유동 세포 계측법에 의한 Thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험

다음 실험의 전반적인 목표는 유세포 분석법을 통해 마우스의 흉선 발달을 조사하는 것입니다. 이는 마우스의 흉선과 비장에서 단일 세포 현탁액을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, 특정 흉선 세포 집단을 식별하기 위해 흉선세포와 비장세포를 항체 칵테일로 염색합니다.

최종적으로, 유세포 분석법을 통해 다양한 림프구 집단의 빈도와 수를 평가할 수 있습니다. 이 방법은 기능적이면서도 세포 내성(cell tolerant)을 갖춘 T 세포 레퍼토리를 생성하는 데 어떤 유전자와 경로가 중요한지와 같은 T 세포 발달의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 흉선 내 T 세포 발달에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 다른 면역 세포의 발달 과정을 조사하는 데에도 적용될 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 유세포 분석을 위한 항체 칵테일 설계에 어려움을 겪습니다. 해부를 시작하기 전, 60 by 15 millimeter 페트리 접시에 멸균된 스틸 메쉬 스크린을 넣으십시오. 그런 다음 접시에 5 mL의 HBSS를 추가하고, 흉선을 수확하기 위해 접시를 얼음에 보관하십시오.

먼저, 핀셋을 사용하여 흉골의 하단 끝부분을 들어 올려 횡격막을 노출시킵니다. 다음으로, 간을 피해 횡격막을 절개하여 흉곽을 분리한 후, 양측의 흉곽을 위쪽 방향으로 절개합니다. 이때 폐와 심장이 손상되지 않도록 주의하십시오.

이제 포셉을 사용하여 흉곽을 조심스럽게 뒤로 당깁니다. 흉선은 심장 위에 위치한 흰색의 이엽성 기관입니다. 포셉의 평평한 면을 사용하여 엽의 하단을 잡습니다.

그런 다음 흉선을 조심스럽게 끌어내어 이전에 준비한 메쉬 스크린 중 하나 위에 놓습니다. 비장을 채취하려면 복막을 절개하여 복강을 노출시킵니다. 비장은 생쥐 복강의 왼쪽, 간 아래에 위치한 붉은색 서프보드 모양의 기관입니다.

그 다음, 한 쌍의 핀셋으로 비장을 꺼내고 다른 핀셋으로 결합 조직을 떼어냅니다. 적출한 비장을 별도의 메쉬 스크린 위에 놓습니다. 이제 3 mL 주사기의 플런저를 사용하여 결합 조직과 지방만 남을 때까지 각 기관을 메쉬 스크린 위에서 갈아줍니다. 세포와 HBSS를 파이펫으로 흡입하여 15 mL 원심 분리관(conical tube)에 옮깁니다.

그런 다음 각 메쉬를 신선한 HBS S로 3회 헹굽니다. 다음으로, 335 ×g, 4 °C에서 5분간 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 흡입하여 제거한 후, 비장 적혈구가 용해되는 동안 세포를 500 µL의 CK lysis buffer에 넣고 상온에서 10분 동안 현탁합니다.

thymocytes를 fax buffer에 20 × 10⁶ cells/mL 농도로 현탁한 후, 얼음 위에 보관하십시오. 세포를 다시 원심 분리한 후, 등장성 상태로 되돌리기 위해 HBSS 5 mL를 첨가하십시오. RBC가 제거된 펠릿을 fax buffer에 20 × 10⁶ cells/mL 농도로 다시 현탁하십시오. 분주하며 이 단계를 시작하십시오.

유세포 분석 샘플당 4 × 10⁶개의 준비된 THYMOCYTES를 96-well 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 다음으로, 보정 대조군을 위해 96-well 플레이트의 웰에 세포를 추가합니다. 그런 다음, 각 세포 샘플을 anti CD 16/32와 함께 얼음 위에서 10분간 배양하여 FC 수용체를 차단합니다.

