Name: 전기 생리학을 바탕으로 솔리드 지원 막 소개 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 56 s
Description: 배우세요 솔리드 지원 막(SSM) 전기 생리학을 활용한 전기성 막 수송체 특성화 방법입니다. 이 기법은 세균 및 진핵생물 수송체 연구에서 기존 전압 클램프나 패치 클램프 기법으로는 조사할 수 없는 경우에 특히 유용하며, 기초 연구와 약물 발굴 스크리닝에 적합합니다.

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우리는 지원과 도움이 토론의 레이스 측정 및 E. 밤베르크에 공헌 J. 가르시아 CELMA, I 미르 노바와 R. Kaback 감사합니다.

1. SSM 기반의 전기 생리학에 대한 장치 설정 자세한 내용은 개략적 도면과 우리 큐벳의 사진을 포함하고 1, 2를 설정 우리의 기술 발행물의 두 가지에있다. 다른 솔루션 교환 구성과 흐름 프로토콜은 또한 우리의 방법 종이 2에 설명되어 있습니다. 다음에서 우리는 몇 가지 최근의 개선 및 비디오 프레 젠 테이션을위한 직접적인 관련이없는 기술적 인 세부 사항을 추가합니다. 밸브 제어 및 데이터 수집 인터페이스 박스는 상용 USB 디지털 출력 / 아날로그 입력 인터페이스 (NI USB 6009 내쇼날 인스트루먼트)와 밸브 드라이버가 포함되어 있습니다. 이 솔루션의 흐름을 제어 및 데이터 수집을 담당하고 있습니다. 밸브는 일반적으로 빠른 밸브 18까지의 전압으로 구동 V. 비디오에서 우리는 12 V 전원 공급 장치를 사용 할 수있는 스위칭, 그러나 12으로 구동 V. 있습니다. &lt;/ P&gt; 밸브 드라이버 회로 보드는 4 개의 밸브를 조작 할 수 있습니다. 그것은 생물 물리학의 맥스 플랑크 연구소의 공장에서 제조되었다. 밸브는 전면 패널 스위치를 통해 컴퓨터 또는 수동으로 제어 할 수 있습니다. 후자는 청소 - 절차 및 플러시 편리합니다. 측정하는 동안, 인터페이스 박스는 밸브 제어 및 데이터 수집 소프트웨어 (SURFE 2 R 소프트웨어 IonGate 생명 과학)를 사용하여 컴퓨터 제어됩니다. 2. 준비 이 섹션에서는 SSM 기반의 전기 생리학 실험의 준비를위한 다양한 프로토콜이 언급되어 있습니다. 2.1 SSM의 형성 지질 솔루션 만들기 <ol><li> 25 μL Octadecylamine (클로로포름 5 MG / ML)와 GLAS 유리 병에 375 μL Diphytanoylphosphatidylcholine을 (클로로포름 20 MG / ML) 섞는다. </li><li> 회전 증발기 및 지속적인 질소 가스 유량 사용에 대한 클로로포름을 증발약 30 분. </li><li> N-데칸의 500 μL로 흔들어 유리 병의 벽에서 지질을 제거합니다. 최종 지질 농도 1:60 (W / W) octadecylamine와 15 MG / ML입니다. </li><li> 유리 저장 병에 대한 해결책을 전송합니다. -20 ° C.에서 지질 솔루션을 저장 </li></ol> 기준 전극의 2.2 염소화 참조 전극 마모로 인해 일정한 간격으로 염화해야합니다. <ol><li> 염소 처리하기 전에 잘 사포를 사용하여 이전 silverchloride 층의 나머지 부분을 제거합니다. </li><li> 1 M 염산 용액에 백금 전극과 함께 실버 와이어를 배치하고 0.5 mA에서 15 분간 chlorinate. 염소를 완료 한 후, 실버 와이어는 균일 한 어두운 회색 색상을 변경합니다. </li></ol> 폴리 아크릴 아마이드 젤 다리 2.3 준비 <ol><li> 100 mM의 pH에​​서 KPI = 7, 100 mM의 KCl을 6를 포함하는 솔루션을 준비합니다%의 아크릴 아미드. </li><li> 0.3 % APS (10 % 주식)을 추가하고 0.6 %는 TEMED 곧 피펫 솔루션을 섞는다. </li><li> 즉시 용액을 혼합 한 후, 빈 젤 다리 용기에 혼합물의 30 μl를 주입 피펫을 사용합니다. 그것은 주입시 공기 방울을 방지하는 것이 중요합니다. </li><li> 20 분의 배양 시간 동안 젤 중합. </li><li> 중합 후 젤 다리 용액 (100 mM의 KPI pH가 7, 100 mM의 KCl을)에 저장됩니다. 젤 다리의 수명을 연장하기 위해 솔루션은 4 ° C.에 저장됩니다 </li></ol> 측정 솔루션 2.4 준비 다른 구성의 솔루션을 교환 할 때 SSM과 용질의 강한 상호 작용으로 인해, 전기 아티팩트가 생성됩니다. 따라서 솔루션의 준비는 중요한 단계입니다. 솔루션 교환 아티팩트를 최소화하기 위해 솔루션의 준비 과정에서 다음과 같은 예방 조치를 취하십시오. <ol><li> 비 활성화하고 하나의 일괄 처리에서 솔루션을 활성화합니다, pH와 이온 강도를 조정합니다. </li><li> 높은 소금 배경 솔루션 교환 아티팩트를 줄일 수 있습니다. </li><li> 두 개의 볼륨으로 배치 솔루션을 나눕니다. </li><li> 활성화 용액에 활성 화합물을 추가합니다. 가능한 한 유사한으로 삼투압과 두 솔루션의 이온 강도를 유지하기 위해 비 활성화 솔루션의 보상 화합물을 사용합니다. </li><li> 솔루션은 4 ° C에 저장되어있는 경우, 온도도 작은 차이가 아티팩트를 생성 할 수 있기 때문에 모든 솔루션은 측정을 시작하기 전에 실내 온도에 도달해야합니다. </li></ol> 3. SSM 기반의 전기 생리학 실험 여기에서 우리는 SSM 기반의 전기 생리학 실험에 대한 일반적인 프로토콜을 제시한다. 3.1 SSM 설치 준비 SSM 설치를 사용하지 않을 때에는 튜브는 30 % 에탄올로 가득/ 물 솔루션 박테리아의 성장을 방지 할 수 있습니다. <ol><li> 큐벳을 설치하기 전에 튜브에서 에탄올을 제거하는 순수한 물 시스템을 씻으십시오. 물 컨테이너 에탄올 용기를 교체합니다. 높은 압력 (0.6-1.0 bar)를 물 20 ~ 30 ml의 시스템을 청소 사용. </li><li> pH를 7.6 또는 비 활성화 솔루션을 100 mM의 KPI 버퍼를 사용하여 청소 절차를 반복합니다. </li><li> 기포가 유체 시스템에 남아 있는지 확인합니다. </li></ol> 3.2 큐벳 장착 <ol><li> 기준 전극에 O-링을 부착 </li><li> 스토리지 솔루션에서 젤 다리를 타고와 기준 전극을 연결합니다. </li><li> 미리 기입 비 활성화 버퍼 콘센트 커넥터, O-링을 삽입하고 기준 전극 어셈블리를 완료하는 젤 다리를 연결합니다. 기포가 젤 다리와 출구 용액 흐름 경로의 교차점에 없는지 특별한주의를 기울입니다. </li><li> cuve의 주요 부분을 Preassemble스프링 접촉 핀 (앰프에 연결), 유입 관 (터미널 밸브에 연결), O-링 (SSM에 대한 밀봉)하고 나사를 추가하여 테. </li><li> 핀셋 사용하여 저장 용액 (에탄올 10 MM의 octadecanethiol)의 센서 칩을 꺼내. </li><li> 피펫을 사용하여, 약에 남아있는 솔루션을 씻어. 