Kupffer의 소포의 유전자 기능 및 속눈썹 생성 된 유체 흐름의 시각화 분석

이 절차의 목적은 좌우 패터닝을 담당하는 Kavas 소포 또는 제브라피시 배아의 KV의 기능 유전자를 조절하고 형광 비드를 kv에 전달하여 motil clia에 의해 생성된 비대칭 유체 흐름을 분석하는 것입니다. 이는 미드 블라시 딜라 단계 배아의 난황 세포에서 특정 관심 유전자의 발현을 억제하는 형광 모프 올리고뉴클레오티드를 먼저 주입하여 kv를 생성하는 등쪽 전구 세포에 로드함으로써 달성됩니다. 다음으로, 난황 세포와 kv에만 형광 모르포스가 있는 주입된 배아를 추가 분석을 위해 선택합니다.

그런 다음 배아를 함몰 슬라이드에 장착하고 형광 구슬을 kv의 액체로 채워진 소포 내강에 주입합니다. 마지막으로, 비디오 현미경은 kv 내부로 흐르는 비드를 기록하는 데 사용됩니다. 궁극적으로, KV에서 후보 유전자의 조직 특이적 고갈이 비드 이동의 정량적 분석을 통해 비대칭 유체 흐름을 변경하는지 여부를 결정하는 결과를 얻을 수 있습니다.

이번 학기의 바이러스 시연은 단계 특이적 몰리노 주사와 형광 비드 주사가 모두 배아의 제안과 실험의 발달 시기에 의존하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 글로벌 모프 또는 MO 주입을 수행하려면 수정 직후 배아를 채취하여 주입 플레이트에 로드합니다. 피펫을 지나는 불을 사용하여 배아를 주입판에 넣어 배아를 고정시킵니다.

주사 바늘의 끝을 부러뜨리고 주입 설정을 조정하여 부피가 1나노리터인 주입 방울을 만듭니다. 해부 현미경을 사용하여 1나노리터의 MO를 1단계와 4개의 세포기 사이에 있는 최소 50개의 배아의 요크에 주입합니다. DFC 표적 M mo 주입의 경우 수정 직후 배아를 채취하여 섭씨 28.5도에서 배양합니다.

배아가 256 세포 단계에 도달하면 주사 플레이트에 빠르게 로드하고 1나노리터의 형광 MO를 난황에 주입합니다. 256 세포기와 1000개의 세포 단계 사이에 최소 100개의 배아를 주입하여 난황 표적 주사를 수행합니다. 수정란을 돔 단계로 배양한 후, 돔과 30%가 플라이 단계 사이에 있는 최소 100개의 배아의 멍에에 1나노리터의 형광 MO를 주입합니다.

M mo 주입 배아가 75%a 플라이 단계에 도달하면. 글로벌 MO 주입을 위해 해부 현미경으로 수정되지 않은 배아와 죽은 배아를 제거합니다. 모든 세포에 고르게 분포된 형광을 위해 살아있는 배아를 선택하십시오.

DFC targeted M mo 주사의 경우, 난황 전체에 형광이 확산되고 배측 블라스팅된 진피 가장자리에 농축된 배아를 선택합니다. 난황 표적 MO 주사용. 형광이 난황 전체에 고르게 분포되어 있고 2개에서 4개 사이의 배아 세포에서 관찰되지 않는 배아를 선택하십시오.

그래서 진드기 단계. KV 세포와 난황에서만 형광을 보이는 DFC 표적 배아를 선택하고 나머지는 난황 표적 주사를 위해 폐기합니다. MO가 주입된 배아의 KV에서 비대칭 흐름을 분석하기 위해 난황에만 형광이 있는 배아를 선택합니다.먼저 날카로운 집게를 사용하여 4개에서 6개 사이에 약 20개의 배아를 조심스럽게 코팅합니다.

따라서 단계에서는 하나의 배아를 유리 함몰 슬라이드로 옮기고 가능한 한 많은 물을 제거할 수 있습니다. 배아가 굳어질 때 배아를 덮을 수 있도록 따뜻한 1%의 낮은 융점 에어로를 충분히 추가하여 배아를 고정시킵니다. 집게를 사용하여 KV가 위를 향하도록 배치하고 10개의 배아를 장착하고 10개의 배아가 모든 주입이 10개까지 완료되도록 신속하게 작업합니다.

그래서 진드기 단계. 0.5 미크론 직경의 형광 마이크로 비드를 멸균 수에서 1-50으로 희석한 후. 비드를 완전히 혼합하고 MO 주입에 사용되는 것과 동일한 마이크로 주입기를 사용하여 모세관 바늘에 3마이크로리터를 로드합니다.

집게를 사용하여 바늘 끝을 부러뜨리고 주입 설정을 조정하여 가능한 한 가장 작은 주입을 생성합니다. 방울. 다음으로, 해부 현미경으로 바늘을 첫 번째 장착된 배아의 KV 루멘에 맞춥니다. 그런 다음 바늘을 내강에 삽입하고 0.5나노리터 미만의 비드를 주입합니다.

직립 형광 현미경 아래에서 배아가 마르는 것을 방지하기 위해 아로스에 멸균수 한 방울을 추가합니다. 20 x 대물렌즈 스크린을 사용하여 주입된 배아를 선택한 각 배아에 대해 비드를 성공적으로 전달하고 KV 내부에 비드를 한 방울 떨어뜨려 aros를 덮습니다. 그런 다음 63배 물 담그기 대물렌즈가 있는 형광 복합 현미경을 사용하여 관찰합니다.

현미경에 장착된 고속 카메라를 사용하여 10초 분량의 동영상을 녹화합니다. 형광 채널을 사용하여 초당 약 70프레임으로 비드를 기록하고 명시야 또는 미분 간섭 대비를 사용하여 KV 루멘을 기록합니다. 동영상을 Image J.Create maximum projections로 가져오고 소프트웨어를 사용하여 개별 구슬의 움직임을 추적합니다.

이 그림은 성공적인 단계 특이적 생배아에서 형광 MO의 분포를 보여줍니다. 용액이 난황 세포에 응집된 상태로 남아 있는 실패한 MO 주입이 여기에 나와 있습니다. 성공적으로 주입된 배아의 유체 흐름은 정상 유동 비드가 있는 대조 배아에서 정성적 또는 정량적으로 측정할 수 있습니다.

시간 경과에 따른 형광 비드 위치를 최대한 투영하거나 시간 경과에 따른 개별 비드를 추적하여 시각화할 수 있는 시계 반대 방향 경로를 따릅니다. 배위 배아의 손실을 입증하기 위해 흐름을 방해하는 열 키나아제 2 B 또는 암석 2 B를 분해하기 위해 MO를 주입하였고, 그 결과 비드는 kv 단위로 무작위로 이동하며, 대조군에서 5개의 비드와 암석 2개의 B mo 배아의 평균 속도가 발달 후 여기에 표시됩니다. 이 기술은 발생 생물학 분야의 연구자들이 제브라피시의 왼쪽 오른쪽 신체 접근을 확립하는 유전자와 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.