이제 플레이트를 원심 분리한 후, 플레이트를 뒤집어 싱크대에 한 번 털어 웰 안의 액체를 제거합니다. 그다음 각 웰에 200 µL의 fax buffer를 넣어 재현탁하고 세척 과정을 반복합니다. 이어서 실험 샘플에는 200 µL의 항체 칵테일을, 보정 대조군(compensation controls)에는 단일 형광색소 접합 항체를 넣어 배양합니다. 모든 과정은 fax buffer를 사용하여 얼음 위 암소에서 진행합니다.

30분 후, FACS 버퍼로 세포를 2회 세척하고 다시 FACS 버퍼에 세포를 부유시킨 후, 생리적 TCR 형질전환 모델 및 야생형 마우스의 샘플을 FACS 튜브로 옮깁니다. 양성 선택은 double positive bright 단계에서 시작되어 double positive dull 단계로 이동하며 진행됩니다. 항원을 만난 후 double positive dull 흉선세포는 CD4 positive CD8 low 전이 단계에 진입한 다음 CD4 세포가 됩니다.

단일 양성 또는 CD8 단일 양성 흉선세포인 성숙한 단일 양성 흉선세포는 높은 TCR 발현과 CD24의 소실이 특징입니다. CD8 및 CD4 프로필을 통해 양성 선택의 결함을 발견할 수 있는 한편, TCR beta 및 CD69 또는 CD5를 조사하면 결함이 발생하는 정확한 지점에 대해 더 자세한 통찰을 얻을 수 있습니다. CD69와 CD5는 모두 TCR 자극 후 상향 조절되며, 더 강한 상호작용이 일어날수록 이러한 마커들의 발현 수준이 높아집니다.

야생형 생쥐의 이 TCR beta 및 CD 69 도표에서, TCR beta low CD 69 negative 게이트는 선택 전 이중 양성(double positive) 흉선세포 집단을 나타냅니다. 반면, TCR beta intermediate CD 69 positive 게이트는 TCR 결합 직후의 과도기적 집단을 나타내며, 이는 double positive bright와 일부 double positive dull 및 CD 4 positive CD 8 low 세포들로 구성됩니다. 여기서 TCR beta high CD 69 positive 게이트는 양성 선택 직후의 세포 집단을 보여주며, 이는 double positive dull, CD 4 positive, CD 8 low 및 CD 4 단일 양성(single positive) 세포들로 구성됩니다.

마지막으로, 이 TCR beta high CD 69 negative 게이트는 주로 CD four 및 CD eight 단일 양성 세포로 구성된 더 성숙한 세포 집단을 보여줍니다. TCR beta intermediate CD 69 positive 및 TCR beta high CD 69 positive 집단의 부재는 양성 선택의 손상을 나타낼 수 있으며, TCR beta high CD 69 negative 집단 내의 CD four 단일 양성 세포 대비 CD eight 단일 양성 세포 비율의 변화는 계통 결정의 변형을 시사할 수 있습니다.

TCR beta high CD 69 양성 및 TCR beta high CD 69 음성 집단의 손실은 양성 선택 이후의 생존 문제를 반영하는 것일 수 있습니다. CD five에 따른 TCR beta를 분석하는 것은 양성 선택 전후의 집단을 식별하기 위한 또 다른 전략입니다. 이 처음 두 집단은 주로 double positive bright 흉선세포로 구성됩니다.

TCR beta low CD five low 집단은 선택 전 이중 양성 흉선세포를 나타내며, TCR beta intermediate CD five intermediate 집단은 양성 선택을 시작하는 세포들로 구성됩니다. 이 집단 또는 이전 집단의 생성 장애는 결함이 있는 양성 선택을 시사합니다. 그러나 TCR beta intermediate CD five high 집단은 양성 선택 과정을 거치고 있는 흉선세포를 나타내며, 주로 double positive dull 및 CD four positive 세포로 구성됩니다.

CD8 low 흉선세포. TCR beta high CD5 high 집단은 주로 양성 선택 후의 단일 양성 흉선세포로 구성됩니다. CD4 단일 양성 세포와 CD8 단일 양성 세포의 비율 변화.