순수 에탄올 5 ㎖. </li><li> 질소 가스 하에서 전극을 건조. </li><li> 입구 큐벳의 주요 부분의 구멍 수 있도록 큐벳의 기본 부분에 정확하게 센서 칩을 배치하는 것은 센서의 원형 활성 영역으로 전달됩니다. </li><li> 센서 칩의 활성 영역 지질 용액 1 μL를 추가합니다. 금 층이 완전히 지질에 포함되어 있는지, 확인하십시오. </li><li> 바로 지질의 솔루션을 추가 한 후, 미리 조립 된 주요 부분을 추가하여 큐벳을 닫습니다. </li><li> 패러데이 케이지에 큐벳을 설치하기 전에 모든 표면이 완전히 건조되어 있는지 확인합니다. </li><li> CONN터미널 밸브 스프링 접촉 핀과 입구 튜브 앰프 요법. 다음 패러데이 케이지 안에 나사 큐벳을 수정합니다. </li><li> 큐벳의 상단에 콘센트 커넥터를 고정합니다. 마지막으로 콘센트 커넥터와 기준 전극에 전압 발생기 출구 튜브를 연결합니다. </li><li> 즉시 설치 후 큐벳 0.6 바에서 버퍼 시스템을 씻는다. 이 자연 SSM 형성에 이르게한다. </li></ol> 3.3 측정 막 매개 변수 SSM의 품질을 확인하려면, 정전 용량 및 전도는 함수 발생기를 사용하여 측정하고 있습니다. <ol><li> 함수 발생기 사용하여 전도도를 측정하기 위해 mV에서 100 mV DC 전압을 적용합니다. </li><li> 컨덕턴스를 계산 : 현재 붕괴 막 커패시터의 충전을 보여줍니다. 커패시터 후 완전히 측정 된 현재의 수익률에게 옴의 법칙을 사용하여 막 전도도가 청구됩니다. 단순함을 위해 우리는 CU를 사용rrent 1 초는 전압 후 전기 전도도 G = I / U.를 적용하여 산정 </li><li> 진폭과 커패시턴스를 측정하는 0.5 Hz의 주파수에서 최대 50 MV 피크 삼각형 AC 전압을 적용합니다. </li><li> 용량 계산 결과 구형파 전류의 진폭은 커패시터의 충전 전류를 나타냅니다. 정전 용량 C는 전송 요금 같다 Q = ΔU = mV에서 100 mV로 나누어 IΔt. (나는 삼각형 전압의 차이가 현재의 긍정적 인 마이너스 음의 기울기이므로 ΔU 두 번 50 MV의인가 전압이다.) </li><li> 반복적으로 막 약마다 10 분의 전기적 매개 변수를 모니터링 할 수 있습니다. 상수 값에 도달 할 때까지 30 ~ 40 분. 1-0.6에 대한 막대의 범위에서 높은 압력에서 KPI 버퍼와의 사이에 씻으십시오. </li><li> SSM의 품질을 추정 : 최적의 매개 변수는 0.1-0.2 nS는 및 2-3.5 NF의 범위에 있습니다. 1 NF 아래 0.8 nS는 낮은 커패시턴스 위의 높은 전도성을 나타냅니다SSM이 제대로 형성되지 않습니다. 4 NF 위의 높은 용량은 활성 영역이 SSM에 의해 완전히 적용되지 않는 것을 의미합니다. </li><li> 매개 변수가 최적의 범위 내에 있지 않은 경우, 멤브레인은 폐기되어야하며 다른 SSM은 갓 준비된 전극 칩을 사용하여, 준비. </li></ol> 솔루션 교환 아티팩트 3.4 검사 막 매개 변수를 검사 한 후, 측정 버퍼 용액 교환 유물에 대한 검사를해야한다. <ol><li> 유체 시스템에 각각의 솔루션 컨테이너를 삽입합니다. </li><li> 수동 밸브를 사용하여 유체 시스템에서 공기 방울을 제거합니다. </li><li> 데이터 수집 소프트웨어를 사용하면 실험에 사용할 흐름 프로토콜을 선택했다. </li><li> 0.6 bar까지 압력을 조정하고 측정을 시작합니다. </li><li> 떨어져 기계적 밸브 스위칭 유물에서 이상적으로 어떤 이슈 전류는 측정하지 않아야하거나 훨씬 SMA해야한다예상 단백질 교통 신호보다 ller의. 솔루션 교환 유물이 발견되면, 실험을 계속하기 전에 버퍼 조성물 및 / 또는 준비 절차를 최적화하려고합니다. </li></ol> 3.5 단백질 샘플을 추가 보통 proteoliposomes 또는 막 조각은 -80에서 냉동 저장됩니다 ° C.는 하나의 측정을 위해 약 30 μL의 나누어지는이 필요합니다. <ol><li> 비 활성화 솔루션 SSM을 씻어. </li><li> 얼음에 단백질 샘플을 해동. </li><li> 세 개의 10 초 초음파주기 얼음에 10 초 냉각 간격으로 교대된다. Proteoliposomes는 목욕 sonicator를 사용하여 초음파됩니다. 막 조각을위한 팁 sonicator이 (50W, 30 kHz에서 1 밀리미터 sonotrode 직경, 강도 20 %, 사이클 0.5)이 사용됩니다. 마지막 초음파 단계 후 얼음에 다시 샘플을 두지 않지만, 큐벳에 즉시 투입. </li><li> 풀고 콘센트는 참조 전극 ASSE와 함께 커넥터를mbly. </li><li> 피펫을 사용하여 단백질 시료 30 μl를 대기음 구멍 콘센트에 피펫 팁을 탑재. </li><li> 폐기물 컨테이너에 비 활성화 경로에 수동 밸브를 열고 큐벳 볼륨으로 proteoliposomes을 주입. 센서 큐벳 볼륨으로 공기를 주입하지 않도록주의하십시오. </li><li> 피펫 팁을 제거하기 전에, 추가 솔루션의 흐름을 방지하기 위해 수동 밸브를 닫습니다. </li><li> proteoliposomes 1 ~ 2 시간의 배양 시간 동안 SSM에 흡착 할 수 있습니다. 그것은 하룻밤 배양하는 것도 가능합니다. </li></ol> SSM 기반 실험의 3.6 일반 절차 <ol><li> 4 ° C.에 저장하는 경우에, 시간 측정 버퍼를 따뜻하게 모든 측정 버퍼 유물을 피하기 위해 측정을 시작하기 전에 실내 온도에 있어야합니다. </li><li> 솔루션을 변경하는 경우, 먼저 비 퍼징 조직으로 솔루션 컨테이너 내부에 튜브를 청소 한 다음 새 병을 삽입합니다. </li><li> 측정을 시작하기 전에, 변경 절차에서 진화 할 수 기포를 제거하기 위해 수동 밸브를 사용합니다. </li><li> 그냥 측정을 시작하기 전에 압력을 조정합니다. 우리는 정기적으로 우리의 특정 밸브와 튜브 구성이 약 1.0 ML / 초 유량을 산출 0.6 바의 압력을 사용합니다. </li><li> 처음 몇 측정은 다른 후 바로 하나를 수행 할 수 있으며, 피크 전류가 일정하게 유지 될 때까지 거부해야한다. 솔루션은 pH가 다른 경우 적어도 3 분의 배양 시간은 측정을 시작하기 전에 proteoliposomes의 내부 산도를 조정하기 위해 필요합니다. </li><li> 이제 세트까지 측정을위한 준비가되어 있습니다. 소음을 줄이기 위해 최소 3 측정이 이루어과 평균해야한다. </li></ol> 3.7 제어 측정 일련의 측정 중 신호 런은 단백질 분해 또는 흡착 손실로 인해 발생할 수 있습니다. 