Name: 바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: 학습하세요 제한된 세포량의 1차 T세포를 이용한 효율적인 염색질 면역침전법(ChIP)으로 DNA 결합 단백질과 히스톤 변형을 검출하는 방법을. 이 기법은 전사 조절 및 후성유전학 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 NIH 보조금 CA141009 및 GM39067에 의해 지원되었다. 우리는 기록 된 부분에 의견을 E. 파넬 (Parnell)과 R. Yarrington 감사합니다.

1. 마우스 비장 나이브 CD4의 분리는 세포를 T <ol><li> 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC) 프로토콜과 일치하는 인간적인 방식으로 마우스를 희생. 비장을 해부하고 10 % FBS와 DMEM 10 ML을 포함하는 페트리 접시에 넣습니다. </li><li> 비장 세포를 분리하기 위해 두 개의 유리 슬라이드의 서리로 덥은 끝을 사용하여 비장을 분쇄. 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 4시 5 분 200 XG (일반 로터 직경 임상 원심 분리기에 대한 ~ 1,200 RPM)에서 원심 분리하여 세포를 수집 ° C. </li><li> 2 ㎖ ACK 버퍼를 Resuspend 세포는 적혈구, 실온 (RT)에서 1 분을 용해합니다. FBS와 DMEM의 13 ML을 추가하여 반응을 중지합니다. </li><li> 4시 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집 ° C. </li><li> DMEM 포함 FBS 5 ML에있는 세포를 resuspend을하고 70 μm의 메쉬 필터 (BD 팔콘, 고양이 # 352350)를 통해 전달합니다. 세포를 계산하고 진행순진 CD4의 분리에 대한 제조 업체의 지침을 사용하여 CD4 분리 키트 (있는 Miltenyi, 고양이 # 130-095-248)를 사용하여 세포가 T. 4시 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 순진 CD4 T 세포를 수집 ° C. FBS와 DMEM 10 ML에있는 세포를 resuspend을. </li></ol> 2. 염색질의 준비 <ol><li> DMEM에 세포 현탁액을 1 %의 최종 농도 37 % 포름 알데히드를 추가하고 부드럽게하는 가교 DNA 15 분 동안 RT (예 Nutator 사용)에서 록 : 단백질 복합체. </li><li> 125 mm의 최종 농도 1 M 글리신을 추가하여 가교를 중지합니다. RT에서 5 분 바위를 계속합니다. </li><li> 4시 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집 ° C. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS 포함하는 단백질 분해 효소 억제제 5ml에 현탁하여 세포를 씻으십시오. 3 회 총 얼음처럼 차가운 PBS를 포함하는 단백질 분해 효소 억제제 씻어 4에서 원심 분리하여 세포를 수집 ° C. </li><li> 1 ML에있는 세포를 resuspend을단백 분해 효소 억제제를 포함하는 얼음처럼 차가운 세포 용해 버퍼입니다. 15 분 동안 얼음에 품어. 세포 용해의 효율은 0.4 % 판 블루 용액에 세포의 작은 나누어지는 현탁 (시그마, 고양이 # T8154)와 현미경으로 관찰하여 확인할 수 있습니다. </li><li> 4시 5 분 200 XG (보통 ~ 1,200 RPM)에서 원심 분리하여 핵을 수집 ° C. 조심스럽게 상층 액을 버린다. </li><li> 단백 분해 효소 억제제를 포함하는 핵 용해 버퍼 500 μL의 핵 resuspend을. 15 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 출력 레벨 4, 15 초 버스트, 얼음 4 회 : Misonix의 Sonicator 3,000 프로브 크기 1.6 mm를 사용하여 세포를 초음파 처리. 각 시료는 시료의 과열을 방지하기 위해 다시 sonicating 전에 1-2 분 동안 얼음에 냉각해야합니다. 과열 상호 링크의 반전을 일으킬 수 있습니다. </li><li> 4에서 5 분 16,000 XG (의 microcentrifuge에서 ~ 13,200 RPM)에서 초음파 처리 염색질을 원심 분리기 ° C. </li><li> 분명 supern의 20 μL 나누어지는을atant, DNA 로딩 염료를 추가하고 2 % 아가 로스 젤 (대부분의 응용 프로그램에 대한 초음파 처리 DNA의 이상적인 크기입니다 200-500 BP)를 통해 전기로 초음파 처리 DNA를 확인합니다. </li><li> UV 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 결정합니다. 전단 염색질은 염색질 immunoprecipitation의 반응을 설정하기 위해 즉시 사용 또는 -80 ° C.에 저장할 수 있습니다 일반적으로 우리는 마우스 당 2-3 X 10 6 정화 CD4 T 세포 7.5-10 μg의 DNA를 얻을 수 있습니다. </li></ol> 3. 염색질의 immunoprecipitation (모든 단계 0-4에서 수행해야합니다 ° C) <ol><li> 단백 분해 효소 억제제 칩 희석 버퍼 ㎍ / ㎖ 5-10의 DNA 농도 (총 부피 = 1 ML)에 초음파 처리 염색질을 희석. </li><li> 입력으로 100 μL (10 %)을 저장합니다. 얼음에 저장합니다. </li><li> 나누어지는 450 μl의 이소 타입 제어 (마우스 또는 토끼 IgG의)과 그 항체로 분류 두 개의 1.7 ML의 microfuge의 튜브에 각각. 같은 이소 타입의 여러 항체를 사용하는 경우, 하나의 이소 타입의 contr를OL이 분석을 수행하기에 충분합니다. 다른 동물의 소스 또는 이소 타입의 항체를 사용하는 경우 여러 이소 타입 컨트롤이 필요합니다. </li><li> 2-5 사용되는 항체의 특이성에 따라 특정 항체 μg, 또는 각각의 튜브에 이소 타입 컨트롤을 추가합니다. </li><li> ° C가 염색질 항체 복합체의 형성을 할 수 있도록 4에서 하룻밤 Nutator을 사용하여 튜브를 바위. </li><li> 상기 혼합물에 단백질 G 자석 구슬 (정지 구슬 1:1 슬러리)의 25 μl를 추가하고 4시에 최소한 2 시간 동안 흔들 수 있습니다 ° C. 