이전 세포 집단이 정상임에도 불구하고 이 집단 내에 단일 양성 세포가 존재하는 것은 계통 결정(lineage commitment)의 변화를 시사할 수 있습니다. 또한, 이 집단이 부재하는 것은 음성 선택 과정에서 소규모의 항원 특이적 집단이 제거되는 것을 포함하므로, 양성 선택 이후 흉선세포의 생존율이 감소했음을 나타낼 수 있습니다. 이 과정의 결함은 TCR 형질전환 생쥐를 사용하여 가장 잘 관찰할 수 있으며, 형질전환 H-Y-T-C-R을 발현하는 HY CD4 생쥐의 흉선세포는 단클론 항체 T 3.7로 검출할 수 있습니다.

H-Y-T-C-R은 MHC Class one db 내에 제시된 수컷 특이적 HY 항원을 인식합니다. 따라서 HY CD four 수컷 마우스에서는 T 3.70 양성 이중 양성 THYMOCYTES 수의 감소와, 더욱 급격한 T 3.7 양성 CD eight 단일 양성 thy cyte 수의 감소로 나타나는 H-Y-T-C-R 양성 흉선세포의 음성 선택이 일어납니다. 이와 대조적으로, HY CD four 암컷 마우스에서는 T 3.7 양성 CD eight 단일 양성 T 세포를 생성하기 위한 양성 선택이 일어납니다.

이중 양성(double positive) 흉선세포 수의 감소는 음성 선택(negative selection)을 나타내지만, 항원 특이적 단일 양성(single positive) 흉선세포의 부재가 가장 정확한 측정 지표입니다. HY CD4 수컷 마우스의 소수 T3.70 양성 CD8 단일 양성 흉선세포를 추가로 조사한 결과, 대부분이 CD24 high 미성숙 세포임이 밝혀졌습니다. 반면, HY CD4 암컷의 대부분의 T3.70 양성 CD8 단일 양성 흉선세포는 성숙 단계에 도달하여 CD24 low 상태이며, 이는 HY CD4 수컷 마우스에서 음성 선택이 일어난다는 점을 추가로 뒷받침합니다.

TCR 형질전환 모델의 한 가지 주의점은 흉선세포 발달 전반에 걸쳐 TCR 발현이 높기 때문에, TCR과 CD69 또는 CD5 발현을 기반으로 세포군을 식별하여 양성 선택을 추가로 특성화하기 어렵다는 점입니다. HY CD4 암컷 마우스는 양성 선택을 거치는 T3.70 양성 이중 양성 흉선세포 집단이 많이 존재합니다. 야생형과 비교했을 때 CD69 양성 세포군의 증가에서 알 수 있듯이, 음성 선택은 양성 선택보다 더 높은 친화도의 TCR 자극을 수반합니다. 이는 HY CD4 수컷 마우스의 T3.70 양성 이중 양성 흉선세포에서 CD69의 발현이 더 높게 나타나며, 그 결과 히스토그램의 피크가 오른쪽으로 이동하는 것으로 확인됩니다.

유전적으로 조작된 마우스의 흉선 선택을 분석할 때 CD5 발현에서도 유사한 경향이 관찰됩니다. CD69 또는 CD5 발현을 검토하면 결함이 TCR 신호 전달에 있는지, 아니면 TCR 자극의 하위 결과에 있는지 판단할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 세포 준비 및 염색에 2시간 30분, 유세포 분석기를 이용한 데이터 수집에 추가로 1시간이 소요됩니다.

올바르게 수행한다면, 마우스 한 마리를 추가할 때마다 약 30분이 더 소요됩니다. 이 실험 절차를 진행할 때, 흉선세포(thymocytes)를 조심스럽게 다루고 염색 전략을 사전에 계획했는지 확인하는 것이 중요합니다. 다음은 이 절차의 상세 내용입니다.

배출된 흉선세포가 적절하게 기능하는지 등 추가적인 질문에 답하기 위해 살상 분석(killing assays)이나 사이토카인 생성 분석(cytokine production assays)과 같은 다른 분석을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 유세포 분석법을 사용하여 흉선 부위 발달을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.