각각의 SSM 실험 내가해야런 컨트롤을 NCLUDE. 이 동일한 솔루션을 반복 측정하여 수행됩니다. 최소 런 컨트롤은 동일한 솔루션을 사용하여, 하나의 시작 부분에 측정하고 실험의 끝을 의미합니다. 우리는 당신이 실험에서 가장 높은 피크 진폭을 기대 조건 런 제어를 수행하는 것이 좋습니다. 이렇게하면 신호의 개요를 정량화 할 수 있습니다. 신호 런은 두 개요 컨트롤의 피크 진폭의 비교에 의해 정량화 할 수있다. 결과 백분율 값은 런의 선형 시간 의존성을 가정하여 측정 된 신호를 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 3.8 아티팩트 컨트롤 가능하면 실험 후 관심 억제 단백질에 의해 결과를 확인하려고합니다. 나머지 신호는 아마도 솔루션 교환 유물이다. 신호는 측정 된 이슈를 수정해야합니다. <ol><li> 순수한 물 20 ~ 30 mL를 30 % 에탄올 / 물 20 ~ 30 ml의 시스템을 씻으십시오. 시스템을 사용하지 않을 때 에탄올 용액은 박테리아의 성장을 방지합니다. </li><li> 이 세척 과정을 거친 후, 시스템에서 압력을 해제하고 모든 기기의 전원을 끄십시오. </li><li> 패러데이 케이지에서 큐벳을 제거하고 분리. 큐벳의 모든 부분은 목욕 sonicator를 사용하여 필요한 경우, 물과 순수 에탄올로 세척 할 수 있습니다. </li><li> 순수 에탄올 GLAS 비커에 센서 칩을 놓습니다. 목욕 sonicator를 사용하여 약 1 ~ 2 분 비커를 초음파 처리. </li><li> 질소 가스 하에서 센서 칩을 말린다. </li><li> 10 MM Octadecanthiol 에탄올 용액에 빛으로부터 멀리 센서 칩을 저장합니다. 약 30 분 배양 시간 이후 센서 칩은 재사용을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

1. SSM 기반의 전기 생리학의 장점은 기존의 방법에 비해 SSM 기반의 전기 생리학은 전기 생리학 도구 상자의 유용한 도구로 자신을 증명하고있다. 그것은 규칙 전기 생리학, 즉 패치 클램프 및 전압 클램프 방법을 적용 할 수없는 경우에 특히 유용 외에도 몇 가지 드문 예외에서 세균 수송 때문에 박테리아의 작은 크기와 때문에 전압 클램프 또는 패치 클램프 방법을 사용하여 조사 할 수 없습니다 그들은 포유 동물 세포 나 난자에서 표현하기가 어렵습니다. 또한 생리학 관련 포유 동물 운송을 조사 할 수 있습니다. 이 경우 SSM 기반의 전기 생리학은 세포 세포막과 때문에 견고성 및 자동화에 대한 가능성의 약물 발견의 심사 응용 프로그램에 대한 운송을위한 매력적이다. 투명의 SSM-basedUsing 기존의 전기 생리학, 시간이 해결 특성orters가 도전합니다. 운송업자의 매출액은 낮기 때문에 &#39;거대한 패치&#39;또는 &#39;전체 세포의 구성이 필요합니다, 솔루션 교환 실험에서 본질적으로 낮은 시간 해상도를 가지고있는. 합병증은 광분해 기판 ​​릴리스를 사용하여 극복 할 수있다. 그러나 기판의 제한된 숫자는이 방법에 적합합니다. 여기에 SSM에서 빠른 솔루션 교환은 임의의 기판을 사용하여 높은 시간 해상도로 전기 생리학 연구를 수행 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 2. 제한 사항 및 중요한 단계 패치 클램프 및 전압 클램프 기법과는 대조적으로, SSM 기반의 전기 생리학은 전위를 적용 할 수 없습니다. 수송 특성 따라서 막 잠재력에 의존하지 않는 모드를 수송하기 위하여 제한됩니다. 일반적으로, SSM 기반의 전기 생리학이 (electrogenic) 수송의 유형에 관한 아무런 제한이 없습니다. 그러나 전압 CL에게결합 단백질과 같은 세포 구성 요소는 단백질의 기능에 필요한 경우 앰프 나 패치 클램프 방법은 장점을 가지고 있습니다. 솔루션 교환이 큰 이슈 전류를 만드는 경우 제한이 발생할 수 있습니다. 기판 친 유성 화합물의 경우처럼 SSM과 강하게 상호 작용할 때 발생합니다. 아티팩트 컨트롤은 측정 된 신호를 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 모든 측정 버퍼에서 더욱 높은 소금 배경 아티팩트를 줄일 수 있습니다. 그러나 경우에, 유물의 크기가 단백질 신호에 비교이고, 그 유물의 단백질 관련 신호를 분리하는 것은 거의 불가능하다. 다행히도, 높은 유물 최적화 된 솔루션 교환 예외적이다. SSM 기반의 전기 생리학 실험의 성공적인 실현을위한 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 단백질 샘플의 준비는 가장 중요한 부분입니다. proteoliposomes를 사용하는 경우, 반드시 정찰titution 프로세스는 충분한 LPR의 깨끗하고 재생 가능한 샘플을 산출하고 수송이 올바른 방법으로 지향이다. 항체가 가능한 경우 LPR은 ELISA 실험에 의해 동결 골절 전자 현미경과 방향을 확인할 수 있습니다. 만 단백질 샘플을 배양 최적의 매개 변수를 보여줍니다 SSM을 사용합니다. 단백질의 주입은 또 다른 중요한 단계입니다. 초음파가 필수적이며, 기포 주입하는 동안 피해야한다. 기포 센서 칩에서 흡착 된 단백질 샘플을 제거하기 때문에 샘플 배양 한 후 측정 자체가 중요하다. 따라서 항상 솔루션을 변경 한 후 기포를 제거합니다. 그럼에도 불구하고 신호 런이 발생할 수 있습니다. 가능한 신호 런 문제를 해결하기 위해, 실험 기간 동안 런 컨트롤을 수행하는 것이 필수적입니다. 3. 특수 시스템 SSM-설정은 그 용도에 따라 변경 될 수 있습니다. 또한 t여기 완전히 다른, 고도로 전문화 된 설정입니다. 산도 기울기에 따라 예를 들어 비대칭 조건에서 단백질의 신호를 측정 할 수있는 가능성이 있습니다. 세 번째 해결책 내부와 proteoliposomes 외부 비대칭 버퍼 구성을 설정하려면, 휴식 솔루션 도입되어야하며이 두 Exchange 구성이 필요합니다. 여기에 비 활성화 및 휴식 솔루션 사이를 전환 추가로 세 방향 밸브가 필요합니다. 우리는 터미널 밸브를 부족하지만, 큐벳의 다른 유형을 사용하여 다른 흐름 경로를 개발 시스템의 시간 해상도를 증가시킵니다. 여기 활성화 및 비 활성화 솔루션의 접합 SSM 앞에 3mm, 큐벳 내부에 있습니다. 이 설정은 물론 빠른 전송 프로세스의 운동 분석에 적합합니다. 그것은 2 밀리 정도의 낮은 시간 해상도가 가능하다는 것을 보여 할 수 있습니다. 상업 Fully 자동화 시스템은 약물 검사에 대한 훨씬 더 높은 처리량을 목표로 사용할 수 있습니다. 이동식 장치 솔루션을 수집하고 표준의 microtiter 플레이트 형식의 96 - 웰 플레이트에서 센서 표면에 그들을 삽입합니다.

