Name: Kupffer의 소포의 유전자 기능 및 속눈썹 생성 된 유체 흐름의 시각화 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 학습하세요 제브라피시 Kupffer's Vesicle에서 형광 비드를 이용한 유전자 기능 조절 및 비대칭 유체 흐름 분석 방법을. 이 기술은 좌우 패턴형성 연구에 필수적입니다.

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우리는 우수한 연구소 지원과 zebrafish 관리에 대한 피오나 폴리 감사드립니다. 이 작품은 GW에 AHA predoctoral 휄로 십 (11PRE5730027)와 HJY (R01HL66292)과 JDA (R01HL095690)에 NHLBI 보조금을 지원했다.

스테이지 별 Zebrafish의 배아 주사의 개요 대상 mRNA에 바인딩하고 증명서의 단백질 표현을 방해 안티센스 morpholino의 oligonucleotides (MO)는, 널리 연구 zebrafish 13,14에서 (손실) 함수 유전자 최저에 사용됩니다. 유전자 도구, LLC는 형광 현미경을 사용하여 주입 배아에 MO를 감지 할 수 carboxyfluorescein (녹색 형광을 방출) 또는 lissamine (적색 형광을 방출) 또는 태그가 수법의 살인을 제공합니다. zebrafish 개발의 여러 단계에서 난황 세포에 MO를 주입함으로써, 배아의 특정 구획 (그림 1A-F)에 MO를 제공 할 수 있습니다. MO는 1-4 세포 단계 (0-1 hpf) 32 셀 단계 15 세계 최저를 촉진하기까지 계속 노른자와 연결을 통해 모든 배아 세포를 (그림 1A, D, D &#39;) 입력 사이의 난황에 주입. MO는 midblast 동안 노른자에 주입울라 단계 (2.5-3 hpf)는 특별히 DFC / KV 세포 계보 (Lineage) 12의 다른 대부분의 배아 세포 lineages를 입력하지 않고 세포질 다리 8 최저 유전자 기능을 통해 가능성이 DFCs (인물 1B, E, E &#39;)의 progenitors을 입력 할 수 있습니다 . 유전자 기능이 DFC / KV 나 또한 난황 12,16 할 필요가 있는지 여부를 테스트하는 중요한 관리로서 한 후 돔 - 30 % epiboly 단계 (~ 4.5 hpf) 사이에 주입하여 난황 세포에 MO를 제한하는 것도 가능합니다 모든 세포질 다리 (그림 1C, F, F &#39;) 마감했습니다. 이 주사는 DFC / KV 세포 17-24에서 유전자 기능을 분석하기 위해 함께 사용되었습니다. KV의 유체 유동을 평가하기 위해, 형광등 microbeads은 6-10 체절 단계 (12-14 hpf) 후 즉시 videomicroscopy을 (도 1G-J)를 사용하여 이미징. 사이의 KV 내강에 주입 아르 Microbeads 빨간색 또는 녹색 형광 (또는 둘 다)를 방출이 가능합니다, 그래서 다른을 사용할 수 있습니다이미지 형광 microbeads와 MO에 채널. 1. Morpholinos의 스테이지 별 사출 (MO) zebrafish의 배아에 MO의 주입은 이전에 25,26 입증되었습니다. 여기 우리가 곧 무대 특정 MO 주사에 대해 설명합니다. 모든 주사 후, 배아는 배양 접시에 전송하고 28.5에서 incubated ° C. <ol><li> 글로벌 MO 주입 : 즉시 수정을 한 후 배아를 수집하고 주입 판으로로드합니다. 모세관 바늘에 형광 MO를로드하고 (예를 들면 하버드 장치 PLI-90 피코 주사기) microinjector에 바늘을 탑재합니다. 바늘 팁을 깨고 25,26 설명 제 1 NL의 볼륨이 분사 드롭을 만드는 사출 설정 (압력 및 / 또는 시간) 조정합니다. 해부 stereomicroscope를 사용하여 (그림 1A) 난황에 MO의 1 NL를 삽입 실험 당 ≥ 50 배아의. 4 셀 사슴으로 주사를 완료하는 데 신속하게 작업5. </li><li> DFC 타겟팅 MO 분사 : 28.5에서 바로 수정을 한 후 배아를 수집하여 배양 ° C. 