Name: 유동 세포 계측법에 의한 Thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: 배우세요 유동 세포 계측법을 이용하여 유전자 조작 마우스에서 T 세포 발달을 분석하는 방법을. 이 기술은 면역 관용 메커니즘 연구와 면역 세포 발달 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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저자는 자신의 기술 지원을 빙 장을 감사드립니다. 이 작품은 건강 연구 (걸레-86595)에 대한 캐나다 연구소에 의해 자금을 지원했다. TAB는 CIHR 새로운 탐정과 AHFMR 학술 수 있습니다. 박사와 AIHS 풀 타임 학생이기 - QH는 CIHR 캐나다 대학원 장학금으로 지원됩니다. SAN은 퀸 엘리자베스 II 대학원 장학금으로 지원됩니다. 박사 - AYWS는 NSERC 대학원 장학금으로 지원된다.

실험 프로토콜의 전반적인 구조에 대해 1 그림을 참조하십시오. 1. 해부 <ol><li> 60 X 15mm 페트리 접시에 장소 무균 스틸 메쉬 화면. 하나의 단위 조직 샘플 당이 필요합니다. </li><li> 각 요리에 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 5 ML을 추가합니다. 얼음 요리세요. </li><li> CO 2와 쥐를 안락사시켜야. </li><li> 분해 표면에 보안 마우스, 최대 직면하고 복부 쪽. 살균에 대한 70 %의 에탄올과 및 모피는 아래 헝클어되어 있는지 확인하는 스프레이 마우스. </li><li> 수술 가위를 사용, 그냥 성기 위의 복부 피부에 복부​​ 절개를하여 절개를 시작합니다. 턱에 절개 위쪽을 연장합니다. </li><li> 중간 선에서 모든 다리를 따라 절개를 확장합니다. 느슨한 피부를 당겨하고 분해 표면에 내려 핀. </li><li> thymus를 수확 : <ol><li> 절개을 할 수있는 흉골의 하단 끝을 들어 봐요.</li><li> 간을 피 갈비를 분리하고 각 측면에 갈비를 절감 가로막을 잘라. 폐와 심장을 피하기 위해 관리하고, 각 쪽의 흉곽 위쪽으로 자른다. </li><li> 흉곽을 다시 집게로 부드럽게 당긴다. thymus은 심장 위에있는 흰색 bilobed 기관이다. 엽 (叶)의 하단을 파악하기 위해 포셉의 평면 가장자리를 사용하여 부드럽게 thymus을 뽑아 메쉬 화면에 배치. </li></ol></li><li> 비장을 수확 : <ol><li> 비장은 간 아래에있는 마우스의 복강의 왼쪽에있는 빨간색 서핑 보드 모양의 기관이다. </li><li> 복강에 절개를합니다. 부드럽게 결합 조직을 멀리 감히 두 번째 쌍을 사용 포셉 한 쌍의와 함께 비장을 당겨. 별도의 메쉬 화면에서 비장를 놓습니다. </li></ol></li></ol> 2. 셀 준비 <ol><li> 3 ML의 주사기에서 플런저를 사용하여 분쇄만 결합 조직과 지방 유적까지 메쉬 화면에 기관. 요리의 HBSS 세 번으로 메쉬를 씻어. 각 조직 샘플에 대한 새로운 플런저를 사용하십시오. <ol><li> 조직을 homogenizing에 대한 다른 옵션은이 방법 대신 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. </li><li> 335에서 원심 분리하여 펠렛 세포는 4 ° C.에 5 분을 위해 XG </li><li> 실온에서 10 분을위한 ACK 용해 버퍼 500 μl (0.15 M NH 4 CIA 같으니, 10 MM KHC0 3, 0.1 MM 그렇단이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.2)에 Resuspend splenocytes. 20 Resuspend thymocytes는 x 10 6 세포 / FACS 버퍼에 ML (PBS, 1 % FCS, 0.02 % 나트륨 azide)과 얼음에 둔다. </li><li> HBSS의 5 ML을 추가하여 isotonicity에 splenocytes을 반환합니다. 펠렛의 20 원심 분리 및 resuspend로 splenocytes X 10 6 세포 / FACS 버퍼에 ML. 세포가 무균 상태로 유지해야하는 경우, 당신은 무균 RPMI + 10% FCS를 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3.유동 세포 계측법에 얼룩 세포 이 프로토콜의 목적은 wildtype (WT)와 HY의 CD4 마우스를 사용하여 긍정적이고 부정적인 선택의 분석을위한 전략을 설명하는 것입니다. 유동 세포 계측법 실험 설계, 획득, 분석에 대한 일반적인 고려 사항의 경우, 우리는 퉁 외하여 우수 리뷰에 독자 참조하십시오. 11 <ol><li> 나누어지는 4 X 10 96 - 웰 플레이트의 각 잘에 유동 세포 계측법 샘플 당 6 thymocytes뿐만 아니라 보상 제어 당 1 × 10 6 WT splenocytes. 유전자 변형 마우스를 사용하는 경우, 당신은 실험에 컨트롤로 WT 마우스를 포함해야합니다. </li><li> 얼음에 10 분에 anti-CD16/32 (클론 2.4G2)로 세포를 잠복기가 FC 수용체를 차단합니다. </li><li> 5 분에 대해 4 ° C에서 335 XG에서 판을 봐. 뚜껑을 제거하고 한 번 판을 flicking하여 우물에서 액체를 풀다, 세면대에 얼굴을 아래로. FACS 버퍼 200 μl의 각 우물을 Resuspend. 세탁을 반복합니다. </li><li> 아래에 나열된뿐만 당 FACS 버퍼 200 μl에 희석를 기준으로하여 각 항체의 최적 농도를 사용하여 항체 칵테일을 준비합니다. 각 항체의 최적 농도는 긍정적이고 부정적인 인구의 가장 큰 분리를 제공하는 데 필요한 최저 농도로 정의됩니다. 