여기에서 우리는 electrogenic 막 단백질의 특성에 대한 확고한 지원 막 (SSM)에 따라 새로운 전기 생리학 방법을 보여줍니다. 고체 지지체는 유리 슬라이드, 센서 칩에 얇은 금 층으로 구성되어 있습니다. 친수성 금 표면 alcanethiol 시약의 티올 그룹을 바인딩하는 데 사용됩니다. 그 후, selfassembly 포스파티딜콜린의 monolyer의는 SSM의 형성이 완료됩니다. 막 단백질의 electrogenic 반응을 측정하기 proteoliposomes 또는 막 조각은 SSM (그림 1)에 흡착된다. 막과 SSM을 포함하는 단백질은 그 용량 성 결​​합 멤브레인 시스템을 형성한다. 따라서 단백질을 포함하는 막에 충전 전위는 SSM을 통해 용량 성 결​​합에 의해 감지 할 수 있습니다. 이 방법은 일시적으로 만 전류를 얻을 수 있습니다. 피크 전류는 고정 된 전송 작업을 나타냅니다. 시간에 따라 수송 잘라 내기rrents은 회로 분석에 의해 재구성 할 수 있습니다. 센서 칩은 큐벳 시스템 (그림 2)에 장착된다. 큐벳은 17 μL의 원통형 큐벳 볼륨이 (O-링과 그물 볼륨 마운트). 스프링 접촉 핀은 앰프 연락처를 만듭니다. 콘센트 커넥터는 주요 부분의 상단에 나사와 기준 전극, 염소화 실버 와이어를 전달합니다. 큐벳은 패러데이 케이지에 장착되어 있습니다. 그것은 빠른 솔루션 교환 (그림 3)에 대한 응답으로 막 단백질의 수송 활동을 유도하는 데 사용되는 유체 통로로 연결되어 있습니다. 단일 솔루션 교환 프로토콜 두 가지 솔루션을 하나의 비 활성화 한 활성화 솔루션이 필요합니다. 흐름은 인터페이스 박스에있는 컴퓨터 또는 수동 스위치를 밸브 제어 소프트웨어를 사용하여 압축 공기에 의해 제어됩니다.

<table><tbody><tr><td colspan = "4 ">Materials</td></tr><tr><td>Waterbath Sonicator</td><td>Bandelin</td><td>RK 52 H</td><td></td></tr><tr><td>Tip Sonicator</td><td>Hielscher Ultrasonics GmbH</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>2-way valve</td><td>NResearch, West Caldwell, USA</td><td>NR225T011</td><td></td></tr><tr><td>터미널 밸브</td><td>NResearch, West Caldwell, USA</td><td>NR225T031</td><td></td></tr><tr><td>압력계</td><td>Greisinger 일렉트로닉스</td><td>GDH 14 AN</td><td></td></tr><tr><td>패러데이 케이지</td><td>막스 플랑크 생물 물리학</td><td></td><td></td>연구소</tr><tr><td>큐벳</td><td>막스 플랑크 생물 물리학</td><td></td><td></td>연구소</tr><tr><td>100ml 용액 용기</td><td>Kartell</td><td>1623</td><td></td></tr><tr><td>O-링</td><td>Seal Science Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>Tektronix</td><td>TDS 1002</td><td></td></tr><tr><td>기준 전극</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>함수 생성기</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubings</td><td>SAINT-GOBAIN Performance Plastics</td><td>AAC00006</td><td></td></tr><tr><td>Sensor chip</td><td>Fraunhofer Institut f&#252; r Schicht und Oberfl&#228; chentechnik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인터페이스 박스</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Keithley</td><td>427</td><td></td></tr><tr><td>Manual cog</td><td>Vygon GmbH</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>USB 아날로그-디지털 컨버터</td><td>National Instruments</td><td>6009</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Regeants</td></tr><tr><td>1,2&#8209; Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids, Inc. (디피타노일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린</td><td>) Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>850356</tr><tr><td>아크릴아미드/비스-아크릴아미드</td><td>시그마 알드리치</td><td>A3574</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모</td>늄 <td>시그마 알드리치</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-글루코스 </td><td>시그마 알드리치</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨 </td><td>시그마 알드리치</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 앱솔루트</td><td>VWR AnalaR NORMAPUR</td><td>603-002-00-5</td><td></td></tr><tr><td>내츄럴 대장균 지질 극성 추출물</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>100600</td><td>LacY 재구성</td></tr><tr><td>n-Decane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D901</td><td></td></tr><tr><td>Octadecanethiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1858</td><td></td></tr><tr><td>Octadecylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74750</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Merck</td><td>1049360500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate 이염기성</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td><td>성 시그마 알드리치</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸에틸렌디아민</td><td>BIO RAD</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>&알파;-유당 일수화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>L8783</td><td></td></tr></tbody></table>

전기 생리학을 바탕으로 솔리드 지원 막 소개

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

우리가 존재하는 전기 생리학 방법은 금 코팅 된 센서 칩 위에 포스파티딜콜린 단일 층에 화학적으로 흡착 octadecanethiol 층으로 구성된 고체 지원 막 (SSM)을 기반으로합니다. 이 어셈블리는 기준 전극, 염소화 실버 와이어를 포함하는 큐벳 시스템으로 마운트됩니다. 막 조각 또는 관심의 막 단백질을 포함 proteoliposomes의 흡착 후 빠른 솔루션 교환은 막 단백질의 수송 활동을 유도하는 데 사용됩니다. 단일 솔루션 교환 프로토콜 두 가지 솔루션을 하나의 비 활성화 한 활성화 솔루션이 필요합니다. 흐름은 패러데이 케이지 내에서 가압 공기 밸브와 배관 시스템에 의해 제어됩니다. electrogenic 수송 활동의 속도론은 SSM과 proteoliposomes 또는 막 조각 사이의 용량 성 커플 링을 통해 얻을 수있다. 방법은, 그러므로, 오직 transien에게 얻을 수T 전류. 피크 전류는 고정 된 전송 작업을 나타냅니다. 시간에 따라 수송 전류는 회로 분석에 의해 재구성 할 수 있습니다. 이 방법은 특히 패치 클램프 또는 전압 클램프 방법으로 조사 할 수없는 세포 막에서 원핵 운송 또는 진핵 수송에 적합합니다.

