Name: Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 배우세요 쥐의 흉선, 림프절, 비장에서 단일 세포를 분리하여 유세포 분석으로 조절 T 세포를 분석하는 방법입니다. 이 비용 효율적인 수동 기술은 면역학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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현재 연구는 스웨덴 연구 위원회, EXODIAB, 스웨덴 당뇨병 재단, 스웨덴 어린이 당뇨병 펀드, 셉 Diabetesfonden 및 O.E. 그리고 Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse에 의해 재정적으로 지원 되었다. 저자 또한 감사 당-올라요 Carlsson Stellan 샌들러 그들의 지원 및 토론에 대 한 같은 것 이다.

웁살라 대학에서 로컬 동물 윤리 위원회 동물 실험 승인.
1. 동물에서 장기 수확
<ol><li>자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 희생.</li>
	<li>Thymic 샘 놓고 20 mL 섬광 튜브 또는 15 mL 원뿔 튜브 Hanks´의 5 mL로 가득 spleens 균형 소금물 (HBSS). 1.5 mL 마이크로 튜브 RPMI 1640의 1 mL로 가득에서 장소 PDLNs. 전체 thymus, 비장, 그리고 모든 PDLNs를 사용 합니다. 참고: 기관 절차에 걸쳐 얼음에 보관 해야 하 고 탐정 thymic 면역 세포 높은 온도에서 신속 하 게 저하 될 수 있습니다 이후 thymic 조직을 처리 하는 경우에 특히 단일 셀 정지를 준비 하는 동안 빠른 수 하려고 한다.</li>
</ol>2. 단일 셀 별개로 Thymus, 비장
<ol><li>철저 하 게 짠 다 thymus, 비장 면역 세포를 분리 하는 핀셋 한 켤레. 나머지 thymic 및 비장 캡슐을 삭제 합니다.</li>
	<li>세포 현 탁 액 15 mL 원뿔 튜브와 펠 릿을 형성 하기 위하여 4 ° C에서 5 분에 대 한 433 x g 에서 원심 분리기를 전송 합니다. 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>붉은 혈액 세포를 lyse 세포 현 탁 액 0.2 M NH4Cl의 5 mL에 resuspend 하 고 10 분 반전 튜브 거꾸로 부드럽게 매 2 분 추가 5 mL는 세포를 중지 하는 외피의 끝에 HBSS의 대 한 상 온에서 품 어.</li>
	<li>원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>HBSS 약 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. HBSS로 튜브를 채우십시오.</li>
	<li>원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>HBSS 약 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. HBSS로 튜브를 채우십시오.</li>
	<li>원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>Thymus 위한 HBSS의 5 mL와 10 mL 비장에 대 한에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>Thymic 셀 서 스 펜 션의 1 mL 및 비장 세포 현 탁 액 5 ml의 500 µ L 라운드 셀 스 트레이너 모자 하단 튜브. 셀 스 트레이너 모자에 세포 현 탁 액을 적용 합니다. 참고: 35 µ m 나일론 메쉬 모자에 통합 됩니다. 약 5-10 백만 셀 각 튜브에 수집 되었다.</li>
</ol>3. 단일 셀 별개로 PDLN
<ol><li>15 mL 원뿔 튜브 랙에 살 균 250 µ m 금속 메시를 놓습니다. 메쉬 RPMI의 1 mL와 린스.</li>
	<li>금속 메쉬를 림프 노드를 전송 하 고 핀셋의 쌍을 사용 하 여 메시를 통해 그들을 갈기. 튜브에 세포를 금속 메쉬에 RPMI의 1 mL를 적용 합니다. 3 번 더 반복 하 고 메시를 제거 합니다.</li>
	<li>원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>RPMI의 약 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 튜브를 RPMI 채우십시오.</li>
	<li>원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>RPMI의 약 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 튜브를 RPMI 채우십시오.</li>
	<li>원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>2 ml RPMI의 셀 펠 릿을 resuspend. 이전 셀 서 스 펜 션의 2 mL 5 mL 라운드 셀 스 트레이너 모자 하단 튜브. 셀 스 트레이너 모자에 세포 현 탁 액을 적용 합니다.</li>
</ol>4. Cytometry
<ol><li>Thymus, PDLN 및 4 ° c.에서 5 분에 대 한 433 x g 에서 비장 세포 정지 원심 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>Cytometry 버퍼 (버퍼 FACS) 얼룩의 100 µ L에 다음 표면 항 체와 세포 얼룩: 0.75 µ g/100 µ L CD4 FITC 활용 된 항 체, 0.60 µ g/100 µ L APC H7 활용 된 CD8 항 체, 0.30 µ g/100 µ L CD25 PE 활용 된 항 체, 5 µ L (1: 20) APC 활용 된 Nrp1 항 체입니다. 40 분 동안 얼음에 튜브를 품 어.</li>
	<li>각 튜브를 FACS 버퍼의 200 µ L를 추가 합니다. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한. 한 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>수정 하 고 500 µ L Permeabilization 고정 버퍼 (PFB)의에서 셀 펠 릿을 resuspending 하 여 세포를 permeabilize. 참고: PFB는 고정/Permeabilization 고정/Permeabilization 희석제의 3 부분으로 집중의 1 부분을 혼합 하 여 준비 된다.</li>
	<li>하룻밤에 4 ° C 냉장고에 튜브를 유지. 참고: 1 시간 보육도 작동합니다.</li>
	<li>원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>500 µ L Permeabilization 세척 버퍼 (PWB)의에서 셀 펠 릿을 resuspend. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한. 참고: PWB Permeabilization diluting 준비한 증류수에 1:10 (10 배)를 버퍼.</li>
	<li>PWB의 100 µ L에 다음 세포내 항 체와 세포 얼룩: 0.30 µ g/100 µ L Foxp3 PE Cy7 활용 된 항 체, 4 µ L (1: 25) 헬 리오스 PacificBlue 활용 된 항 체. 1 시간에 대 한 얼음에 튜브를 품 어.</li>
	<li>각 튜브를 PWB의 500 µ L를 추가 합니다. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>PWB의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>FACS 버퍼의 300 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>에 교류 cytometer 세포 분석.</li>
	<li>측면 살포 지역, 높이 폭, 그리고 앞으로 피해 지역, 높이 너비에 따라 단일 셀 게이트 분석에 대 한 1 백만 이벤트를 실행 합니다.</li>
	<li>실험의 FCS 파일 내보내고 흐름 cytometry 분석기 소프트웨어를 사용 하 여 분석.</li>
</ol>

