유동 세포 계측법에 의한 Thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험

다음 실험의 전반적인 목표는 유세포 분석을 통해 마우스의 발달 과정을 조사하는 것입니다. 이것은 마우스, 흉선 및 비장에서 단세포 현탁액을 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 흉선세포(thymocyte)와 세포(cyte)는 특정 thy 집단을 식별하기 위해 항체 칵테일로 염색됩니다.

궁극적으로 다양한 림프구 집단의 빈도와 수는 유세포 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 이 방법은 기능적이면서도 세포에 내성이 있는 T 세포 레퍼토리를 생성하는 데 중요한 유전자와 경로와 같은 T 세포 발달의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 흉선의 T 세포 발달에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 면역 세포의 발달을 검사하는 데에도 적용할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 유세포 분석을 위한 항체 칵테일을 설계하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 해부를 시작하기 전에 멸균 강철 메쉬 스크린을 60 x 15mm 페트리 접시에 넣으십시오. 그런 다음 접시에 HBSS 5ml를 넣고 접시를 얼음에 보관하여 흉선을 채취합니다.

먼저 집게를 사용하여 흉골의 아래쪽 끝을 들어 올려 횡격막을 드러냅니다. 다음으로, 간을 피하고 횡격막을 절단하여 흉곽을 분리한 다음 흉곽을 양쪽에서 위쪽 방향으로 자릅니다. 폐와 심장을 피하도록 주의하십시오.

이제 집게를 사용하여 흉곽을 부드럽게 뒤로 당깁니다. 흉선은 심장 위에 위치한 흰색 이중 엽 기관입니다. 집게의 평평한 가장자리를 사용하여 엽의 바닥을 잡습니다.

그런 다음 흉선을 부드럽게 당겨 미리 준비된 메쉬 스크린 중 하나에 놓습니다. 비장을 채취하려면 복막을 절개하여 복강을 노출시킵니다. 비장은 간 아래 쥐의 복강 왼쪽에 위치한 빨간색 서핑보드 모양의 기관입니다.

그런 다음 한 쌍의 집게를 사용하여 비장을 빼내고 다른 한 쌍을 사용하여 결합 조직을 떼어냅니다. 그런 다음 절개된 비장을 별도의 메쉬 스크린에 놓습니다. 이제 3밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 결합 조직과 지방만 피펫으로 세포와 HBSS를 15ml 원뿔형 튜브에 남을 때까지 각 장기를 메쉬 스크린에 갈아넣습니다.

그런 다음 각 메쉬를 새 HBS S3로 헹굽니다. 다음으로, G의 335배와 섭씨 4도에서 5분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상등액 Resus를 흡인시킨 후, 비장 적혈구가 Resus를 주입하는 동안 실온에서 10분 동안 CK 용해 완충액 500마이크로리터에 세포를 현탁시킵니다.

흉선세포를 팩스 버퍼의 밀리리터당 6개 세포에 20 곱하기 10으로 현탁시키고 얼음 위에 따로 보관합니다. 이제 세포를 다시 회전시킨 후 세포를 등장성으로 되돌리기 위해 HBSS 5ml를 추가하고, resus는 적혈구 프리 펠릿을 팩스 버퍼에서 밀리리터당 6번째 세포에 20 곱하기 10으로 현탁시킵니다. Ali Watting이 이 단계를 시작합니다.

96 웰 플레이트의 각 웰에 대한 유세포 분석 샘플당 예약된 THYMOCYTES의 10배에서 6배. 다음으로, 보상 제어를 위해 96웰 플레이트의 웰에 cyte를 추가합니다. 그런 다음 얼음에서 10분 동안 anti CD 1632로 배양하여 각 세포 샘플의 FC 수용체를 차단합니다.