지금까지, SSM 기반의 전기 생리학은 대부분 원핵 생물 유래의 20 개 이상의 운송, 예를 들면 MelB 3 NhaA 4 PUTP 5 (6 요약) 특성을 사용 하였다. 또한 세포 세포막에서 진핵 운송, 예를 들어 ClC7 7뿐만 아니라 이온 채널, 니코틴 아세틸 콜린 수용체 8 조사 된 예. 여기에서 우리는 5 9 LPR, 10시 레이스 지향의 아웃 85 % 이상 오른쪽으로 proteoliposomes를 사용하여 대장균에서 레이스 설탕 / H + cotransporter의 예 측정으로 제시한다. 우리는이 수송 단백질의 최소한의 운동 모델을 선도하는 주요 단계에 초점을 맞 춥니 다. 1. 야생형 레이스의 전기 생리학 특성 첫 번째 단계는 서로 다른의 pH 값을 측정하여 electrogenic 반응의 일반적인 특성이다 ( <strong<html> &gt; 그림 4), 기질 농도 (그림 5)와 기판. 기술의 유효성을 검사하려면, 문학에 주어진 K M과는 PK 값이 재현되었다. 레이스의 pH 의존성은 두 개의 서로 다른 electrogenic 반응을 보여줍니다. pH가 5와 pH를 8.5 사이뿐만 아니라, 용량 성 결​​합 전류가 증가는 그것의 모양을 변경합니다. 산성 산도에 대해서만 빠른 electrogenic 반응이 남아있는 값 중에 알칼리 조건 하에서 정상 상태 전송이 관찰된다. 우리는 운송업자 전류 (그림 6) 재구성 회로 분석을 사용 빠른 electrogenic 반응에서 정상 상태 신호를 구별합니다. pH가 7에서 monophasic 신호는 이상성됩니다. 또한이 두 가지 electrogenic 반응이 있다는 것을 나타냅니다. 전송 요금 (신호의 적분)로부터 추정, 두 반응은 약 6 % 및 전송주기의 총 electrogenicity의 94 %가있다. electrogenic 반응 ove_step &quot;&gt; 2. 지정 레이스의 반응주기의 특정 단계 두 electrogenic 반응을 지정하려면 E325A 레이스 변형 (그림 7)를 측정 하였다. 이 변종은 유당 교환을 보여 주지만 때문에 양성자 방출 억제의 모든 활성 전송 모드의 부족이다. 레이스 E325A의 신호는 빠른 과도을 대표하고 모든 측정의 pH 값에 대한 상수이다. 신호의 모양과 진폭은 산성 조건에서 레이스 야생형의 신호와 비슷합니다. 또한 우리는 용량 성 결​​합 시스템에서 측정 급속한 과도 전류에 대한 특징 감소 피크 전류, 후 작은 음의 위상을 관찰합니다. 유당 바인딩 및 릴리스 electrogenic 없기 때문에, 빠른 과도은 유당 바인딩을 다음 electrogenic 구조적 변화와 연관해야합니다. 그것은 양성자 방출 단계 속도 limiti 것으로 알려져있다유당 농도 구배 기반의 전송 모드에서 레이스 회전율 NG. 양성자 방출이 선호되기 때문에이 경우 우리는 알칼리성과 전송 속도의 증가를 기대하고 있습니다. 이것은 정상 상태 전송 레이스 야생형의 신호 상관 관계의 경우입니다. 또한 그것은 단지 내부 pH가 레이스의 정상 상태 전송 (게시되지 않은) 영향을 준다는 산도 기울기 측정하여 표시 할 수 있습니다. 따라서 큰 electrogenic 반응은 양성자 방출 단계에 할당 할 수 있습니다. 3. 운동 분석을위한 측정 전송 속도 켜고 electrogenic 반응의 확인 후 약 4.5 밀리의 높은 시간 해상도와 SSM 설치 프로그램을 사용하여 결정 하였다. 한 반응 신호를 지배 할 때,이 조건에서만 가능하다. 이 경우 속도 상수는 반복적 최소 자승 드를 사용하여 신호의 시간 해상도를 고려 과도 전류로부터 유도 될 수있다<html> 컨볼 루션 알고리즘 (그림 8). 결정 속도 상수뿐만 아니라 제안 최소한의 운동 모델 (그림 9) 마지막으로 수송 동역학의 시뮬레이션에 사용 하였다. 시뮬레이션 곡선은 또한 운동 모델을 증명 SSM 데이터를 재현. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1highres.jpg"/> 그림 1. SSM에 proteoliposomes의 흡착 형상. SSM은 센서 칩, 구조화 된 금 코팅 유리 슬라이드에 형성된다. 막 단백질의 electrogenic 반응을 측정하기 proteoliposomes 또는 막 조각은 SSM에 흡착되어 있습니다. 두 막은 용량 성 결​​합 시스템을 형성한다. 일시적으로 만 전류가 감지되는 이유입니다. tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg &quot;/&gt; 그림 2. SSM 큐벳은 센서 칩과 레퍼런스 전극을 수행합니다. 센서 칩은 큐벳베이스와 큐벳 머리 사이에 끼워 넣으면됩니다. 기준 전극은 폴리 아크릴 아마이드 젤 소금 교량 흐름 경로에서 격리됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3.jpg" alt="그림 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3highres.jpg"/> 그림 3. SSM 설치 프로그램의 유체 통로 및 전기 회로. 단일 솔루션 교환 프로토콜에 하나의 비 활성화 (NA)와 하나의 활성화 (A) 솔루션이 필요합니다. 흐름은 두 개의 2 웨이 밸브 (V1)와 하나의 터미널 밸브 (V2)에 의해 제어됩니다. 비 활성화 및 활성화 솔루션과 터미널 밸브 스위치, 큐벳과 폐기물 용기 (W)에 다른 솔루션 솔루션 중 하나를 연출. 센서 칩 (SSM)는 증폭기 (I / U)에 연결되어<html> 기준 전극 (AgCl을)은 외부 전기 회로에서 함수 발생기 (F)에 연결되어있는 동안. 컴퓨터 (PC)와 인터페이스 박스는 밸브 작동 및 데이터 수집에 사용됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4.jpg" alt="그림 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4highres.jpg"/> 그림 4. 활성 솔루션은 100 MM의 유당을 포함하는 동안 다른 산도 값이 100 밀리미터 유당 농도 점프 후 야생형 레이스 proteoliposomes로 측정 과도 전류. 비 활성화 솔루션은 100 mM의 포도당이 포함되어 있습니다. 모든 솔루션은 1 ㎜의 DTT로 지정된 pH에서 100 MM의 칼륨 인산 버퍼에 준비되었다. 이있는 측정 조건에 대한 자세한 내용은 다음과 같은 그림 9와 10을 참조하십시오. <html> ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg &quot;/&gt; 그림 5. 평균 정규화 된 피크 전류는 서로 다른 농도의 pH 값에서 유당 농도 점프 후 야생형 레이스 proteoliposomes로 측정. K M 값은 하이퍼 볼릭 맞는로부터 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6.jpg" alt="그림 6" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6highres.jpg"/> 그림 6. 수송 전류의 재건. 과도 전류 (A) 수송 전류 (B)를 재구성하는 데 산도 8.5 (청색 트레이스)와 pH를 5.2 (적색 트레이스) 100 MM의 유당 농도 점프 후 야생형 레이스 proteoliposomes로 측정 하였다. pH가 5.2에서 빠른 electrogenic 반응이 발생하면서 pH에서 8.5 연속 매출이 관찰된다. 이것은 명확하게 복원 된 현재의 (B)에서 관찰된다. files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg &quot;고도 =&quot;그림 7 &quot;FO : 콘텐츠 너비 =&quot;4 인치 &quot;FO : SRC =&quot;/ files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg &quot;/&gt; 그림 7. 과도 전류는 pH가 5.2에서 100 mM의 유당 농도 점프 후 E325A 레이스 proteoliposomes로 측정 하였다.이 모양의 변형은 전송주기의 양성자 방출 단계에서 억제하기 때문에 전송 부족합니다. 관찰 작은 음의 구성 요소는 용량 성 결​​합 시스템에서 측정 급속한 과도 전류에 대한 특성과 빠른 electrogenic 반응 후 막 용량의 방전에 의해 발생합니다. 그 시간 상수 π0은 시스템 (그림 1)의 커패시턴스와 컨덕턴스에 의해 결정됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8.jpg" alt="그림 8" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8highres.jpg"/> 그림 8. 야생형 레이스 proteoliposomes로 측정 과도 전류는 afte를pH가 5.2에서 R 다른 유당 농도 이동합니다.이 조건없이 정상 상태 전송이 관찰하지만, 유당시 electrogenic 구조적 전환 바인딩입니다. 점선은 시스템의 시간 해상도를 나타내는 전달 함수를 보여줍니다. 삽입은 데이터 과장 적합은 관찰 속도 상수 kobs에서 속도 상수에 오프의 결정을 보여줍니다. 관찰 된 속도 상수는 반복적 최소 자승 디컨 볼 루션 알고리즘 10과 과도 전류로부터 결정 하였다. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9.jpg" alt="그림 9" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9highres.jpg"/> 그림 9. 레이스. 두 electrogenic 단계의 반응주기 운동 모델을 식별 SSM 측정을 특징으로 할 수있다. 반응에서 총 책임 변위 ~ 94 %를 나타내는 강하게 electrogenic 반응주기는 중성과 기본의 pH 값에서 관찰된다. 그것은 양성자 방출 단계 (파란색 화살표)에 할당 할 수 있습니다. 야생형 레이스 지속적으로 매출이 억제 될 때 약하게 electrogenic 단계는 산성 pH에서 관찰된다. 우리는 반응주기의 총 책임 변위의 6 %를 나타냅니다 유당 바인딩시 electrogenic 구조적 전환이 반응으로 지정되어 있습니다.

