전기 생리학을 바탕으로 솔리드 지원 막 소개

따라서 지원되는 멤브레인 기반 전기 생리학은 SSM 기반 전기 생리학으로 약칭됩니다. 이것은 새로운 전기생리학적 접근 방식입니다. 그것은 전통적인 방법과 비교된 많은 신청을 위해 현저한 개선을 제안합니다.

기존 전기생리학의 주요 도구는 전해질로 채워진 미립자 전극인 반면, M 기반 전기생리학은 고체지지 멤브레인 전극을 통해 전하 전좌를 감지합니다. 몇 가지 드문 예외를 제외하고는 전압 클램프 또는 패치 캠 방법으로 조사할 수 없는 박테리아 수송체의 경우와 같이 기존의 전기 생리학을 사용할 수 없는 경우에 매우 유용합니다. 이러한 경우 SSM 기반 전기생리학은 매우 성공적인 것으로 입증되었습니다.

또한 세포내막에서 생리학적으로 관련된 진핵생물 수송체를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. SSM 기반 전기생리학 실험을 수행하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 기초 연구에서는 운동 매개변수를 결정하고 운송 메커니즘을 명확히 하는 데 적용할 수 있지만, 견고성과 자동화 가능성으로 인해 트랙 발견에서 응용 분야를 스크리닝하는 데 이상적입니다.

SSM 전극은 기본 SSM과 관심 수송 단백질을 포함하는 프로테아좀 또는 멤브레인 단편을 채택하는 것으로 구성된 복합 멤브레인 시스템을 운반합니다. 복합 멤브레인의 전기적 특성은 멤브레인이 용량성 결합 시스템을 형성하는 등가 회로로 설명할 수 있습니다. 시스템의 전기적 거동은 멤브레인 단편을 사용하든 프로테아 리포좀을 사용하든 본질적으로 동일합니다.

수송 단백질의 전하 변위는 방광막의 커패시턴스를 통해 측정 회로로 전달됩니다. 용량성 결합이라고 하는 감지 원리. 일반적인 실험에서 VSSM의 신속한 용액 교환은 단백질의 전기 발생 수송 활성을 따르는 수송 단백질 V에 대한 기질을 제공하며, 이는 SSM 커패시턴스를 통해 측정 시스템에 결합됩니다.

동시에, 전기 생성 단백질 활성은 리포솜 막을 점진적으로 충전하여 수송 단백질의 억제와 기록 회로의 전류 감소로 이어지며, 측정된 전류는 엔조에 흡수된 수백만 개의 프로테아 리포좀의 동시 수송 반응의 결과입니다. 각각 약 100 대의 수송기가 포함되어 있습니다. 이 설정은 솔루션 경로가 있는 패러데이 케이지, 밸브 제어를 위한 외부 회로, 신호 증폭, 데이터 수집 및 분석으로 구성됩니다.

EC 케이지에는 용액 흐름 제어에 필요한 용기, 밸브 및 튜브와 XOR 칩이 있는 큐빗이 포함되어 있습니다. XOR 칩은 SSM 전극과 흡수된 프로트 리포좀을 운반합니다. 베트는 외부 전기 회로의 증폭기 및 함수 발생기에 연결됩니다.

SSM 측정, wreak fire, 두 가지 용액, 하나는 활성화되고 다른 하나는 활성화 용액에만 존재하는 기판에서 떨어져 활성화되지 않습니다. 두 솔루션 모두 단일 교환 구성에서 동일한 구성을 갖습니다. 둘째, 양방향 밸브는 비 재활성화 및 활성화 용액의 흐름을 제어합니다.

기계적으로 3회 3회 결합된 3방향 밸브인 단자 밸브는 비활성화 용액과 활성화 용액 사이를 전환하는 데 사용되어 용액 중 하나는 폐기물 용기로, 다른 용액은 qve로 향하게 합니다. 단자 밸브가 전환되면 비활성화 용액의 흐름은 폐기물로 다시 라우팅되고 활성화 용액은 qve로 흐릅니다. 이 구성을 사용하면 두 솔루션의 동시 연속 흐름을 수행할 수 있습니다.

