Name: Phagokinetic 트랙 운동성 분석에 의한 세포 마이그레이션의 수량 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 학습하세요 금 나노입자 코팅 커버슬립을 이용한 세포 이동성 정량 분석 방법입니다. 이 기술은 화학운동성을 측정하여 다양한 세포 유형의 행동을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 국립 보건원 (AI050677, HD-051998, 그리고 GM103433), 말콤 Feist 심장 혈관 연구 교제, 그리고 미국 심장 협회 predoctoral 휄로 십 (10PRE4200007)에서 보조금에 의해 지원되었다.

1. 젤리 - 코팅 Coverslips의 작성 <ol><li> 멸균 플라스틱 100mm 요리 (ES)의 장소 산 세척 유리 coverslips (직경 15mm). 요리 당 8-9 coverslips을 놓고 서로가 서로를 만지거나 요리의 측면 있지 않은지 확인 ... </li></ol> 참고 : Coverslips, 바늘과 핀셋이 가능한 오염 미생물뿐만 아니라, 운동성 등의 세포 기능에 영향을 미칠 것입니다 endotoxins을 제거 할 무균 있어야합니다. <ol start="2"><li> 젤라틴 가루를 무게 0.5 g/300 ML의 최종 농도와 젤라틴 솔루션을 만들기 위해 탈 이온수의 분말을 resuspend. 다음, 젤라틴 솔루션은 autoclaved해야합니다. </li><li> 피펫 2-3 각 coverslip에 젤라틴 (~ 100-150 ML)로 떨어. </li></ol> 참고 : 젤라틴은 접시를 터치하거나 요리에서 coverslips을 제거 할 수 없습니다 허용하지 않도록주의하십시오. <ol start="4"&gt; <li> 10 분 동안 90 ° C에서 오븐에 100mm 요리에 젤라틴 코팅 coverslips을 구워. </li><li> 부드러운 pipetting하여 초과 젤라틴을 제거합니다. </li><li> 45 분에 70에서 오븐에 100mm 요리 ° C에서 coverslips를 말린다. </li><li> 일단 건조, 살균, 독소 - 무료 바늘과 핀셋을 (needle을 부드럽게 제거 부드럽게 핀셋에 액세스 할 수 있도록 coverslip을 자극하는 데 사용)를 사용하여 100mm 요리에서 coverslips를 제거합니다. </li><li> 24 잘 접시 별도의 우물로 개별 젤라틴 코팅 coverslips를 놓습니다. </li></ol> 2. 콜로이드 금 코팅 Coverslips의 작성 <ol><li> chloroauric 산 (tetrachloroauric 산 trihydrate, HAuCl 4 · 3H 2 O)의 적절한 양을 무게 후 최종 14.5 MM 솔루션을 (독성) 준비하기 위해 무균 탈 이온수에 resuspend. 8-9 coverslips 당 솔루션의 1.5 ML를 준비합니다. </li></ol> 경고 : Chloroauric 산 반장님입니다한 이름 삼킨 경우는 심각한 피부 화상 및 눈 손상을 원인과 알레르기 피부 반응을 일으킬 수 있습니다. 독성 삼킨 경우. <ol start="2"><li> 나트륨 구연산의 적절한 양의 무게 (trisodium dihydrogen 2-hydroxypropane-1 ,2,3-tricarboxylate, 오세영 3 C 6 H 5 O 7) 한 후 최종 0.5 % 솔루션을 만들기 위해 탈 이온수의 분말을 resuspend. 8-9 coverslips 당 솔루션 1 ML을 준비합니다. </li></ol> 경고 : 나트륨 구연산은 눈과 피부 자극의 원인이 될 수 있습니다. 또한 호흡기 및 소화 기관의 염증을 일으킬 수 있습니다. <ol start="3"><li> 살균, 독소 - 무료 비커에서 무균 14.5 MM HAuCl 4 솔루션과 살균 탈 이온수의 13.5 ML의 1.5 ML을 결합하고, 결과는 희미한 노란색 솔루션을 얻을 수 있습니다. 앞서 언급 한 권 한 할 8-9 콜로이드 골드 coverslips을 허용합니다. </li><li> 지속적으로 교반 동안은 B로 시작 때까지 핫 플레이트에 솔루션을 가열오일. </li></ol> 경고 : 증기는 유독 / 유해 할 수 있으므로 솔루션의 가열가 연기 후드에서 수행해야합니다. 증기는 점액을 분비하는 세포막과 상부 호흡기 기관의 조직 파괴합니다. <ol start="5"><li> 핫 플레이트에서 비커를 제거합니다. </li><li> 교반 동안 0.5 % 나트륨 구연산 솔루션의 0.7 ML를 추가합니다. 