여기에서 우리는 electrogenic 막 수송의 특성에 대한 응용 프로그램에 초점을 맞춘 견고한 지원 세포막에 따라 전기 생리학 방법을 제시한다.

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

지지 막 기반 전기생리학(supported membrane based electrophysiology, 약칭 SSM 기반 전기생리학)은 새로운 전기생리학적 접근 방식입니다. 이는 여러 응용 분야에서 기존 방식에 비해 상당한 개선을 제공합니다.전통적인 전기생리학의 주요 도구는 전해질이 충전된 미세입자 전극인 반면, SSM 기반 전기생리학은 고체 지지 막 전극을 통해 전하 전이를 검출합니다. 이는 박테리아 수송체와 같이 몇 가지 드문 예외를 제외하고는 전압 클램프(voltage clamp)나 패치 클램프(patch clamp) 방법으로 조사할 수 없어 전통적인 전기생리학을 사용할 수 없는 경우에 매우 유용합니다. 이러한 사례에서 SSM 기반 전기생리학은 매우 성공적인 것으로 입증되었습니다.또한 세포 내 막에 존재하는 생리학적으로 유의미한 진핵생물 수송체를 조사하는 데에도 활용될 수 있습니다. SSM 기반 전기생리학 실험을 수행하는 방법은 다양합니다. 기초 연구에서는 kinetic 파라미터를 결정하고 수송 메커니즘을 규명하는 데 적용될 수 있으며, 그 견고함과 자동화 가능성 덕분에 타겟 발굴을 위한 스크리닝 응용 분야에 매우 이상적입니다.SSM 전극은 하단의 SSM과 표적 수송 단백질을 포함하는 프로테아좀 또는 막 단편으로 구성된 복합 막 시스템을 탑재합니다. 복합 막의 전기적 특성은 막들이 정전 용량 결합 시스템을 형성하는 등가 회로로 설명할 수 있습니다. 시스템의 전기적 거동은 막 단편을 사용하든 프로테아 리포좀을 사용하든 기본적으로 동일하다는 점에 유의하십시오.수송 단백질의 전하 변위는 방광 막의 정전 용량을 통해 측정 회로로 전달됩니다. 이는 정전 용량 결합(capacitive coupling)이라 불리는 검출 원리입니다. 전형적인 실험에서, VSSM의 신속한 용액 교환은 수송 단백질 V에 기질을 제공하며, 이에 따라 발생하는 단백질의 전기 발생적 수송 활성이 전류를 생성하고, 이 전류는 SSM 정전 용량을 통해 측정 시스템에 결합됩니다.동시에, 전기발생 단백질 활성으로 인해 리포좀 막이 점차 충전되어 수송 단백질이 억제되고 기록 회로의 전류가 감소하게 됩니다. 측정된 전류는 Enzo에 흡착된 수백만 개의 단백질 리포좀에서 동시에 일어나는 수송 반응의 결과이며, 각 리포좀에는 약 100개의 수송체가 포함되어 있습니다. 실험 장치는 용액 경로가 포함된 패러데이 케이지, 밸브 제어 및 신호 증폭을 위한 외부 회로, 그리고 데이터 수집 및 분석 시스템으로 구성됩니다.EC 케이지는 용액 흐름 제어에 필요한 용기, 밸브 및 튜브와 XOR 칩이 장착된 큐비트로 구성됩니다. XOR 칩에는 SSM 전극과 흡수된 prot 리포좀이 포함되어 있습니다. vete는 외부 전기 회로의 증폭기 및 함수 발생기에 연결됩니다.SSM 측정, wreak fire, 두 가지 용액, 즉 기질이 포함된 활성화 용액과 기질이 없는 비활성화 용액이 사용됩니다. 단일 교환 구성에서 두 용액은 동일한 조성을 갖습니다. 두 개의 2방향 밸브가 비활성화 용액과 활성화 용액의 흐름을 제어합니다.기계적으로 결합된 3x3 3방향 밸브인 터미널 밸브는 비활성 용액과 활성 용액 사이의 전환에 사용되며, 한쪽 용액은 폐기물 용기로, 다른 쪽 용액은 qve로 유도합니다. 터미널 밸브를 전환하면 비활성 용액의 흐름은 폐기물 쪽으로 재지정되고 활성 용액은 qve로 흐르게 됩니다. 이러한 구성은 두 용액의 동시 연속 흐름을 가능하게 합니다.유동 프로토콜 진행 중 언제든지 필요에 따라 유동 경로를 최적화할 수 있습니다. 하지만 SSM과 비활성화 용액 및 활성화 용액의 접합부 사이의 거리를 최대한 짧게 유지해야 한다는 점에 유의하십시오. 이 거리가 용액 교환의 타이머 솔루션을 결정하기 때문입니다.파워 덱 케이지 외부에 위치한 전류 증폭기는 센서 칩에 연결되어 있습니다. 일반적으로 증폭도는 10⁸에서 10⁹ V/A로 설정하며, 휴지 시간은 1에서 10 ms로 설정합니다. 함수 발생기는 참조 전극에 연결되며, 밸브 제어 및 데이터 수집 소프트웨어가 설치된 컴퓨터와 인터페이스 박스가 시스템을 구성합니다.인터페이스 박스에는 밸브 드라이버 데이터 수집 및 디지털 출력 하드웨어가 포함되어 있으며, 용액 흐름은 0.22 bar의 가압 공기로 유지됩니다. 압력은 디지털 압력계를 사용하여 모니터링합니다. 이는 공기 공급원과 EC 케이지 내의 용액 용기 사이에 설치된 스틸 컨테이너를 니들 밸브를 통해 채워 유지할 수 있습니다.CVIC는 네 가지 부분으로 구성됩니다. zen 칩은 vet 베이스와 vet 헤드 사이에 끼워져 있습니다. 원통형 배출 커넥터가 vet 헤드에 나사로 고정되어 있으며, 여기에는 기준 전극 어셈블리가 장착됩니다.기준 전극은 소형 SMC 커넥터가 달린 염화은선으로 구성되며, 폴리아크릴 겔 염다리에 의해 유로와 격리되어 있습니다. 사용하지 않을 때 겔 다리 어셈블리는 100 millimolar 염화칼륨이 포함된 100 millimolar 인산칼륨 pH 7 용액에 보관합니다. 먼저, 기준 전극을 겔 다리가 포함된 기준 전극 어셈블리에 장착해야 합니다.기준 전극을 설치할 때 공기 방울이 생기지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이제 이 전극 부분을 완충 용액이 미리 채워진 배출 커넥터에 연결합니다. 모든 연결 부위는 O-링으로 밀봉해야 합니다.이 SM은 구조화된 염소 코팅 유리에 제작된 zor 칩 위에 형성됩니다. 