배아는 256 세포 단계 (~ 2.5 hpf)에 도달했을 때, 빠르게 분사 판으로를로드 한 다음 (그림 256 전지 및 1,000 세포 단계 사이 ≥ 100 배아의 난황에 형광 MO의 1 NL를 삽입 1B). </li><li> 난황 타겟팅 MO 분사 : 28.5에서 바로 수정을하고 배양 한 후 배아를 수집 ° C. 돔 단계 (~ 4 hpf)에서 분사 판으로 배아를로드 한 후 돔과 30 % epiboly 단계 (그림 1C) 사이 ≥ 100 배아의 난황에 형광 MO의 1 NL를 삽입. </li></ol> 2. 분석을위한 양념을 넣은 태아를 선택 <ol><li> MO는 배아는 (8 hpf) 75%-epiboly 단계에 도달 주입하면 형광 MO의 배포 용 형광 해부 현미경 unfertilized와 죽은 태아를 제거하고 화면 생활 배아. 그런 다음여w는 배아는 28.5에서 개발 선택한 ° C. <ol><li> 글로벌 MO 주사를 들어, 골고루 모든 배아 세포 (; 그림 2A 그림 1D)를 통해에 형광 배포 한 배아를 선택합니다. </li><li> DFC 타겟팅 MO 주사를 들어, 형광 MO는 난황에 걸쳐 확산하고 등쪽의 배반 엽 마진 (DFCs) (, 그림 2B 그림 1E)에 집중 표시되는 배아를 선택합니다. 이 단계에서는 기본 난황에서 밝은 형광에 의한 형광 DFCs을 시각화하기 어려울 수 있습니다. 형광 MO는 DFCs 이외의 배아 세포에 통합하거나 남아있는 분사 사이트 (그림 2D)에서 집계 한있는 배아를 제외 조심해. </li><li> 난황 타겟팅 MO 주사를 들어, MO 형광이 고르게 난황 전체에 분산하고 배아 세포 (; 그림 2C 그림 1 층)에서 관찰되지 않은 배아를 선택합니다. 다시 말하지만, 형광 MO가 남아있는 배아를 제거사출 사이트에서 집계됩니다. </li></ol></li><li> 2-4-체절 ​​단계 (~ 11 hpf) 사이, 화면이 배아 높은 배율을 사용하여 형광 현미경으로 두 번째 시간입니다. 그런 다음 선택한 배아는 28.5에서 개발 할 수 있습니다 ° C. <ol><li> 글로벌 MO 주사를 들어, 선택된 배아는 MO 형광가 균등하게 KV 모든 배아 세포 (; 그림 2E 그림 1D &#39;)에 배포되어 있는지 확인합니다. </li><li> DFC 타겟팅 MO 주사를 들어, 신중하게 MO의 만 KV 세포에서 형광과 난황 (그림 1E &#39;을)이 배아를 선택합니다. 27 MO가 성공적으로 KV 세포 (그림 2F)로 전달되었습니다 된 배아의 식별에 도움이 수 있습니다 : 예 TG와 같은 KV 세포에 명시 GFP는 (d2EGFP Dusp6)는 유전자 변형 배아. KV 셀 다른 배아 세포에서 MO 형광이있는 배아를 폐기하십시오. </li><li> 난황 타겟팅 MO 주사를 들어, 난황 (그림 1 층 &#39;에 독점적으로 MO의 형광이 배아를 선택합니다 : 그림2G). </li></ol></li></ol> 3. KV에서 유체 흐름을 분석 할 마운트 태아 <ol><li> 글로벌 MO의 KV에 비대칭 유체 흐름을 분석하기 위해, MO 또는 난황 타겟팅 MO 주입 배아를 DFC는 타겟팅 신중하게 dechorionate ~ 날카로운 집게와 4-6 체절 단계 (~ 11-12 hpf) 사이 20 배아. </li><li> 42의 건조한 목욕탕에서 액체로 유지되어야하는 5 ML 튜브 ° C.에 1% 낮은 녹는 점 아가로 오스와 나누어지는 50 ML 준비 </li><li> 유리 우울증 슬라이드 (미국 과학 용품, 주식회사) 하나의 배아를 전송하고 가능한 한 물을 많이를 제거합니다. 단지 (너무 많은 아가로 오스는 이후 영상을 방해 할 수 있습니다) 배아를 커버하기에 충분한 따뜻한 1% 낮은 녹는 점 아가로 오스를 추가하여 배아를 고정. 아가로 오스는 굳은으로, 이러한 배아를 위치 시키도록 포셉을 사용하는 KV는 (그림 1H) (등쪽보기)를 향하고 있습니다.에게 슬라이드 당 하나의 배아로 10 배아를 탑재합니다. 