우리의 공급 업체로부터 구슬을 직접 사용할 수 있습니다. </li><li> 자기 스탠드에의 microfuge 튜브를 놓고 구슬은 자기 측에 수집 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 구슬을 방해하지 않고 흡인하여 솔루션을 제거합니다. </li><li> 낮은 소금 세척 용액 1 ㎖를 추가하고 부드럽게 Nutator에 5 분 동안 흔들 수 있습니다. 자기 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고 세척 용액을 제거. 한 번 반복합니다.</li><li> 염분 세척 용액 1 ㎖를 추가하고 Nutator에 5 분 동안 흔들 수 있습니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고 세척 용액을 제거. 한 번 반복합니다. </li><li> 염화 리튬 세척 용액 1 ㎖를 추가하고 Nutator에 5 분 동안 흔들 수 있습니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고 세척 용액을 제거. 한 번 반복합니다. LiCl을의 사용은 구슬 비 특정 크로 마틴 상호 작용의 효과적인 제거를 향상시킵니다. </li><li> TE 용액 1 ㎖를 추가하고 Nutator에 5 분 동안 흔들 수 있습니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고 세척 용액을 제거. </li><li> 용출 버퍼 250 μl를 추가하여 구슬에서 DNA를 용출. 실온에서 15 분 동안 바위. 용출액을 피펫하고 새로운 1.7 ML의 microfuge의 관이 물질을 저장합니다. 한 번 더 반복하고 elutions 둘을 결합한다. 구슬을 폐기하십시오. </li><li> 상호 링크가 최종 0.3 M의 농도와 RNase의 1 μL (20m에 5 M NaCl을 추가 역방향<html> 용출 된 DNA에 대한 G / ML). 볼륨을 500 μl를 만드는 단계 3.2에서 저장된 입력에 용출 버퍼 400 μl를 추가합니다. 입력에 0.3 M,의 RNase A, 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 M 트리스 - 염산 산도 6.5의 20 μL와 단백질 분해 효소 K (20 밀리그램 / ML) 1 μL의 10 μL의 1 μL에 NaCl을 추가합니다. </li><li> 건조 가열 블록에 65에서 하룻밤 튜브 ° C를 품어. 샘플, 인감의 증발을 방지하거나 오프닝에서 그들을 유지하기 위해 튜브에 무게를 배치합니다. 하이브 리다이 제이션 오븐도 사용할 수 있습니다. </li><li> RT로 냉각 튜브를 할 수 있습니다. 1 ML 100 % 에탄올을 추가하고 -80에서 2 시간 - 밤새 품어 ° C 침전물 DNA합니다. </li><li> 펠렛에 15 분 DNA 16,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 70 % 에탄올과 공기 건조 펠렛 한 번 DNA 펠렛을 씻으십시오. 멸균 증류수 100 μL의 DNA 펠렛을 resuspend을. </li><li> 용출 버퍼 50 μl의 총 볼륨 QiaQuick 스핀 컬럼 및 용출을 사용하여 DNA를 정화. 이 DNA는 PCR을 위해 사용할 수 있습니다. </li></ol>PCR 반응 (모든 단계는 얼음에서 수행해야 함) &quot;&gt; 4. 준비 <ol><li> 칩 및 해당 입력 샘플에서 모든 DNA 샘플을 수집합니다. 또한, PCR 시약 및 대상 지역의 프라이머뿐만 아니라 제어 영역을 모두 수집합니다. &quot;hotstart&quot;DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소를 사용합니다. 우리는이 절차에서 DNA 증폭을 정량화하기 SYBR 녹색 기반 분석을 사용하지만, qPCR에 mastermix 키트는 필요한 경우 사용할 수 있습니다. </li><li> 의 qPCR 분석 표준 곡선을 생성하기 위해 입력 DNA의 시리얼 희석을 예 : 10 %, 1 %, 0.1 % 및 용출 버퍼의 0.01 % (단계 3.18에서 QiaQuick 스핀 컬럼부터)합니다. 이 표준 곡선 템플릿 집합의 농도 범위와 증가는 칩 농축의 기대 수준에 따라 달라질 수 있습니다, 등 (Genemate, 고양이 # T-3182-1 96 - 웰 플레이트의 각 우물에 입력 DNA 샘플의 10 μl를 분배 ), 중복합니다. </li><li> 각각의 10 ㎖ 칩 이소 타입 컨트롤에서 DNA뿐만 아니라 특정 항체를 분배우물, 세중합니다. </li><li> 대상 프라이머 또는 컨트롤 프라이머 (각 프라이머의 0.1 μM 최종 농도) 중 하나를 포함하는 &quot;마스터 믹스&quot;를 확인하고 각각의 우물에 10 μl를 분배. 예를 들어, 아래 템플릿에 혼합 함유 우물에 대상 뇌관은 녹색으로 표시된 마스터를 분배하고 빨간색으로 표시된 우물에 컨트롤 프라이머 마스터 믹스를 분배. </li><li> 우물의 바닥에 모든 것을 수집하는 RT에서 1 분에 대한 임상 원심 분리기 (~ 1,200 RPM)에서 500 XG에서 광학 플라스틱 바다 표범 어업 필름과 원심 분리기와 PCR 플레이트를 커버. </li><li> PCR 반응을 시작합니다. 우리는이 예제에서 qPCR에를 실행하는 LightCycler 480 II (로슈) 운영하기 LightCycler 480SW 1.5 소프트웨어를 사용합니다. </li></ol> 미리 배양 : 1 사이클 : 95 ° C / 5 분. 증폭 : 40-45주기 : 94 ° C / 5 초, 60 ° C / 5 초, 72 ° C/10 초 (온도가 녹는 그리고 온도보다 2-3 ° C이어야한다 어닐링프라이머 E). 용융 곡선 : 1 사이클. 냉각 : 1 사이클. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> </td><td> 10 % 입력 </td><td> 10 % 입력 </td><td> 이소 타입 </td><td> 특정 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> B </td><td> 1 % 입력 </td><td> 1 % 입력 </td><td> 이소 타입 </td><td> 특정 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> C </td><td> 0.1 % 입력 </td><td> 0.1 % 입력 </td><td> 이소 타입 </td><td> 특정 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 디 </td><td> 0.01 % 입력 </td><td> 0.01 % 입력 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td> 10 % 입력 </td><td> 10 % 입력 </td><td> 이소 타입 </td><td> 특정 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 에프 </td><td> 1 % 입력 </td><td> 1 % 입력 </td><td> 이소 타입 </td><td> 특정 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 지 </td><td> 0.1 % 입력 </td><td> 0.1 % 입력 </td><td> 이소 타입 </td><td> 특정 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td> 0.01 % 입력 </td><td> 0.01 % 입력 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 녹색 : 대상 지역 프라이머를 사용합니다. 빨간색 : 제어 영역 프라이머를 사용합니다. 5. 분석 <ol><li> DNA의 절대 양의 정량화 프로그램의 qPCR 소프트웨어입니다. 중요한 것은, 알 수없는 구체적이고 이소 타입 샘플 보간 DNA 금액에 표준 곡선의 사용 평가와 모든 프라이머의 품질과 효율성의 매칭이 샘플에서 발견 농도의 범위에서 설정 할 수 있습니다. 게다가, 그것은 또한 MOR를 제공합니다전자 usingΔΔCq 및 관련 방법보다 최종 상대 배 농축 결과에 Cq와 (C T 또는 C P) 값을 변환하는 신뢰할 수있는 방법. </li><li> 샘플 편집기로 가서 자신의 표준 곡선 값으로 다양한 희석의 입력 샘플을 (10 %, 1 %, 0.1 % 및 0.01 %)를 포함하는 우물을 표시합니다. 또한 PCR 플레이트가 배치되어 정확히 알 수없는 칩 샘플 우물 레이블을 지정합니다. 다른 qPCR의 기계에 사용되는 해당 소프트웨어에서 각 프라이머 쌍, 표준 곡선 값과 그에 따라 실험 이소 타입 컨트롤 샘플에 대한 반응에 해당하는 하위 집합을 지정합니다. </li><li> LightCycler 소프트웨어에서 집합 편집기에 가서 입력 샘플 우물뿐만 아니라 미지의 칩 샘플을 포함하는 하위 집합을 표시합니다. 미지 시료는 분석을 위해 입력 샘플의 알려진 농도에서 생성 된 표준 곡선을 사용하여 정량화 할 것입니다. 다른 qPCR의 기계에 사용되는 해당 소프트웨어를 지명 한 집합 corresp의각 프라이머 쌍에 대한 모든 반응에 onding. </li><li> PCR 증폭이 완료된 후, &quot;애비 Quant/2nd 파생 최대&quot;로 분석을 수행하고 분석하고 확인을 누르 하위 집합을 선택합니다. 다른 qPCR의 기계에 사용되는 해당 소프트웨어의 각 부분 집합에서 DNA 양에 Cq와 값을 변환합니다. </li><li> 입력 샘플의 알려진 농도를 사용하여 표준 곡선을 생성하고 미지 시료에서 DNA 존재의 절대 양을 표시하는 &quot;계산&quot;을 누릅니다. </li><li> 전단 DNA의 품질이 좋은 경우 프라이머가 대상 영역에 구체적으로 바인딩하는 경우, 그리고 PCR 효율은 가까운 2 있어야합니다. </li><li> 가능한 경우, 동일한 하위 집합 &quot;Tm 값이 호출&quot;을 용해 곡선 분석을 수행합니다. 하나의 피크는 하나의 특정 제품이 증폭되었음을 나타냅니다. 특정 DNA의 증폭은 아가로 오스 겔을 통해 DNA 사다리와 함께 PCR 제품을 electrophoresing하여 테​​스트 할 수 있습니다. </li><li> 로 데이터 내보내기 탭추가 분석을 위해 Microsoft Excel에서 열 수있는 구분 된 텍스트 파일,. </li><li> Microsoft Excel을 사용하여 대상 프라이머의 이소 타입 컨트롤에 특정 항체 DNA 양을 나눕니다. 제어 영역 프라이머에 대해이 단계를 반복합니다. 같은 이소 타입의 여러 항체가 서로 다른 immunoprecipitations 사용하는 경우, 같은 이소 타입 컨트롤에서 값으로 이들 각각을 정상화. 여러 대상 프라이머 쌍을 사용하는 경우 또한, 단일 제어 프라이머 쌍 세트의 DNA 수량은 각 목표 (그림 1 및 2)의 정상화를 위해 사용되어야한다. 출력 값이 아닌 특정 항체 배경 면역 침전을 기준으로 각 위치에서 특정 항체 면역 침전 배 농축을 나타냅니다. </li><li> 에 상대적으로 농축를 얻기 위해 제어 영역 프라이머의 배 농축 (제어 이소 타입하기)를 대상으로 프라이머의 배 농축 (제어 이소 타입 위하여) 분할컨트롤 언 바운드 영역 (그림 1). 중요한 때문에 각 샘플에 대한 총 입력 DNA, 표준 곡선의 생성 위의 immunoprecipitation의 값을 각각의 표준 곡선에서 이미 정상화되어 보간, 다음과 같이 표현주의, 머신 소프트웨어에 의해 총 입력의 비율. </li><li> 면역 침전이나 세정에 사용되는 버퍼의 엄중가 너무 높은 경우, 이소 타입 컨트롤에서 증폭 샘플이 관찰되지 않습니다 immunoprecipitated 동안 특정 항체 immunoprecipitated 샘플에서 강력한 증폭이 관찰 될 가능성이 있습니다. 이러한 시나리오에서는 대상 지역과 언 바운드 영역 모두에 대한 항체 칩에서 이소 타입 제어 칩의 양을 빼는 것이 좋습니다. 상대 농축 언 바운드 영역 (그림 3)에 대한 차이에 의한 대상 지역의 차이를 나누어 계산 될 수있다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