<ol><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li>
<li>Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+Scurfin+in+CD4%2BCD25%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+%28CD25%29.+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li>
<li>Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+regulatory+T+cells+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">How regulatory T cells work.</a> Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).</li>
<li>Thornton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Helios%2C+an+Ikaros+transcription+factor+family+member%2C+differentiates+thymic-derived+from+peripherally+induced+Foxp3%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).</li>
<li>Weiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+1+is+expressed+on+thymus-derived+natural+regulatory+T+cells%2C+but+not+mucosa-generated+induced+Foxp3%2B+T+reg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).</li>
<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).</li>
<li>Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+analysis+of+Helios+and+Neuropilin-1+as+a+marker+to+detect+thymic+derived+regulatory+T+cells+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice.</a> Scientific Reports. 5, 7767(2015).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-35+administration+counteracts+established+murine+type+1+diabetes--possible+involvement+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, 12633(2015).</li>
<li>Digre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+heparanase+enhances+T+lymphocyte+activities+and+intensifies+the+inflammatory+response+in+a+model+of+murine+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis.</a> Scientific Reports. 7, 46229(2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-tumoral+immune+cell+alterations+in+wild+type+and+Shb-deficient+mice+in+response+to+4T1+breast+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas.</a> Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 연구에서 우리는 thymic 동맥, PDLNs 및 끄 덕 임 쥐의 spleens에서 단일 셀을 절연 하 고 헬 리오스와 CD4에 Nrp1의 식을 조사+CD8-CD25+Foxp3+ Treg 세포 cytometry 사용 하 여. 현재 연구는 타입-1 당뇨병의 murine 모델은 끄 덕 임 쥐가 사용 되었다. 이전 연구에서 우리는 헬 리오스 또는 Nrp1 tTreg pTreg 세포에서 세포를 구별을 위한 더 나은 표식 인지를 조사 하는 야생 타입 마우스 CD-1 긴장과 C57BL/6 마우스를 이용 했다. 그 연구에 우리 순진한 마우스9Treg 세포의 하위 집합을 결정 하기 위해 비슷한 프로토콜 사용. 우리 헬 리오스가이 맥락에서 더 나은 마커 발견. 따라서, 여기에 우리가이 모델에 우리의 이전 발견을 확인 하 여 결과10우리의 이전 결과 일치 했다 발견 normogly...