특정 항체에 대한 부정적인 인구가없는 경우, isotype 항체가 포함되어야합니다. 원하는 경우도 당 총 볼륨이 (물론 당 100 μl로 등)를 줄일 수 있습니다. <ol><li> WT thymus : 안티 - TCRβ, 안티 CD4, 항 CD8, 항 CD69 또는 안티 CD5, 항 CD24 </li><li> thymus HY의 CD4 : 안티 - HY TCR (T3.70), 안티 - CD4, 항 CD8, 항 CD69 또는 안티 CD5, 항 CD24 CD69 ro와 thymocytes에서 CD69 하이 인구의 더 나은 분리를 얻으려면, 그것은 다음, biotinylated 방지 CD69 주요 항체를 사용하는 것이 좋습니다 보조 fluorochrome - 복합 streptavidin을 포함하는 얼룩. 우리는 UCD5 착색에 대한 SE 같은 전략. </li></ol></li><li> 어둠 속에서 얼음에 30 분을위한 FACS 버퍼의 항체 칵테일 200 μl로 세포를 배양. </li><li> 항체 칵테일 착색이 동시에, 하나의 fluorochrome - 복합 항체 각 보상 제어를 얼룩. 이상적으로, 보상 착색은 항체 칵테일에 사용되는 것과 같은 항체을 포함한다. 많은 항원이 assayed되고 나면 그러나, 각각의 항원에 대한 얼룩은 큰 실험에 대한 가능한하지 않을 수 있습니다. 따라서, 항 CD4 또는 안티 CD8 중에 얼룩은 높은 이들 항원의 표현, 또는 보상 비즈의 사용으로 인해 권장합니다. 어둠 속에서 얼음에 30 분을위한 FACS 버퍼에 청바지. 한 보상 제어 흠없는 둡니다. </li><li> FACS 버퍼로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> FACS 버퍼와 FACS 튜브로 전송에 Resuspend 세포. </li><li> 흐름 cytometer에 샘플을 수집. FSC-A의 수집 및에 FSC-W 포함이중 어 차별에 대한 llow. </li></ol> 4. 유동 세포 계측법 데이터 분석 - 비 TCR 트렌스 제닉 마우스 우리는 유동 세포 계측법 데이터 분석을 위해 FlowJo를 사용합니다. 비 TCR 유전자 변형 마우스의 게이팅 전략에 대한 2A 그림을 참조하십시오. <ol><li> SSC의 &quot;림프구&quot;인구에 전자 게이트에서 FSC-A를 사용합니다. </li><li> &quot;림프구&quot;인구 내에서, 세포 doublets 및 aggregrates을 제외 할 전자 게이트 FSC-W 그냥 ... 인구에 FSC-W에 의해 FSC-A를 사용합니다. 이렇게하면 &quot;중항&quot;문입니다. </li><li> &quot;중항&quot;게이트, CD4의 줄거리 CD8의 이벤트를 사용합니다. DN, DP 지루, DP 밝은에 문을 그려, CD4 그림 2B에 묘사 된대로 + CD8 이오, CD4SP 및 CD8SP 인구. </li><li> CD4SP 및 CD8SP 문에서 CD24 플롯에 의해 TCRβ을 만듭니다. 그림 2C에 도시로 문을 끌기 위해 사분면의 게이팅 도구를 사용합니다. </li><li> NE를 만듭니다CD69의 TCRβ : &quot;중항&quot;게이트에서 w의 줄거리. 문 A, B, C, D 그림 2D에 도시.을 그립니다 </li><li> CD5에 의해 TCRβ : &quot;중항&quot;게이트에서 다른 음모를 만듭니다. 그림 2E에 묘사 된대로 문 I, II, III, IV을 그립니다.이 긍정적 인 선택을 검토의 또 다른 전략이다. </li><li> 문 I, II, III, IV, A, B, C, D (그림 2D, E)에 &#39;중항 &quot;아래에서 DN, DP 지루, DP 밝고 CD4의 정수, CD4SP 및 CD8SP 문을 적용합니다. </li><li> 귀하의 대상 인구에 도달 할 때까지 이후의 각 게이트의 주파수에 의해 오르간 cellularity를​​ 곱하여 특정 하위 집합에있는 셀의 개수를 계산할 수 있습니다. 예를 들어, TCRβ 하이 CD69-CD8SP의 thymocytes의 수는 thymus cellularity X % TCR bhi에 의해 결정됩니다 CD69-(일부 D) X %의 CD8SP. <ol><li> 계산은 이미 라이브와 죽은 세포가 그렇게 &#39;lymphoc을 포함하지 않는 고려귀하의 계산 yte &quot;게이트. </li></ol></li></ol> 5. 유동 세포 계측법 데이터의 분석 - TCR 트렌스 제닉 마우스 TCR 유전자 변형 마우스의 게이팅 전략에 대한 3A 그림을 참조하십시오. <ol><li> 단계 이전 섹션에서와 같이 4.1 및 4.2을 따르십시오. </li><li> &quot;중항&quot;게이트에서 T3.70의 SSC 계획 및 게이트에 의해 T3.70을 만들 + 세포 인구를 항원 특정 T 세포 (그림 3B) 분석 할 수 있습니다. 일부 환경에서는 비 항원 특정 (T3.70-) T 세포의 인구에이 인구를 비교할 관심이있을 것으로 생각됩니다. </li><li> 내 T3.70 + 인구, 추첨 DN, DP, CD4SP 및 CD8SP 문 (그림 3C). <ol><li> 거의 T3.70 + 세포가있을 것 같은 WT 제어 샘플에 대해 &quot;중항&quot;게이트에서이 문을 그리거나 T3.70의 문을 만듭니다. </li></ol></li><li> CD8SP 게이트에서을 만들CD24 플롯으로 T3.70. 네 인구 (그림 3 층)에 셀을 분할 할 사분면의 게이팅 도구를 사용합니다. </li><li> WT 마우스와 HY의 CD4 마우스의 T3.70 + DP 구획 (그림 4A)의 DP 구획에서 CD69 표현을 묘사 겹쳐 히스토그램을 생성합니다. CD5 표현 (그림 4B)을 검사 반복합니다. </li><li> 4.8에서와 같이 관심의 각 하위 집합에있는 셀의 절대 수를 계산합니다. </li></ol>

