바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

다음 실험의 전반적인 목표는 전사 인자와 같은 DNA 결합 단백질의 결합 또는 그의 결석 변형을 감지하는 것입니다. 이는 먼저 두 번째 단계로 염색질을 준비함으로써 달성됩니다. 염색질 면역침전 반응은 관심 단백질에 결합된 DNA 단편을 끌어내리도록 설정됩니다.

다음으로, 관심있는 단백질에 결합된 DNA 단편은 PCR에 의해 증폭됩니다. QPCR 분석을 기반으로 결합되지 않은 영역과 비교하여 관심 단백질에 결합된 DNA 단편의 접힘 농축을 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 이 방법은 전사, 염색질 및 후성유전학 분야의 주요 질문(예: 다양한 변형 또는 변형되지 않은 단백질이 존재하는 시기와 장소)에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

DNA에 대하여: 그러나 이 방법은 T 세포 유전자 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 B 림프구, 백혈병 샘플 및 불멸화된 세포 라인과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 실험을 위한 염색질은 마우스의 비장 나이브 CD 4개의 T 세포로부터 제조될 것이다.

이 절차를 시작하려면 DMEM의 CD 4 T 세포 현탁액에 최종 농도 1%에 37%의 포름알데히드를 추가하고 실온에서 15분 동안 부드럽게 흔듭니다. 이것은 DNA 단백질 복합체를 가교 결합시킵니다. 최종 농도인 125 millimolar에 하나의 몰 글리신을 첨가하여 교차결합을 중지합니다.

실온에서 5분 동안 계속 흔듭니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 200G에서 원심분리하여 세포를 수집합니다. 상층액을 제거하고 프로테아제 억제제를 함유한 5ml의 얼음처럼 차가운 PBS에서 세포를 다시 부유시키고, 최종 세척 후 총 3회 동안 이러한 방식으로 세포를 세척하고, 상등액을 버리고 프로테아제 억제제를 함유한 1ml의 얼음 저온 세포 용해 완충액에 세포를 재현탁합니다.

세포 현탁액을 1.7ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 200G에서 원심분리하여 핵을 수집합니다. 상등액을 조심스럽게 버리고 핵 용해 500마이크로리터에 핵을 재현탁합니다.

프로테아제 억제제가 함유된 완충액은 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 다음으로, 1.6mm 프로브와 4의 출력 레벨을 사용하여 15초 동안 세포를 초음파 처리합니다. 과열을 방지하기 위해 얼음에서 샘플을 1-2분 동안 식힌 후 15초 동안 다시 초음파 처리합니다.

총 4 회 원심 분리기에 대한 초음파 처리 및 냉각을 반복하고, 16, 000 G에서 5 분 동안 음파 염색질을 반복합니다. 섭씨 4도. 새 마이크로 원심분리기 튜브에 투명 상층액을 수집합니다.

20마이크로리터의 투명 상등액 분취액을 제거합니다. DNA loading dye를 첨가하고 2%agro gel을 통해 전기영동으로 초음파 처리된 DNA를 확인합니다. 대부분의 응용 분야에서 초음파 처리된 DNA의 이상적인 크기는 200-500 염기쌍입니다.

마지막으로 UV 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. 전단 염색질은 즉시 염색질 면역침전 반응을 설정하는 데 사용되거나 염색질 면역침전을 위해 섭씨 음의 80도에서 저장하거나 단백질 분해 효소 억제제가 있는 칩 희석 완충액에서 총 부피 2밀리리터에서 밀리리터당 5-10마이크로그램의 DNA 농도로 희석된 초음파 염색질을 저장할 수 있습니다. 이 절차의 모든 단계는 섭씨 0도에서 4도에서 수행해야 합니다.