규정 (Treg) T 세포는 면역 시스템의 항상 성에 대 한 중요 합니다. Treg 세포 표면 항 원 c d 4의 식와 CD25, 및 녹음 방송 요인 forkhead 상자 P3 (Foxp3)1,2,3에 의해 정의 됩니다. 사 카 구치 외. 먼저 CD25 constitutively 쥐4, 인간 Treg 세포의 식별에 대 한 선구적인 관찰을 제공 하는 T 억제기 세포에 표현 된 보여주었다. Treg 세포 apoptosis, cytokine 소비 및 세포 독성의 표현을 통해 억제를 유도 하는 granzymes의 분 비를 통해 cytolysis를 포함 하 여 메커니즘의 다양 한 통해 진압 능력을 발휘 하 여 면역 관용에 중심 역할을 담당 T-림프 구 항 45. 또한, 그들은 변형 성장 인자 베타 (TGF-β), 인터 루 킨-10 (IL-10) 및 IL-355등 억제 cytokines를 분 비 수 있습니다. Treg 세포 자연스럽 게 파생 될 수 있다, thymus에서 thymic 파생된 Treg (tTreg) 셀, 지정 되어 어떤 경우에 또는 케이스 주변 유도 Treg (pTreg) 셀 이라고 그 주변 기관에서 유도 될 수 있다.
헬 리오스, Ikaros 녹음 방송 요인 가족의 일원이 tTreg 세포 사이 구별을 위한 마커 이기 위하여 보고 되었다 그리고 pTreg 세포6. 나중에, 다른 두 그룹 Neuropilin 1 (Nrp1), semaphorin III 수용 체 특정 조건7,8에서 tTreg 세포에 대 한 표면 표식으로 될 수 있는 보고. 그럼에도 불구 하 고, 싱 외. 헬 리오스는 순진한 마우스9에서 이런이 맥락에서 더 나은 표식으로 나타났습니다.
Treg 세포의 하위 집합 및 면역 및 감염에 대 한 보호 면역 체계의 항상성 유지에 중추적인 역할. 따라서, 그것은 숫자와 림프 및 비 림프 조직에 이러한 인구의 비율을 결정 하는 것이 중요입니다. 이를 위해, 하나의 단일 셀이이 기관에서 정지를 준비 하고있다. 여러 프로토콜 설명 또는 이전 연구에서 사용 된 있다. 주로, 자동 dissociators 이전 게시 된 보고서10,11에 사용 되었습니다. 자동 dissociators를 사용 하는 편리 하 고 시간 절약, 하지만 그것은 비싼 절차. 따라서, normoglycemic 비 뚱뚱한 당뇨병 (끄 덕) 쥐, 및이 기관에서 격리 된 단일 셀에서 murine thymic 땀 샘, 췌 장 배출 림프 노드 (PDLNs) 및 spleens 단일 셀 정지를 준비 하는 수동 방법을 사용 했습니다. 이 방법은 우리의 이전 연구에서 사용 되었습니다 그리고 우리는 단일 세포 현 탁 액을 준비 하기 위한 수동 방법 자동 dissociator 방법9,12,,1314만큼 효율적 이다 발견. 또한, 우리는 CD4의 비율을 확인 하려면 cytometry 사용+CD8-CD25+Foxp3+ Treg 세포와 Treg 하위 집합 tTreg 및 pTreg 세포 세포. TTreg 및 pTreg 세포 tTreg 세포에 대 한 표식으로 헬 리오스와 Nrp1를 사용 하 여 구분 했다. 따라서, 우리의 결과 단일 셀을 준비 하기 위한 수동 방법 효율적으로 작동 하 고 준비 된 단일 셀 정지 추가 연구 cytometry 사용 하 여 사용 될 수 있습니다 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td>NOD 마우스</td><td></td><td></td><td>사내 빵가루 입히기</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Statens veterin&auml; rmedicinska anstalt</td><td>991750</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>EMD Millipore</td><td>1011450500</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / 전사 인자 염색 버퍼 세트</td><td>ThermoFisher</td><td>00-5523-00</td><td>고정/투과화 농축액, 고정/투과화 희석제 및 투과화 완충액 (10x) 포함</td></tr><tr><td>eBioscience 플로우 사이토메트리 염색 버퍼</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>CD4 단클론 항체 (RM4-5), FITC, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0042-85</td><td></td></tr><tr><td>CD25 단클론 항체 (PC61.5), PE, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>12-0251-83</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen&nbsp; APC-H7 쥐 안티 마우스 CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>560182</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated 항체</td><td>R& D Systems</td><td>FAB5994A</td><td></td></tr><tr><td>FOXP3 단클론 항체 (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>25-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-mouse/human Helios 항체</td><td>BioLegend</td><td>137220</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Round Bottom 폴리스티렌 시험관, Cell Strainer Snap Cap</td><td>CORNING</td><td>352235</td><td>A 35 &micro; 이중 위치 스냅 캡에 m 나일론 메쉬가 통합되어</td></tr> 있습니다 <tr><td>튜브 15 mL, 120 mm x17 mm, PP</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 튜브 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>일회용 섬광 바이알</td><td>WHEATON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석 소프트웨어</td><td>Inivai Technologies</td><td>Flowlogic</td><td></td></tr></tbody></table>