프로토콜은 위에 정확하게 칩을 사용하여 기본 림프구의 DNA 농축을 정량화하는 강력한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜의 안정성에 대한 하나의 주요 이유는 생물학적가 복제를 포함합니다. 위의 프로토콜은 세 가지가 독립적으로 계산되는 농축을 복제합니다. 출력은 다음 농축과 변화의 측정을 제공하기 위해 계산 된 표준 편차의 정도를 제공하기 위해 평균한다. 각 샘플은 세 가지 기술은 또한 샘플 처리의 변화, PCR 증폭 등의 기술적 인 반복의 변화의 양이 다른 생물 학적 샘플 사이에 관찰 된 것보다 일반적으로 훨씬 적다을 제거하기 위해 수행하는 복제합니다. 견고성에 대한 두 번째 이유는 이소 타입 - 대조군 항체, 표준 입력 DNA 곡선의 사용 및 비 특정 게놈 영역에 해당하는 컨트롤의 amplicon의 사용을 포함한 여러 기술 컨트롤을 포함합니다. <p class위의 방법 = &quot;jove_content&quot;&gt; 제한은 일반적으로 칩을 사용하여 발생하는 것과 유사하다. 방법은 다소 빈약 한 공간 분해능을 앓고,...

<table><tbody><tr><td>포름 알데히드</td><td>시그마</td><td>F-8775</td><td>RT</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 정제</td><td>Roche</td><td>04693116001</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>단백질 G 마그네틱 비즈</td><td>액티브 모티프</td><td>101945</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>RNase A (20 mg/ml)</td><td>EMD Millipore</td><td>556746</td><td>-20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 K (20 mg / ml)</td> <td>Roche</td><td>03115879001</td><td>50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10966-034</td>에 용해 <td>-20 °C에 보관; C</td></tr><tr><td>SYBR Green I</td><td>Invitrogen</td><td>S7567</td><td>-20 &deg; C</td></tr><tr><td>1 M 글리신</td><td></td><td></td><td>RT</td></tr><tr><td>세포 용해 완충액에 보관 (5 mM 파이프, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5 % NP-40)</td><td></td><td></td> <td>4 °C에 보관; C</td></tr><tr><td>핵 용해 완충액 (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1 % SDS)</td><td></td><td></td> <td>RT</td></tr><tr><td>ChIP 희석 완충액 (0.01 % SDS; 1.1 % Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)</td>에 보관4 <td></td><td></td><td>°C에 보관; C</td></tr><tr><td>저염 세척 완충액 (0.1 % SDS, 1 % 트리톤 X-100, 2 mM EDTA, 20 mM 트리스 pH 8.1, 150 mM NaCl)</td><td></td><td></td> <td>4 °C에서 보관; C</td></tr><tr><td>고 염분 세척 완충액 (0.1 % SDS; 1 % 트리톤 X-100; 2 mM EDTA; 20 mM 트리스 pH 8.1; 600 mM NaCl)</td><td></td><td></td> <td>4 °C에서 보관; C</td></tr><tr><td>LiCl 세척 완충액 (0.25 M LiCl; 1 % NP-40; 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 1 mM EDTA, 10 m 트리스 pH 8.0)</td><td></td><td></td> <td>4 °C에서 보관; C</td></tr><tr><td>TE 완충액 (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)</td><td></td><td></td> <td>4 °C에서 보관; C</td></tr><tr><td>용리 완충액 (1 % SDS; 0.1 M NaHCO3)</td><td></td><td></td> <td>RT에서 새로운</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td></td><td></td><td>저장</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td></td><td></td><td>RT</td></tr><tr><td>에서 저장 1 M Tris-HCl, pH 6.5</td><td></td><td></td><td>RT</td></tr><tr>에서 저장 colspan = <td colspan = 4 "> 특정 시약 표</td></tr><tr><td>Clay Adams 브랜드 Nutator</td><td>Becton Dickinson</td><td>모델: 421105</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 스탠드</td><td>Promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Masonix Sonicator 3000</td><td>QSonica</td><td>모델: S3000</td><td></td></tr><tr><td>UV 분광 광도계</td><td>NanoDrop Technologies</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>가열 블록</td><td>VWR</td><td>13259-030</td><td></td></tr><tr><td>회전자</td><td>VWR</td><td>80085-692</td><td></td></tr><tr><td>냉장 벤치 탑 원심 분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>모델: Allegra X-12R</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">장비 테이블 </td></tr></tbody></table>

