라이브 세포 형광 현미경을 사용하여 박테리아 독소 유도 응답의 시각화

이 절차의 목적은 박테리아 독소에 대한 면역 세포의 반응을 시각화하는 것입니다. 먼저, 독소는 BL 21 금 세포에서 발현되고 정제됩니다. 독소의 활성과 농도가 확인되면 독소는 면역 세포에 전달됩니다.

마이크로 주입기와 고속 라이브 셀 현미경을 사용하여 수행합니다. 결과 이미지를 분석하면 독소에 대한 면역 세포 반응의 실시간 역학이 드러납니다. 이 방법은 인플라마솜 활성화 메커니즘과 같은 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법은 독소 매개 면역 세포 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 화학주성 견인차를 포함한 다른 자극에도 적용할 수 있습니다. 우리는 박테리아와 배양된 면역 세포의 상호 작용을 연구하고 박테리아와 면역 세포 간의 매우 다양한 상호 작용을 관찰할 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. PAG 3 SLO를 포함하는 BL 21 금 세포 배양으로 연쇄상구균 리신 O 또는 SLO의 정제를 시작합니다.

그의 플라스미드는 약 0.6의 OD로 성장했습니다. 단백질 발현을 유도하기 위해 배양액에 20%의 OSes 5ml를 첨가하고 실온에서 2 25 RPM으로 3시간 동안 흔듭니다. 다음으로, 박테리아를 500ml 원심분리기 병에 옮깁니다.

그런 다음 스핀 디캔트 후 섭씨 4도의 12분 동안 12, 000회 G로 배양을 회전시킵니다. supinate는 펠릿을 섭씨 영하 80도에서 하룻밤 동안 보관하거나 필요한 경우 그 이상 보관합니다. 발현된 SLO를 정제하기 위해 Triton X 100 라이소자임과 페닐 메틸 설퍼릴 플루오라이드가 보충된 10ml의 세척 버퍼를 냉동 펠릿 피펫에 약 15분 동안 위아래로 첨가합니다.

Resus로 펠릿을 매달아 샘플을 얼음 위에 올려 놓습니다. 재현탁된 펠릿을 50ml 오크 릿지 둥근 바닥 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 프로브를 사용하여 용해물을 초음파 처리하고, 40% 출력에서 30초 간격으로 각각 30초 간격으로 5회 초음파 처리하고, 그 사이에 얼음 위에서 30초를 초음파 처리합니다.

다음 39, 4 섭씨 온도의 20 분 동안 G 000 번 sonicate lysate를 회전시킵니다. 탈수 후 세척된 니켈 NTA aros 1ml에 박테리아 supinate를 추가합니다. 니켈 NTA aros를 배양하고 배양 후 섭씨 4도에서 2.5시간 동안 부드러운 흔들기로 함께 용해합니다.

섭씨 4도에서 5분 동안 400배 G로 회전하여 비드를 펠릿화합니다. 모든 추가 세척 및 용리는 이러한 원심분리 설정으로 수행되며 달리 언급되지 않습니다. 원심분리 후.

마이크로 원심분리 튜브에 30마이크로리터의 supinate와 10μl의 4배 SDS 시료 완충액을 결합하고 순도 분석을 위해 얼음에 저장합니다. 그런 다음 나머지 앙와위제는 버리고 비드를 이빨 세척 버퍼에서 4 번 씻습니다. 그리고 일단 관심이 있을 때마다 소금 완충액 원심분리 이 시점부터는 샘플을 항상 얼음 위에 보관하십시오.

SLO는 산화환원에 매우 민감한 단백질이며 짧은 기간 동안이라도 섭씨 37도까지 따뜻해지면 빠르게 활성을 잃게 됩니다. SLO 단백질을 용리화하려면 비드에 1ml의 용출 버퍼와 5마이크로리터의 1몰 DTT를 추가하고 얼음에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 원심 분리기를 사용하여 elucian number로 표시된 fuge 튜브에 supinate를 수집합니다.

그런 다음 이 과정을 세 번 반복하여 SLO 단백질에서 내독소를 고갈시키고, 200마이크로리터의 세척된 폴리 혼합 접합 아그로 비드, 현탁 res 염 완충액을 샘플에 첨가하고 섭씨 4도에서 30분 동안 흔듭니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 1분 동안 10, 000회 G로 회전합니다. 스핀 후, 라벨이 부착된 새 마이크로 원심분리기 튜브에 상층액을 수집합니다.

