Name: 생리 연구를위한 모든 고체 이온 선택성 전극 (ASSISE)를 기반으로 다중 분석 바이오칩 (MAB) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-18T08:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 학습하세요 전도성 고분자 변환층을 이용한 전고체 이온선택성 전극(ASSISE) 제작 및 교정 방법을. 생물학적 매질에서 장기간 안정성을 유지하며 실시간 이온 활성 측정이 가능한 다중분석 바이오칩 기술입니다.

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우리는 MAB 장치의 와이어 본딩을위한 자금 지원 (보조금 번호 103498 및 103692), 퍼듀 대학교는 Birck Nantechnology 센터 게일 록우드에 대한 NASA 우주 생물학 과학 기술 장비 개발 (ASTID) 프로그램을 감사 좋아하고, 준 진형 공원에 대한 것 흐름 셀 챔버의 CAD 드로잉입니다.

1. 폴리 (4 - 스티렌 설포 네이트 나트륨) (PEDOT : PSS) - 이온 H +와 CO에 대한 Electropolymerization 솔루션 3 2 폴리 (3,4 - 에틸렌)의 준비 <ol><li> 완전히 (약 10 초) 분산 될 때까지 10 ㎖ 탈 이온수 (DI) 물과 소용돌이에 - 70 밀리그램 폴리 (4 - 스티렌 설포 네이트 나트륨) (나 + PSS)를 추가합니다. </li><li> 용액이 완전히 혼합 될 때까지 1.1 솔루션 소용돌이 10.7 ㎕의 3,4 - ethlyenedioxythiophene (EDOT)를 추가합니다. </li></ol> 2. 칼슘 황산염 (PEDOT : 카소 4) 칼슘 2 Electropolymerization 솔루션 + 이온 폴리 (3,4 - 에틸렌)의 준비 <ol><li> 10 ㎖ DI 물과 소용돌이에 136 밀리그램의 칼슘 황산염 CASO (4) 추가, 솔루션은 완전히 분산 유백색 표시되지 않습니다. </li><li> 완전히 혼합 될 때까지 2.1와 소용돌이의 솔루션에 10.7 μL EDOT를 추가합니다. </li></ol> 3. PEDOT 기반의 Electropolymerization전도성 고분자 <ol><li> 생 분석 시스템 주식 회사 (BASI) C3 셀 스탠드 (그림 3)과 EC 엡실론 텐쇼 / galvanostat는 electropolymerization에 대한 전기 화학적 셀을 형성하는 데 사용됩니다. 용존 산소를 제거하는 20 분 동안 전기 세포와 질소 거품 PSS electropolymerization 솔루션 : EDOT를 놓습니다. </li><li> 이제 전기 화학 셀의 상대 전극 위치에서 백금 거즈 클립. 그런 백금 거즈에 직면 작동 전극과 전기 화학 셀의 작동 전극 위치에서 MAB 클립. PSS electropolymerization 솔루션 : 만 원형 전극 PEDOT에 빠져들되도록 MAB 깊이를 조정합니다. 사각 전기 접촉 패드를 가진 솔루션의 접촉을 피하십시오. </li><li> BASI 포화은 / 염화은 (자세 / AgCl을) 전기 화학 셀의 참조 전극의 위치에 전극을 배치합니다. 기준 전극이 작동하고 counte 사이에 있지 않은지 확인R 전극. </li><li> PEDOT의 경우 : PSS 증착 : 거품 전기 20 분간 세포와 0V에서 단일주기 voltammogram을 실행하는 EC 엡실론 텐쇼 / galvanostat을 사용 - 20의 스캔 속도와 1.1V ± 100 μA의 규모 MV / 초. </li><li> 에 대한 PEDOT : 카소 4 증착 : 거품 20 분 동안 전기 화학 셀, 30 분 nA의 814에 chronopotentiometry를 실행하는 EC 엡실론 텐쇼 / galvanostat를 사용합니다. </li></ol> 4. K 3 철의 PEDOT 계 고분자 복합체의 순환 전압 전류계 (CN) 6 <ol><li> 3.1-3.3 위의 단계를 수행합니다. </li><li> ± 10 μA의 규모 MV / 초 (25, 50, 75, 100, L25, 150, 175, 200)의 스캔 속도를 변화와 -653 MV에서 853 mV에서 하나의 순환 전압 전류를 실행하는 EC 엡실론 텐쇼 / galvanostat을 사용하여 . </li></ol> 5. 