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

염색질의 immunoprecipitation (칩)은 살아있는 세포의 염색질의 DNA와 다른 단백질의 상호 작용을 결정하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 예를 들면 시퀀스 특정 DNA 결합 전사 인자, 히스톤과 다른 수정 상태와 같은 RNA 중합 효소와 보조 인자와 같은 효소와 DNA 복구 구성 요소를 포함. 그 편재에도 불​​구하고, 소재 모두 벤치 준비 및 상호 작용의 정량적 측정을 허용 정확한 분석을위한 최신 상세한 방법론의 부족이있다. 정보의 부족으로 인해, 또한 어떤 면역 침전과 같은 조건이 실험 조건의 새로운 집합에 대해 다시 최적화해야하기 때문에 칩의 분석은 부정확하거나 잘못 정량 결과에 감염 될 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 궁극적으로 전사 인자에 정액 일에서 파생됩니다 DNA 상호 작용 1,2,하지만 sensiti에 개선의 번호를 통합하기 어려운 얻을 세포 유형에 대한 VITY 및 재현성. 프로토콜이 성공적으로 사용되어왔다 3,4, DNA 농축을 정량화하기 qPCR에 사용하거나, 아래의 프로토콜의 반 정량적 인 변형을 사용하여 두. PCR 증폭 물질이 정량적 분석은 계산 수행 및 분석에 제한 요소를 나타냅니다. 중요한 컨트롤 및 기타 고려 사항에 따라 변경을 표시하지 않는 등 연구중인 단백질 (또는 예상에 구속되지 않도록 예측 intergenic 지역으로 이소 타입을 맞춘 항체의 사용뿐만 아니라 게놈 DNA의 제어 영역의 평가를 포함 실험 조건). 또한, 모든 칩 샘플에 대한 입력 자료의 표준 곡선은 실험 물질에 농축의 절대 수준을 도출하는 데 사용됩니다. 표준 곡선의 사용에 관계없이 설계하는 방법을주의 깊게의 프라이머 세트 사이에 계정의 차이를 고려하고, 또한 효율이 다를 수 있습니다하나의 프라이머 세트에 대한 템플릿 농도의 범위에 걸쳐 ences. 우리 프로토콜은 우리가 광범위 나중에 분석 단계를 포함한다는 점에서 5-8 사용할 수있는 다른 사람과 다른 것입니다.

염색질의 immunoprecipitation (칩) 프로토콜은 따라서 &quot;로드 관리&quot;역할, 게놈의 언 바운드 영역을 증폭 프라이머 쌍의 사용을 통해 PCR에 사용되는 DNA의 양 (있는 경우), 차이 여기에 컨트롤을 선보였다. 그림 3의 예제에서, 우리는 대상 영역으로 마우스 IL2 발기인에 대한 관심과 전사 인자 NFAT 바인딩 사이트의 우리의 단백질 지역 언 바운드로 마우스 Actb 유전자의 코딩 영역을 사용했습니다. 또한, 관심의 단백질에는 결합이없는 것으로 알려져 타겟 지역의 상류 또는 하류 지역에 몇 킬로베이스는이 목적을 위해 선택할 수 있습니다. 대상 지역의 프라이머 쌍을 디자인 할 때, PCR 제품의 이상적인 크기는 약 100 ~ 200 BP입니다. 계산이 프라이머는 게놈의 다른 곳 바인딩하지 않는지 확인하는 것도 중요하다. 차이에 바인딩 단백질의 상대적인 풍부이소 타입 제어 및 특정 ...