murine thymus, 림프절, 비장 cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 t 세포의 결정

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

규제 T 세포 (Treg) 세포 등 면역 세포의 다양 한 숫자와 우리의 면역 체계에 의하여 이루어져 있다. Treg 세포는 두 개의 하위 집합, thymic 파생된 Treg (tTreg) 세포와 주변 유도 Treg (pTreg) 셀으로 나눌 수 있습니다. 그들은 우리의 신체의 다른 장기에 존재 하 고 헬 리오스 Neuropilin 1 등 특정 마커에 의해 구별 될 수 있다. TTreg 세포는 pTreg 셀 보다 기능적으로 더 진압으로 보고 되었습니다. 따라서, 그것은 다른 유형의 세포 인구를 조사할 때 tTreg와 pTreg 세포의 비율을 결정 하는 것이 중요입니다. 여기, 우리 수집 thymic 땀 샘, 췌 장 배출 림프절과 spleens cytometry를 사용 하 여 pTreg 세포에서 tTreg 셀을 구별 normoglycemic 비 뚱뚱한 당뇨병 쥐에서. 우리는 수동으로 단일 셀 정지가이 기관에서 준비. 형광 색소 활용 된 표면 CD4, CD8, CD25, 그리고 Neuropilin 1 항 체는 세포 얼룩 사용 되었다. 그들은 하룻밤 냉장고에 보관 했다. 다음 날, 세포 형광 색소 활용 된 세포내 Foxp3와 헬 리오스 항 체와 얼룩이 있었다. 이러한 마커는 Treg 세포의 두 하위 집합 하 사용 되었다. 이 프로토콜에서는 murine thymus, 림프절, 비장을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하 고 이후의 흐름 cytometric 분석을 위해 그들을 사용 하는 간단 하지만 실용적인 방법을 보여 줍니다.