흐름 프로토콜 중 언제든지 필요에 따라 흐름 경로를 최적화할 수 있습니다. 그러나 SSM과 비활성화 및 활성화 솔루션의 접합부 사이의 거리는 가능한 한 짧게 유지되어야 한다는 점을 명심해야 합니다. 솔루션 교환의 타이머 솔루션을 결정하기 때문입니다.

파워 데크 케이지 외부의 전류 증폭기는 센서 칩에 연결됩니다. 일반적으로 이것은 10의 증폭으로 8-10의 전력, 암페어 당 9 볼트의 전력 및 1-10 밀리 초의 휴식 시간으로 설정됩니다. 함수 발생기는 기준 전극에 연결되고 밸브 제어 및 데이터 수집 소프트웨어와 인터페이스 박스가 있는 컴퓨터가 시스템을 완성합니다.

인터페이스 상자에는 밸브 드라이버, 데이터 수집이 포함되어 있으며 디지털 출력 하드웨어 솔루션 흐름은 OH 0.22의 가압 공기로 유지됩니다. 하나의 bar 압력은 디지털 밀리미터를 사용하여 모니터링됩니다. 니들 밸브를 통해 EC 케이지의 공기 공급 장치와 용액 용기 사이에 설치된 강철 용기를 채워 유지 관리할 수 있습니다.

CVIC는 네 부분으로 구성되어 있습니다. 젠 칩은 수의사 베이스와 수의사 머리 사이에 끼워져 있습니다. 원통형 출구 커넥터는 수의사 헤드에 나사로 고정되어 기준 전극 어셈블리를 운반합니다.

기준 전극은 소형 SMC 커넥터가 있는 염소화 은선으로 구성되며 poly acry gel salt bridge에 의해 흐름 경로에서 분리됩니다. 사용하지 않는 젤 브리지 어셈블리는 100 밀리몰 염화칼륨을 함유 한 100 밀리 몰 인산 칼륨 pH 7 용액에 보관됩니다. 먼저, 기준 전극은 지오 브리지를 포함하는 기준 전극 어셈블리에 장착되어야 합니다.

기준 전극을 설치하는 동안 기포를 피하는 것이 중요합니다. 이제 베트의 이 부분은 버퍼 용액으로 미리 채워진 출구 커넥터에 연결됩니다. 모든 연결은 O 링으로 밀봉되어야 합니다.

이 SM은 구조화된 염소 코팅 유리 조명인 zor 칩에 형성됩니다. 이 sematic road는 직경이 1mm이며 0.2mm 흰색 접촉 스트립을 통해 접촉 패드에 연결됩니다. 스프링 접촉 핀은 증폭기에 대한 접촉을 생성합니다.

zen 칩은 10 LAR Okta Deccan 티올 에탄올 용액에 담아 어두운 곳에 보관됩니다. 흡수되지 않은 Okta deccan 바이러스 분자를 제거하기 위해 난해한 thi 층을 유지하기 위해 전극을 순수 에탄올로 헹구고 전극을 질소 가스로 건조시킵니다. 이제 포스포콜린 단층을 조립할 수 있습니다.

지질 용액에는 밀리리터당 15밀리그램의 DFI 콜린과 밀리리터당 250마이크로그램이 함유되어 있습니다. Okta two 광산은 부패하여 영하 20도에서 보관됩니다. 이제 전극이 SA 큐빗의 바닥에 정확하게 배치됩니다.

용액 1마이크로리터를 금층에 닿지 않고 SSM 전극에 첨가합니다. 지질 용액을 첨가 한 직후, vete를 조립할 수 있습니다. O 링으로 밀봉된 베트 부피는 장착 시 내부 부피가 17마이크로리터인 원통형입니다.

SSM은 입구 보어 아래의 중앙에 있어야 합니다. 수의사를 연결하기 전에 유체 시스템에 100밀리몰의 인산칼륨 완충 용액을 미리 채워야 합니다. 튜브와 밸브에 기포가 없는지 확인하는 것이 중요합니다.