우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

다음 실험의 전반적인 목표는 전사 인자와 같은 DNA 결합 단백질의 결합 또는 히스톤 수식(histone modifications)을 검출하는 것입니다. 이를 위해 먼저 두 번째 단계로 크로마틴을 준비합니다. 이후 관심 단백질에 결합된 DNA 단편을 침전시키기 위해 크로마틴 면역침전 반응을 수행합니다.다음으로, 표적 단백질에 결합된 DNA 단편을 PCR로 증폭합니다. QPCR 분석을 통해 결합되지 않은 영역과 비교하여 표적 단백질에 결합된 DNA 단편의 배수 농축(fold enrichment) 정도를 나타내는 결과가 도출됩니다. 이 방법은 서로 다른 수정 또는 비수정 단백질이 언제, 어디에 존재하는지와 같이 전사, 염색질 및 후성유전학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.DNA에 대하여, 이 방법은 T-세포 유전자 조절에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 B 림프구, 백혈병 샘플 및 불멸화 세포주와 같은 다른 시스템에도 적용 가능합니다. 본 실험을 위한 염색질은 마우스 비장 나이브 CD4 T-세포로부터 준비될 것입니다.이 절차를 시작하려면, DMEM 내의 CD4 T-세포 현탁액에 37% formaldehyde를 최종 농도가 1%가 되도록 첨가하고 실온에서 15분 동안 가볍게 흔들어줍니다. 이 과정은 DNA-단백질 복합체를 가교 결합시킵니다. 1M glycine을 최종 농도가 125mM이 되도록 첨가하여 가교 결합을 중단시킵니다.실온에서 5분 동안 계속해서 흔들어 줍니다. 4°C에서 200 G로 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다. 상층액을 제거하고 프로테아제 억제제가 포함된 얼음처럼 차가운 PBS 5 mL에 세포를 재부유시킨 후 다시 원심분리하며, 이런 방식으로 총 3회 세포를 세척합니다. 마지막 세척 후 상층액을 버리고 프로테아제 억제제가 포함된 얼음처럼 차가운 세포 용해 버퍼 1 mL에 세포를 재부유시킵니다.세포 현탁액을 1.7 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 4°C에서 200 G로 5분간 원심분리하여 핵을 수집합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 500 µL의 핵 용해 버퍼(nuclear lysis buffer)에 핵을 재현탁합니다.단백질 분해 효소 억제제가 포함된 완충액을 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 다음으로, 1.6 millimeter 프로브와 출력 레벨 4를 사용하여 세포를 15초 동안 초음파 처리합니다. 과열을 방지하기 위해 샘플을 얼음 위에서 1~2분 동안 냉각시킨 후, 다시 15초 동안 초음파 처리합니다.초음파 처리와 냉각 과정을 총 4회 반복한 후, 초음파 처리된 크로마틴을 4 °C에서 16,000 G로 5분간 원심 분리합니다. 투명한 상층액을 새로운 마이크로 원심 분리 튜브에 수집합니다.투명한 상층액 20 µL를 분취하여 제거합니다. DNA 로딩 다이를 추가하고 2% 아가로스 겔 전기영동을 통해 초음파 처리된 DNA를 확인합니다. 대부분의 응용 분야에서 초음파 처리된 DNA의 이상적인 크기는 200 내지 500 bp입니다.마지막으로, UV 분광광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. 전단된 크로마틴은 즉시 크로마틴 면역침강 반응을 설정하는 데 사용하거나, 크로마틴 면역침강을 위해 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 프로테아제 억제제가 포함된 chip 희석 완충액을 사용하여, 총 부피 2 mL에서 DNA 농도가 5~10 µg/mL가 되도록 초음파 처리된 크로마틴을 희석합니다. 이 절차의 모든 단계는 0~4 °C에서 수행되어야 합니다.희석된 초음파 처리 크로마틴의 10%(본 예시에서는 200 µL)를 입력용(input)으로 따로 보관하여 얼음에 두고, 남은 샘플 분량을 isotype control 및 관심 항체(antibody of interest)라고 라벨이 붙은 네 개의 1.7 mL 마이크로 튜브에 각각 450 µL씩 분주합니다. 동일한 isotype의 항체를 여러 개 사용하는 경우, 단일 isotype control만으로도 충분합니다. 이 분석을 수행하기 위해, 사용되는 항체의 특이성에 따라 2~5 µg의 특이 항체 또는 isotype control을 각각의 튜브에 첨가합니다. 튜브를 4 °C에서 하룻밤 동안 흔들어주어 다음 날 아침까지 크로마틴-항체 복합체가 형성되도록 합니다.각 혼합물에 25 µL의 protein G magnetic beads를 추가하고 4 °C에서 최소 2시간 동안 흔들어 섞어줍니다. 다음으로, 비드들이 자화된 측면에 모일 수 있도록 원심분리관을 자력 스탠드 위에 15~20초 동안 둡니다. 비드가 흐트러지지 않도록 주의하여 흡입법으로 용액을 제거합니다.저염 세척액 1 mL를 첨가하고 무타터(mutator) 위에서 5분 동안 천천히 흔들어 줍니다. 자성 스탠드를 사용하여 비드를 수집하고 세척액을 제거합니다. 다시 저염 세척액 1 mL를 첨가하고 5분 동안 천천히 흔들어 줍니다.저염 세척액을 제거한 후, 고염 세척액 1 mL를 첨가하고 5분 동안 흔들어 줍니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 수집하고 세척액을 제거합니다. 고염 세척액으로 세척 과정을 반복합니다.고염 세척액을 제거한 후, 리튬 클로라이드 세척액 1 mL를 첨가하고 5분 동안 쉐이킹(rocking)합니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 회수하고 세척액을 제거합니다. 리튬 클로라이드 세척 과정을 한 번 더 반복합니다.TE 용액 1 mL를 첨가하고 5분 동안 흔들어 섞어줍니다. 자성 스탠드를 사용하여 비드를 수집하고 세척 용액을 제거합니다. 용출 버퍼 250 µL를 첨가한 후 상온에서 15분 동안 흔들어 비드로부터 DNA를 용출합니다.EIT를 피펫으로 분리하여 새로운 1.7 millimeter fuge tube에 보관합니다. 