Nrp1 및 tTreg 및 pTreg 세포에 헬 리오스의 식을 조사, 우리 thymic 동맥, PDLNs 및 normoglycemic 끄 덕 임 쥐의 spleens에서에서 단일 셀을 준비 하 고 흐름 cytometric 위한 Treg 세포 마커 CD4, CD25, Foxp3, 헬 리오스와 Nrp1으로 그들을 물 분석입니다. 결과 전략 (그림 1) 게이팅 담당자와 같이 분석 되었다. 우리는 CD4 중 헬 리오스+ 세포의 비율을 발견+CD8-CD25+Foxp3+ Treg 세포는 Nrp1 이상+ 모든 3 개의 기관 (그림 2A)에서 세포. Thymus Treg 세포의 80% 이상이 표현 헬 리오스, PDLN 및 비장 (<strong class="xfig"...

여기, 선물이 murine thymus, 림프절, 비장 추가 연구를 cytometry를 사용 하 여 이러한 셀을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하는 프로토콜. 또한,이 프로토콜 cytometry 사용 규제 T 세포의 하위 집합을 결정 하는 데 사용 되었다.

Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

이 프로토콜은 건강과 병리학에서 특정 기관에서 면역 세포의 역할을 조사하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 수동 기술이기 때문에 비용 효율적인 기술이라는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생 인 정강 루오 (Zhengkang Luo)가 될 것입니다.우선, 이전에 안락사된 마우스의 흉선과 비장을 20ml 의 신자극 성 자경단 또는 15ml 원추형 튜브에 넣고 행크의 균형 잡힌 소금 용액 5ml로 채워집니다. 췌장 배수 림프절을 RPMI-1640 1 ml로 채워진 1.5 ml 마이크로 튜브에 넣습니다. 전체 흉선과 비장, 그리고 모든 PDLN을 사용해야합니다.전체 절차 전반에 걸쳐 얼음에 장기를 유지합니다. 한 쌍의 가위를 사용하여 흉선과 비장을 철저히 짜서 면역 세포를 방출하십시오. 남은 흉부와 비장 캡슐을 버리십시오.셀 서스펜션을 15ml 원물 튜브로 옮기. 원심분리기는 433배, 섭씨 4도에서 5분간, 상수부를 폐기합니다. 적혈구를 분해하기 위해, 0.2 몰라 암모늄 염화의 5 ml에서 세포 현탁액을 다시 중단하고 10 분 동안 실온에서 배양하십시오.2분마다 튜브를 부드럽게 반전시면 됩니다. 인큐베이션이 끝나면 HBSS 5 ml를 추가하여 리시스를 중지합니다. 원심 분리는 433 배 g와 섭씨 4도에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다.상체를 버리고 약 5 ml의 HBSS에서 세포를 다시 중단하십시오. 그런 다음 튜브를 HBSS로 채웁니다. 샘플을 원심분리하는 것에서부터 튜브를 HBSS로 채우는 것까지, 한 번 반복하십시오.원심 분리튜브는 다시 한 번 433g, 섭씨 4도에서 5분간 튜브를 분리합니다. 상체를 버리고 HBSS에서 펠릿을 다시 중단합니다. 셀 스트레이너 캡으로 5ml 의 라운드 하단 튜브를 가져옵니다.세포 스트레이너 캡에 현탁액을 적용하여 비장 세포 현탁액의 1 ml와 비장 세포 현탁액 500 마이크로리터를 튜브로 옮기다. 먼저 15ml의 원상 관을 랙에 넣습니다. 멸균 250 마이크로미터 금속 메쉬를 튜브 위에 놓습니다.RPMI 1 ml로 메시를 헹도 헹도 됩니다. 그런 다음 림프절을 금속 메시로 옮기고 핀셋 쌍을 사용하여 메시를 통해 갈아. 메쉬에 RPMI 1 ml를 적용하여 세포를 튜브로 플러시합니다.각 샘플에 대해 림프절을 세 번 옮기고 연삭하는 과정을 반복한 다음 메시를 제거합니다. 원심 분리는 433 배 g와 섭씨 4도에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 버리고 약 5 ml의 RPMI에서 세포를 다시 중단하십시오.그런 다음, RPMI로 튜브를 채웁니다. 샘플을 원심분리하는 것에서부터 튜브를 RPMI로 채우는 것까지, 한 번 반복하십시오. 