앞서 언급 한 볼륨이 만들어 질 수있는 8-9 콜로이드 골드 coverslips을 허용합니다. </li><li> 약 2 분이 결합 된 솔루션을 교반 유지 (참고 : 솔루션의 색상이 점점 드디어 레드 와인에 도달하기 전에, 깊은 보라색으로, 보라색으로, 회색으로, 삭제하거나, 바람직하게는, 녹 색, 희미한 노란색에서 변경됩니다) . 이 제품은 콜로이드 금 솔루션입니다. </li><li> 1-2 분 (콜로이드 금 솔루션이 추가 될 때 녹는에서 coverslip에 젤라틴 층을 유지하기 위해)에 대한 10 ML 피펫의 콜로이드 금 솔루션을 냉각 한 후 colloida의 1.0-2.0 ML을 추가참조 - 이전에 24 잘 요리 (ES) (당신이 젤라틴 코팅 coverslips에 추가 콜로이드 금 솔루션의 양이 금 입자가 용액에 시켰던 얼마나 잘에 따라 달라집니다에 배치 각 젤라틴 코팅 coverslip로 난 금 솔루션 아래에 덧글). </li></ol> 참고 : 금 입자 강수량의 효율성의 변화가있을 수 있기 때문에, 그것은 먼저 젤라틴 코팅 coverslips에 콜로이드 금 솔루션의 0.5-1 ML을 추가하고 0.5 시간 동안 보육에 24 잘 접시를 배치 할 것이 좋습니다 . 이 부화 시간 후, coverslips는 coverslips에 금 입자의 적절한 밀도의 빛 현미경으로 확인해야합니다. 금 입자를 너무 낮게하고 너무 높은 농도의 예 20x 현미경 이미지를 그림 1을 참조하십시오. 금 입자 (적어도 단핵 세포와 함께 사용하기위한)의 이상적인 농도의 40x 현미경 이미지에 대한 그림 2를 참조하십시오. 선택다른 세포의 특성이 coverslips에 운동의 힘을 지시하므로 슬라이드의 금 나노 입자의 imal 밀도는 실험적으로, 사용되는 각 세포 유형에 대한 결정해야합니다. 금 입자의 농도가 부족한 경우, 젤라틴 코팅 coverslips에 콜로이드 금 솔루션의 추가 0.5-1 ML를 추가합니다. 셀의 크기에 따라, 금 입자의 적절한 농도는 다를 수 있으며, 따라서 궁극적으로 운동성에 대한 검사 셀의 크기에 따라 달라집니다. 예를 들어, 소형 전지 (~ 10-20 μm 28) 인간 단핵 세포와 금 입자의 높은 농도는 우리의 분석이 필요했습니다. 금 나노 입자의 적절한 배포 쉽고 효율적으로 세포 트랙의 가장자리를 구별 할 수있는 능력을 가진 연구자를 제공합니다. 너무 높은 금 입자의 농도가 정확하게 측정하는 것이 이동하는 세포의 능력을 바구니자신의 운동성 반면, 운동성의 정확한 트랙을 윤곽을 그리다가 너무 낮은 제한 사람의 능력입니다 금 입자의 농도. 중요 참고 : 금 나노 입자의 합성이 문제가있는 경우, 합성 금 나노 입자가 5 nm의에서 400 nm의에 크기 상업적으로 사용할 수 있습니다. 또한, 형광 마이크로은 세포 운동성 29 연구에서도 사용되었습니다. 그러나, 이러한 마이크로의 사용은 세포 이주의 분석을위한 형광 현미경이 필요합니다. <ol start="9"><li> 37 보육의 콜로이드 금으로 덮인 coverslips과 24 잘 접시를 놓고 1 시간에서 하룻밤을 ° C 및 품다. </li><li> 부화 후 린스 / (PBS, pH를 7.4) 생리 버퍼 멸균 인산에 coverslips을 (3 배) 찍어하여 언 바운드 금을 제거합니다. </li><li> PBS를 포함하는 깨끗한 12 잘 요리 (ES)에서 이러한 콜로이드 골드 코팅 coverslips를 놓습니다. </li><li> 4 번 ° C까지 해당 coverslips를 저장 할 준비가(parafilm 냉장고에 넣어 전에 판)을 사용합니다. </li></ol> 중요 참고 : 항상 금 입자는 coverslips에서 플레이크 마를 허용되는 경우 할 수있는 액체 / 미디어의 일부 유형의 콜로이드 골드 코팅 coverslips를 유지. 콜로이드 골드 coverslips는 그들이 만든 된 날짜 2-3개월 내에서 사용되어야합니다. 품질 관리 : 단일 phagokinetic 트랙 운동성 분석에서는 금 입자의 비슷한 농도에 의해 특징입니다 coverslips를 사용하는 것이 중요합니다. 이 간단한 점은 치료가 아닌 콜로이드 골드 코팅 coverslips의 물리적 특성의 성격에 전적으로 인해 할 샘플 사이의 세포 운동성의 양적 차이가있게됩니다. 우리가 금 나노 입자의 밀도만큼 오래가 동일한 것으로 나타났습니다하지만 우리는 각각의 실험에서 같은 시간에 한에서만 coverslips를 사용하여 선호, coverslips의 사용다른 준비에서 적합합니다. 3. 