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<li>Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+analysis+of+clonal+deletion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo.</a> J. Immunol. 179, 837-844 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 비 TCR 유전자 변형과 TCR 유전자 변형 마우스의 양수와 음수 선택을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 표면 항원의 착색에 대해 설명합니다. 분자 메커니즘의 추가 분석을 위해, 그것은 종종 세포 염색법을 수행 할 필요가 있습니다. 우리는 전사 인자 대부분의 세포 내 단백질과 BD Biosciences의 Foxp3의 얼룩 키트의 BD Biosciences Cytofix / Cytoperm 키트를 사용합니다. 우리는 보통 즉시 염색 후 우리의 샘플을 취득. 그러나, 샘플은 4에서 1 %의 포름 알데히드 ° 어둠 속에서 C로 FACS 버퍼에 밤새 저장할 수 있습니다. 일부 fluorochromes과 항체가 고정와 호환되지 않을 수도 있으니주의하십시오. 긍정적 인 선택의 분석을 위해, 우리는 부정적인 중급, 높은 표현 인구를보다 효율적으로 분리 (그림 2)를 제공 할 수 biotinylated 항 CD69 또는...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> HyClone 행크의 균형 소금 솔루션 </td><td> 열 과학 </td><td> SH30030.02 </td><td></td></tr><tr><td> 금속 메쉬 화면 </td><td> Cedarlane </td><td> CX-0080-E-01 </td><td></td></tr><tr><td> 배양 접시 (60 X 15mm) </td><td> 피셔 과학 </td><td> 877221 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 (3 ML) </td><td> BD Biosciences </td><td> 309657 </td><td></td></tr><tr><td> 원추형 튜브 (15 ML) </td><td> Sarstedt </td><td> 62.554.205 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 </td><td> Zeiss - 프리모 스타 </td><td> 415500-00XX-000 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser과학적인 </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 플레이트 </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 멀티 채널 피펫 </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-829 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 송아지 혈청 </td><td> PAA </td><td> A15-701 </td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 염분 버퍼 </td><td> 피셔 과학 </td><td> SH3025802 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 azide </td><td> IT 베이커 화학 (주) </td><td> V015-05 </td><td></td></tr><tr><td> FcR 차단 시약 </td><td></td><td></td><td> 복제 2.4G2 </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 HY TCR </td><td> eBioscience </td><td> XX-9930-YY의 * </td><td> 복제 T3.70 </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 CD4 </td><td> eBioscience </td><td> XX-0042-YY의 * </td><td> 복제 RM4-5 </td></tr><tr><td>nti 마우스 CD8α </td><td> eBioscience </td><td> XX-0081-YY의 * </td><td> 복제 53-6.7 </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 CD24 </td><td> eBioscience </td><td> XX-0242-YY의 * </td><td> 복제 M1/69 </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 TCRβ </td><td> eBioscience </td><td> XX-5961-YY의 * </td><td> 복제 H57-597 </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 CD69는 Biotinylated </td><td> eBioscience </td><td> 13-0691-YY * </td><td> 복제 H1.2F3 </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 CD5는 Biotinylated </td><td> eBioscience </td><td> 13-0051-YY * </td><td> 복제 53-7.3 </td></tr><tr><td> Streptavidin </td><td> eBioscience </td><td> XX-4217-YY의 * </td><td></td></tr><tr><td> 흐름 cytometer </td><td> BD Biosciences - FACS 캔토 </td><td> 338962 </td><td></td></tr><tr><td> FACS 튜브 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352052 </td><td></td></tr><tr><td> 유동 세포 계측법 분석 소프트웨어 </td><td> TreeStar - Flowjo </td><td> FlowJo V7 / 9 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone RPMI - 1640 미디어 </td><td> 열 과학 </td><td> SH30027.01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> fluorochrome와 YY는 유리 병의 크기에 따라 다릅니다에 의해 * XX는 다릅니다. </td></tr></tbody></table>