원심 분리는 튜브를 다시 433 배 g에서 5 분 동안 섭씨 4도에서 다시 분리합니다.상체를 버리고 RPMI 2 ml의 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 셀 서스펜션 2ml를 셀 스트레이너 캡으로 5ml 의 라운드 하단 튜브로 옮기습니다. 첫째, 흉선, 비장 및 PDLN 샘플에서 세포 현탁액을 433배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다.상부체를 폐기합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 표면 항체로 세포를 염색하고, 40 분 동안 얼음에 관을 배양합니다. 다음으로 각 튜브에 200마이크로리터의 FACS 버퍼를 추가합니다.원심분리기는 433배, 섭씨 4도에서 5분간 폐기하고, 상부체를 폐기한다. 이 프로세스를 반복하여 버퍼를 추가하고 원심분리하고 상퍼를 한 번 폐기합니다. 세포를 고치고 침투하기 위해 투과화 고정 버퍼의 500 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단합니다.하룻밤 사이에 4도의 냉장고에 튜브를 옮기. 다음 날, 원심 분리튜브는 433g, 섭씨 4도에서 5분간 튜브를 분리합니다. 상체를 버리고, 충혈 세척 버퍼의 500 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.세포를 다시 433배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리하고 상퍼를 폐기합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 세포 내 항체를 가진 세포를 얼룩지게 합니다. 1 시간 동안 얼음에 튜브를 배양.그 후 각 튜브에 500마이크로리터의 충류 세척 버퍼를 추가합니다. 원심분리기는 433배, 섭씨 4도에서 5분간. 상체를 버리고, 침투 세척 버퍼의 500 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.원심분리기는 다시 한 번 433배, 섭씨 4도에서 5분간. 상체를 버리고 FACS 버퍼의 300 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 흐름 사이토미터에서 셀을 분석합니다.이 연구에서, 단일 세포는 정상 혈당 NOD 마우스의 흉선, PDLNs 및 비장으로부터 분리되고, 흐름 세포 측정 분석을 위해 Treg 세포 마커, CD4, CD25, Foxp3, 헬리오스 및 신경 필린-1로 염색된다. 결과는 분석되며 여기에 대표적인 게이팅 전략으로 표시됩니다. CD4 양성, CD8-음수, CD25 양성, Foxp3 양성 Treg 세포 중 헬리오스 양성 세포의 비율은 세 가지 장기 모두에 있는 Nrp1 양성 세포의 세포보다 높은 것으로 보입니다.흉합에 있는 Treg 세포의 80% 이상은 PDLN및 비장보다는 더 높은 헬리오스를 표현하기 위하여 보입니다. 헬리오스 양성 Treg 세포 중 NrP1 양성 세포의 비율은 흉선 또는 비장의 세포보다 PDLN에서 더 높은 것으로 보입니다. Nrp1 양성 Treg 세포의 대다수는 또한 헬리오스를 표현하고, Nrp1 양성 Treg 세포 중 헬리오스 양성 세포의 비율은 PDLN에서 보다는 흉선 및 비장에서 더 높은 것으로 보입니다.함께, 이러한 결과는 헬리오스가 Nrp1보다 Treg 세포를 검출하는 더 나은 마커임을 나타냅니다. 림프절은 작지만 일부 세포 내 마커는 유동 세포 측정에 좋은 신호를 주기 위해 많은 수의 세포가 필요합니다. 세포가 이미 염색되고 죽었기 때문에 다른 방법은 이 절차 후에 수행될 수 없습니다.그러나 동물의 4개의 세포 마커는 면역 세포의 그밖 모형을 공부하기 위하여 대체될 수 있습니다.

determination-regulatory-t-cell-subsets-murine-thymus-pancreatic

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이것은 골수양 유래 억제 세포 (MDSC)를 immunophenotyping 및 GR-1 풍요로운의 신속하고 포괄적인...