세포 운동성 분석 <ol><li> 관심 세포에 적절한 세포 미디어에서 콜로이드 골드 코팅 coverslips를 놓습니다. </li><li> 24 잘 요리 (ES)에 배치 콜로이드 골드 코팅 coverslips에 적절하게 치료 세포를 전송 </li></ol> 참고 : 하나의 잘으로 전송 세포의 수는 각 세포 유형은 공부에 대한 결정해야합니다. 이상적으로, 세포는 동등 결과적으로 하나의 셀에 의해 생성 만 트랙의 통계 분석을 위해 수 콜로이드 골드 코팅 coverslip에 배포해야합니다. 세포가 너무 높은 농도에 도금하는 경우, 그것은 여러 세포의 중복 트랙이 보이는 것을 매우 가능성이된다. 중복 트랙이 정확하게 quantitated 할 수 없으며, 따라서, 그것들은 테스트 세포의 움직임의 최종 분석에서 고려 할 수 없습니다. 의 결과로 트랙을 중복여러 셀의 참여은 일반적으로 쉽게 관찰되며, 두 개 이상의 셀이 동일한 연속 해제 지역에서 관찰 할 수있는 트랙을 (분석 분야의) 합병 또는 교차 있습니다. <ol start="3"><li> 37 품다 ° 24 시간을위한 C / 5 % CO 2 (또는 적절한 시간에, 우리는 6 시간 및 12 시간 후 치료 24 시간 후 치료 및 내피 세포 사이의 단핵 세포 운동성를 분석 한 예를). 셀 타입 공부하고, 따라서 실험적으로 각 셀 타입 (- 12 시간 게시물 트리트먼트 좋은 출발점은 그러나, 6이다)에 대해 결정해야와 세포 운동성을 결정하고 측정하기위한 최적의 시간 프레임이 달라집니다. </li></ol> 참고 : 실험 콜로이드 골드 코팅 coverslips는 나중에 저장 및 / 또는 분석해야하는 경우, 셀 및 금 나노 입자가 coverslips에 고정해야합니다. 이 고정 단계 달성하기 위해, 다음과 같은 단계 3.3 처음 세탁은 1X와 함께 조심스럽게 2 번 coverslipsPBS은 (coverslips에서 금 나노 입자의 제거가 피할 수해야하기 때문에 coverslips의 찍어 것은 바람직하다), 그러한 상온 3 % paraformaldehyde로 부화 등의 표준 셀 고정 방법을 사용합니다. 15 분 부화 후, 3 % paraformaldehyde가 제거되어야하며 coverslips는 1X PBS로 조심스럽게 3 번 씻어. 고정 coverslips는 냉장고에 저장 될 수 있습니다. <ol start="4"><li> 가벼운 현미경 사용하여, 하나의 이동 셀 (: 확실히 조사중인 세포 유형에 따라 달라집니다 휴대 트랙의 사진을 찍어하는 데 사용되는 배율 주)에서 만든 트랙의 이미지를 캡처합니다. 콜로이드 골드 코팅 coverslips에 비 운동성 및 운동성 세포에 의해 생성 세포 트랙의 예는 그림 2에 표시됩니다. </li></ol> 참고 : phagokinetic 트랙 운동성 분석에 사용되는 크기의 금 나노 입자가 세포 30에 완전히 독성이 발견되었습니다. 필요한 경우, 심사 세포의 생존 능력은 trypan 파란색으로 얼룩에 의해 평가 또는 세포 생존 능력의 다른 마커에 대한 검사를 할 수 있습니다. 하나는이 단계를 수행해야하는 경우, 계정에 고정 등의 고정, 유형에 대한 필요성을해야합니다. <ol start="5"><li> 이러한 ImageJ 소프트웨어 (등 자유롭게 사용 가능한 소프트웨어 사용 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) 또는 NIH 이미지 ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/</a> 에서 개발), 모두 보건 국립 연구소, 또는 ImageTool ( <a href="http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html" target="_blank">http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html는</a> ) 산 안토니오 (San Antonio)에서 텍사스 건강 과학 센터에 의해 삭제 콜로이드 금의 평균 면적 (임의의 단위)의 대학에서 개발 10-20 이상 세포 (샘플 당) 캡처 된 이미지에서 각 실험 팔에 결정됩니다. 통계는 다음 t를 수행 할 수 있습니다그는 결과를 수집. 예를 들어, 결과는 의미로 역모를 할 수 있습니다 ± 샘플 사이의 통계적 유의미성의 척도로 사용 학생의 t 수행 검사, 및 P 값이 &lt;0.05과 수단 (SEM)의 표준 오류를.도 3 및도 4 쇼 단계 세포에 의해 삭제 콜로이드 금의 지역의 분석. </li></ol>