지금 판을 회전시키고 그 후에 수채로 판을 아래로 한 번 아래로 튕겨서 우물에서 액체를 쫓아내고, 그 후에 resus는 팩시밀리 완충기의 200 마이크로리터에 있는 각 우물을 중단하고 세척을 반복한다. 다음으로, 보상 대조군을 위해 200마이크로리터의 항체 칵테일 또는 단일 형광 색소 접합 항체로 실험 샘플을 배양합니다. 모두 팩스로 어둠 속에서 얼음 위에 버퍼를 놓습니다.

30분 후, 팩스 버퍼로 세포를 두 번 세척한 다음 팩스 버퍼에 세포를 현탁시킨 후 생리학적 TCR 형질전환 모델 및 야생형 마우스의 팩스 튜브로 샘플을 전송합니다. 긍정적 인 선택은 이중 긍정적 인 밝은 단계에서 시작하여 이중 긍정적 인 둔한 단계로 이동하기 전에 시작됩니다. 항원이 이중 양성 무딘 흉선 세포를 만난 후, CD 4가 되기 전에 과도기 CD 4 양성 CD 8 낮은 단계로 들어갑니다.

단일 양성 또는 CD 8개의 단일 양성 흉선세포, 성숙한 단일 양성 흉선세포는 높은 TCR 발현과 CD 24의 손실이 특징입니다. CD 8 x CD 4 프로파일은 포지티브 셀렉션의 결함을 나타낼 수 있지만, CD 69 또는 CD 5에 의한 TCR 베타를 검사하면 결함이 어디에 있는지에 대한 추가 통찰력을 제공할 수 있습니다. CD 69와 CD 5는 모두 TCR 자극 후 상향 조절되며, 이러한 마커의 발현을 높이는 더 강력한 상호 작용으로 인해 상향 조절됩니다.

야생형 마우스의 CD 69에 의한 이 TCR 베타 플롯에서, TCR R beta low CD 69 negative gait은 pre-selection double positive thymocytes의 집단을 나타냅니다. 이 TCR 베타 중간 CD 69 양성 보행은 TCR 참여 직후의 전이 집단을 나타내며 일부 이중 양성 둔한 이중 양성 및 CD 4 양성 CD 8 개의 낮은 세포로 구성됩니다. 여기서 TCR R beta high CD 69 positive gait은 양성 선택 직후 세포 집단을 보여주며, 이는 이중 양성 둔한 CD 4 개의 양성, CD 8 개의 낮은 세포 및 CD 4 개의 단일 양성 세포로 구성됩니다.

마지막으로, 이 TCR 베타 높은 CD 69 음성 보행은 주로 CD 4 및 CD 8 단일 양성 세포로 구성된 보다 성숙한 세포 집단을 보여줍니다. TCR R beta intermediate CD 69 양성 및 TCR R beta high CD 69 양성 집단의 부재는 CD 4 단일 양성 대 CD 8의 비율에서 양성 선택 변화가 손상되었음을 나타낼 수 있습니다. TCR beta high CD 69 음성 집단 내의 단일 양성 세포는 계통 투입의 변화를 암시할 수 있습니다.

TCR beta high CD 69 양성 및 TCR beta high CD 69 음성 집단의 손실은 양성 선택 후 생존 문제를 반영할 수 있습니다. CD 5에 의한 TCR 베타를 조사하는 것은 사전 및 사후 양성 선택 집단을 식별하는 또 다른 전략입니다. 이 처음 두 집단은 주로 이중 양성 밝은 흉선세포로 구성됩니다.

TCR beta low CD five low population은 preselection double positive thymocytes를 나타내고, TCR beta intermediate CD five 중간 population은 positive selection을 시작하는 세포로 구성됩니다. 이 개체군 또는 이전 개체군의 손상된 생성은 결함이 있는 양성 선택을 암시합니다. 그러나 TCR R 베타 중간 CD 5 높은 모집단은 양성 선택을 겪는 과정에서 흉선세포를 나타내며 주로 이중 양성 둔탁 및 CD 4 양성으로 구성됩니다.