이제 수의사를 갑상선 데이 케이지에 장착하고 증폭기, 용액 흐름 경로의 입구 및 출구 및 함수 발생기를 연결할 수 있습니다. 마지막으로, 큐빗은 100mm 인산칼륨 완충액으로 헹굴 수 있습니다. 이것은 SSM의 품질을 확인하기 위해 자발적인 SSM 형성으로 이어집니다.

커패시턴스와 컨덕턴스는 컨덕턴스를 측정하기 위해 함수 발생기를 사용하여 측정되며 100 밀리 볼트 DC 전압이 사용됩니다. 전류 감쇠는 커패시터가 완전히 충전된 후의 멤브레인 커패시터의 충전을 보여줍니다. 측정된 전류는 M'S 법칙을 사용하여 멤브레인 전도도를 산출합니다.

여기서 우리는 oh 0.17 나노 지멘스의 전도도를 관찰합니다. 커패시턴스는 50 밀리 볼트 피크 대 피크 진폭의 삼각형 AC 전압과 oh 0.5 헤르츠의 주파수를 사용하여 측정 할 수 있습니다. 결과 구형파 전류의 진폭은 커패시터의 판단 전류를 나타냅니다.

커패시턴스는 전달된 전하를 부과된 전압으로 나눈 값과 같습니다. 이 멤브레인은 2.3 나노의 커패시턴스를 나타내며 높은 전도도 및 낮은 커패시턴스는 SSM이 올바르게 형성되지 않았음을 나타냅니다. 이러한 경우 멤브레인을 폐기하고 새 전극 칩을 사용하여 다른 SSM을 준비해야 합니다.

일반적으로 프로트 리포솜은 영하 80도에서 냉동 보관됩니다. 얼음 초음파 처리에 대한 샘플은 응집된 샘플이 풀리를 SSM에 흡수하여 균일한 prot 리포좀 현탁액을 얻기 때문에 필수적입니다. 3 개의 10 초 초음파 처리주기가 얼음 위에서 10 초의 냉각 간격으로 번갈아 가며 진행됩니다.

SSM을 비활성화 용액으로 헹굽니다. 그런 다음 기준 전극 샘플과 함께 콘센트 커넥터의 나사를 풉니다. 피펫을 사용하여 30마이크로리터의 단백질 샘플을 수의사 배출구를 통해 ette 부피에 주입합니다.

먼저 피펫 팁을 배출구 구멍에 장착합니다. 그런 다음 위의 설명서를 비활성화 경로에서 열고 프로테아 리포좀을 주입합니다. 피펫 팁을 강등하기 전에.

추가 용액 흐름을 방지하기 위해 위의 설명서를 닫으십시오. 프로테아 리포좀이 SSM에 흡수되도록 1-2시간의 배양 시간 동안 기다립니다. 밸브 제어 및 데이터 수집 소프트웨어의 흐름 프로토콜 창을 사용하여 흐름 프로토콜을 정의하십시오.

기질 특이성, KM 값 또는 pH 의존성 측정과 같은 대칭 조건에서 측정하려면 단일 용액 교환 프로토콜을 선택하십시오. 각 솔루션의 흐름 시간을 oh 0.5에서 1초로 설정합니다. 전류는 전체 흐름 프로토콜에 걸쳐 기록됩니다.

증폭은 일반적으로 10의 9의 거듭제곱으로 설정되며, 샘플 속도의 경우 초당 2000개의 데이터 포인트를 선택합니다. 마지막으로 NA a 및 a라는 제목으로 새 프로토콜을 저장합니다. flow protocol 창의 두 번째 탭에서 특정 밸브의 개방 또는 폐쇄 상태를 정의하여 큐비트를 통한 비활성화 또는 활성화 솔루션의 흐름을 제어할 수 있습니다.

여기에서 우리는 프로테아 리포좀의 측정, E coli에서 Y와 같은 설탕 양성자 수입을 보여줍니다. 활성화 용액은 수송된 기질 유당을 함유하는 반면, 비활성화 용액은 보상 화합물과 동일한 양의 비수송 포도당을 함유합니다. 설탕 외에도 용액에는 pH 7.6에서 100 밀리 몰의 인산 칼륨과 1 밀리 몰의 DTT가 포함되어 있습니다.

