Phagokinetic 트랙 운동성 분석에 의한 세포 마이그레이션의 수량 평가

이 절차의 전반적인 목표는 금 나노입자 기반 세포 운동성 분석을 사용하여 시간 경과에 따른 세포 운동성을 정량적으로 측정할 수 있는 것입니다. 이것은 먼저 금 나노 입자 코팅을 위한 유리 커버 슬립을 준비하여 수행됩니다. 구체적으로 말하자면, 내독소가 없는 커버 슬립은 젤라틴으로 코팅된 다음 굽습니다.

두 번째 단계는 금 나노 입자를 생성하는 클로로 오릭산을 줄이고 젤라틴으로 코팅된 덮개가 용액과 함께 고르게 미끄러지는 것을 코팅하는 것입니다. 다음으로, 세포는 실험 세포의 원하는 시간 동안 금 나노 입자 코팅 덮개 슬립에 배치됩니다. 계속해서 젤라틴은 금 나노 입자를 대체하여 트랙을 만듭니다.

마지막 단계는 움직이는 세포에 의해 생성된 트랙을 이미지화하기 위해 현미경을 사용하여 세포 운동성을 모니터링하고 정량화하는 것입니다. 궁극적으로 트랙의 면적 측정은 무료로 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 타임 랩스 이미징과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점 중 하나는 이 분석이 표준 광학 현미경, 표준 카메라만 필요하고 무료로 사용할 수 있는 이미징 소프트웨어를 사용한다는 것입니다.

또한 이 분석을 통해 고처리량 스크리닝이 가능한 Methodist를 사용하여 여러 샘플을 쉽게 분석하고 비교할 수 있습니다. 이 방법은 다양한 생리학적 요인과 세포 이동의 영향에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 병원체가 감염된 세포의 운동성에 미치는 영향에 대한 연구와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 프로토콜에 표시된 부피와 온도를 엄격하게 따라야 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 성공을 보장하기 위해 침전된 금 나노 입자의 최종 용액의 색상을 평가하는 데 중점을 둡니다. 이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다. FGO kinetic track 운동성 분석 단계는 배우기 어렵습니다.

여기에는 세포 및 분자 생물학 실험실에서 일반적으로 사용되지 않는 몇 가지 절차가 포함되어 있습니다. 젤라틴으로 코팅된 커버 슬립을 준비하기 위해 먼저 Resus는 젤라틴과 탈이온수를 현탁시켜 300밀리리터당 0.5g의 최종 농도로 용액을 만든 다음 혼합물을 15-30분 동안 고압멸균합니다. 조직 배양 후드에 젤라틴을 첨가한 후 2시간 이내에 이 작업을 수행하는 것이 중요합니다.

먼저 8-9개의 산성 세척 커버 슬립을 100mm 플라스틱 접시에 옮겨 코팅을 위한 커버 슬립을 준비합니다. 커버 슬립이 서로 닿거나 접시의 측면에 닿지 않는지 확인하십시오. 젤라틴 2-3방울을 조심스럽게 피펫으로 각 커버에 떨어뜨려 접시에 넘치지 않도록 합니다.

그런 다음 젤라틴으로 코팅된 덮개가 들어 있는 접시를 오븐에 넣고 섭씨 90도에서 10분 동안 굽습니다. 10분 후 오븐에서 접시를 꺼내 티슈에 다시 넣습니다. 문화 후드.

여분의 젤라틴을 부드럽게 피펫으로 제거합니다. 접시를 오븐에 다시 넣고 뚜껑 슬립을 섭씨 70도에서 45분 동안 건조시킵니다. 커버 슬립이 마르면 오븐에서 접시를 꺼내 조직 배양 후드에 다시 넣습니다.

멸균 바늘을 사용하여 커버 슬립의 한쪽 면을 조심스럽게 들어 올립니다. 그런 다음 멸균 핀셋을 사용하여 접시에서 젤라틴 코팅 커버 슬립을 제거하고 24웰 플레이트의 별도의 웰에 넣습니다. 다음 단계는 콜로이드 금 코팅 커버 슬립을 준비하는 것입니다.

먼저 조직 배양 후드에서 작동하는 0.5% 구연산나트륨 용액 10ml를 준비하고, 14.5 밀리몰 클로로 ORIC 산 용액 1.5 밀리리터와 오토클레이브 탈이온수 13.5 밀리리터를 멸균 내독소가 없는 삼각 플라스크에 넣습니다. 8-9번의 커버 슬립마다 결과는 희미한 노란색 용액을 생성해야 합니다. 클로로 ORIC 산은 독성이 있으므로 조심스럽게 다루어야 합니다. 또한 빛에 민감하므로 끓는 단계는 저조도 설정에서 수행해야 합니다.

용액이 끓는점에 도달하면 핫 플레이트에서 플라스크를 제거하고 교반 플레이트로 옮깁니다. 용액에 콜로이드 금 입자를 형성하기 위해 교반하면서 클로로 ORIC 산 용액 15 밀리리터 당 0.5 % 구연산 나트륨 용액 0.7 밀리리터를 첨가하고 약 2 분 동안 계속 교반한다. 이 시간 동안 용액은 희미한 노란색에서 맑은 색으로, 회색에서 자주색, 짙은 자주색으로 바뀝니다.