다음 단계의 모든 주사는 compl을 보장하기 위해 신속하게 작업10 체절 단계 (14 hpf)에 의해 eted. </li></ol> 4. KV에 형광 Microbeads의 주입 <ol><li> 1.5 ML Eppendorf 튜브에 멸균 물에 1시 50분에 Multifuorescent 0.5 미크론 직경 마이크로을 (Polysciences 주식회사) Fluoresbrite 희석. </li><li> 튜브를 클릭하여 철저하게 microbeads의 1시 50분 희석을 섞어서 모세관 바늘로 3 μl를로드합니다. MO 주사 (예를 들면 하버드 장치 PLI-90 피코 주사기)에 사용 된 것과 같은 microinjector를 사용하여 집게로 바늘 끝을 해제하고 가장 작은 가능한 (&lt;0.5 NL) 주입 드롭을 생성하기 위해 분사 설정을 조정합니다. </li><li> 해부 현미경의 첫 번째 장착 된 배아의 KV의 루멘으로 바늘을 맞 춥니 다. 루멘에 바늘을 넣고 구슬의 작은 볼륨 (&lt;0.5 NL) (그림 1G)를 주입. 작은 바늘 끝과 작은 사출 볼륨이 손상 KV를 방지하는 것이 중요합니다. </li><li> 모든 마운트 된 배아를 삽입. 난자는 injecte되면D, 멸균 물 한 방울은 이미 건조하지 않도록 아가로 오스의 상단에 추가 할 수 있습니다. 주사의 과정 동안, 구슬은 종종 바늘 구멍을 방해합니다. 이 바늘 끝을 다시 깨고 microinjection 장치의 변조 압력 또는 시간 설정에 의해 주입 볼륨을 조정해야합니다. 이 분사 동안 상당한 손상을 일으킬 정도로 무딘 될 경우 바늘을 교체합니다. </li><li> 화면 수직 형광 복합 현미경 (예 : Zeiss AxioImager M1)에 따라 구슬을 성공적으로 배달 주입 배아는 20X 목표를 사용합니다. 첫째, KV 구조가 brightfield 조명을 (그림 1J)를 사용하여 손상 여부를 확인한 다음 구슬을 관찰하는 형광 사용합니다. 구슬이 존재하고 KV의 내강 내에 이사하는 배아를 선택합니다. KV 손상 또는 KV에없이 떠있는 구슬이있는 배아를 폐기하십시오. 이 KV를 놓치지 인근 조직 또는 기본 노른자에 구슬을 제공하는 간단합니다. 마운트 ano, 실패하는 경우10 배아를 군터 및 분사 절차를 반복하십시오. </li></ol> 5. KV의 유체 흐름의 가시화 및 분석 <ol><li> KV 내부 구슬로 선택한 각 배아를 들어, 아가로 오스를 커버 한 다음 63X 물을 찍어 목적 (그림 1I)를 사용하여 수직 형광 화합물 현미경 KV를 관찰하기 위해 멸균 물 한 방울을 추가합니다. 또는 coverslip가 아닌 물을 찍어 목표 및 / 또는 거꾸로 현미경에 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다. </li><li> 10 초 동영상을 녹화 할 수 (예 : Zeiss AxioCamHSm) 현미경에 장착 고속 카메라를 사용합니다. brightfield 또는 차등 간섭 대비 (DIC) 채널을 사용하여 형광 채널 (약 70 프레임 / 초)와 KV의 루멘을 사용하여 구슬을 모두 기록합니다. </li><li> 시간이 지남에 따라 모든 구슬 움직임을 시각화하려면, ImageJ 소프트웨어 (에서 무료로 다운로드에 형광 구슬의 동영상을 가져 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> )ND는 영화의 모든 형광 신호의 최대 투영을 만듭니다. ImageJ에서 최대 투영을 수행하려면 다음 &quot;이미지 → 스택 → Z 프로젝트를.&quot; &quot;Z 프로젝트&quot;창에서 &quot;최대 강도&quot;의 프로젝션 유형으로 모든 조각 프로젝트. 이 이미지는 구슬이 (그림 3A-B) 이미지로 된의 KV의 DIC 이미지를 겹쳐 할 수 있습니다. </li><li> 개인 구슬의 움직임이 ImageJ를 사용하여 추적 할 수 있습니다. 플러그인 ( &quot;수동 추적&quot;)에서 다운로드 할 수 있습니다 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> . ImageJ에서 형광 구슬 동영상을 열고 수동 추적 기능을 실행합니다. 수동 추적 창에서 &quot;시간 간격&quot;과 &quot;X / Y 보정&quot;에 대한 &quot;표시 매개 변수&quot;및 입력 매개 변수를 확인합니다. 수동 ≥ 50 프레임 동영상의 초점 평면에 남아있는 구슬을 선택한 다음 배아 당 ≥ 5 구슬을 추적 할 수 있습니다. 각 구슬의 경로와 속도는 일에 의해 생성되는전자 소프트웨어 (도 3 CD). </li></ol>

