전기 생리학을 바탕으로 솔리드 지원 막 소개

지지 막 기반 전기생리학(supported membrane based electrophysiology, 약칭 SSM 기반 전기생리학)은 새로운 전기생리학적 접근 방식입니다. 이는 여러 응용 분야에서 기존 방식에 비해 상당한 개선을 제공합니다.

전통적인 전기생리학의 주요 도구는 전해질이 충전된 미세입자 전극인 반면, SSM 기반 전기생리학은 고체 지지 막 전극을 통해 전하 전이를 검출합니다. 이는 박테리아 수송체와 같이 몇 가지 드문 예외를 제외하고는 전압 클램프(voltage clamp)나 패치 클램프(patch clamp) 방법으로 조사할 수 없어 전통적인 전기생리학을 사용할 수 없는 경우에 매우 유용합니다. 이러한 사례에서 SSM 기반 전기생리학은 매우 성공적인 것으로 입증되었습니다.

또한 세포 내 막에 존재하는 생리학적으로 유의미한 진핵생물 수송체를 조사하는 데에도 활용될 수 있습니다. SSM 기반 전기생리학 실험을 수행하는 방법은 다양합니다. 기초 연구에서는 kinetic 파라미터를 결정하고 수송 메커니즘을 규명하는 데 적용될 수 있으며, 그 견고함과 자동화 가능성 덕분에 타겟 발굴을 위한 스크리닝 응용 분야에 매우 이상적입니다.

SSM 전극은 하단의 SSM과 표적 수송 단백질을 포함하는 프로테아좀 또는 막 단편으로 구성된 복합 막 시스템을 탑재합니다. 복합 막의 전기적 특성은 막들이 정전 용량 결합 시스템을 형성하는 등가 회로로 설명할 수 있습니다. 시스템의 전기적 거동은 막 단편을 사용하든 프로테아 리포좀을 사용하든 기본적으로 동일하다는 점에 유의하십시오.

수송 단백질의 전하 변위는 방광 막의 정전 용량을 통해 측정 회로로 전달됩니다. 이는 정전 용량 결합(capacitive coupling)이라 불리는 검출 원리입니다. 전형적인 실험에서, VSSM의 신속한 용액 교환은 수송 단백질 V에 기질을 제공하며, 이에 따라 발생하는 단백질의 전기 발생적 수송 활성이 전류를 생성하고, 이 전류는 SSM 정전 용량을 통해 측정 시스템에 결합됩니다.

동시에, 전기발생 단백질 활성으로 인해 리포좀 막이 점차 충전되어 수송 단백질이 억제되고 기록 회로의 전류가 감소하게 됩니다. 측정된 전류는 Enzo에 흡착된 수백만 개의 단백질 리포좀에서 동시에 일어나는 수송 반응의 결과이며, 각 리포좀에는 약 100개의 수송체가 포함되어 있습니다. 실험 장치는 용액 경로가 포함된 패러데이 케이지, 밸브 제어 및 신호 증폭을 위한 외부 회로, 그리고 데이터 수집 및 분석 시스템으로 구성됩니다.

EC 케이지는 용액 흐름 제어에 필요한 용기, 밸브 및 튜브와 XOR 칩이 장착된 큐비트로 구성됩니다. XOR 칩에는 SSM 전극과 흡수된 prot 리포좀이 포함되어 있습니다. vete는 외부 전기 회로의 증폭기 및 함수 발생기에 연결됩니다.

SSM 측정, wreak fire, 두 가지 용액, 즉 기질이 포함된 활성화 용액과 기질이 없는 비활성화 용액이 사용됩니다. 단일 교환 구성에서 두 용액은 동일한 조성을 갖습니다. 두 개의 2방향 밸브가 비활성화 용액과 활성화 용액의 흐름을 제어합니다.

기계적으로 결합된 3x3 3방향 밸브인 터미널 밸브는 비활성 용액과 활성 용액 사이의 전환에 사용되며, 한쪽 용액은 폐기물 용기로, 다른 쪽 용액은 qve로 유도합니다. 터미널 밸브를 전환하면 비활성 용액의 흐름은 폐기물 쪽으로 재지정되고 활성 용액은 qve로 흐르게 됩니다. 이러한 구성은 두 용액의 동시 연속 흐름을 가능하게 합니다.