용액을 교체한 후에는 수동 밸브를 사용하여 기포가 제거되었는지 확인하십시오. 유량 프로토콜을 시작하기 전에 측정을 시작하기 직전에 압력을 조정하십시오. 우리는 일상적으로 O 0.6bar의 압력을 사용하며, 이는 특정 밸브 및 튜브 구성에서 초당 약 1밀리리터의 유속을 생성합니다.

그런 다음 여기에서 안전 흐름 프로토콜인 NAA 프로토콜을 선택하고 시작 버튼을 눌러 각 측정을 시작합니다. 처음 몇 번의 측정 동안 느슨하게 흡수되면 프로테아 리포좀이 제거되므로 피크 전류가 감소할 수 있습니다. 피크 전류가 일정하게 유지될 때까지 측정을 반복합니다.

활성화되지 않은 용액 흐름의 첫 번째 단계에서 전류는 0입니다. 유당을 함유한 비활성화 용액에서 활성화 용액으로의 교환은 막의 전기적 수송 활성을 유도합니다. 단백질 양전하(protein positive charge)는 단백질 리포좀(prote liposome) 내부에 축적되고 증폭기는 SSM을 통한 포지티브 커플링으로 인한 포지티브 과도 전류를 감지합니다.

이 양의 양방향으로 결합된 전류를 활성화 용액에서 온 신호 V 교환이라고 합니다. 다시 비활성화 용액으로 돌아가서, 리포솜에서 양성자 당 코드 전달을 유도합니다. 이 경우, 음의 LY 결합 전류가 단백질 역학 분석을 위한 소위 꺼짐 신호로 표시됩니다.

멤브레인 밸브 스위칭의 충전 상태로 인해 오프 신호가 제대로 정의되지 않았기 때문에 켜짐 신호만 사용되며 기계적 및 전기적 아티팩트가 생성됩니다. 다행히도 이러한 신호는 단백질 유도 신호가 관찰되기 전의 시간 범위로 제한됩니다. 밸브 스위칭 아티팩트와 트랜스포터 신호 사이의 50밀리초 지연은 솔루션이 터미널 밸브에서 SSM Rapid Solution Exchange의 표면으로 전파되어야 하는 시간이며, SSM에서 수행된 것과 같은 것은 일반적인 완화 실험을 나타냅니다.

이러한 실험에서 전류는 시간 의존적인 사전 정상 상태 단계를 통해 일정한 정상 상태로 이완됩니다. 반응 사이클의 전류 역학 세부 사항은 사전 정상 상태 전류의 모양과 크기에서 파생될 수 있습니다. 정상 상태 전류는 연속적인 막 단백질 회전율에 대한 정보를 제공합니다.

프로테아 리포좀이 SSM에 흡수되는 ly 결합 시스템에서 사전 정상 상태 전류는 거의 변경되지 않습니다. 일정한 정상 상태 전류는 결코 얻어지지 않지만 대신 리포솜의 충전으로 인해 측정된 전류는 점차 감소합니다. 트랜스 포터 전류는 회로 분석을 통해 측정 된 결합 전류로부터 계산할 수 있습니다.

여기에서는 8.5에서 7.6 사이의 PA 범위에서 Y와 같은 설탕 양성자 공동 수송체를 사용하는 대표 결과를 보여줍니다. 수송체 전류는 반응 주기 후반에 전기 발생 반응에 의해 지배됩니다. 이러한 조건에서 사전 정상 상태 면은 정상 상태 값으로의 간단한 전류 상승으로 구성됩니다.

이것은 용량성 결합으로 인해 감소합니다. 우리는 정상 상태 수송 전류에 관심이 있습니다. 멤브레인 전위가 없는 경우, 이것은 피크 전류에 의해 좋은 근사치로 표현됩니다.

따라서 Ali Mein kinetics는 서로 다른 기판 농도에 대한 피크 전류를 블로팅하여 분석할 수 있지만, 피크 전류 진폭은 한 번의 실험에서 단일 센서에서 얻은 경우에만 엄격하게 비교할 수 있다는 점을 고려하십시오. 한 가지 이유는 흡수 효율의 가변성입니다. pH가 더 감소하면 단상 신호가 이위상이 됩니다.