30마이크로리터의 각 용리액을 10마이크로리터, SDS의 4배인 시료 완충액과 결합합니다. SDS 페이지 분석을 위해 SLO 솔루션을 얼음에 보관합니다. 단백질 농도와 용혈 활성이 만족스러우면 측정하고 SLOE를 5-10마이크로리터 쿼트로 당긴 다음 드라이 아이스에 얼려 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

그런 다음 특정 용해를 결정합니다. 리스. 테스트할 셀을 두 번 일시 중단합니다. 밀리리터당 6개의 셀을 밀리리터당 20마이크로그램으로 완충액 RB의 중앙에 놓습니다.

프로피듐 요오드화물. 여기서 T27 A 셀이 테스트됩니다. 별도의 마이크로 원심분리 튜브에 있는 96웰 V 바닥 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 세포를 추가합니다.

SLO를 버퍼 rb의 최종 농도의 2배로 연속적으로 희석합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 독소 또는 100마이크로리터의 완충액 RB를 세포에 추가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 일반적인 최종 농도 범위는 밀리리터당 2000단위에서 밀리리터당 31.25단위입니다.

유세포 분석기에서 세포를 실행하고 fi, cethrin 또는 pe에 대한 필터를 사용하여 데이터를 수집합니다. 1 log shift는 일시적인 투과성 세포를 나타내고 3 log shift는 죽은 세포를 나타냅니다. 실험 플레이트 하루 전에 여기에 표시된 방정식을 사용하여 대조군에서 죽은 세포의 비율을 빼서 세포의 특정 용해를 계산하고, 콜라겐 코팅 유리에 5개의 대식세포를 두 번 중앙에 놓습니다.

바닥 35mm 접시. 독소 전달에 사용되는 현미경에는 도립 스테이지, 가열 스테이지, 적절한 여기 방출 필터 큐브 및 가능한 경우 베르탕 렌즈가 장착되어야 합니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 바늘을 그대로 세포로 가져오는 것입니다.

성공을 보장하기 위해 우리는 Bertrand 렌즈를 사용하는데, 이 렌즈는 일반적으로 초점면을 통과할 때 바늘을 시각화하기 위해 정렬에 사용됩니다. 현미경은 마이크로 인젝터에 연결되어야 하며 데이터를 수집 및 저장하고, 현미경과 마이크로 인젝터를 켜고, 가열된 스테이지 시간을 기다리는 동안 스테이지가 섭씨 37도까지 예열될 수 있도록 충분한 메모리를 갖춘 컴퓨터로 제어해야 합니다.tage 가열. 섭씨 37도에서 염료로 30분 동안 세포에 라벨을 붙입니다.

분석법에 따라 라벨링은 5 마이크로 리터로 수행 할 수 있으며, 1 밀리리터에서 4 또는 2 : 00 AM, HBSS 또는 2 마이크로 리터 칼슘 am은 1 밀리리터 전체 매체에서 4 또는 2 개가 사용됩니다. 세포 배지를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 씻습니다. PBS를 흡인하고 2밀리몰 염화칼슘이 보충된 1ml RPMI로 대체합니다.

현미경에 접시를 장착하고 명시야로 세포에 초점을 맞춘 다음 세포보다 약간 위에 초점을 맞추도록 조정합니다. 다음으로, 1마이크로리터의 SLO 독소를 4마이크로리터, 밀리리터당 10밀리그램, DEXTRA 5 55 및 6마이크로리터의 물에 결합합니다. 그런 다음 섭씨 4도의 10분 동안 20, 000번 G를 원심분리하십시오.

덱스트란은 펨토 팁이 G로 막히지 않았는지 확인하는 데 사용됩니다. 마이크로 로더를 사용하여 2마이크로리터의 희석된 독소를 뒤쪽에서 펨토 팁에 적재합니다. 펨토 팁을 마이크로 주입기에 로드합니다.

그런 다음 팁이 모든 방향으로 움직일 수 있는 공간이 있는 세포 중앙에 놓이도록 인젝터의 각도를 조정하고 마이크로 인젝터 팁이 얼마나 낮게 갈 수 있는지 제한하는 Z 제한에 대한 이전 설정을 지웁니다. 0.5PSI의 배압으로 120PSI에서 20초 동안 주입하도록 마이크로 인젝터를 설정합니다. 그런 다음 매체에 들어갈 때까지 팁을 내립니다.