이 시맨틱 도로는 직경 1mm이며, 0.2mm 폭의 화이트 컨택 스트립을 통해 컨택 패드에 연결됩니다. 스프링 컨택 핀이 앰프와 접점을 형성합니다.zen 칩은 10 LAR Okta Deccan 티올 에탄올 용액 내의 암소에 보관합니다. 흡수되지 않은 Okta deccan 바이러스 분자를 제거하여 arcane thi 층을 유지하기 위해, 전극을 순수 에탄올로 헹구고 질소 가스로 건조합니다. 이제 포스포콜린 단분자층을 조립할 수 있습니다.지질 용액은 15 mg/mL의 DFI choline와 250 µg/mL의 Okta two A mine in decay를 포함하며, -20 °C에서 보관합니다. 이제 전극을 SA cubit의 바닥면에 정확하게 배치합니다.용액 1 µL를 금 층에 닿지 않게 SSM 전극에 첨가합니다. 지질 용액을 첨가한 직후 vete를 조립할 수 있습니다. O 링으로 밀폐된 vete 부피는 장착 시 내부 부피가 17 µL인 원통형입니다.SSM은 입구 보어 아래에 중앙 정렬되어야 합니다. 벳을 연결하기 전에 유체 시스템을 100 millimolar 인산칼륨 완충액으로 미리 채워야 합니다. 튜빙과 밸브 내에 기포가 없는지 확인하는 것이 중요합니다.이제 벳(vet)을 갑상선 데이 케이지(thyroid day cage)에 장착하고, 앰플리파이어, 용액 흐름 경로의 입구와 출구, 그리고 함수 발생기를 연결할 수 있습니다. 마지막으로, 큐비트(cubit)를 100 millimeter 인산칼륨 완충액으로 헹굽니다. 이렇게 하면 SSM이 자연적으로 형성되어 SSM의 품질을 확인할 수 있습니다.정전용량과 전도도는 함수 발생기를 사용하여 측정하며, 전도도 측정을 위해 100 millivolt DC 전압을 사용합니다. 전류 감쇠는 정전용량이 완전히 충전된 후 막 정전용량의 충전 상태를 보여줍니다. 측정된 전류는 M'S 법칙을 통해 막 전도도를 산출합니다.여기서 0.17 nS의 전도도를 관찰할 수 있습니다. 정전용량은 피크-투-피크 진폭이 50 mV인 삼각형 AC 전압과 0.5 Hz의 주파수를 사용하여 측정할 수 있습니다. 결과로 나타나는 사각파 전류의 진폭은 커패시터의 누설 전류를 나타냅니다.정전용량은 전이된 전하량을 인가된 전압으로 나눈 값과 같습니다. 이 막은 2.3 nF의 정전용량을 보입니다. 높은 전도도와 낮은 정전용량은 SSM이 올바르게 형성되지 않았음을 나타냅니다. 이러한 경우, 해당 막은 폐기하고 새로운 전극 칩을 사용하여 다른 SSM을 준비해야 합니다.일반적으로 단백질 리포좀은 -80°C에서 냉동 보관합니다. 균질한 단백질 리포좀 현탁액을 얻기 위해 샘플을 얼음 위에서 해동한 후 초음파 처리(sonication)를 하는 것이 필수적인데, 이는 응집된 샘플이 SSM을 통해 빛을 과도하게 흡수하기 때문입니다. 10초 동안의 초음파 처리 사이클을 3회 반복하며, 각 사이클 사이에는 얼음 위에서 10초간의 냉각 간격을 둡니다.비활성 용액으로 SSM을 헹굽니다. 그런 다음 기준 전극 시료와 함께 배출구 커넥터를 풉니다. 피펫을 사용하여 단백질 시료 30 µL를 vete의 배출구를 통해 ette 부피 내부로 주입합니다.먼저 피펫 팁을 배출구 보어에 장착하십시오. 그런 다음 비활성화 경로에서 위의 매뉴얼을 열고 protea 리포좀을 주입하십시오. 이후 피펫 팁을 제거하십시오.더 이상의 용액 흐름을 방지하기 위해 위의 수동 밸브를 잠급니다. 프로테아 리포좀이 SSM에 흡수되도록 1~2시간 동안 배양합니다. 밸브 제어 및 데이터 수집 소프트웨어의 flow protocol 창을 사용하여 흐름 프로토콜을 설정하십시오.기질 특이성, KM 값 또는 pH 의존성 결정과 같이 대칭적 조건에서 측정하려는 경우, 단일 용액 교환 프로토콜을 선택하십시오. 각 용액의 흐름 지속 시간을 0.5초에서 1초로 설정하십시오. 전류는 전체 흐름 프로토콜 동안 계속 기록됩니다.증폭도는 통상적으로 10의 9제곱으로 설정하며, 샘플링 속도는 초당 2000개 데이터 포인트로 선택합니다. 마지막으로, 새 프로토콜을 NA a a라는 제목으로 저장하십시오. 플로우 프로토콜 창의 두 번째 탭에서는 큐비트를 통한 비활성 또는 활성 용액의 흐름을 제어하기 위해 특정 밸브의 개폐 상태를 정의할 수 있습니다.여기에서 우리는 E. coli 유래의 당-양성자 공수송체(sugar proton symporter)인 LacY의 프로테오리포솜(proteoliposomes) 측정 방법을 시연합니다. 활성화 용액에는 수송 대상 기질인 lactose가 포함되어 있으며, 비활성화 용액에는 보정 화합물로서 수송되지 않는 동일한 양의 glucose가 포함되어 있습니다. 당 외에도, 용액에는 pH 7.6의 100 mM potassium phosphate와 1 mM DTT가 포함되어 있습니다.용액을 교체한 후, 수동 밸브를 사용하여 기포가 완전히 제거되었는지 확인하십시오. 유량 프로토콜을 시작하기 전, 측정 직전에 압력을 조절하십시오. 당사는 통상적으로 0.6 bar의 압력을 사용하며, 이는 당사의 특정 밸브 및 튜브 구성에서 초당 약 1밀리리터의 유량을 생성합니다.그다음 여기서 안전 유량 프로토콜인 NAA 프로토콜을 선택하고, 시작 버튼을 눌러 각 측정을 시작합니다. 처음 몇 번의 측정 동안에는 느슨하게 흡착된 프로테아 리포좀이 제거되므로 피크 전류가 감소할 수 있습니다. 피크 전류가 일정하게 유지될 때까지 측정을 반복하십시오.비활성화 용액이 흐르는 첫 번째 단계에서는 전류가 0입니다. 락토스가 포함된 활성화 용액으로 교체하면 막의 전기발생적 수송 활동이 유도됩니다. 단백질의 양전하가 프로테오리포좀 내부에 축적되며, 증폭기는 SSM을 통한 양성 결합으로 인해 발생하는 양의 일시적 전류를 검출합니다.이 양의 정전위 결합 전류는 활성 용액으로부터의 V 교환 온(on) 신호라고 불립니다. 