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<li>Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+fluxes+in+dorsal+forerunner+cells+antagonize+beta-catenin+and+alter+left-right+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning.</a> Development. 135 (1), 75-84 (2008).</li>
<li>Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cdc14B+phosphatase+contributes+to+ciliogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (2), 291-302 (2011).</li>
<li>Matsui, T., Bessho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetry+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetry in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. , (2012).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

DFC / KV 세포 계보 (Lineage)에 MO를 타겟팅 할 단계 별 주사를 사용하여 유전자 기능의 휴대 자율성을 연구하고 글로벌 유전자 최저로 인한 pleiotropic phenotypes을 방지 할 수있는 유용한 방법이다. 그러나, 이러한 주사는 기술적 도전이 될 수 있습니다. 256 전지 및 1,000 세포 단계 사이 MO의 주입이 세 가지 결과가 발생할 수 있습니다 : 1) MO는 난황에 걸쳐 MO의 diffuses)는 주사 사이트 2 집계 유지하고 DFC / KV 셀 또는 3) MO를 입력 난황에 걸쳐 diffuses 및 DFC / KV 세포와 다른 배아 세포를 입력합니다. 따라서, MO는 DFC / KV 셀에 독점적으로 이동되었습니다 된 배아를 선택하면이 실험에서 핵심 단계입니다. 그것은 MO 모든 DFC / KV 셀에로드 할 수 있습니다하는 것이 중요하지만 종종 이러한 세포 (10)의 하위 집합 만 들어갑니다. 대상이 모자이크를 근간 이유는 불분명 남아 있지만, 난황 및 / 또는 산업의 폐쇄...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 표준 제어 태그 oligo-Lissamine </td><td> 유전자 도구, LLC </td><td></td></tr><tr><td> 사용자 Rock2b morpholino oligo </td><td> 유전자 도구, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 미크론 마이크로 </td><td> Polysciences 주식회사 </td><td> 24,054 </td></tr></tbody></table>