표면 기능화 프로토콜 <ol><li> 3 단계로 관심의 이온에 대한 특정 예금 전도성 고분자 결합. </li><li> 6 단계로 이온 선택 막을 적용합니다. </li></ol> 6. 이온 선택 막 적용 <ol><li> 진공 회 척을 중심 MAB. </li><li> MAB 및 런타임의 중앙 위에 보증금 100 μL 막. </li><li> 5 초 램프 아래로 30 초 동안 1,500 rpm으로 스핀 코터와 스핀 코트 이온 선택 막. </li><li> 30 분 동안 스핀 코팅 MAB를 진공 청소기로 청소 20 분 동안 70 ° C 오븐에서 칩을 굽는다. </li></ol> 7. 이온 선택 막 - pH와 탄산 PEDOT-PSS 전도성 고분자 접합 (CO 3 2)의 보정 <ol><li> 조건에 10 μM의 중탄산 나트륨 (NaHCO3를) 및 조류 미디어 5 MM의 칼륨 염화물 (KCl을)에서 하룻밤 MAB. </li><li> 마이크로 유체 유동 세포 칩 홀더에 MAB를 삽입합니다. </li><li> 초기의 pH 값 또는 농도 (CO 3 2 예, pH가 4 또는 10 μM -)와 5ml를 시험 용액을 주입. 온것을 제거흐름 세포 칩 홀더에서 준한. </li><li> 흐름 세포 전기기구 상 유동 세포 칩 홀더를 놓습니다. </li><li> EC 엡실론 소프트웨어를 열고 개방 회로 전위 (OP) 모드로 들어갑니다. 300 분, ± 1V에 전압 스케일, 10 kHz로 컷오프 주파수에 시간을 설정하고, 값마다 2 초를 기록합니다. </li><li> MAB는 보정 과정을 계속하기 전에 (플랫 행을 찾습니다) 안정 수 있습니다. </li><li> MAB가 안정되면, 시험 용액으로하여 흐름 세포를 세척하고 보정 할 다음 농도를 주입 (산도 5 또는 3 CO 2를 25 μM -). 더 거품이 흐름 세포를 입력 할 수 없습니다 있는지 확인합니다. pH가 6, 7, 8, 9 또는 CO 3 2 단계 7.5 및 7.6를 반복 - 50의 농도, 75, 100, 250, 500, 750, 1000 μM. </li><li> 최종 농도가 실행 된 후, 질소 공기와 MAB 건조를 제거합니다. </li><li> MAB 다시 다음 사용 때까지 신선한 조절 용액에 넣습니다. </li></ol>2 카소 4 전도성 고분자 접합 <ol><li> 조건 0.1 M 염화칼슘과 10 μM에 NaNO 3 7 ML에서 하룻밤 MAB. </li><li> 7.10-7.2과 같은 단계를 수행합니다. 단계 8.3, 0.01 mM의 염화칼슘의 초기 농도와 탄산 테스트 솔루션을 대체합니다. 시험 용액 0.05의 농도, 0.1, 0.5, 1, 10 MM에 대해이 단계를 반복합니다. </li></ol>

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</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

MAB 바이오 칩 백금 전극, 측정 전기 신호로 관심의 이온 농도를 transduces하는의 조합에 PEDOT 기반의 CP 공액 전달 층 꼭대기 ISM에서 건설 ASSISEs으로 구성되어 있습니다. 안정된 전극 전위는 CP 층과 ISM 층 모두에 의해 정의됩니다. 두 레이어는 MAB 및 측정 전기 신호의 품질 (소음, 드리프트)의 작동 수명을 결정합니다. PEDOT 모두의 이온 및 전자 성질 (산화 된 형태)로 전달 레이어 때문에 같은 특히 매력적이다. PEDOT는 효과를 편광 전도성 전극을 최소화하기 위해 높은 산화 환원 용량에 대한 용량을 가지고, 우리는 153 MV ± 6 대 자세 / AgCl을에서 안정적인 산화 환원 전위를 측정했다. 이 특성은 고체 내부 접점 12을 사용하는 ISE의 잠재적 인 안정성을 위해 필요합니다. PEDOT은 : PSS CP 복합체 SMA에 대한 변환기로 사용됩니다LL 가의 양이온 (예 : H +)와...