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<li>Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+behavior+screen%3A+identification%2C+sorting%2C+and+enrichment+of+cells+based+on+motility%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility.</a> BMC Cell Biol. 6, 14(2005).</li>
<li>Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+cytotoxicity+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles.</a> Small. 3, 1941-1949 (2007).</li>
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<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
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</ol>

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이 문서에서 제시 phagokinetic 트랙 운동성 분석은 세포 이주의 정량 분석​​을위한 간단하고 매우 효과적인 방법입니다. 여러 셀 타입은 9-17을 분석 할 수 있기 때문에,이 방법은 여러 분야에 걸쳐 잠재적 인 폭 넓은 사용이 있습니다. 콜로이드 골드 코팅 유리 coverslips의 사용은 움직이는 세포에 의해 삭제 트랙 영역의 측정 할 수 있습니다. 검정은 세포 운동성에 (ECM의 리간드, 바이러스, 박테리아를 정화 즉, 성장 요소) 다른 자극의 효과를 측정 할 수 있습니다. 또한, 셀 고정에 대한 요구의 부족은 다른 실험 시간 지점에서 세포 마이그레이션 모니터링 할 수 있습니다. 또한, 분석은 표준 광 현미경, CCD (전하 결합 소자) 이미지 센서와 자유롭게 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 표준 카메라가 필요합니다. 따라서 정교한 현미경과 카메라가 필요하거나 특별한 소프트웨어 스위트 아르되지 않습니다. 비록 엉덩이에불안은 디자인 간단하다, 그것은 통계적으로 실험 조건의 다양한...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 유리 Coverslips (15 ㎜) </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-545-83 </td><td></td></tr><tr><td> 젤라틴 300 블룸 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G-1890 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrachloroauric 산성 Trihydrate </td><td> 피셔 화학 </td><td> G54-1 </td><td> 14.5 ㎜ (최종 작업 솔루션) </td></tr><tr><td> 나트륨 시트르산 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP327-500 </td><td> 0.5 % (최종 작업 솔루션) </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 피셔 과학 </td><td> O4042 </td><td> 3퍼센트 (최종 작업 솔루션) </td></tr><tr><td> 100mm 조직 문화 요리 </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802 </td><td></td></tr><tr><td> 12 자 플레이트 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-772-29 </td><td></td></tr><tr><td> 24 자 플레이트 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 07-200-84 </td><td></td></tr><tr><td> Techne 오븐 Hybridiser HB-1D </td><td> LabPlanet </td><td> 2040500 </td><td> 표준 실험실 오븐은 충분 </td></tr><tr><td> 10 ML 혈청 학적 피펫 </td><td> Sarstedt </td><td> 86.1254.001 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet-보조 필러 / 디스펜서 </td><td> Drummond </td><td> 13-681-15 </td><td></td></tr><tr><td> P200 단일 채널 수동 피펫 </td><td> 비가 </td><td> PR-200 </td><td></td></tr><tr><td> 200 ML 장벽 팁 </td><td> CLP </td><td> BT200 </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ 소프트웨어 </td><td> <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">htt</a>P :/ / rsb.info.nih.gov / 엘 제이 / </td><td></td><td> 라이센스 : 공개 도메인 </td></tr><tr><td> photometrics CoolSNAPfx과 니콘 이클립스 TE300은 12 비트 CCD 카메라를 흑백 </td><td> 니콘 </td><td></td><td> 중단, 가장 유사한 사양은 니콘 이클립스 티를 가지고 있지만, 낮은 엔드 니콘 80i도 적합합니다. 다른 브랜드도 비교 현미경을 제공합니다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 참고 : 아래에 나열된 시약 및 장비는 다양한 연구에서 우리가 이용되었습니다. 다른 공급, 공급​​ 업체, 시약 및 장비 등의 손님들이 유사한 사양을 가지고, 사용할 수 있습니다. </td></tr></tbody></table>