유동 프로토콜 진행 중 언제든지 필요에 따라 유동 경로를 최적화할 수 있습니다. 하지만 SSM과 비활성화 용액 및 활성화 용액의 접합부 사이의 거리를 최대한 짧게 유지해야 한다는 점에 유의하십시오. 이 거리가 용액 교환의 타이머 솔루션을 결정하기 때문입니다.

파워 덱 케이지 외부에 위치한 전류 증폭기는 센서 칩에 연결되어 있습니다. 일반적으로 증폭도는 10⁸에서 10⁹ V/A로 설정하며, 휴지 시간은 1에서 10 ms로 설정합니다. 함수 발생기는 참조 전극에 연결되며, 밸브 제어 및 데이터 수집 소프트웨어가 설치된 컴퓨터와 인터페이스 박스가 시스템을 구성합니다.

인터페이스 박스에는 밸브 드라이버 데이터 수집 및 디지털 출력 하드웨어가 포함되어 있으며, 용액 흐름은 0.22 bar의 가압 공기로 유지됩니다. 압력은 디지털 압력계를 사용하여 모니터링합니다. 이는 공기 공급원과 EC 케이지 내의 용액 용기 사이에 설치된 스틸 컨테이너를 니들 밸브를 통해 채워 유지할 수 있습니다.

CVIC는 네 가지 부분으로 구성됩니다. zen 칩은 vet 베이스와 vet 헤드 사이에 끼워져 있습니다. 원통형 배출 커넥터가 vet 헤드에 나사로 고정되어 있으며, 여기에는 기준 전극 어셈블리가 장착됩니다.

기준 전극은 소형 SMC 커넥터가 달린 염화은선으로 구성되며, 폴리아크릴 겔 염다리에 의해 유로와 격리되어 있습니다. 사용하지 않을 때 겔 다리 어셈블리는 100 millimolar 염화칼륨이 포함된 100 millimolar 인산칼륨 pH 7 용액에 보관합니다. 먼저, 기준 전극을 겔 다리가 포함된 기준 전극 어셈블리에 장착해야 합니다.

기준 전극을 설치할 때 공기 방울이 생기지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이제 이 전극 부분을 완충 용액이 미리 채워진 배출 커넥터에 연결합니다. 모든 연결 부위는 O-링으로 밀봉해야 합니다.

이 SM은 구조화된 염소 코팅 유리에 제작된 zor 칩 위에 형성됩니다. 이 시맨틱 도로는 직경 1mm이며, 0.2mm 폭의 화이트 컨택 스트립을 통해 컨택 패드에 연결됩니다. 스프링 컨택 핀이 앰프와 접점을 형성합니다.

zen 칩은 10 LAR Okta Deccan 티올 에탄올 용액 내의 암소에 보관합니다. 흡수되지 않은 Okta deccan 바이러스 분자를 제거하여 arcane thi 층을 유지하기 위해, 전극을 순수 에탄올로 헹구고 질소 가스로 건조합니다. 이제 포스포콜린 단분자층을 조립할 수 있습니다.

지질 용액은 15 mg/mL의 DFI choline와 250 µg/mL의 Okta two A mine in decay를 포함하며, -20 °C에서 보관합니다. 이제 전극을 SA cubit의 바닥면에 정확하게 배치합니다.

용액 1 µL를 금 층에 닿지 않게 SSM 전극에 첨가합니다. 지질 용액을 첨가한 직후 vete를 조립할 수 있습니다. O 링으로 밀폐된 vete 부피는 장착 시 내부 부피가 17 µL인 원통형입니다.

SSM은 입구 보어 아래에 중앙 정렬되어야 합니다. 벳을 연결하기 전에 유체 시스템을 100 millimolar 인산칼륨 완충액으로 미리 채워야 합니다. 튜빙과 밸브 내에 기포가 없는지 확인하는 것이 중요합니다.