<table><tbody><tr><td>3,4-에틸렌디옥시티오펜</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>, 483028</td><td></td></tr><tr><td>폴리(나트륨 4-스티렌설포네이트)</td><td>시그마-알드리치</td><td></td>, 243051 <td></td></tr><tr><td>EC, 엡실론, 갈바노스타트/포텐시오스탯</td>, <td>바이오분석 시스템, Inc.</td><td>e2P</td><td></td></tr><tr><td>포화 Ag/AgCl 기준 전극</td><td>Bioanalytical Systems Inc.</td><td>MF-2052</td><td></td></tr><tr><td>Pt 거즈</td><td>Alfa Aesar</td><td>10283</td><td></td></tr><tr><td>페리시아나이드 칼</td><td>륨 Sigma-Aldrich</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>질산 칼륨</td><td>J.T. Baker</td><td>3190-01</td><td></td></tr><tr><td>중탄산 나트륨</td><td>Mallinckrodt / Macron</td><td>7412-12</td><td></td></tr><tr><td>탄산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-7127</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>황산칼슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237132</td><td></td></tr><tr><td>C3 세포 스탠드</td><td>Bioanalytical Systems Inc.</td><td>EF-1085</td><td></td></tr><tr><td>플로우 셀 칩 홀더</td><td></td><td></td><td>맞춤형, NASA Ames</td></tr><tr><td>플로우 셀 전기 설비</td><td></td><td></td><td>맞춤형, NASA Ames </td></tr><tr>제공 <td colspan="4">표 2. 특정 시약 및 장비.</td></tr></tbody></table>

생리 연구를위한 모든 고체 이온 선택성 전극 (assise)를 기반으로 다중 분석 바이오칩 (mab)

Multi-analyte Biochip (MAB) Based on All-solid-state Ion-selective Electrodes (ASSISE) for Physiological Research