phagokinetic 트랙 운동성 분석에 의한 세포 마이그레이션의 수량 평가

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

세포 운동성은 단세포 및 다세포 생물 모두에게 중요한 생물학적 과정입니다. 그것은 영양소 나 거리에 적합 조건뿐 아니라 조직 개발, 면역 감시 및 상처 치유에 대한 다세포 생물에서와 같이, 단 몇 역할을 하나, 둘, 셋을 언급하는의 근원에 대한 단세포 생물의 움직임에 필수적입니다. 이 과정의 규제 완화는 심각한, 신경 심혈관 및 면역 질환뿐만 아니라 악화 종양 형성으로 이어질와 4,5 확산 될 수 있습니다. Molecularly, 고를 중합 및 수용체 재활용이 셀 6,7,8의 전진 운동을 유도 세포의 확장 (lamellipodia)를 만드는 중요한 역할을 재생 표시되어 있습니다. 그러나, 세포 마이그레이션하는 것에 대한 많은 생물 질문받지 않은 남아 있습니다. 인간의 건강과 질병의 세포 운동성의 중심 역할은 특정 멕을 이해의 중요성을 강조hanisms이 과정에 참여, 특히 중요한 세포 운동성을 평가하는 정확한 방법을합니다. 현미경은 일반적으로 세포의 움직임을 시각화하는 데 사용됩니다. 그러나, 세포는 운동성 세포의 정량 시간이 실효 영화를 만들 고가의 카메라와 소프트웨어를 필요로하는 리소스를 소모 과정을 세포 이주의 양적 측정을, 오히려 천천히 이동합니다. 따라서, 비용 효율적인 비 힘드는, 그 일반적인 실험실 장비를 활용합니다 세포 이주의 양적 측정을 수행 할 수있는 능력은 많은 연구자를위한 훌륭한 필요합니다. phagokinetic 트랙 운동성 분석은 콜로이드 골드 코팅 유리 coverslip 9,10에 측정 트랙을 만들 수는 경로에서 금 입자를 삭제하는 이동 셀의 능력을 활용합니다. 자유롭게 사용할 소프트웨어의 사용으로 여러 트랙이 통계 요구 사항을 달성하기 위해 각 치료를 평가 할 수 있습니다. 검정은 평가하기 위해 활용 될 수있다이러한 암 세포 11,12, 섬유 아세포 9, 호중구 13, 골격근 세포 14, keratinocytes 15, trophoblasts 16, 내피 세포 17와 단핵 세포 10,18-22 많은 세포 유형의 운동성. 프로토콜은 나트륨 구연산의 chloroauric 산 (호주 3 +)의 감소에 의해 생성 된 금 나노 입자 (호주 °)으로 코팅 슬라이드의 생성을 포함한다. 이 방법은 1951 23인치 Turkevich 외에 의해 개발 된 후 Frens 외하여 1970 년대 향상되었습니다. 24,25. 이 화학 감소 단계의 결과로, 금 입자 (직경 10-20 nm 정도)는 반응 혼합물로부터 침전 및 셀룰러 마이그레이션 분석 9,26,27에서 사용하기위한 다음 준비가되어 유리 coverslips에 적용 할 수 있습니다. 일반적으로 phagokinetic 트랙 운동성 분석 세포 운동성의, 빠른 양적 쉽게 측정하기위한 한 방법입니다. 또한,시간이 실효 영상뿐만 아니라 연구자의 필요에 따라 다른 용도 의무가없는 세포 유형에 사용할 수 있도록 간단한 높은 처리량 분석으로 활용 될 수있다. 함께 양적 비싼 현미경 및 소프트웨어 필요없이 여러 세포 유형의 세포 운동성을 측정 할 수있는 능력은 일반적인 실험실 장비와 화학 물질의 사용과 함께, 휴대을 이해 phagokinetic 트랙 운동성 분석에게 관심이있는 과학자를위한 견고한 선택을 운동성.

표시는 하나의 셀 (우리의 실험에서 단핵 세포는 그림 2에 표시되어 있습니다)에 의해 삭제 트랙 영역을 표시하는 가벼운 현미경으로 촬영 한 사진의 예입니다. 비 운동성 세포는 특성 작고, 타원형 또는 이들 unstimulated 세포 (그림 2A와 2B)에 대한 운동의 낮은 기저 수준을 나타내는 스스로 주위에 원 모양의 책자를 만들 수 있습니다. 반면, 높은 운동성 세포 [시스템에서 인간 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV)에 감염된 세포는] 가늘고 긴 트랙 영역으로 그림 2C와 2D를에 표시된 방향 움직임을 특징으로하고 있습니다. 40x 목적으로 역 현미경을 사용하여 트랙 영역의 여러 사진을 취득 후, 총 트랙 영역은 ImageJ 소프트웨어 (그림 3)를 사용하여 표시했습니다, 유사한 결과는 다른 소프트웨어 응용 프로그램과 함께 얻을 수 있습니다. 는 무료이며 사용하기 쉽게 때...

phagokinetic 운동성 트랙 분석은 세포의 움직임을 평가하는 데 사용되는 방법입니다. 특히, 분석은 양적 방식으로 시간이 지남에 chemokinesis (임의의 셀 운동성)을 측정합니다. 검정은 콜로이드 골드 코팅 coverslips에 미치는 운동의 측정 트랙을 만들 수있는 세포의 능력을 활용합니다.