비활성 용액으로 다시 돌아가면 리포좀 외부로의 양성자 당-코드 수송이 유도됩니다. 이 경우, 단백질 동역학 분석을 위한 소위 오프(off) 신호인 음의 정전위 결합 전류가 나타납니다.멤브레인 밸브의 전하 상태 전환으로 인해 off 신호는 정의가 불분명하며 기계적 및 전기적 아티팩트가 생성되므로, on 신호만 사용합니다. 다행히 이러한 아티팩트는 단백질 유도 신호가 관찰되기 전의 시간 범위로 제한됩니다. 밸브 전환 아티팩트와 운반체 신호 사이의 50 milliseconds 지연 시간은 용액이 말단 밸브에서 SSM Rapid Solution Exchange 표면까지 전달되는 데 필요한 시간임을 유의하십시오. SSM에서 수행된 것과 같은 실험은 전형적인 완화 실험을 나타냅니다.이러한 실험에서 전류는 시간 의존적인 전정상 상태(pre steady state) 단계를 거쳐 일정한 정상 상태(steady state)로 완화됩니다. 반응 주기의 전류 역학적 세부 사항은 전정상 상태 전류의 형태와 크기에서 도출될 수 있습니다. 반면, 정상 상태 전류는 막 단백질의 지속적인 회전(turnover)에 대한 정보를 제공합니다.프로테아 리포좀이 SSM에 흡착된 ly 결합 시스템에서, 전정상상태(pre steady state) 전류는 거의 변하지 않습니다. 리포좀의 충전으로 인해 일정한 정상상태 전류는 얻어지지 않으며, 대신 측정된 전류가 점진적으로 감소합니다. 수송체 전류는 회로 분석을 통해 측정된 ly 결합 전류로부터 계산할 수 있습니다.여기서 우리는 pH 8.5에서 7.6 범위의 sugar proton co-transporter인 like Y를 사용한 대표적인 결과를 보여줍니다. 수송체 전류는 반응 주기의 후반부에 일어나는 전기생성적 반응에 의해 지배됩니다. 이러한 조건 하에서, 정상 상태 이전 단계(pre steady state phase)는 정상 상태 값으로 단순하게 상승하는 전류 흐름으로 구성됩니다.이후 이는 정전 결합으로 인해 감쇠됩니다. 우리가 관심을 갖는 것은 정상 상태의 수송 전류입니다. 막 전위가 없는 경우, 이는 피크 전류로 상당히 정확하게 나타낼 수 있습니다.따라서 다양한 기질 농도에 따른 피크 전류를 플로팅하여 Ali Mein 역학을 분석할 수 있지만, 피크 전류 진폭은 단일 실험 내의 단일 센서에서 얻은 경우에만 엄격하게 비교할 수 있다는 점을 고려하십시오. 그 이유 중 하나는 흡수 효율의 가변성 때문입니다. pH를 더 낮추면 단상 신호가 이상 신호로 변합니다.마지막으로, 수송 결핍 lag Y 돌연변이체에서는 빠른 과도 응답(rapid transient)이 유지됩니다. 이 빠른 과도 응답 뒤에는 작고 더 느린 음의 성분이 뒤따릅니다. 이러한 음의 성분은 ly 결합 시스템에서 측정된 빠른 과도 전류의 특징이며, 막 커패시턴스 방전으로 인해 발생합니다.여기서 피크 전류는 정상 상태 수송을 나타내는 것이 아니라, 이온 사이클 초기의 전이 단계에 대한 전기발생적 확인을 나타냅니다. 이는 y 변이체에서 정상 상태 수송이 나타나지 않고, 야생형 lag y의 경우 낮은 pH에서 정상 상태 수송이 억제되기 때문에 분명해집니다. 실험적 증거는 반응 사이클 내 전하 전이에 대한 기전적 해석을 제공하며, 이는 키네틱 모델에 표시되어 있습니다. 수송 결핍 변이체에서 관찰되거나 산성 조건의 야생형 lag Y에서 나타나는 빠른 과도 응답은 락토스 결합 이후의 신속하고 약한 전기발생 반응 때문이며, 더 높은 pH 값에서는 반응 사이클 후반의 주요 전기발생 반응이 신호를 지배합니다. 이 반응은 정전용량 결합 시스템에서의 유사 세포질 양성자 방출을 나타내는 것으로 제안되었습니다.이는 강한 전압 클램프 상호작용으로 인해 Lag y의 정상 상태 수송을 나타내는 과도 전류를 유발합니다. SSM의 경우, 성분이 서로 다른 용액을 교체할 때 전기적 아티팩트가 발생합니다. 비활성 용액과 활성 용액이 특히 pH와 이온 강도 측면에서 최대한 유사하도록 확인하십시오.기질 또한 아티팩트를 생성할 수 있으므로 대조군 실험을 수행해야 합니다. 단백질 샘플을 추가하기 전에 반드시 아무것도 코팅되지 않은 SSM을 사용하여 특정 버퍼 시스템과 흐름 프로토콜의 아티팩트 여부를 테스트하십시오. 단백질 샘플을 추가한 후에는 기질과 구조적으로 유사하지만 기질이 아닌 용액을 사용하여 대조군 측정을 수행할 수 있습니다.또한, 목적 단백질이 없는 리포좀이나 막 단편을 사용하여 기질의 아티팩트를 테스트할 수 있습니다. 용액에 억제제를 추가하거나 피펫으로 분주할 수도 있습니다. 실험 후 수송체 신호 억제를 측정하기 위해 vete의 출구에 직접 투입하면, 단백질 특이적 신호는 사라지고 용액 교환 아티팩트만 남게 됩니다.이후 단백질 신호를 쉽게 보정할 수 있습니다. 흡착된 단백질의 손실, 리포좀 또는 단백질 분해가 측정값에 영향을 주지 않도록 주의하십시오. 동일한 조건에서 대조군 측정을 반복하여, 최대 20%까지의 신호 감소(rundown)는 허용 가능하며, 이러한 감소가 시간에 따라 선형적으로 나타난다고 가정하여 보정할 수 있습니다.이 설정은 저희 연구실에서 20년간 진행한 기술 개발의 결과물입니다. 또한, 키네틱 분석을 위한 더 정밀한 타이머 솔루션과 고가의 기질 소모량을 줄인 특수 시스템도 이용 가능합니다. 약물 스크리닝을 위해서는 처리량이 더 높은 완전 자동화 설정을 사용합니다.현재까지 이 방법을 통해 20개 이상의 수송체가 특성화되었습니다. 여기에는 수송 APA, 호흡 연쇄 복합체, 냉각 수송체, 교환체, 그리고 철 채널까지 포함됩니다. 따라서 표준 전기생리학적 방법으로 문제를 해결할 수 없는 경우, 대신 SS Mase 전기생리학법을 사용하는 것을 고려하십시오.

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