베르트랑 렌즈를 사용하여. 팁을 중앙에 놓고 팁이 세포에 더 가깝게 내려갈 때 팁을 따릅니다. 바늘이 초점을 벗어나면 일반 광학 장치로 다시 전환합니다.

바늘 그림자는 현장에서 분명해야 합니다. 세포 위에 초점을 맞추고 초점이 맞을 때까지 바늘을 내립니다. 그런 다음 세포에 초점을 맞추고 바늘을 세포 근처로 조심스럽게 가져옵니다.

주입에 대한 Z 한계를 설정한 후 이미징을 시작하고 독소를 주입합니다. 그런 다음 바늘을 들어 올려 새로운 세포 영역으로 이동합니다. 추가 독소를 주입하고 주입 후 이미징을 계속합니다.

이 비디오에 설명된 방법을 사용하여 바늘에서 원치 않는 독소 누출을 방지하기 위해 바늘을 홈 위치로 이동합니다(10에서 7-10에서 밀리리터당 8단위). SLO는 일반적으로 밀리리터당 4밀리그램의 단백질 농도로 얻어집니다. 이 SDS 페이지 겔은 정제 후 독소 유도 사테 전후의 박테리아 샘플을 보여주며, 3개의 엘루시안 카마시 블루 염색 각각은 유도된 SLO가 성공적으로 정제되었음을 나타냅니다.

SLO는 T 27 A 또는 D 두 세포의 용해에 필요한 독소의 양을 결정하기 위해 69 킬로달톤의 밴드입니다. 세포는 프로피듐 요오드화물이 있는 상태에서 섭씨 37도에서 5분 동안 다양한 농도의 SLO를 투여하고 유세포 분석으로 검사했습니다. 특이적 용해는 여기에 나타난 바와 같이 결정되었다.

밀리리터당 250 단위. SLO는 T 27 A 및 D 두 개의 세포를 50% 용해시킵니다. 독소의 하위 litic 10% 용해 용량은 밀리리터당 62.5단위입니다.

이러한 값은 독소 노출 후 세포 사멸을 평가하기 위한 벤치마크 독소 활성에 중요합니다. 인간 진피 섬유아세포는 Life Technologies의 살아있는 사체 키트를 사용하여 칼슘 및 아테리움 호모다이머로 배양되었습니다. 이 이미지에서 안트로 리신(anthro ly O.In sin)이 박테리아 독소에 국부적으로 노출된 후 칼슘은 마이크로바이옴에 가까운 빨간색 영역에서 녹색과 아테륨 브로마이드로 표시되며, 칼슘 손실과 동질이머 흡수로 대표되는 세포 사멸을 보여주는 반면, 팁에서 더 멀리 떨어진 영역은 손상이 나타나지 않습니다.

또한 독소의 마이크로 전달을 통해 칼슘 플럭스와 같은 실시간 이벤트를 검사할 수 있습니다. 오전 4시 2분에 로드된 이 인간 dcs는 동시 라이브 이미징이 녹색에서 파란색으로 전환되는 일정한 유속으로 SLO에 노출되었습니다. 유사 색상은 세포질 칼슘 수치의 증가를 나타냅니다.

SLO는 세포질 칼슘의 급격한 증가를 유도하며, 이는 국소 전달로 인해 접시 영역을 통해 전파됩니다. 그러나 마이크로 주입기 팁에 가까운 세포만 반응기 독소를 만나게 됩니다. 이는 독소에 대한 단일 세포 반응과 zdi 차원의 이벤트를 해결하기 위해 독소 전달의 공간적으로 제한된 영역을 모두 보여줍니다.

마이크로 전달은 고속 3D 컨포칼 현미경과 결합되었습니다. 이 이미지 세트는 독소 주입 후 수지상 세포를 보여줍니다. 원형질막을 라벨링하기 위해 녹색으로 표시된 PC에 접합된 anti CD 11 C로 사전 배양되었습니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 미세소포는 독소 전달 후 방출됩니다. 세포 복구 과정의 일환으로 독소 분자는 독소를 제거하기 위해 흘려지는 기포에 집중됩니다. 마스터하면 45분 안에 현미경 검사를 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 세포와 혼합하기 전에 독소를 차갑게 유지하고 용혈 활성을 테스트하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 좋다. 이 동영상을 시청한 후에는 생체 세포 현미경을 사용하여 박테리아 독소에 대한 면역 세포 반응의 실시간 동역학을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.