Phagokinetic 트랙 운동성 분석에 의한 세포 마이그레이션의 수량 평가

세포 운동성은 단세포 및 다세포 생물 모두에게 중요한 생물학적 과정입니다. 이는 단세포 생물의 이동에 필수적이며...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 금 나노입자 기반의 세포 이동성 분석법을 사용하여 시간에 따른 세포 이동성을 정량적으로 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 금 나노입자를 코팅하기 위한 유리 커버슬립을 준비합니다. 구체적으로, 엔도톡신 제거 커버슬립에 젤라틴을 코팅한 후 가열 건조합니다.두 번째 단계는 염화금산을 환원시켜 금 나노입자를 생성하고, 젤라틴이 코팅된 커버슬립을 해당 용액으로 균일하게 코팅하는 것입니다. 다음으로, 실험 세포의 설정된 시간 동안 금 나노입자가 코팅된 커버슬립 위에 세포를 배치합니다. 이어서, 젤라틴이 금 나노입자를 밀어내어 트랙을 생성하게 됩니다.마지막 단계는 현미경을 사용하여 이동하는 세포가 생성한 궤적을 촬영함으로써 세포 운동성을 모니터링하고 정량화하는 것입니다. 최종적으로, 무료 소프트웨어를 사용하여 궤적의 면적 측정을 수행합니다. 타임랩스 이미징과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점 중 하나는 표준 광학 현미경과 표준 카메라만 필요하며, 무료 이미징 소프트웨어를 사용한다는 점입니다.또한, 이 분석법은 고처리량 스크리닝이 가능한 방법을 통해 여러 시료의 분석과 비교를 용이하게 합니다. 이 방법은 다양한 생리적 요인과 세포 이동의 영향에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 병원균이 감염된 세포의 운동성에 미치는 영향에 대한 연구와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사용자는 프로토콜에 명시된 부피와 온도를 엄격하게 준수해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다.본 프로토콜에서는 성공 여부를 확인하기 위해 침전된 금 나노입자 최종 용액의 색상을 평가하는 것에 중점을 둡니다. FGO 키네틱 트랙 운동성 분석 단계는 습득하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다.여기에는 세포 및 분자 생물학 실험실에서 흔히 사용되지 않는 몇 가지 절차가 포함되어 있습니다. 젤라틴 코팅 커버슬립을 준비하려면, 먼저 젤라틴과 탈이온수를 재현탁하여 최종 농도가 300 mL당 0.5 g인 용액을 만든 후, 혼합물을 15분에서 30분 동안 오토클레이브 처리합니다. 이 과정은 조직 배양 후드 내에서 젤라틴을 첨가한 후 2시간 이내에 수행하는 것이 중요합니다.먼저 산 세척된 커버슬립 8~9개를 100mm 플라스틱 디시에 옮겨 코팅 준비를 합니다. 커버슬립들이 서로 닿거나 디시 벽면에 닿지 않도록 주의하십시오. 각 커버슬립 위에 젤라틴 2~3방울을 조심스럽게 피펫팅하며, 플레이트에 넘치지 않도록 주의합니다.그다음 젤라틴이 코팅된 커버슬립이 담긴 디시를 오븐에 넣고 90 °C에서 10분 동안 가열합니다. 10분 후, 오븐에서 디시를 꺼내 조직 배양 후드로 다시 옮깁니다.과량의 젤라틴을 피펫으로 조심스럽게 제거합니다. 접시를 다시 오븐에 넣고 커버슬립을 70 °C에서 45분 동안 건조시킵니다. 커버슬립이 건조되면 접시를 오븐에서 꺼내 조직 배양 후드로 옮깁니다.멸균된 바늘을 사용하여 조심스럽게 커버슬립의 한쪽 끝을 들어 올립니다. 그 다음, 멸균 핀셋으로 젤라틴이 코팅된 커버슬립을 디쉬에서 제거하여 24웰 플레이트의 각각 다른 웰에 넣습니다. 다음 단계는 콜로이드 금이 코팅된 커버슬립을 준비하는 것입니다.조직 배양 후드 내에서 1.5 mL의 14.5 mM 클로로 ORIC 산 용액과 13.5 mL의 오토클레이브 멸균 탈이온수를 멸균된 엔도톡신 프리 삼각 플라스크에 혼합하여 0.5% 시트르산 나트륨 용액 10 mL를 준비하는 것으로 시작합니다. 커버슬립 8~9장당 결과물은 옅은 노란색 용액이어야 합니다. 클로로 ORIC 산은 독성이 있으므로 주의해서 다뤄야 합니다. 또한 빛에 민감하므로 가열 단계는 낮은 조도 환경에서 수행해야 합니다.용액이 끓는점에 도달하면, 플라스크를 핫플레이트에서 분리하여 교반기에 옮깁니다. 용액 내에 콜로이드 금 입자를 형성하기 위해, chloro ORIC acid 용액 15 mL당 0.5% sodium citrate 용액 0.7 mL를 교반하면서 첨가하고, 약 2분 동안 계속 교반합니다. 이 과정 동안 용액의 색상은 옅은 노란색에서 투명색, 회색, 보라색을 거쳐 진한 보라색으로 변합니다.최종적으로 레드 와인 또는 가급적 녹슨 쇠 색상이 되기 전에, 콜로이드 금 용액을 10 milliliter 피펫으로 흡입하고 용액이 실온에 도달할 때까지 피펫 내에서 1~2분 동안 식힙니다. 그 다음 24-웰 플레이트의 젤라틴 코팅 커버슬립 위에 0.5~1 milliliter를 첨가합니다. 