kupffer의 소포의 유전자 기능 및 속눈썹 생성 된 유체 흐름의 시각화 분석

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

같은 심장, 뇌, 그리고 내장 등의 내부 기관은 정상적인 기능 1 중요한 왼쪽, 오른쪽 (LR) asymmetries을 개발할 수 있습니다. 운동성 섬모가 부족해은 마우스, 개구리, 그리고 zebrafish 2-6 포함한 척추 동물의 배아에 LR을 비대칭 수립에 참여하고 있습니다. 이러한 &#39;LR의 속눈썹은&#39;장기에게 7 개발을위한 LR의 패턴 정보를 제공하는 것으로 생각되어 왼쪽 측면 판 중배엽에서 층계를 신호 보존 비대칭 결절을 (TGF-β superfamily), 실행하는 데 필요한 비대칭 유체 흐름을 생성합니다. 따라서, LR의 패턴의 근간이 메커니즘을 이해하기 위해, 그것은 LR 솜털이있는 세포의 조직, LR의 속눈썹하고 강력한 비대칭 흐름을 생성하는 능력의 운동성 및 길이를 조절 유전자를 식별하는 것이 중요합니다. zebrafish 배아에서 LR의 속눈썹은 2,4,5 Kupffer의 소포 (KV)에 위치하고 있습니다. KV는 monociliated 상피 세포의 단일 층으로 구성되어 있습니다유체 - 채워진 내강을 둘러싸 그. 운명 매핑은 KV이 epiboly 단계 8,9 동안 등쪽 배반 엽 여백에 이전 등쪽 전신 세포 (DFCs)로 알려진 ~ 20-30 셀의 그룹에서 파생되는 것으로 나타났습니다. 초기 체절 단계 동안, DFCs 클러스터와 솜털이있는 상피 세포로 분화가 배아 10,11의 tailbud에 KV를 형성합니다. 식별하고 추적 할 수있는 능력을 DFCs을의 조합 광학 투명성과 zebrafish KV LR 솜털이있는 세포를 연구 할 수있는 훌륭한 모델 시스템 배아하게되면 zebrafish의 신속한 개발. 흥미롭게도, DFC / KV 세포 계보 (Lineage)의 progenitors은 4 시간 후 수정을 (hpf)에 난황 세포 사이에 세포질 다리를 유지, 2 hpf 8 후 가까운 난황 세포와 다른 배아 세포 사이에 세포질 다리 반면. 이 세포질 다리 활용, 우리는 morpholino oligonucle를 제공​​ 할 수있는 단계 별 분사 전략을 개발DFCs 및 최저 이러한 세포 12 대상 유전자의 기능에 대한 독점적 otides (MO). 이 기술은 유전자 기능이 야생 형 배아의 맥락에서 개발 DFC / KV 혈통에 쓰러되는 키메라 배아를 생성합니다. KV에서 비대칭 유체 흐름을 분석하기 위해, 우리는 KV 루멘과 videomicroscopy 2를 사용 기록 비즈 운동으로 형광 microbeads를 삽입. 유체 흐름은 쉽게 시각화하고 시간이 지남에 따라 구슬 변위를 추적하여 정량화 할 수 있습니다. 여기 단계 별 DFC 타겟 유전자 최저 기법과 흐름을 시각화 할 수 KV에 형광 microbeads의 주입을 사용하여, 우리는 KV 개발 및 기능 중에 특정 유전자의 역할을 특성화 할 수있는 효과적인 방법을 제공하는 프로토콜을 제시한다.

스테이지 별 MO 주사는 배아의 특정 구획에서 유전자 기능을 분석 할 수있는 유용한 방법을 제공합니다. 그림 1은 유체 흐름을 시각화하는 형광 구슬을 소개하는 DFC / KV 세포와 방법에 유전자 기능을 테스트하는 데 사용되는 분사 전략의 흐름 차트를 제공 KV 인치 성공적인 단계 별 주입 배아의 형광 MO의 배포는 그림 1D-F과 그림 2에서 라이브 배아에서 개략적으로 표시됩니다. 실패 MO 분사는, 난황 셀에 집계 된 MO 남아가 그림 2D에 표시되는 인치 성공적으로 주입 배아 - 선택 형광의 지역화 MO는 - 수 유체 흐름을 분석 할 수있는 KV 루멘 (그림 1G-H)로 형광 microbeads의 제공을위한 4-6 체절 단계에서 설치할 수에 따라. Videomicroscopy는 KV의 구슬 움직임을 (그림 ...

Kupffer의 소포에 솜털 생성 된 유체 흐름 (KV)는 zebrafish 배아의 왼쪽, 오른쪽 패턴을 제어합니다. 여기, 우리는 KV 세포에 특별히 유전자 기능을 조절하는 기술을 설명합니다. 또한, 우리는 유체 흐름을 시각화하는 KV에 형광 구슬을 전달하는 방법을 보여줍니다.