이 과정을 한 번 더 반복하여 두 용출액을 합치고, 가교 결합을 해제하기 위해 비드를 제거합니다. 용출된 DNA에 5 molar sodium chloride를 최종 농도 0.3 molar가 되도록 첨가하고, 1 µL의 RNAs를 추가합니다.이전에 저장해 둔 입력물에 용출 버퍼 400 µL를 추가합니다. 각 입력물의 부피를 500 µL로 맞추기 위해, 0.3 M NaCl 1 µL, 0.5 M EDTA 10 µL, 1 M tris-HCl pH 6.5 20 µL, 그리고 proteinase K 1 µL를 추가합니다. 튜브를 밀폐하고 건식 가열 블록에서 65 °C로 하룻밤 동안 배양한 다음, 다음 날 아침에 튜브를 실온까지 식힙니다. 그런 다음 100% 에탄올 1 mL를 추가하고 -80 °C에서 2시간에서 하룻밤 동안 배양합니다.DNA를 침전시키기 위해 16,000 G에서 15분 동안 튜브를 원심분리합니다. DNA 펠렛을 만들기 위해 70% ethanol로 DNA 펠렛을 한 번 세척하고 공기 중에서 건조합니다. 100 µL의 오토클레이브 멸균 증류수에 DNA 펠렛을 재부유시키고, Qiagen Quick spin column을 사용하여 DNA를 정제한 후 총 50 µL 부피의 용출 완충액으로 용출합니다. 이렇게 얻은 DNA는 이제 PCR 증폭에 사용할 수 있습니다.대조군 비결합 영역 대비 전체 농축도를 얻기 위한 QPCR 분석은 이 프로토콜에서 가장 중요한 부분입니다. QPCR 소프트웨어를 사용하여 에디터로 이동한 다음, 다양한 희석 배율의 입력 샘플이 포함된 웰에 표준 곡선 값을 표시하십시오. 또한, PCR 플레이트의 배치와 동일하게 미지의 칩 샘플이 포함된 웰에 라벨을 지정하십시오.표준 곡선을 사용하여 미지의 특이적 및 아이소타이프 샘플 내 DNA 양을 보간함으로써, 샘플에서 발견되는 농도 범위 전반에 걸쳐 모든 프라이머 세트의 품질과 효율성을 평가하고 일치시킬 수 있습니다. 서브셋 편집기로 이동하여 입력 샘플이 포함된 웰과 미지의 칩 샘플을 포함한 서브셋을 표시하십시오. 분석을 위해 알려진 농도의 입력 샘플로부터 생성된 표준 곡선을 사용하여 미지 샘플을 정량화하게 됩니다.PCR 증폭이 완료되면, ABS quant. Second derivative max.로 분석을 수행합니다. 분석할 서브셋을 선택한 후 확인(Okay)을 누르십시오.계산(calculate)을 누르면 입력된 샘플의 기지 농도를 사용하여 표준 곡선이 생성되며, 미지 샘플에 존재하는 DNA의 절대량이 표시됩니다. DNA의 품질이 좋고 프라이머가 표적 영역에 특이적으로 결합한다면, PCR 효율은 2에 가까워야 합니다. 가능한 경우 동일한 서브셋에 대해 TM 콜링을 포함한 융해 곡선 분석을 수행하십시오. 단일 피크가 나타나면 하나의 특이적 산물만 증폭되었음을 나타냅니다.특정 DNA의 증폭 여부는 PCR 산물을 DNA 래더와 함께 AROS 젤로 전기영동하여 확인할 수 있습니다. 얻어진 데이터는 탭으로 구분된 텍스트 파일로 내보낼 수 있으며, 이는 추가 분석을 위해 Microsoft Excel에서 열 수 있습니다. 표적 프라이머에 대해 특이 항체의 DNA 양을 이소타입 대조군의 DNA 양으로 나눕니다.대조군 영역 프라이머에 대해 이 단계를 반복하십시오. 서로 다른 면역 침강에 동일한 이소형의 항체가 여러 개 사용된 경우, 각각을 동일한 이소형 대조군의 값으로 표준화하십시오. 또한, 여러 개의 표적 프라이머 쌍이 사용된 경우, 단일 대조군 프라이머 세트에서 얻은 DNA 양을 각 표적의 표준화에 사용해야 합니다.출력값은 비특이적 항체 배경 면역침전 대비 각 위치에서의 특이적 항체 면역침전 농축 배수를 나타냅니다. 대조군 비결합 부위에 대한 상대적 농축도를 구하려면, 표적 프라이머의 농축 배수를 대조 영역 프라이머의 농축 배수로 나눕니다. 중요한 점은, 각 샘플의 총 입력 DNA를 사용하여 표준 곡선을 생성했기 때문에, 표준 곡선에서 보간된 각 면역침전 값은 이미 기기 소프트웨어에 의해 총 입력 DNA의 분율로 정규화되어 표시된다는 것입니다. 본 과정에서 시연된 염색질 면역침전 프로토콜은 게놈의 비결합 부위를 증폭하는 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 사용된 DNA 양의 차이를 제어하며, 이를 통해 로딩 대조군으로 활용합니다.본 예시에서는 마우스 beta actin 유전자의 코딩 영역을 표적 단백질과 결합하지 않는 영역으로 사용하였으며, 마우스 IL2 프로모터의 전사 인자 및 지방 결합 부위를 표적 영역으로 사용하였습니다. 이 Excel 스프레드시트 스냅샷은 노란색, 녹색, 보라색 상자로 표시된 세 번의 실험 반복 데이터와 세 번의 기술적 반복 데이터를 통해 분석 데이터에서 설명된 계산 프로토콜을 사용하는 모습을 보여줍니다. 각 데이터는 농축 배수(fold enrichment)를 계산하는 데 사용되었습니다.동일한 유형의 아이소타입 대조군 및 특이적 항체를 선택하면, 게놈의 서로 다른 영역에 결합된 단백질의 상대적 농축도를 비교할 수 있습니다. 항체의 특이성이 높을 경우, 일반적으로 결합되지 않은 대조 영역에 비해 2배에서 10배 정도의 농축이 관찰됩니다. 이 그림은 마우스에서 분리한 일반적인 CD4 T 세포와 조절 CD4 T 세포를 이용한 ChIP 실험 결과를 보여줍니다.소량의 conventional T 세포를 PMA와 ion mycin으로 30분 동안 자극했습니다. IL two 프로모터에서 NFA 전사 인자인 N fat C one 및 NFA C two의 상대적 농축이 관찰되었으며, 이는 본 절차 이후 unbound 영역 대비 fold enrichment로 여기에 묘사되어 있습니다. 전사 인자의 전역적 점유 상태나 자극에 따른 후성유전적 표지의 전역적 변화를 확인하기 위해 ChIP-seq과 같은 다른 방법들을 사용할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 소량의 세포를 사용하여 염색질 면역침강을 수행하는 방법과, 대조군인 비결합 영역과 비교하여 전사 인자의 결합 정도를 결정하기 위해 QPCI 데이터를 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