유동 세포 계측법에 의한 thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

건강한 면역 체계가 자기 항원에 허용 남아있는 동안 T 세포가 외국 항원에 반응해야합니다. T 세포 수용체 (TCR) α와 β loci의 무작위 다시 정리하기는 자신과 외국에 모두 항원 특이성의 광대 한 다양성과 T 세포 레퍼토리를 생성합니다. thymus에서 개발 중에 레퍼토리의 선택은 안전하고 유용한 T 세포를 생성 중요합니다. thymic 선택에 결함이 면역과 면역 결핍 장애 1-4의 발전에 기여하고 있습니다. T 세포 progenitors은 CD4 또는 CD8 공동 수용체를 표현하지 않는 2 중 부정 (DN) thymocytes로 thymus를 입력합니다. αβTCR하고 두 공동 수용체의 표현은 &#39;더블 긍정적 (DP) 단계에서 발생합니다. 자기 펩타이드-MHC (pMHC) thymic 세포에서 제공과 αβTCR의 상호 작용은 DP의 thymocyte의 운명을 결정합니다. 높은 연관성 상호 작용은 부정적인 선택과 elimina로 연결자기 반응성 thymocytes의 기. CD4 또는 자기 MHC (5)에 의해 제시 외국 항원을 인식 할 수 CD8 하나의 긍정적 인 (SP) T 세포의 긍정적 인 선택과 개발에 낮은 친화 상호 작용 결과. 긍정적 인 선택은 성숙 T 세포의 생성을 관찰하여 polyclonal (wildtype) TCR의 레퍼토리와 마우스에서 공부 할 수 있습니다. 그러나, 작은 항원 특정 인구의 삭제를 포함 부정적인 선택의 연구에 적합하지 않습니다. 대부분의 모델 시스템은 부정적인 선택을 공부하지만, 생리 이벤트에게 6 요점을 되풀이하는 능력에 따라 다를하는 데 사용되었습니다. 외인성 항원의 행정 thymocytes 7-9의 비 특정 삭제 될 수 있습니다 예를 들어, thymocytes의 체외 자극에 깊은 선택에 관여 thymic 환경을 부족합니다. 현재 생체 부정적인 선택에서 공부에 가장 적합한 도구 transg을 표현할 마우스 아르자기 항원 내생에 enic TCR의 특정. 그러나 많은 고전 TCR 유전자 변형 모델은 조기 부정적인 선택의 결과로, DN 단계에서 유전자 변형 TCRα 체인의 조기 표현을 특징으로하고 있습니다. 우리 연구소는 10 wildtype 마우스에서 발생하는 부정적인 선택 SP 전환에 DP 동안 발생 할 수 있습니다 유전자 변형 HY TCRα이 조건 DP 단계에서 표현되는 HY의 CD4 모델을 개발했습니다. 여기, 우리는 HY의 CD4 마우스 모델에서 thymic 긍정적이고 부정적인 선택을 검토 할 수있는 흐름 세포 계측법 기반의 프로토콜을 설명합니다. HY의 CD4 마우스의 부정적인 선택이 매우 생리이지만,이 방법은 다른 TCR 유전자 변형 모델에도 적용 할 수 있습니다. 우리는 또한 유전자 조작 마우스에 적용 polyclonal 레퍼토리에 긍정적 인 선택을 분석하는 일반적인 전략을 제시합니다.