Kupffer의 소포의 유전자 기능 및 속눈썹 생성 된 유체 흐름의 시각화 분석

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

이 절차의 목적은 좌우 패터닝을 담당하는 Kavas 소포 또는 제브라피시 배아의 KV의 기능 유전자를 조절하고 형광 비드를 kv에 전달하여 motil clia에 의해 생성된 비대칭 유체 흐름을 분석하는 것입니다. 이는 미드 블라시 딜라 단계 배아의 난황 세포에서 특정 관심 유전자의 발현을 억제하는 형광 모프 올리고뉴클레오티드를 먼저 주입하여 kv를 생성하는 등쪽 전구 세포에 로드함으로써 달성됩니다. 다음으로, 난황 세포와 kv에만 형광 모르포스가 있는 주입된 배아를 추가 분석을 위해 선택합니다.그런 다음 배아를 함몰 슬라이드에 장착하고 형광 구슬을 kv의 액체로 채워진 소포 내강에 주입합니다. 마지막으로, 비디오 현미경은 kv 내부로 흐르는 비드를 기록하는 데 사용됩니다. 궁극적으로, KV에서 후보 유전자의 조직 특이적 고갈이 비드 이동의 정량적 분석을 통해 비대칭 유체 흐름을 변경하는지 여부를 결정하는 결과를 얻을 수 있습니다.이번 학기의 바이러스 시연은 단계 특이적 몰리노 주사와 형광 비드 주사가 모두 배아의 제안과 실험의 발달 시기에 의존하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 글로벌 모프 또는 MO 주입을 수행하려면 수정 직후 배아를 채취하여 주입 플레이트에 로드합니다. 피펫을 지나는 불을 사용하여 배아를 주입판에 넣어 배아를 고정시킵니다.주사 바늘의 끝을 부러뜨리고 주입 설정을 조정하여 부피가 1나노리터인 주입 방울을 만듭니다. 해부 현미경을 사용하여 1나노리터의 MO를 1단계와 4개의 세포기 사이에 있는 최소 50개의 배아의 요크에 주입합니다. DFC 표적 M mo 주입의 경우 수정 직후 배아를 채취하여 섭씨 28.5도에서 배양합니다.배아가 256 세포 단계에 도달하면 주사 플레이트에 빠르게 로드하고 1나노리터의 형광 MO를 난황에 주입합니다. 256 세포기와 1000개의 세포 단계 사이에 최소 100개의 배아를 주입하여 난황 표적 주사를 수행합니다. 수정란을 돔 단계로 배양한 후, 돔과 30%가 플라이 단계 사이에 있는 최소 100개의 배아의 멍에에 1나노리터의 형광 MO를 주입합니다.M mo 주입 배아가 75%a 플라이 단계에 도달하면. 글로벌 MO 주입을 위해 해부 현미경으로 수정되지 않은 배아와 죽은 배아를 제거합니다. 모든 세포에 고르게 분포된 형광을 위해 살아있는 배아를 선택하십시오.DFC targeted M mo 주사의 경우, 난황 전체에 형광이 확산되고 배측 블라스팅된 진피 가장자리에 농축된 배아를 선택합니다. 난황 표적 MO 주사용. 형광이 난황 전체에 고르게 분포되어 있고 2개에서 4개 사이의 배아 세포에서 관찰되지 않는 배아를 선택하십시오.그래서 진드기 단계. KV 세포와 난황에서만 형광을 보이는 DFC 표적 배아를 선택하고 나머지는 난황 표적 주사를 위해 폐기합니다. MO가 주입된 배아의 KV에서 비대칭 흐름을 분석하기 위해 난황에만 형광이 있는 배아를 선택합니다.먼저 날카로운 집게를 사용하여 4개에서 6개 사이에 약 20개의 배아를 조심스럽게 코팅합니다.따라서 단계에서는 하나의 배아를 유리 함몰 슬라이드로 옮기고 가능한 한 많은 물을 제거할 수 있습니다. 배아가 굳어질 때 배아를 덮을 수 있도록 따뜻한 1%의 낮은 융점 에어로를 충분히 추가하여 배아를 고정시킵니다. 집게를 사용하여 KV가 위를 향하도록 배치하고 10개의 배아를 장착하고 10개의 배아가 모든 주입이 10개까지 완료되도록 신속하게 작업합니다.그래서 진드기 단계. 0.5 미크론 직경의 형광 마이크로 비드를 멸균 수에서 1-50으로 희석한 후. 비드를 완전히 혼합하고 MO 주입에 사용되는 것과 동일한 마이크로 주입기를 사용하여 모세관 바늘에 3마이크로리터를 로드합니다.집게를 사용하여 바늘 끝을 부러뜨리고 주입 설정을 조정하여 가능한 한 가장 작은 주입을 생성합니다. 방울. 다음으로, 해부 현미경으로 바늘을 첫 번째 장착된 배아의 KV 루멘에 맞춥니다. 그런 다음 바늘을 내강에 삽입하고 0.5나노리터 미만의 비드를 주입합니다.직립 형광 현미경 아래에서 배아가 마르는 것을 방지하기 위해 아로스에 멸균수 한 방울을 추가합니다. 20 x 대물렌즈 스크린을 사용하여 주입된 배아를 선택한 각 배아에 대해 비드를 성공적으로 전달하고 KV 내부에 비드를 한 방울 떨어뜨려 aros를 덮습니다. 그런 다음 63배 물 담그기 대물렌즈가 있는 형광 복합 현미경을 사용하여 관찰합니다.현미경에 장착된 고속 카메라를 사용하여 10초 분량의 동영상을 녹화합니다. 형광 채널을 사용하여 초당 약 70프레임으로 비드를 기록하고 명시야 또는 미분 간섭 대비를 사용하여 KV 루멘을 기록합니다. 동영상을 Image J.Create maximum projections로 가져오고 소프트웨어를 사용하여 개별 구슬의 움직임을 추적합니다.이 그림은 성공적인 단계 특이적 생배아에서 형광 MO의 분포를 보여줍니다. 용액이 난황 세포에 응집된 상태로 남아 있는 실패한 MO 주입이 여기에 나와 있습니다. 성공적으로 주입된 배아의 유체 흐름은 정상 유동 비드가 있는 대조 배아에서 정성적 또는 정량적으로 측정할 수 있습니다.시간 경과에 따른 형광 비드 위치를 최대한 투영하거나 시간 경과에 따른 개별 비드를 추적하여 시각화할 수 있는 시계 반대 방향 경로를 따릅니다. 배위 배아의 손실을 입증하기 위해 흐름을 방해하는 열 키나아제 2 B 또는 암석 2 B를 분해하기 위해 MO를 주입하였고, 그 결과 비드는 kv 단위로 무작위로 이동하며, 대조군에서 5개의 비드와 암석 2개의 B mo 배아의 평균 속도가 발달 후 여기에 표시됩니다. 이 기술은 발생 생물학 분야의 연구자들이 제브라피시의 왼쪽 오른쪽 신체 접근을 확립하는 유전자와 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