ESC의 차별은 셀 타입의 특정 구조의 변화와 염색질의 구성과 일치한다. 이러한 변화의 감지는 stemcellness 및 세포 분화를 정의하는 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공합니다. 염색질 immunoprecipitation (칩)은 줄기 세포 분화를 기본 분자 메커니즘을 해부하다하는 소중한 방법을 나타냅니다.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

이 동영상은 단백질-DNA 상호작용을 입증하는 고전적인 기술인 염색질 면역침전(ChIP) 분석 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술은 인간 만성 림프구성 백혈병 세포에서 표적 유전자를 확인하는 데 사용됩니다.

염색질 면역침전 분석법: 세포에서 단백질-DNA 상호 작용을 연구하는 기술

염색질의 immunoprecipitation과 매우 높은 처리량 시퀀싱 (칩 SEQ)의 조합은 특정 조직이나 세포주에서 단백질 DNA 상호 작용을 파악하고 매핑 할 수 있습니다. 설명은 예를 들어 전사 인자 TCF7L2 경험을 사용하여 다음 순서를위한 고품질 칩 템플릿을 생성하는 방법이다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

DNA- 단백질 상호 작용은 여러 생물학적 과정에 필수적입니다. 세포 기능을 평가하는 동안 DNA- 단백질 상호 작용의 분석은 유전자 조절을 이해하는 데 없어서는 안될 필수 요소입니다. Chromatin immunoprecipitation (ChIP)은 생체 내에서 그러한 상호 작용을 분석하는 강력한 도구 입니다.

Chromatin Immunoprecipitation을 이용한 c-KIT 리간드 프로모터 분석

우리는 cross-linked 마우스 골격근으로부터 고품질의 핵을 분리하기위한 여과 기반의 프로토콜을 제시했습니다. 우리는 초 원심 분리의 필요성을 제거하여 쉽게 적용 할 수있게했습니다. 우리는 핵에서 준비한 염색질이 염색질 면역 침전 및 염색질 면역 침전 시퀀싱 연구에 적합 함을 보여줍니다.

Chromatin Immunoprecipitation을위한 Cross-linked Skeletal Musculus로부터 고품질 핵을 준비하기위한 Filtration 기반 방법

여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

염색 질 chromatin immunoprecipitation 근육 섬유에 있는 유전자 규칙의 학문에 적응 하는 성인 마우스 골격 근육에서의 준비에 대 한 새로운 프로토콜 제공 됩니다.

마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

이것은 후속 proteomic 분석에 대 한 가교 된 chromatin의 순서 특정 캡처에 의존 하는 특정 대상 loci에 새로운 상호 작용 하는 DNA 단백질을 식별 하는 방법. 잠재적인 바인딩 단백질도 세포 수정에 대 한 사전 지식이 요구 된다. 처음에 효 모에 대 한 개발, 기술은 지금 되었습니다 포유류 세포에 대 한 적응.

교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 Chromatin 관련 단백질의 캡처

여기는 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 분리의 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq) 다음 효율적인 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 히스톤 수정 매핑와 관심 비보의 비 히스톤 단백질의 게놈 넓은 지역화 조사에 적합 합니다.

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

크로마틴 면역 침전 (ChIP)은 유전자 조절의 분자 메커니즘을 이해하는 강력한 도구입니다. 그러나, 이 방법은 기계적 전단에 의한 재현가능한 크로마틴 단편화를 얻는 데 어려움을 수반한다. 여기서, 우리는 효소 소화를 사용하여 ChIP 분석에 대한 향상된 프로토콜을 제공한다.

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

학습하세요 제한된 세포량의 1차 T세포를 이용한 효율적인 염색질 면역침전법(ChIP)으로 DNA 결합 단백질과 히스톤 변형을 검출하는 방법을. 이 기법은 전사 조절 및 후성유전학 연구에 필수적인 도구입니다.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

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