생리 TCR 유전자 변형 모델 및 WT 생쥐에서 긍정적 인 선택 항원 만남 후 DP 지루 무대로 이동하기 전에 DP 밝은 단계에서 시작됩니다. DP 무딘 thymocytes는 CD4SP 또는 CD8SP의 thymocytes (그림 2B)가되기 전에 과도기적 CD4 + CD8에게 이오 단계를 입력합니다. 성숙 SP의 thymocytes은 높은 TCR의 표현과 CD24 (그림 2C)의 손실을 특징으로하고 있습니다. 프로필은 CD69 또는 CD5으로 TCRβ을 검토, 긍정적 인 선택에 결함을 밝힐 수 CD4하여 CD8는 결함이 자리하고있는 곳으로 더 통찰력을 제공 할 수 있지만. CD69과 CD5 모두 이러한 마커 높은 표현을 유도하는 강한 상호 작용과 TCR의 자극 후 upregulated 있습니다. CD69 음모에 의해 ...

우리는 T 세포 개발을 검토 할 수있는 흐름 세포 계측법 기반 방법을 제시<em&gt; 생체 내</em&gt; wildtype 또는 T 세포 수용체 유전자 변형 배경에 유전자 조작 쥐를 사용합니다.

유동 세포 계측법에 의한 Thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험

건강한 면역 체계는 T 세포가 자기 항원에 대해서는 내성을 유지하면서 외래 항원에는 반응하도록 요구합니다. T 세포의 무작위 재배열은...