이제 벳(vet)을 갑상선 데이 케이지(thyroid day cage)에 장착하고, 앰플리파이어, 용액 흐름 경로의 입구와 출구, 그리고 함수 발생기를 연결할 수 있습니다. 마지막으로, 큐비트(cubit)를 100 millimeter 인산칼륨 완충액으로 헹굽니다. 이렇게 하면 SSM이 자연적으로 형성되어 SSM의 품질을 확인할 수 있습니다.

정전용량과 전도도는 함수 발생기를 사용하여 측정하며, 전도도 측정을 위해 100 millivolt DC 전압을 사용합니다. 전류 감쇠는 정전용량이 완전히 충전된 후 막 정전용량의 충전 상태를 보여줍니다. 측정된 전류는 M'S 법칙을 통해 막 전도도를 산출합니다.

여기서 0.17 nS의 전도도를 관찰할 수 있습니다. 정전용량은 피크-투-피크 진폭이 50 mV인 삼각형 AC 전압과 0.5 Hz의 주파수를 사용하여 측정할 수 있습니다. 결과로 나타나는 사각파 전류의 진폭은 커패시터의 누설 전류를 나타냅니다.

정전용량은 전이된 전하량을 인가된 전압으로 나눈 값과 같습니다. 이 막은 2.3 nF의 정전용량을 보입니다. 높은 전도도와 낮은 정전용량은 SSM이 올바르게 형성되지 않았음을 나타냅니다. 이러한 경우, 해당 막은 폐기하고 새로운 전극 칩을 사용하여 다른 SSM을 준비해야 합니다.

일반적으로 단백질 리포좀은 -80°C에서 냉동 보관합니다. 균질한 단백질 리포좀 현탁액을 얻기 위해 샘플을 얼음 위에서 해동한 후 초음파 처리(sonication)를 하는 것이 필수적인데, 이는 응집된 샘플이 SSM을 통해 빛을 과도하게 흡수하기 때문입니다. 10초 동안의 초음파 처리 사이클을 3회 반복하며, 각 사이클 사이에는 얼음 위에서 10초간의 냉각 간격을 둡니다.

비활성 용액으로 SSM을 헹굽니다. 그런 다음 기준 전극 시료와 함께 배출구 커넥터를 풉니다. 피펫을 사용하여 단백질 시료 30 µL를 vete의 배출구를 통해 ette 부피 내부로 주입합니다.

먼저 피펫 팁을 배출구 보어에 장착하십시오. 그런 다음 비활성화 경로에서 위의 매뉴얼을 열고 protea 리포좀을 주입하십시오. 이후 피펫 팁을 제거하십시오.

더 이상의 용액 흐름을 방지하기 위해 위의 수동 밸브를 잠급니다. 프로테아 리포좀이 SSM에 흡수되도록 1~2시간 동안 배양합니다. 밸브 제어 및 데이터 수집 소프트웨어의 flow protocol 창을 사용하여 흐름 프로토콜을 설정하십시오.

기질 특이성, KM 값 또는 pH 의존성 결정과 같이 대칭적 조건에서 측정하려는 경우, 단일 용액 교환 프로토콜을 선택하십시오. 각 용액의 흐름 지속 시간을 0.5초에서 1초로 설정하십시오. 전류는 전체 흐름 프로토콜 동안 계속 기록됩니다.

증폭도는 통상적으로 10의 9제곱으로 설정하며, 샘플링 속도는 초당 2000개 데이터 포인트로 선택합니다. 마지막으로, 새 프로토콜을 NA a a라는 제목으로 저장하십시오. 플로우 프로토콜 창의 두 번째 탭에서는 큐비트를 통한 비활성 또는 활성 용액의 흐름을 제어하기 위해 특정 밸브의 개폐 상태를 정의할 수 있습니다.

여기에서 우리는 E. coli 유래의 당-양성자 공수송체(sugar proton symporter)인 LacY의 프로테오리포솜(proteoliposomes) 측정 방법을 시연합니다. 활성화 용액에는 수송 대상 기질인 lactose가 포함되어 있으며, 비활성화 용액에는 보정 화합물로서 수송되지 않는 동일한 양의 glucose가 포함되어 있습니다. 당 외에도, 용액에는 pH 7.6의 100 mM potassium phosphate와 1 mM DTT가 포함되어 있습니다.