CD 8 낮은 흉선 세포. TCR 베타 하이 CD 5 하이 모집단은 주로 포스트 포지티브 선택으로 구성됩니다. 단일 양성 흉선세포는 CD 4, 단일 양성 대 CD 8의 비율로 변화합니다.

이 집단 내의 단일 양성 세포는 정상적인 선행 집단에도 불구하고 계통 투입의 변화를 암시할 수 있습니다. 또한, 이 집단의 부재는 음성 선택이 작은 항원 특이적 집단의 결실을 포함하기 때문에 긍정적 선택 후 흉선세포의 생존 감소를 나타낼 수 있습니다. 이 과정에서의 결함은 HY CD에서 TCR 형질전환 마우스를 사용하여 가장 잘 관찰할 수 있으며, 형질전환 H-Y-T-C-R을 발현하는 4개의 마우스 흉선세포는 단클론 항체 T 3.7로 검출할 수 있습니다.

H-Y-T-C-R은 MHC Class one db 내에 존재하는 남성 특이적 HY 항원을 인식합니다. 따라서 HY CD 4 개의 수컷 마우스는 T 3 점 70 긍정적 인 이중 양성 THYMOCYTES 수의 감소와 T 3.7 긍정적 인 CD 8, 단일 긍정적 인 thy cyte 수의 더 극적인 감소로 표시된 바와 같이 H-Y-T-C-R 양성 thymocytes의 음성 선택을 겪습니다. 대조적으로, HY CD 4 개의 암컷 마우스는 T 3.7 양성 CD 8 개의 단일 양성 T 세포를 생성하기 위해 긍정적 인 선택을 거칩니다.

이중 양성 thy 수치의 감소는 음성 선택을 나타내지만, 항원 특이적 단일 양성 흉선세포가 없는 것이 가장 정확한 측정입니다. HY CD 4 개의 수컷 마우스에서 몇 개의 T 3 점 70 긍정적 인 CD 8 개의 단일 양성 흉선 세포에 대한 추가 검사는 대부분이 CD 24 높은 미성숙 세포임을 밝힌다. HY CD 4 암컷에서 대부분의 T 3 점 70 긍정적 인 CD 8 개의 단일 양성 흉선 세포는 성숙에 도달하고 CD 24 낮은, 추가 지원을 제공하는 동안, 그 음성 선택은 HY CD 4 개의 수컷 마우스에서 발생합니다.

TCR 형질전환 모델의 한 가지 주의점은 CYTE 발달 전반에 걸쳐 높은 TCR 발현으로 인해 TCR 및 CD 69 또는 CD 5 발현을 기반으로 집단을 식별하여 양성 선택을 추가로 특성화하기 어렵다는 것입니다. 야생형에 비해 CD 69 양성 모집단의 증가에서 알 수 있듯이, 음성 선택은 긍정적 선택보다 더 높은 친화성 TCR 자극을 포함합니다. 이는 HY CD 4마리의 수컷 마우스에서 T 3점 70 양성 이중 양성 흉선세포에서 CD 69의 더 높은 발현으로 나타나며, 이로 인해 히스토그램 피크가 오른쪽으로 이동

유전적으로 조작된 마우스에서 흉선 선택을 분석할 때 CD five 발현에서도 유사한 경향이 나타납니다. CD 69 또는 CD five 발현을 검사하면 결함이 TCR 신호에 있는지 TCR 자극의 다운스트림 결과에 있는지 여부를 결정할 수 있습니다. 이 기법을 마스터하면 세포 준비 및 염색을 위해 2시간 30분 만에 수행할 수 있으며, 유세포 분석기에서 데이터를 수집하는 데 추가로 1시간을 할애할 수 있습니다.

올바르게 수행하면 마우스를 추가할 때마다 약 30분이 추가됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 흉선세포를 부드럽게 다루고 사전에 염색 전략을 계획했는지 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따릅니다.

사멸 분석 또는 사이토카인 생산 분석과 같은 다른 분석은 내보낸 흉선세포가 제대로 기능하는지 여부와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 유세포 분석을 사용하여 흉선 부위 발달을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.