환경, 생물 의학, 농업, 생물, 그리고 우주 비행 연구 실험실 - 온 - 칩 (LOC) 응용 프로그램은 복잡한 생물학적 매체 1-4 장기간 보관을 견딜 수있는 이온 선택성 전극 (ISE)가 필요합니다. 모든 고체 이온 선택성 전극 (ASSISE)는 앞서 언급 한 응용 프로그램에 특히 매력적이다. 일괄 처리를 허용, 쉬운 건축, 낮은 유지 보수 및 (잠재력)의 소형화 : 전극은 다음과 같은 유리한 특성을 가지고 있어야합니다. 미세하게 ASSISE은 H +, 캘리포니아 2 +, 및 CO 3 2 정량화하기위한 것 - ​​이온이 건설되었다. 그것은 고귀한 금속 전극층 (즉, 백금), 전달 계층 및 이온 선택 막 (ISM) 층으로 구성되어 있습니다. 전달 계층 함수는 측정 전기 신호로 이온 선택 막 농도 의존적​​ 화학 잠재력을 형질 도입합니다. 티그는 ASSISE의 수명은 층 / 멤브레인 인터페이스 5-7 전도성의 잠재력을 유지에 의존 찾을 수 있습니다. ASSISE 작동 수명을 연장함으로써 계면 층에서 안정 가능성을 유지하기 위해, 우리는 (자세 / AgCl을)은 / 염화은 대신 전도성 고분자 (CP) 폴리 (3,4 - 에틸렌) (PEDOT) 7-9 활용 변환기 레이어. 우리는 우리가 다중 분석 바이오칩 (MAB) (그림 1)라는 실험실 - 온 - 칩 형식으로 ASSISE을 구축. (측정 범위 0.01 밀리미터 - 1 - MM) 및 CA 2 + (1 mm의 로그 선형 범위 0.01 ㎜) 테스트 솔루션의 보정은 MAB가 산도 (작동 범위 산도 4-9), CO 3 2를 모니터 할 수 있습니다 것을 보여 주었다. 산도의 MAB는 조류 중간에 거의 한 달 저장 한 후 가까운 따른다 Nernstian 경사 응답을 제공한다. 탄산 바이오칩은 기존의 이온 선택성 전극의 그것과 유사 전위차 프로필을 보여줍니다. 관심 회원ogical 측정 모델 시스템의 생물학적 활성, microalga 클로렐라의 vulgaris를 모니터링하기 위해 사용되었다. MAB 크기, 다양성의 장점을 전달하고, 분석 감지 기능 멀티 플렉스, 지구 또는 공간에 많은 제한 모니터링 상황이 적용하고. 바이오칩 설계 및 실험 방법 바이오 칩 차원에서 10 × 11mm이며, 작업 전극 (WES) 5 Ag / AgCl 기준 전극과 같은 기준 전극 (해상도)로 지정 9 ASSISEs 있습니다. 각 작업 전극 (WE) 직경 240 μm의과 동등 직경 480 μm의 수 있습니다 정규 표현식에서 1.4 mm 이격되어 있습니다. 이 전극은 0.5 mm × 0.5 mm의 차원과 전기 접촉 패드에 연결됩니다. 회로도는 그림 2에 표시됩니다. 순환 전압 전류 법 (CV)와 galvanostatic 증착 방법은 Bioanalytic를 사용하여 PEDOT 필름을 electropolymerize하는 데 사용됩니다알 시스템즈 (BASI) C3 셀 스탠드 (그림 3). PEDOT 필름의 카운터 이온이 관심의 분석 이온에 맞게 맞게 조정됩니다. 폴리 (스티렌) 카운터 이온 (PEDOT / PSS)와 PEDOT는 H +와 CO 3 2 활용 - 황산염 (카소 4와 같은 솔루션에 추가)와 하나가 칼슘 2 +에 활용되는 동안. PEDOT 코팅의 전기 화학적 특성은 우리는 산화 환원 활성 솔루션 (페리 시안화 칼륨 즉, 2 MM (K 3 철 (CN) 6))에 이력서를 사용하여 분석됩니다. CV 프로필을 기반으로, 랜들 - Sevcik 분석은 유효 표면적 10를 결정하는 데 사용되었다. 1,500 rpm으로 스핀 코팅 MAB 작업 전극 (WES)에 1 ~ 2 μm의 두께 이온 선택 막 (ISMS)를 캐스팅하는 데 사용됩니다. MAB는 조류 매체의 150 μL 볼륨 가득 미세 유체 흐름 셀 챔버에 포함되고 접촉 패드는 전기적으로 (그림 BASI 시스템에 연결되어URE 4). 클로렐라의 vulgaris의 광합성 활동은 주위의 빛과 어두운 조건에서 모니터링됩니다.

<html> PEDOT의 순환 voltammogram (CV) 결과의 예 : PSS와 해당 음극 피크 전류 (I P) 대 스캔 속도 (V 1 / 2)는 각각 그림의 5A 및 5B에 표시됩니다. PEDOT : 다양한 스캔 속도 및 음극 피크 전류에서 카소 4 표시되지 않습니다. PSS와 PEDOT : 랜들 - Sevcik 분석 10, 고체 접촉 PEDOT의 유효 표면적을 이용하여 이온 선택성 막 않고 카소 4는 각각 4.4 × 10 -11 cm 2 5.8 × 10 -11 cm 2 것으로 나타났다. 이 값은 때문에 우리의 연구 그룹 11에서보고 된 전극 크기보다 ~ 130 배 작은되는 전극의 크기 이전에보고 된 전극에 비해 상대적으로 작다. MAB...