최종적으로 레드 와인이나 바람직하게는 녹슨 색에 도달하기 전에 10ml 피펫에 콜로이드 금 용액을 추출하고 실온에 도달할 때까지 피펫에서 용액을 1-2분 동안 식힙니다. 그런 다음 24웰 플레이트의 젤라틴 코팅된 커버 슬립 위에 0.5-1밀리리터를 추가합니다: 콜로이드 금으로 덮인 커버 슬립이 포함된 24웰 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 놓고 30분 동안 배양합니다. 입자가 젤라틴으로 코팅된 커버 슬립에 가라앉을 시간을 가졌을 때 광학 현미경으로 밀도를 확인하십시오.

금 나노 입자의 적절한 분포는 태양열 트럭의 가장자리를 쉽고 효율적으로 구별하는 데 도움이 됩니다. 최적 밀도는 세포 크기에 따라 다릅니다. 금 입자의 농도가 너무 높으면 세포의 이동 능력이 저하되는 반면, 금 입자의 농도가 너무 낮으면 정확한 운동성 추적을 묘사하는 능력이 제한됩니다.

이러한 이유로 동일한 배치에서 만들어지거나 동일한 밀도를 갖도록 화된 커버 슬립만 개별 실험에서 함께 사용해야 합니다. 금 입자의 농도가 충분하지 않은 경우 젤라틴 코팅된 커버 슬립에 콜로이드 금 용액을 0.5-1ml를 추가로 첨가합니다. 그러나 여기에 표시된 경우와 같이 금 입자의 농도가 너무 높은 경우 유일한 효과적인 선택은 콜로이드 금 용액을 다시 만들고 새 커버 슬립을 코팅하는 것입니다.

입자 밀도가 정확하면 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 다시 넣고 1시간 동안 배양한 후 하룻밤 동안 커버 슬립을 멸균 인산염 완충 식염수에 담궈 결합되지 않은 금 입자를 헹굽니다. 그런 다음 콜로이드 금 코팅 커버 슬립을 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 4도의 깨끗한 12웰 플레이트의 PBS로 채워진 웰에 보관합니다. 커버 슬립은 건조시켜서는 안 되며 제작된 날로부터 2-3개월 이내에 사용해야 합니다.

다음 단계는 세포 배양을 위해 콜로이드 금 코팅 커버 슬립을 준비하는 것입니다. 커버 슬립을 추가하기 전에 약 0.3 밀리리터의 배양 배지가 추가된 24웰 플레이트의 개별 웰에 배치하여 시작하여 각 콜로이드 금 코팅 커버 슬립에 약 5, 000 - 50, 000 세포를 전송합니다. 셀 번호는 셀 유형에 따라 다르지만 셀 밀도는 동일한 영역에 있는 여러 셀의 셀 트랙이 겹치는 것을 방지할 수 있을 만큼 충분히 낮아야 합니다.

플레이트를 덮고 섭씨 37도의 인큐베이터에 5% 이산화탄소로 6-24시간 동안 놓습니다.세포 유형의 운동성에 따라 배양 후 각 세포 유형에 대한 최적의 기간을 실험적으로 결정해야 하며, 즉시 분석되지 않을 커버 슬립을 먼저 PBS에 두 번 담근 다음 3% 파라 포름알데히드에서 실온에서 15분 동안 배양하여 즉시 분석되지 않는 커버 슬립을 수정해야 합니다. 고정되지 않거나 고정된 커버 슬립에서 단일 이동 셀에 의해 생성된 트랙의 이미지를 광으로 캡처합니다. 세포 발자국의 사진을 찍는 데 사용되는 배율은 세포 유형에 따라 다릅니다. 그러나 결과를 비교할 수 있도록 각 연구에 대해 동일한 배율을 사용해야 합니다.

단핵구의 경우, 40 x 배율은 이미지, JNIH 이미지 또는 이미지 도구와 같은 무료로 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 잘 작동합니다. 캡처된 이미지에서 각 샘플에 대해 10-20개 이상의 세포로 투명화된 콜로이드 금의 평균 면적을 결정합니다. 여기에 표시된 이미지는 40 x 대물렌즈로 촬영한 단일 자극되지 않은 단핵구에 의한 콜로이드 금 입자의 제거 경로입니다. 운동성이 없는 세포는 그들 주위에 특징적인 작은 타원형 또는 원 모양의 궤도를 생성하는데, 이는 낮은 가신 수준의 움직임을 나타냅니다. 대조적으로, 운동성이 높은 세포는 불규칙한 모양으로 인해 길쭉한 관과 더 큰 전체 영역과 같은 방향성 이동을 특징으로 합니다.

세포 트랙은 Image J 소프트웨어의 자유형 도구를 사용하여 부피를 간략하게 설명하는 것이 가장 좋습니다. 그런 다음 이미지 J의 분석 메뉴에 있는 측정 도구를 사용하여 정량적 면적 측정을 수행할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 편차가 최종 결과에 큰 영향을 미칠 수 있으므로 프로토콜에 표시된 부피와 온도를 엄격하게 따르는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 젤라틴 코팅 커버 슬립을 만드는 방법, 금 나노 입자 및 금 나노 입자 코팅 커버 슬립을 준비하는 방법, 광학 현미경을 사용하여 세포 움직임을 모니터링하고 정량적으로 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

핫 플레이트의 끓는 용액, 특히 플루오로, AIC 산 및 구연산 나트륨의 끓는 용액에서 나오는 증기로 작업하는 것은 후드에서 작업하고 상식을 사용하는 것과 같은 위험한 예방 조치가 될 수 있음을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 항상 상식을 사용해야 합니다.