용액을 교체한 후, 수동 밸브를 사용하여 기포가 완전히 제거되었는지 확인하십시오. 유량 프로토콜을 시작하기 전, 측정 직전에 압력을 조절하십시오. 당사는 통상적으로 0.6 bar의 압력을 사용하며, 이는 당사의 특정 밸브 및 튜브 구성에서 초당 약 1밀리리터의 유량을 생성합니다.

그다음 여기서 안전 유량 프로토콜인 NAA 프로토콜을 선택하고, 시작 버튼을 눌러 각 측정을 시작합니다. 처음 몇 번의 측정 동안에는 느슨하게 흡착된 프로테아 리포좀이 제거되므로 피크 전류가 감소할 수 있습니다. 피크 전류가 일정하게 유지될 때까지 측정을 반복하십시오.

비활성화 용액이 흐르는 첫 번째 단계에서는 전류가 0입니다. 락토스가 포함된 활성화 용액으로 교체하면 막의 전기발생적 수송 활동이 유도됩니다. 단백질의 양전하가 프로테오리포좀 내부에 축적되며, 증폭기는 SSM을 통한 양성 결합으로 인해 발생하는 양의 일시적 전류를 검출합니다.

이 양의 정전위 결합 전류는 활성 용액으로부터의 V 교환 온(on) 신호라고 불립니다. 비활성 용액으로 다시 돌아가면 리포좀 외부로의 양성자 당-코드 수송이 유도됩니다. 이 경우, 단백질 동역학 분석을 위한 소위 오프(off) 신호인 음의 정전위 결합 전류가 나타납니다.

멤브레인 밸브의 전하 상태 전환으로 인해 off 신호는 정의가 불분명하며 기계적 및 전기적 아티팩트가 생성되므로, on 신호만 사용합니다. 다행히 이러한 아티팩트는 단백질 유도 신호가 관찰되기 전의 시간 범위로 제한됩니다. 밸브 전환 아티팩트와 운반체 신호 사이의 50 milliseconds 지연 시간은 용액이 말단 밸브에서 SSM Rapid Solution Exchange 표면까지 전달되는 데 필요한 시간임을 유의하십시오. SSM에서 수행된 것과 같은 실험은 전형적인 완화 실험을 나타냅니다.

이러한 실험에서 전류는 시간 의존적인 전정상 상태(pre steady state) 단계를 거쳐 일정한 정상 상태(steady state)로 완화됩니다. 반응 주기의 전류 역학적 세부 사항은 전정상 상태 전류의 형태와 크기에서 도출될 수 있습니다. 반면, 정상 상태 전류는 막 단백질의 지속적인 회전(turnover)에 대한 정보를 제공합니다.

프로테아 리포좀이 SSM에 흡착된 ly 결합 시스템에서, 전정상상태(pre steady state) 전류는 거의 변하지 않습니다. 리포좀의 충전으로 인해 일정한 정상상태 전류는 얻어지지 않으며, 대신 측정된 전류가 점진적으로 감소합니다. 수송체 전류는 회로 분석을 통해 측정된 ly 결합 전류로부터 계산할 수 있습니다.

여기서 우리는 pH 8.5에서 7.6 범위의 sugar proton co-transporter인 like Y를 사용한 대표적인 결과를 보여줍니다. 수송체 전류는 반응 주기의 후반부에 일어나는 전기생성적 반응에 의해 지배됩니다. 이러한 조건 하에서, 정상 상태 이전 단계(pre steady state phase)는 정상 상태 값으로 단순하게 상승하는 전류 흐름으로 구성됩니다.

이후 이는 정전 결합으로 인해 감쇠됩니다. 우리가 관심을 갖는 것은 정상 상태의 수송 전류입니다. 막 전위가 없는 경우, 이는 피크 전류로 상당히 정확하게 나타낼 수 있습니다.

따라서 다양한 기질 농도에 따른 피크 전류를 플로팅하여 Ali Mein 역학을 분석할 수 있지만, 피크 전류 진폭은 단일 실험 내의 단일 센서에서 얻은 경우에만 엄격하게 비교할 수 있다는 점을 고려하십시오. 그 이유 중 하나는 흡수 효율의 가변성 때문입니다. pH를 더 낮추면 단상 신호가 이상 신호로 변합니다.