콜로이드 금이 도포된 커버슬립이 들어있는 24-웰 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 넣고 30분 동안 배양합니다. 입자들이 젤라틴 코팅 커버슬립 위에 가라앉을 시간을 준 후, 광학 현미경으로 밀도를 확인합니다.금 나노입자의 적절한 분포는 솔라 트랙(solar trucks)의 가장자리를 쉽고 효율적으로 구별하는 데 도움이 됩니다. 최적의 밀도는 세포 크기에 따라 달라집니다. 금 입자의 농도가 너무 높으면 세포의 이동 능력이 저해되며, 금 입자의 농도가 너무 낮으면 운동성의 정확한 궤적을 묘사하는 능력이 제한됩니다.이러한 이유로, 개별 실험에서는 동일한 배치에서 제작되었거나 동일한 밀도를 갖도록 최적화된 커버슬립만을 함께 사용해야 합니다. 금 입자의 농도가 불충분한 경우, 젤라틴이 코팅된 커버슬립에 콜로이드 금 용액을 0.5에서 1 mL 더 추가하십시오. 그러나 여기에 표시된 경우처럼 금 입자의 농도가 너무 높다면, 콜로이드 금 용액을 다시 제작하고 새로운 커버슬립을 코팅하는 것이 유일하고 효과적인 방법입니다.입자 밀도가 적절하다면, 플레이트를 37°C 인큐베이터로 다시 옮겨 1시간에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 이후 커버슬립을 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 세 번 담가 결합되지 않은 금 입자를 씻어냅니다. 그 다음, 콜로이드 금이 코팅된 커버슬립을 깨끗한 12웰 플레이트의 PBS가 채워진 웰에 넣고 4°C에서 사용 시까지 보관하십시오. 커버슬립이 마르지 않도록 주의해야 하며, 제작일로부터 2~3개월 이내에 사용해야 합니다.다음 단계는 세포 배양을 위해 콜로이드 금이 코팅된 커버슬립을 준비하는 것입니다. 먼저 커버슬립을 추가하기 전에 약 0.3 milliliters의 배양액이 들어 있는 24-well 플레이트의 개별 웰에 커버슬립을 넣습니다. 각 콜로이드 금 코팅 커버슬립 위에 약 5,000에서 50,000개의 세포를 옮깁니다. 세포 수는 세포 종류에 따라 다르지만, 동일한 영역 내에서 여러 세포의 이동 경로가 겹치는 것을 방지하기 위해 세포 밀도를 충분히 낮게 유지해야 합니다.플레이트를 덮고 37°C, 5% CO₂ 조건의 배양기에 넣어 6에서 24시간 동안 배양합니다. 세포 유형의 운동성에 따라 최적의 배양 시간은 각 세포 유형별로 실험적으로 결정해야 합니다. 배양 후, 즉시 분석하지 않을 커버슬립은 먼저 PBS에 두 번 담근 다음, 실온에서 3% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 15분 동안 처리하여 고정합니다. 현미경을 사용하여 고정되지 않았거나 고정된 커버슬립 상에서 단일 이동 세포가 생성한 궤적의 이미지를 캡처합니다. 세포 궤적 사진 촬영에 사용되는 배율은 세포 유형에 따라 다르지만, 결과 비교를 위해 각 연구 내에서는 동일한 배율을 사용해야 합니다.단핵구의 경우, ImageJ, JNIH image 또는 image tool과 같이 무료로 제공되는 소프트웨어를 사용하여 40배 배율로 관찰하는 것이 적절합니다. 캡처된 이미지에서 각 샘플당 10~20개 이상의 세포에 의해 제거된 콜로이드 금의 평균 면적을 측정하십시오. 여기에 제시된 이미지는 40배 대물렌즈로 촬영한 자극되지 않은 단일 단핵구에 의해 콜로이드 금 입자가 제거된 경로입니다. 운동성이 없는 세포는 주변에 특징적인 작은 타원형 또는 원형의 궤적을 형성하며, 이는 낮은 수준의 이동성을 나타냅니다. 반면, 운동성이 높은 세포는 불규칙한 형태와 더불어 길게 늘어난 궤적과 더 넓은 전체 면적으로 나타나는 방향성 이동이 특징입니다.세포 궤적은 Image J 소프트웨어의 freehand 도구를 사용하여 부피를 외곽선으로 그려 분석하는 것이 가장 좋습니다. 이후 Image J의 분석 메뉴에 있는 measure 도구를 사용하여 정량적인 면적 측정을 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 오차가 최종 결과에 큰 영향을 미칠 수 있으므로 프로토콜에 명시된 부피와 온도를 엄격히 준수하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후, 젤라틴 코팅 커버슬립을 제작하는 방법, 금 나노입자와 금 나노입자 코팅 커버슬립을 준비하는 방법, 그리고 광학 현미경을 사용하여 세포 이동을 관찰하고 정량적으로 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.핫플레이트 위에서 끓는 용액을 다룰 때, 특히 fluoro, AIC acid 및 sodium citrate 끓는 용액에서 발생하는 증기는 위험할 수 있다는 점에 유의하십시오. 본 절차를 수행하는 동안에는 후드 내에서 작업하고 상식적인 주의 사항을 지키는 등의 예방 조치를 항상 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