다음 실험의 전반적인 목표는 유세포 분석법을 통해 마우스의 흉선 발달을 조사하는 것입니다. 이는 마우스의 흉선과 비장에서 단일 세포 현탁액을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, 특정 흉선 세포 집단을 식별하기 위해 흉선세포와 비장세포를 항체 칵테일로 염색합니다.최종적으로, 유세포 분석법을 통해 다양한 림프구 집단의 빈도와 수를 평가할 수 있습니다. 이 방법은 기능적이면서도 세포 내성(cell tolerant)을 갖춘 T 세포 레퍼토리를 생성하는 데 어떤 유전자와 경로가 중요한지와 같은 T 세포 발달의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 흉선 내 T 세포 발달에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 다른 면역 세포의 발달 과정을 조사하는 데에도 적용될 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 유세포 분석을 위한 항체 칵테일 설계에 어려움을 겪습니다. 해부를 시작하기 전, 60 by 15 millimeter 페트리 접시에 멸균된 스틸 메쉬 스크린을 넣으십시오. 그런 다음 접시에 5 mL의 HBSS를 추가하고, 흉선을 수확하기 위해 접시를 얼음에 보관하십시오.먼저, 핀셋을 사용하여 흉골의 하단 끝부분을 들어 올려 횡격막을 노출시킵니다. 다음으로, 간을 피해 횡격막을 절개하여 흉곽을 분리한 후, 양측의 흉곽을 위쪽 방향으로 절개합니다. 이때 폐와 심장이 손상되지 않도록 주의하십시오.이제 포셉을 사용하여 흉곽을 조심스럽게 뒤로 당깁니다. 흉선은 심장 위에 위치한 흰색의 이엽성 기관입니다. 포셉의 평평한 면을 사용하여 엽의 하단을 잡습니다.그런 다음 흉선을 조심스럽게 끌어내어 이전에 준비한 메쉬 스크린 중 하나 위에 놓습니다. 비장을 채취하려면 복막을 절개하여 복강을 노출시킵니다. 비장은 생쥐 복강의 왼쪽, 간 아래에 위치한 붉은색 서프보드 모양의 기관입니다.그 다음, 한 쌍의 핀셋으로 비장을 꺼내고 다른 핀셋으로 결합 조직을 떼어냅니다. 적출한 비장을 별도의 메쉬 스크린 위에 놓습니다. 이제 3 mL 주사기의 플런저를 사용하여 결합 조직과 지방만 남을 때까지 각 기관을 메쉬 스크린 위에서 갈아줍니다. 세포와 HBSS를 파이펫으로 흡입하여 15 mL 원심 분리관(conical tube)에 옮깁니다.그런 다음 각 메쉬를 신선한 HBS S로 3회 헹굽니다. 다음으로, 335 ×g, 4 °C에서 5분간 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 흡입하여 제거한 후, 비장 적혈구가 용해되는 동안 세포를 500 µL의 CK lysis buffer에 넣고 상온에서 10분 동안 현탁합니다.thymocytes를 fax buffer에 20 × 10⁶ cells/mL 농도로 현탁한 후, 얼음 위에 보관하십시오. 세포를 다시 원심 분리한 후, 등장성 상태로 되돌리기 위해 HBSS 5 mL를 첨가하십시오. RBC가 제거된 펠릿을 fax buffer에 20 × 10⁶ cells/mL 농도로 다시 현탁하십시오. 분주하며 이 단계를 시작하십시오.유세포 분석 샘플당 4 × 10⁶개의 준비된 THYMOCYTES를 96-well 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 다음으로, 보정 대조군을 위해 96-well 플레이트의 웰에 세포를 추가합니다. 그런 다음, 각 세포 샘플을 anti CD 16/32와 함께 얼음 위에서 10분간 배양하여 FC 수용체를 차단합니다.이제 플레이트를 원심 분리한 후, 플레이트를 뒤집어 싱크대에 한 번 털어 웰 안의 액체를 제거합니다. 그다음 각 웰에 200 µL의 fax buffer를 넣어 재현탁하고 세척 과정을 반복합니다. 이어서 실험 샘플에는 200 µL의 항체 칵테일을, 보정 대조군(compensation controls)에는 단일 형광색소 접합 항체를 넣어 배양합니다. 모든 과정은 fax buffer를 사용하여 얼음 위 암소에서 진행합니다.30분 후, FACS 버퍼로 세포를 2회 세척하고 다시 FACS 버퍼에 세포를 부유시킨 후, 생리적 TCR 형질전환 모델 및 야생형 마우스의 샘플을 FACS 튜브로 옮깁니다. 양성 선택은 double positive bright 단계에서 시작되어 double positive dull 단계로 이동하며 진행됩니다. 항원을 만난 후 double positive dull 흉선세포는 CD4 positive CD8 low 전이 단계에 진입한 다음 CD4 세포가 됩니다.단일 양성 또는 CD8 단일 양성 흉선세포인 성숙한 단일 양성 흉선세포는 높은 TCR 발현과 CD24의 소실이 특징입니다. CD8 및 CD4 프로필을 통해 양성 선택의 결함을 발견할 수 있는 한편, TCR beta 및 CD69 또는 CD5를 조사하면 결함이 발생하는 정확한 지점에 대해 더 자세한 통찰을 얻을 수 있습니다. CD69와 CD5는 모두 TCR 자극 후 상향 조절되며, 더 강한 상호작용이 일어날수록 이러한 마커들의 발현 수준이 높아집니다.야생형 생쥐의 이 TCR beta 및 CD 69 도표에서, TCR beta low CD 69 negative 게이트는 선택 전 이중 양성(double positive) 흉선세포 집단을 나타냅니다. 반면, TCR beta intermediate CD 69 positive 게이트는 TCR 결합 직후의 과도기적 집단을 나타내며, 이는 double positive bright와 일부 double positive dull 및 CD 4 positive CD 8 low 세포들로 구성됩니다. 