전도성 고분자 (CP) 트랜스 듀서에서 생성 모든 고체 이온 선택성 전극 (ASSISEs) 액체 매체의 기능적 수명이 몇 달을 제공합니다. 여기, 우리는 실험실 - 온 - 칩 형식 ASSISEs의 제조 및 교정 과정을 설명합니다. ASSISE 복잡한 생물학적 매체에서 장기간 보관 후 가까운 따른다 Nernstian 기울기 프로파일을 유지 한 것으로 설명된다.

생리 연구를위한 모든 고체 이온 선택성 전극 (ASSISE)를 기반으로 다중 분석 바이오칩 (MAB)

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) ...

이 절차의 전반적인 목표는 양이온 및 이온 검출 모두를 위한 모든 고체 상태 이온 선택 전극을 기능화하는 것입니다: 먼저 전기 중합. MAB 스핀 코트의 작동 전극에 있는 전도성 고분자 트랜스듀서 층, 이온 선택성 멤브레인 층 및 하룻밤 동안 바이오칩을 조절하여 이온 선택성 멤브레인을 활성화합니다. 이제 플로우 셀 챔버에서 접촉 패드를 BASSI 3전극 전위 스탯 푸시 측정 용액에 챔버에 연결합니다.원치 않는 기포를 제거하고, 궁극적으로 MAB 칩을 관심 이온으로 보정하고 MAB의 출력 신호를 실시간으로 기록할 수 있습니다. 기존의 마이크로 전극 및 무선 라벨링 프로브 기술과 달리 모든 고체 이온 선택성 전극은 비침습적이며 이온 활성의 실시간 측정을 위해 다중화하고 생물학적 및 생리학적 시스템을 모델링할 수 있습니다. 우리는 생리학적 측정을 수행하는 데 제한된 공간이 필요한 우주 생물학 연구에 참여하면서 이 방법을 수행하자는 아이디어를 처음 떠올렸습니다.버번 잎 생리학적 감지 시설의 대학원생인 June Hume Park은 전기 중합을 위한 전기화학 셀을 형성하는 시연을 도와줄 것입니다. Bassi C3 셀 스탠드와 EC 엡실론 전위 stat galvan stat를 사용합니다. 전기 중합 용액을 전기 화학 셀에 넣은 다음 용존 산소를 제거하기 위해 20 분 동안 질소를 거품을 일으킨다.이제 백금 거즈 상대 전극을 상대 전극 위치에서 전기화학 전지에 클립합니다. 그런 다음 작동 전극이 백금 거즈를 향하도록 하여 MAB를 전기화학 전지의 작동 전극 위치 또는 중앙 위치에 클립하고 원형 전극만 전기 중합 용액에 잠기도록 MAB 깊이를 조정합니다. 정사각형 전기 접촉 패드와의 용액 접촉을 피합니다.다음으로 전기화학 전지의 기준 전극 위치에 bassi 포화 전극을 놓습니다. 기준 전극이 작동 전극과 상대 전극에 닿지 않는지 확인하십시오. 그런 다음 EC 엡실론 전위를 사용하여 Stat gal Vanos stat는 플러스 마이너스 100 마이크로 암푸 스케일에서 초당 20 밀리볼트의 스캔 속도로 0에서 1.1 볼트까지 단일 순환 그램을 실행합니다.칼슘 감지를 위해 MAB 거품, e. plus 황산칼슘 용액에 PDO 황산칼슘 증착을 20분 동안 수행합니다. pdot 표면을 특성화하려면 pdot 기반 고분자 접합체의 순환 원격 측정을 사용합니다.2밀리몰의 시안화칼륨에서 마이너스 653밀리볼트에서 853밀리볼트까지 다양한 스캔 속도로 단일 주기적 그램을 실행하고, 플러스 마이너스 10 마이크로퍼 스케일 중심에서 진공 스피너 척의 다중 분석 물질 바이오 칩을 100 마이크로리터 멤브레인을 MAB 중앙에 증착한 다음 측정을 실행합니다. 