다. 여기서 높은 콘텐츠 스크리닝 방법 식별 및 작은 분자의 β 세포의 복제를 촉진 활성을 평가하기 제시된다.

높은 콘텐츠<em&gt; 체외</em&gt; 췌장 작은 섬의 β 세포 복제 디스커버리 플랫폼

여기에서는 β세포 증식에 대한 후속 면역형광 분석을 통해 배양에서 온전한 마우스 섬에 관심 부하가 있는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 미세구의 화합물을 생성하고 관리하는 방법론을 제시합니다. 이 방법은 후보 β세포 유사분열제의 효능을 측정하는 데 적합합니다.

본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 생분해 성 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 마이크로 스피어를 사용하여

짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 운반하는 렌티바이러스에 의해 형화되는 분산된 인간 섬 세포로부터 유전자 변형된 인간 의사구성을 생성하는 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 쉽게 사용할 수있는 효소 및 배양 혈관을 활용하고, 쉽게 수행 할 수 있으며, 기능 및 형태 학적 연구에 적합한 유전자 변형 인간 의사 를 생산합니다.

렌티 바이러스는 낮은 부착 플레이트에 준비 인간의 의사에 유전자 침묵 중재

이 프로토콜의 목표는 인간 췌장 이식 과정과 기여 숙주 대 기증자 세포의 역학을 지속적으로 모니터링하는 것입니다. 이것은 NOD의 눈의 전방 챔버 (ACE)에 인간 섬을 이식하여 달성된다. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-마우스 수신자가 반복된 2광자 이미징을 수행합니다.

생체 내 눈 챔버에서 인간 췌장 이식 및 기여 호스트 세포의 생체 내 이미징 및 정량화

이 프로토콜은 고리형 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 바이오센서, cAMP 차이 검출기 in situ (cADDis) 및 미세페리퓨전 시스템의 아데노바이러스 전달을 사용하여 일차 인간 유사섬에 의한 세포 내 신호전달 이벤트의 동기 획득 및 공동 정합 및 인슐린 및 글루카곤 분비를 위한 방법을 설명합니다.

형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템

이 프로토콜은 루이스 쥐 췌장 섬의 외과적 채취, 효소 소화 및 밀도-구배 정제를 표준화하는 방법을 설명하여, 이식 또는 시험관 내 연구에 직접 사용할 수 있는 고수율, 고순도 제제를 가능하게 합니다.

효소 소화 및 밀도-구배 분리를 이용한 루이스 쥐로부터의 췌장 섬 분리 및 정제

학습하세요 아데노바이러스 벡터를 이용한 유전자 조작으로 격리된 쥐 섬에서 베타 세포 복제와 기능을 평가하는 방법을. 인슐린 분비 및 트리티움 표식 티미딘 삽입법을 통해 당뇨병 치료 표적을 식별합니다.

에서 복제와 베타 세포 기능을 평가 Adenovirally-transduced 절연 쥐 Islets

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