여기서 TCR beta high CD 69 positive 게이트는 양성 선택 직후의 세포 집단을 보여주며, 이는 double positive dull, CD 4 positive, CD 8 low 및 CD 4 단일 양성(single positive) 세포들로 구성됩니다.마지막으로, 이 TCR beta high CD 69 negative 게이트는 주로 CD four 및 CD eight 단일 양성 세포로 구성된 더 성숙한 세포 집단을 보여줍니다. TCR beta intermediate CD 69 positive 및 TCR beta high CD 69 positive 집단의 부재는 양성 선택의 손상을 나타낼 수 있으며, TCR beta high CD 69 negative 집단 내의 CD four 단일 양성 세포 대비 CD eight 단일 양성 세포 비율의 변화는 계통 결정의 변형을 시사할 수 있습니다.TCR beta high CD 69 양성 및 TCR beta high CD 69 음성 집단의 손실은 양성 선택 이후의 생존 문제를 반영하는 것일 수 있습니다. CD five에 따른 TCR beta를 분석하는 것은 양성 선택 전후의 집단을 식별하기 위한 또 다른 전략입니다. 이 처음 두 집단은 주로 double positive bright 흉선세포로 구성됩니다.TCR beta low CD five low 집단은 선택 전 이중 양성 흉선세포를 나타내며, TCR beta intermediate CD five intermediate 집단은 양성 선택을 시작하는 세포들로 구성됩니다. 이 집단 또는 이전 집단의 생성 장애는 결함이 있는 양성 선택을 시사합니다. 그러나 TCR beta intermediate CD five high 집단은 양성 선택 과정을 거치고 있는 흉선세포를 나타내며, 주로 double positive dull 및 CD four positive 세포로 구성됩니다.CD8 low 흉선세포. TCR beta high CD5 high 집단은 주로 양성 선택 후의 단일 양성 흉선세포로 구성됩니다. CD4 단일 양성 세포와 CD8 단일 양성 세포의 비율 변화.이전 세포 집단이 정상임에도 불구하고 이 집단 내에 단일 양성 세포가 존재하는 것은 계통 결정(lineage commitment)의 변화를 시사할 수 있습니다. 또한, 이 집단이 부재하는 것은 음성 선택 과정에서 소규모의 항원 특이적 집단이 제거되는 것을 포함하므로, 양성 선택 이후 흉선세포의 생존율이 감소했음을 나타낼 수 있습니다. 이 과정의 결함은 TCR 형질전환 생쥐를 사용하여 가장 잘 관찰할 수 있으며, 형질전환 H-Y-T-C-R을 발현하는 HY CD4 생쥐의 흉선세포는 단클론 항체 T 3.7로 검출할 수 있습니다.H-Y-T-C-R은 MHC Class one db 내에 제시된 수컷 특이적 HY 항원을 인식합니다. 따라서 HY CD four 수컷 마우스에서는 T 3.70 양성 이중 양성 THYMOCYTES 수의 감소와, 더욱 급격한 T 3.7 양성 CD eight 단일 양성 thy cyte 수의 감소로 나타나는 H-Y-T-C-R 양성 흉선세포의 음성 선택이 일어납니다. 이와 대조적으로, HY CD four 암컷 마우스에서는 T 3.7 양성 CD eight 단일 양성 T 세포를 생성하기 위한 양성 선택이 일어납니다.이중 양성(double positive) 흉선세포 수의 감소는 음성 선택(negative selection)을 나타내지만, 항원 특이적 단일 양성(single positive) 흉선세포의 부재가 가장 정확한 측정 지표입니다. HY CD4 수컷 마우스의 소수 T3.70 양성 CD8 단일 양성 흉선세포를 추가로 조사한 결과, 대부분이 CD24 high 미성숙 세포임이 밝혀졌습니다. 반면, HY CD4 암컷의 대부분의 T3.70 양성 CD8 단일 양성 흉선세포는 성숙 단계에 도달하여 CD24 low 상태이며, 이는 HY CD4 수컷 마우스에서 음성 선택이 일어난다는 점을 추가로 뒷받침합니다.TCR 형질전환 모델의 한 가지 주의점은 흉선세포 발달 전반에 걸쳐 TCR 발현이 높기 때문에, TCR과 CD69 또는 CD5 발현을 기반으로 세포군을 식별하여 양성 선택을 추가로 특성화하기 어렵다는 점입니다. HY CD4 암컷 마우스는 양성 선택을 거치는 T3.70 양성 이중 양성 흉선세포 집단이 많이 존재합니다. 야생형과 비교했을 때 CD69 양성 세포군의 증가에서 알 수 있듯이, 음성 선택은 양성 선택보다 더 높은 친화도의 TCR 자극을 수반합니다. 이는 HY CD4 수컷 마우스의 T3.70 양성 이중 양성 흉선세포에서 CD69의 발현이 더 높게 나타나며, 그 결과 히스토그램의 피크가 오른쪽으로 이동하는 것으로 확인됩니다.유전적으로 조작된 마우스의 흉선 선택을 분석할 때 CD5 발현에서도 유사한 경향이 관찰됩니다. CD69 또는 CD5 발현을 검토하면 결함이 TCR 신호 전달에 있는지, 아니면 TCR 자극의 하위 결과에 있는지 판단할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 세포 준비 및 염색에 2시간 30분, 유세포 분석기를 이용한 데이터 수집에 추가로 1시간이 소요됩니다.올바르게 수행한다면, 마우스 한 마리를 추가할 때마다 약 30분이 더 소요됩니다. 이 실험 절차를 진행할 때, 흉선세포(thymocytes)를 조심스럽게 다루고 염색 전략을 사전에 계획했는지 확인하는 것이 중요합니다. 다음은 이 절차의 상세 내용입니다.배출된 흉선세포가 적절하게 기능하는지 등 추가적인 질문에 답하기 위해 살상 분석(killing assays)이나 사이토카인 생성 분석(cytokine production assays)과 같은 다른 분석을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 유세포 분석법을 사용하여 흉선 부위 발달을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