다음으로 이온 선택성 멤브레인을 1, 500RPM으로 30초 동안 스핀 코팅하고 5초 동안 위아래로 램프를 하고 스핀 코팅된 MAB를 30분 동안 진공 청소기로 청소합니다. 그런 다음 칩을 섭씨 70도의 오븐에서 20분 동안 굽습니다.10마이크로몰의 중탄산나트륨과 5밀리몰의 염화칼륨을 조류 매체에서 하룻밤 동안 MAB를 컨디셔닝합니다. 이제 MAB를 미세유체 플로우 셀 칩 홀더에 삽입합니다. 5ml의 테스트 용액에 적절한 초기 pH 값 또는 농도를 주입합니다.플로우 셀 칩 홀더에서 기포를 제거하고 플로우 셀 칩 홀더를 플로우 셀 전기 설비에 놓습니다. 그런 다음 EC 엡실론 소프트웨어를 열고 개방 회로 전위 모드로 들어갑니다. 시간을 300분으로, 전압 스케일을 플러스에서 1볼트를 뺀 값으로, 차단 주파수를 10킬로헤르츠로 설정하고 2초마다 값을 기록합니다.보정 프로세스를 계속하기 전에 MAB가 안정화될 때까지 기다립니다. 그런 다음 플로우 셀을 테스트 용액으로 세척하고 보정할 다음 농도를 주입합니다. 플로우 셀에 기포가 유입되지 않는지 확인합니다.마지막 실행 후 검량선의 나머지 샘플에 대해 측정을 반복합니다. MAB를 제거하고 질소 공기로 건조시킵니다. 다음까지 MAB를 새 컨디셔닝 용액에 다시 넣습니다.MAB 및 염화칼슘 조건의 교정에 사용, 0.1 몰 염화칼슘 및 10 마이크로몰 질산나트륨에서 하룻밤 동안 pdot 황산칼슘 전도성 고분자 접합체 및 칼슘 선택성 멤브레인을 사용합니다. 그런 다음 pH 또는 탄산염 테스트 용액을 초기 농도인 0.01 millimolar calcium chloride로 교체합니다. 다른 테스트 용액 농도에 대해 반복합니다.이 데이터는 pdot PSS의 순환 볼타와 이에 상응하는 카타르시스 피크 전류 대 스캔 속도를 보여줍니다. Randall의 수빅 분석은 이온 선택성 멤브레인이 없는 고체 접촉에 대해 4.4 곱하기 10에서 음의 11센티미터 제곱의 유효 표면적을 결정합니다. 모든 고체 상태 ISE의 기능을 테스트하여 실제 세포 배양 환경에서 측정값을 획득할 수 있습니다.ISE는 lgal 배지에서 20일 동안 보관한 후 pH 4에서 9 사이의 Lgal 배지에서 보정되었습니다. 여기서 PDO PSS는 pH 8.5에서 완충된 lgal 생물학적 배지 및 lgal 생물학적 배지 모두에서 0.01 밀리몰 내지 1 밀리몰의 농도 범위를 가진 탄산염 용액에서 보정되었습니다. 완충된 용액으로 기울기를 낮추면서 농도가 변하는 것을 주목하십시오.탄산염 선택성 전극은 pH에 따라 달라지며 전압의 증가는 탄산염 종의 증가와 관련이 있습니다. 측정은 pH 7.8에서 이루어지기 때문에 대부분의 종은 중탄산염 형태이며, 생물학적 모델인 클로렐라 불가리스를 사용한 탄산염 농도 측정은 주변의 밝은 상태와 어두운 조건에서 30밀리볼트 변화를 보여주고, 조류 매체만 있는 대조군은 기능적 바이오 칩을 나타내는 반응을 보이지 않습니다. 이러한 MAB ISE는 농도가 증가하는 염화칼슘 용액의 PPSS를 기반으로 하며, 10년당 30밀리볼트에서 2가 양이온에 대한 니안 기울기에 가까운 경사 프로파일을 기반으로 합니다.칼슘 농도의 변화는 발아 고사리의 칼슘 전류 수준을 측정하는 데 사용됩니다. 이 접근 방식은 생물학, 농업 및 의학에서 이온 수송 및 세포 전기 생리학 및 신호 전달, 식물 및 동물 시스템과 관련된 생체 분자 메커니즘을 연구하는 데 유용합니다.

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