기도 섬모 운동과 섬모 생성 흐름을 마우스 기관을 사용하여 시각화 및 정량화를위한​​ 쉽고 안정적​​인 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 요소의 넓은 범위 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는 점액 부하와 같은 기계적 요인 등 섬모 운동성에 영향을 미치는 방법을 결정 수정할 수 있습니다.

설치류기도 상피의 섬모 운동성의 높은 해상도 이미지를위한 생체 방법

본 연구에서는 초구조 분석을 위한 전자 현미경 방법과 함께 생체 외 CPEC 섬모의 움직임을 실시간 관찰 및 분석할 수 있도록 상세한 광학 현미경 기술을 최적화했습니다.

맥락총 상피 세포의 섬모 운동의 관측<em&gt; 전의 VIVO</em

여기에서는 예쁜꼬마선충의 발달 과정을 추적하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 쉽게 구현할 수 있는 오픈 소스 도구를 기반으로 합니다. 3D 세포 모양 모델을 재구성하는 방법, 세포 내 구조를 수동으로 추적하는 방법, 피질 수축 흐름을 분석하는 방법을 보여줍니다.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

최근 우리 라이브 셀에 기본 속눈썹 안쪽 translocating 다양 한 단백질에 대 한 전송 경로의 3 차원 (3D) 공간 위치 매핑. 여기 실험 설정, 생물 학적 샘플의 과정 및 접근을 새로 이미징 3D 슈퍼 해상도 형광에 대 한 데이터 분석에 적용이 종이 세부 기본 속눈썹 살고 있습니다.

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초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 운동성입니다. 원칙적으로, 그들은 특정 형광 프로브를 통해 실시간으로 이미징 될 수 있지만, 달걀 껍질은 배아에 직접 적용하는 것을 방지합니다. 이 프로토콜은 미세주입을 통해 이러한 프로브  를 도입한 다음 입자 이미지 속도측정법을 통해 벌크 소기관 움직임을 분석하는 방법을 설명합니다.

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이 방법은 조직 수집에서 섬모 조직 분석에 이르기까지 광물화된 조직의 넓은 영역에 걸쳐 원발성 섬모를 3차원으로 제 자리에서 이미지화하기 위해 ARL13B-CENTRIN-2 형질전환 마우스 모델에서 내인성 신호를 활용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 유형의 조직에도 적용될 수 있습니다.

ARL13B-CENTRIN-2 마우스 모델을 사용한 근골격계 조직의 원발성 섬모의 체적 이미징 및 분석

학습하세요 제브라피시 Kupffer's Vesicle에서 형광 비드를 이용한 유전자 기능 조절 및 비대칭 유체 흐름 분석 방법을. 이 기술은 좌우 패턴형성 연구에 필수적입니다.

Kupffer의 소포의 유전자 기능 및 속눈썹 생성 된 유체 흐름의 시각화 분석

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