examination-thymic-positive-negative-selection-flow

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포, γδ T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 단핵구를 식별하기 위해 두 개의 형광 색소를 사용하는 유세포 분석 기반 기술을 보여줍니다. 표면 마커에 대해 형광 색소 접합 항체로 세포를 배양하면 최적의 유세포 분석 게이팅 전략을 사용하여 세포 subset을 식별할 수 있습니다.

말초 혈액 단핵 세포에서 면역 세포 subset을 식별하기 위한 유세포 분석 분석

여기에서 우리는 분리, 식별 및 마우스 흉선 상피 세포 (TEC는) 정화용 효율적인 방법을 설명합니다. 프로토콜은 정상 T 세포의 발달, 흉선 기능 장애, 및 T 세포 재구성을위한 흉선 기능의 연구에 활용 될 수있다.

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

우리는 유동 세포 계측법와 함께, T 세포 현상의 양 및 음의 선택을 모델링하는데 사용될 수 있고, 흉선 조각의 제조를 설명한다. 흉선 조각은 또한 흉선 세포 마이그레이션, 현지화의 현장에서 분석하도록하고, 면역 및 두 광자 현미경을 통해 시그널링 할 수있다.

준비 및의 Organotypic 흉선 슬라이스 문화의 응용 프로그램

노출 된 정상적인 안구 표면은 각막과 결막으로 이루어져 있습니다. 상피 세포, 배 세포 및 면역 세포가 결막에 존재한다. 여기, 노출 세포학의 비 침습적 기술은 인상 세포학 장치 및 결막의 면역 세포를 분석하는 유동 세포 계측법을 사용하여 설명합니다.

결막에서 세포를 분리하고 표현하기위한 비 침습적 방법

여기, 분리와 CD4의 특성에 대 한 프로토콜+ T-세포 인간 주변 혈액에서 하위 집합 설명. CD4 정화+ T-세포 cytometry T follicular 도우미 셀 하위 집합의 비율을 결정 하 여 분석 된다.

CD4의 격리+ T-세포 및 분석의 순환 T-follicular 도우미 (cTfh) 6 컬러 Flow Cytometry 주변 혈액을 사용 하 여에서 셀 하위 집합

여기, 선물이 murine thymus, 림프절, 비장 추가 연구를 cytometry를 사용 하 여 이러한 셀을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하는 프로토콜. 또한,이 프로토콜 cytometry 사용 규제 T 세포의 하위 집합을 결정 하는 데 사용 되었다.

Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정

여기, 선물이 CD4를 식별 하는 흐름 cytometric 프로토콜+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포와 7 대신만 두 형광을 사용 하 여 인간의 말 초 혈액에 monocytes. 이 방법을 5 추가 마커 대부분 교류 cytometers에 기록할 수 있습니다.

2 형광 색소에 의해 7 개의 면역 세포 하위 집합의 차별 Cytometry 흐름

본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

이 프로토콜은 추가 기능 분석을 위해 델타와 같은 4-발현 골수 기질 세포주 공동 배양 시스템(OP9-DL4)에서 레트로바이러스 형질도입 및 공동 배양에 이어 마우스 흉선에서 이중 음성 흉선 세포를 분리하는 것을 설명합니다.

T 세포 백혈병에서 종양 유전자를 연구하기 위해 델타와 같은 4-발현 간질 세포에서 쥐 흉선세포의 공동 배양 및 형질도입

우리는 마우스 흉선 상피 세포의 단일 세포 현탁액 준비 및 유세포 분석을 위한 세포 내 분자의 염색을 위한 프로토콜을 설명합니다.

Preparation of single-cell suspension of mouse thymic epithelial cells (마우스 흉선 상피 세포의 단세포 현탁액 및 유세포 분석을 위한 세포 내 분자의 염색)

배우세요 유동 세포 계측법을 이용하여 유전자 조작 마우스에서 T 세포 발달을 분석하는 방법을. 이 기술은 면역 관용 메커니즘 연구와 면역 세포 발달 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

유동 세포 계측법에 의한 Thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험

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