이 방법은 실제 시간과 같은 속도, 변위와 속도 등 다양한 세포 이주 매개 변수의 양적 측정에 세포의 모니터링이 가능합니다. 전통적인 방법과는 달리,이 실시간 접근법 끝점 양적 마이 그 레이션 측정에 기초하지 않고 대신 그것은 모니터링하고 지속적으로 서로 다른 매개 변수를 계산할 수 있습니다.

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

우리는 다양한 성장 인자의 존재 하에서 장용성 신경 능선 세포 이동 전위의 정확한 정량을 허용 생체 세포 이동 분석을 제시한다.

쥐과 장내 신경 전구 세포에 대한 양이 세포 이동의 분석

일반적으로 사용되는 체외에서 세포의 이동 및 침윤을 조사하기위한 고도의 접근 방법이 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법은 세포 운동성을 측정하는 세포 상처 폐쇄 분석이다. 두 번째 방법은 화성과 세포의 침략적인 능력을 평가하는 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석이다.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

일차원 국한 미세 환경에서 세포의 자발적인 이동을 연구하는 정량적 방법이 설명된다. 이 방법은 미세 채널을 활용하고 번의 실험에서 서로 다른 조건 하에서 세포의 다수의 이동을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

미세 채널에서 세포의 이동에 관한 연구

세포 이동은 암과 같은 상처 치료 및 면역 반응 및 병태 생리 학적 과정으로, 생리의 과다에 관여하는 생물학적 현상이다. 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 3 차원 형상의 생리적 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 특성을 분석하는 다용도 공구이다.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

상향 조절된 많은 유전자는 종양 세포의 이동과 침입을 자극하여 예후를 악화시킵니다. 어떤 유전자가 종양 세포의 이동과 침입을 조절하는지 알아내는 것은 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 종양 세포의 이동 및 침입에 대한 유전자 발현 증가의 효과를 실시간으로 조사하는 방법을 제시합니다.

합성 mRNA transfection 후 종양 세포 이동 및 침습의 실시간 정량 측정

이 절차에서는 Acanthamoeba spp  를 시각화, 추적 및 정량화하는 방법에 대해 설명합니다.운동성.

Acanthamoeba spp.의 정량화 운동성

이 프로토콜은 정량 분석을 통해 특정 환경 조건에서 T 세포 이동의 일차 쥐 T 세포 분리 및 타임 랩스 현미경 검사 방법을 제공합니다.

일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay

유동세포계측법로 부상 / 병적인 CNS에 염증 세포의 부량는 감도 / 정확도를 감소, 유사한 크기 및 과립 세포를 가질 수 지질 / myelin 파편에 의해 복잡합니다. 우리는 myelin 파편을 제거하고 피해를 입은 척수에 유동세포계측법에 의해 세포 검출을 향상시킬 수있는 세포 준비 방법을 고급 있습니다.

유동세포계측법에 의해 피해를 입은 척수 조직에서 면역 세포의 양적 평가 : 세포 정제 방법에 대한 소설을 사용

학습하세요 금 나노입자 코팅 커버슬립을 이용한 세포 이동성 정량 분석 방법입니다. 이 기술은 화학운동성을 측정하여 다양한 세포 유형의 행동을 연구하는 데 활용됩니다.

Phagokinetic 트랙 운동성 분석에 의한 세포 마이그레이션의 수량 평가

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