그리고 마지막으로, 수송 결핍 지연 Y 돌연변이에 대한 빠른 과도 상태가 남아 있습니다. 빠른 과도 상태 다음에는 작고 느린 음의 성분이 뒤따릅니다. 음의 성분은 ly coupled 시스템에서 측정되는 빠른 과도 전류의 특징이며 멤브레인 커패시턴스 방전에 의해 발생합니다.

여기서 피크 전류는 정상 상태 전달을 나타내는 것이 아니라 이온 사이클 초기에 전이에 대한 전기적 확인을 나타내며, 이는 y 돌연변이가 정상 상태 전달을 나타내지 않기 때문에 명백해지고, 야생형 지연의 경우 y 정상 상태 전달이 낮은 pH에 의해 억제됩니다. 실험적 증거는 운동 모델에서 보여지는 지연 y의 반응 주기에서 전하 전좌에 대한 기계론적 해석을 제공합니다. 수송이 결핍된 돌연변이 또는 산성 조건에서 야생형 지연 Y의 경우 관찰된 빠른 과도 현상은 더 높은 pH 값에서 유당 결합 후 빠른 주간 전기 발생 반응에 기인하며, 신호는 반응 주기 후반의 주요 전기 유발 반응에 의해 지배되며, 이는 용량성 결합 시스템에서 유사 플라즈마 양성자 방출을 나타내는 것으로 제안되었습니다.

이것은 Utes의 강한 상호 작용으로 인해 Lag y의 정상 상태 전송을 나타내는 과도 전류로 이어집니다. SSM을 사용하면 서로 다른 구성의 용액을 교환할 때 전기 아티팩트가 생성됩니다. 비활성화 용액과 활성화 용액이 특히 pH 및 이온 강도와 관련하여 가능한 한 유사한지 확인하십시오.

기질은 또한 인공물을 생성할 수 있으므로 제어를 수행해야 합니다. 단백질 샘플을 추가하기 전에 항상 베어 SSM을 사용하여 특정 버퍼 시스템과 흐름 프로토콜에 아티팩트가 있는지 테스트하십시오. 단백질 샘플을 추가한 후 대조군 측정은 기질과 구조적으로 유사한 비기질(non substrates)을 포함하는 용액으로 수행할 수 있습니다.

또한 관심 단백질이 없는 리포솜 또는 멤브레인 조각을 사용하여 아티팩트에 대한 기질을 테스트할 수 있습니다. 용액에 억제제를 추가하거나 피펫팅할 수도 있습니다. 수송체 신호 억제를 측정하기 위해 정맥의 배출구로 직접 실험한 후 단백질 특이적 신호는 사라지고 용액 교환 아티팩트만 남습니다.

그러면 단백질 신호를 쉽게 수정할 수 있습니다. 흡수된 프로트, 리포좀의 손실 또는 단백질 분해가 측정에 영향을 미치지 않는지 확인하십시오. 동일한 조건에서 반복적인 제어 측정을 수행하면 최대 20%의 신호 런다운이 허용되며 런다운의 선형 시간 의존성을 가정하여 수정할 수 있습니다.

이 설정은 우리 실험실에서 20년 동안 기술 개발을 진행한 결과입니다. 또한 kinetic 분석을 위한 더 높은 타이머 솔루션과 값비싼 기판에 대한 더 낮은 솔루션 소비를 가진 특수 시스템을 사용할 수 있습니다. 약물 스크리닝의 경우 처리량이 더 높은 완전 자동 설정을 사용합니다.

현재까지 20개 이상의 수송기가 이 방법을 사용하여 특성화되었습니다. 여기에는 운송 APA, 호흡 사슬 복합체, 냉각 수송기, 교환기 및 철 채널이 포함됩니다. 따라서 표준 전기생리학으로 문제를 해결할 수 없는 경우 대신 SS Mase 전기생리학을 사용하는 것이 좋습니다.