Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정

이 프로토콜은 건강과 병리학에서 특정 기관에서 면역 세포의 역할을 조사하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 수동 기술이기 때문에 비용 효율적인 기술이라는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생 인 정강 루오 (Zhengkang Luo)가 될 것입니다.

우선, 이전에 안락사된 마우스의 흉선과 비장을 20ml 의 신자극 성 자경단 또는 15ml 원추형 튜브에 넣고 행크의 균형 잡힌 소금 용액 5ml로 채워집니다. 췌장 배수 림프절을 RPMI-1640 1 ml로 채워진 1.5 ml 마이크로 튜브에 넣습니다. 전체 흉선과 비장, 그리고 모든 PDLN을 사용해야합니다.

전체 절차 전반에 걸쳐 얼음에 장기를 유지합니다. 한 쌍의 가위를 사용하여 흉선과 비장을 철저히 짜서 면역 세포를 방출하십시오. 남은 흉부와 비장 캡슐을 버리십시오.

셀 서스펜션을 15ml 원물 튜브로 옮기. 원심분리기는 433배, 섭씨 4도에서 5분간, 상수부를 폐기합니다. 적혈구를 분해하기 위해, 0.2 몰라 암모늄 염화의 5 ml에서 세포 현탁액을 다시 중단하고 10 분 동안 실온에서 배양하십시오.

2분마다 튜브를 부드럽게 반전시면 됩니다. 인큐베이션이 끝나면 HBSS 5 ml를 추가하여 리시스를 중지합니다. 원심 분리는 433 배 g와 섭씨 4도에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다.

상체를 버리고 약 5 ml의 HBSS에서 세포를 다시 중단하십시오. 그런 다음 튜브를 HBSS로 채웁니다. 샘플을 원심분리하는 것에서부터 튜브를 HBSS로 채우는 것까지, 한 번 반복하십시오.

원심 분리튜브는 다시 한 번 433g, 섭씨 4도에서 5분간 튜브를 분리합니다. 상체를 버리고 HBSS에서 펠릿을 다시 중단합니다. 셀 스트레이너 캡으로 5ml 의 라운드 하단 튜브를 가져옵니다.

세포 스트레이너 캡에 현탁액을 적용하여 비장 세포 현탁액의 1 ml와 비장 세포 현탁액 500 마이크로리터를 튜브로 옮기다. 먼저 15ml의 원상 관을 랙에 넣습니다. 멸균 250 마이크로미터 금속 메쉬를 튜브 위에 놓습니다.

RPMI 1 ml로 메시를 헹도 헹도 됩니다. 그런 다음 림프절을 금속 메시로 옮기고 핀셋 쌍을 사용하여 메시를 통해 갈아. 메쉬에 RPMI 1 ml를 적용하여 세포를 튜브로 플러시합니다.

각 샘플에 대해 림프절을 세 번 옮기고 연삭하는 과정을 반복한 다음 메시를 제거합니다. 원심 분리는 433 배 g와 섭씨 4도에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 버리고 약 5 ml의 RPMI에서 세포를 다시 중단하십시오.

그런 다음, RPMI로 튜브를 채웁니다. 샘플을 원심분리하는 것에서부터 튜브를 RPMI로 채우는 것까지, 한 번 반복하십시오. 원심 분리는 튜브를 다시 433 배 g에서 5 분 동안 섭씨 4도에서 다시 분리합니다.

상체를 버리고 RPMI 2 ml의 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 셀 서스펜션 2ml를 셀 스트레이너 캡으로 5ml 의 라운드 하단 튜브로 옮기습니다. 첫째, 흉선, 비장 및 PDLN 샘플에서 세포 현탁액을 433배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다.

상부체를 폐기합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 표면 항체로 세포를 염색하고, 40 분 동안 얼음에 관을 배양합니다. 다음으로 각 튜브에 200마이크로리터의 FACS 버퍼를 추가합니다.

원심분리기는 433배, 섭씨 4도에서 5분간 폐기하고, 상부체를 폐기한다. 이 프로세스를 반복하여 버퍼를 추가하고 원심분리하고 상퍼를 한 번 폐기합니다. 세포를 고치고 침투하기 위해 투과화 고정 버퍼의 500 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단합니다.

하룻밤 사이에 4도의 냉장고에 튜브를 옮기. 다음 날, 원심 분리튜브는 433g, 섭씨 4도에서 5분간 튜브를 분리합니다. 상체를 버리고, 충혈 세척 버퍼의 500 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.

세포를 다시 433배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리하고 상퍼를 폐기합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 세포 내 항체를 가진 세포를 얼룩지게 합니다. 1 시간 동안 얼음에 튜브를 배양.

그 후 각 튜브에 500마이크로리터의 충류 세척 버퍼를 추가합니다. 원심분리기는 433배, 섭씨 4도에서 5분간. 상체를 버리고, 침투 세척 버퍼의 500 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.

원심분리기는 다시 한 번 433배, 섭씨 4도에서 5분간. 상체를 버리고 FACS 버퍼의 300 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 흐름 사이토미터에서 셀을 분석합니다.

이 연구에서, 단일 세포는 정상 혈당 NOD 마우스의 흉선, PDLNs 및 비장으로부터 분리되고, 흐름 세포 측정 분석을 위해 Treg 세포 마커, CD4, CD25, Foxp3, 헬리오스 및 신경 필린-1로 염색된다. 결과는 분석되며 여기에 대표적인 게이팅 전략으로 표시됩니다. CD4 양성, CD8-음수, CD25 양성, Foxp3 양성 Treg 세포 중 헬리오스 양성 세포의 비율은 세 가지 장기 모두에 있는 Nrp1 양성 세포의 세포보다 높은 것으로 보입니다.

흉합에 있는 Treg 세포의 80% 이상은 PDLN및 비장보다는 더 높은 헬리오스를 표현하기 위하여 보입니다. 헬리오스 양성 Treg 세포 중 NrP1 양성 세포의 비율은 흉선 또는 비장의 세포보다 PDLN에서 더 높은 것으로 보입니다. Nrp1 양성 Treg 세포의 대다수는 또한 헬리오스를 표현하고, Nrp1 양성 Treg 세포 중 헬리오스 양성 세포의 비율은 PDLN에서 보다는 흉선 및 비장에서 더 높은 것으로 보입니다.

함께, 이러한 결과는 헬리오스가 Nrp1보다 Treg 세포를 검출하는 더 나은 마커임을 나타냅니다. 림프절은 작지만 일부 세포 내 마커는 유동 세포 측정에 좋은 신호를 주기 위해 많은 수의 세포가 필요합니다. 세포가 이미 염색되고 죽었기 때문에 다른 방법은 이 절차 후에 수행될 수 없습니다.

그러나 동물의 4개의 세포 마커는 면역 세포의 그밖 모형을 공부하기 위하여 대체될 수 있습니다.