유동세포계측법 및 자동화된 마그네틱 활성화 셀 정렬 (AutoMACS)를 사용 나이브 및 췌장 종양 베어링 마우스에서 골수양 파생 억제 세포 (MDSC)의 작성

우리는 T 세포 개발을 검토 할 수있는 흐름 세포 계측법 기반 방법을...

유동 세포 계측법에 의한 Thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험

이 비디오에서는 쥐 췌장 배출 림프절(PDLN)에서 단일 세포를 분리하는 프로토콜과 유세포 분석을 사용하여 단일 세포 집단에서 조절 T 세포(Tregs)를 특성화하는 방법에 대해 설명합니다. Tregs는 핵 전사 인자 Foxp3 및 Helios와 함께 세포 표면 마커 CD4, CD25 및 Nrp1의 양성 발현을 기반으로 식별됩니다.

Murine Pancreatic Draining Lymph Nodes에서 조절 T 세포 subsets 확인

다른 T 세포의 하위 집합에서 별개의 이펙터 기능으로, TH17 세포는 중앙 염증성자가 면역 질환에 연루되어있다. 이 체외 TH17 분화 프로토콜은 순진 CD4 + T 림프구는 TH17 세포로 분화 할 수 있고, 또한자가 면역 및 호스트 응답에서 자신의 역할을 조사할지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

순진한 CD4+ T cell은 활성화 시점의 환경에 따라 다양한 subset으로 분극화합니다.  naive CD4+ T cell을 다양한 effector subset으로 분화하는 것은 T cell receptor stimuli 및 specific cytokine signal의 추가를 통해 in vitro에서 달성할 수 있습니다.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

이 문서 분광 계측법, 형광 색소를 구별하는 발광 스펙트럼의 형상을 사용하여 유동 세포 계측법에서의 새로운 접근 방식을 설명한다. 알고리즘은 보상을 대체하고 독립적 인 매개 변수로 자동 형광을 처리 할 수 ​​있습니다. 이 새로운 접근 방식은 고체 기관에서 분리 된 세포의 적절한 분석을 할 수 있습니다.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

이 문서에서는 미토 콘 드리 아 또는 살아있는 세포에서는 리소좀을 계량 하는 강력한 방법을 보여 줍니다. 표면 표식에 놓여있는지 활용 된 항 체와 리소좀 또는 미토 콘 드리 아 특정 염료의 조합 사용 하 여 조직 샘플에서 수확 하는 1 차 셀 같은 혼합된 세포 인구에 이러한 세포의 부 량 수 다 색 cytometry입니다.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

여기, 선물이 CD4를 식별 하는 흐름 cytometric 프로토콜+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포와 7 대신만 두 형광을 사용 하 여 인간의 말 초 혈액에 monocytes. 이 방법을 5 추가 마커 대부분 교류 cytometers에 기록할 수 있습니다.

2 형광 색소에 의해 7 개의 면역 세포 하위 집합의 차별 Cytometry 흐름

여기에서, 우리는 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 교압 조직 내의 엑스트라 세포 염색 분석체를 모두 사용하여 단세포/대식세포 및 T 세포 하위 세트를 식별하기 위해 상세하고 재현 가능한 유동 세포 측정 프로토콜을 설명하며, 골관절염의 확립된 수술 모델을 활용합니다.

골관절염 모델에서 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 치압 조직 내의 면역 세포 하위 집합의 흐름 세포 분석

본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

이 프로토콜은 조절 T 세포가 이펙터 T 세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 조사하기 위한 시험관 내 공동 배양 전략을 제공합니다.

시험관 내 조절 T 세포의 기능 분석: 증식과 분화에 초점을 맞춘다

배우세요 쥐의 흉선, 림프절, 비장에서 단일 세포를 분리하여 유세포 분석으로 조절 T 세포를 분석하는 방법입니다. 이 비용 효율적인 수동 기술은 면역학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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