마지막으로, 수송 결핍 lag Y 돌연변이체에서는 빠른 과도 응답(rapid transient)이 유지됩니다. 이 빠른 과도 응답 뒤에는 작고 더 느린 음의 성분이 뒤따릅니다. 이러한 음의 성분은 ly 결합 시스템에서 측정된 빠른 과도 전류의 특징이며, 막 커패시턴스 방전으로 인해 발생합니다.

여기서 피크 전류는 정상 상태 수송을 나타내는 것이 아니라, 이온 사이클 초기의 전이 단계에 대한 전기발생적 확인을 나타냅니다. 이는 y 변이체에서 정상 상태 수송이 나타나지 않고, 야생형 lag y의 경우 낮은 pH에서 정상 상태 수송이 억제되기 때문에 분명해집니다. 실험적 증거는 반응 사이클 내 전하 전이에 대한 기전적 해석을 제공하며, 이는 키네틱 모델에 표시되어 있습니다. 수송 결핍 변이체에서 관찰되거나 산성 조건의 야생형 lag Y에서 나타나는 빠른 과도 응답은 락토스 결합 이후의 신속하고 약한 전기발생 반응 때문이며, 더 높은 pH 값에서는 반응 사이클 후반의 주요 전기발생 반응이 신호를 지배합니다. 이 반응은 정전용량 결합 시스템에서의 유사 세포질 양성자 방출을 나타내는 것으로 제안되었습니다.

이는 강한 전압 클램프 상호작용으로 인해 Lag y의 정상 상태 수송을 나타내는 과도 전류를 유발합니다. SSM의 경우, 성분이 서로 다른 용액을 교체할 때 전기적 아티팩트가 발생합니다. 비활성 용액과 활성 용액이 특히 pH와 이온 강도 측면에서 최대한 유사하도록 확인하십시오.

기질 또한 아티팩트를 생성할 수 있으므로 대조군 실험을 수행해야 합니다. 단백질 샘플을 추가하기 전에 반드시 아무것도 코팅되지 않은 SSM을 사용하여 특정 버퍼 시스템과 흐름 프로토콜의 아티팩트 여부를 테스트하십시오. 단백질 샘플을 추가한 후에는 기질과 구조적으로 유사하지만 기질이 아닌 용액을 사용하여 대조군 측정을 수행할 수 있습니다.

또한, 목적 단백질이 없는 리포좀이나 막 단편을 사용하여 기질의 아티팩트를 테스트할 수 있습니다. 용액에 억제제를 추가하거나 피펫으로 분주할 수도 있습니다. 실험 후 수송체 신호 억제를 측정하기 위해 vete의 출구에 직접 투입하면, 단백질 특이적 신호는 사라지고 용액 교환 아티팩트만 남게 됩니다.

이후 단백질 신호를 쉽게 보정할 수 있습니다. 흡착된 단백질의 손실, 리포좀 또는 단백질 분해가 측정값에 영향을 주지 않도록 주의하십시오. 동일한 조건에서 대조군 측정을 반복하여, 최대 20%까지의 신호 감소(rundown)는 허용 가능하며, 이러한 감소가 시간에 따라 선형적으로 나타난다고 가정하여 보정할 수 있습니다.

이 설정은 저희 연구실에서 20년간 진행한 기술 개발의 결과물입니다. 또한, 키네틱 분석을 위한 더 정밀한 타이머 솔루션과 고가의 기질 소모량을 줄인 특수 시스템도 이용 가능합니다. 약물 스크리닝을 위해서는 처리량이 더 높은 완전 자동화 설정을 사용합니다.

현재까지 이 방법을 통해 20개 이상의 수송체가 특성화되었습니다. 여기에는 수송 APA, 호흡 연쇄 복합체, 냉각 수송체, 교환체, 그리고 철 채널까지 포함됩니다. 따라서 표준 전기생리학적 방법으로 문제를 해결할 수 없는 경우, 대신 SS Mase 전기생리학법을 사용하는 것을 고려하십시오.