이 예에서는 희석된 초음파 처리된 염색질의 10%를 저장하고, 나머지 샘플의 얼음 위에 저장하고, 450마이크로리터를 동형, 제어 및 관심 항체로 표시된 4개의 1.7 밀리리터 마이크로뷰 튜브 각각에 저장합니다. 동일한 동형의 항체를 여러 개 사용하는 경우 단일 동형(isotype) 대조군으로도 충분합니다.이 분석을 수행하려면 사용된 항체의 특이성에 따라 2-5마이크로그램의 특정 항체 또는 동형(isotype) 대조군을 각 튜브에 추가합니다. 다음 날 아침에 염색질 항체 복합체가 형성될 수 있도록 섭씨 4도에서 밤새 튜브를 흔듭니다.

각 혼합물에 25마이크로리터의 단백질 G 마그네틱 비드를 추가하고 섭씨 4도에서 최소 2시간 동안 록킹합니다. 그런 다음 fuge 튜브를 마그네틱 스탠드에 15-20초 동안 놓아 비드가 자화된 쪽에 모일 수 있도록 합니다. 구슬을 방해하지 않고 흡인으로 용액을 조심스럽게 제거하십시오.

저염 세척액 1ml를 넣고 돌연변이원에서 5분 동안 부드럽게 흔듭니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 구슬을 모으고 세척 용액을 제거합니다. 저염 세척액 1ml를 다시 넣고 5분 동안 부드럽게 흔듭니다.

저염 세척액을 제거한 후 고염 세척액 1ml를 넣고 5분 동안 흔들어 놓습니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 구슬을 모으고 세척 용액을 제거합니다. 고염 세척 용액으로 세척을 반복합니다.

고염 세척 용액을 제거한 후 염화리튬 세척 용액 1ml를 넣고 5분 동안 흔듭니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 구슬을 모으고 세척 용액을 제거합니다. 염화리튬 세척을 한 번 반복합니다.

TE 용액 1ml를 넣고 5분 동안 흔듭니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 구슬을 모으고 세척 용액을 제거합니다. 실온에서 15분 동안 250마이크로리터의 엘루시안 완충암을 첨가하여 비드에서 DNA를 용리합니다.

EIT를 피펫으로 분리하고 이 재료를 새로운 1.7mm 퍼지 튜브에 저장합니다. 한 번 더 반복하고 두 elu를 결합하고 구슬을 버리고 교차 링크를 반전시킵니다. 유출된 DNA에 5몰 염화나트륨을 0.3몰의 최종 농도와 1마이크로리터의 RNA로 추가합니다.

A: 이전에 저장한 입력에 400마이크로리터의 용리 버퍼를 추가합니다. 각 입력에 부피를 500 마이크로 리터로 만들려면 0.3 몰 1 마이크로 리터의 RNA, 0.5 몰 EDTA 10 마이크로 리터, 1 몰 트리스 20 마이크로 리터, HCL pH 6.5 및 단백질 분해 효소 1 마이크로 리터에 염화나트륨을 추가하십시오. 튜브를 실온으로 식히십시오. 그런 다음 100% 에탄올 1ml를 넣고 섭씨 영하 80도에서 하룻밤 동안 2시간 동안 배양합니다.

DNA 분리기를 침전시키기 위하여는, 16, 15 분 동안 000 G에 관. DNA 세척을 펠릿화하기 위하여는, 70%ethanol로 DNA 펠릿을 한 번 말리고, 펠릿은 다시 현탁시키고, 오토클레이브 증류수의 100 마이크로리터에 있는 DNA 펠릿은, 카약, 빠른 급강하 칼럼을 사용하여 DNA를 순화하고 50 마이크로리터 용출 완충액의 총계에서 용출합니다. 이 DNA는 이제 PCR 증폭에 사용할 준비가 되었습니다.

제어 바인딩되지 않은 영역에 대한 완전한 농축을 얻기 위한 QPCR 준비금 분석은 이 프로토콜의 가장 중요한 측면입니다. QPCR 소프트웨어를 사용하여 편집기로 이동하여 다양한 희석액의 입력 샘플이 포함된 웰을 표준 곡선 값으로 표시합니다. 또한 PCR 플레이트가 배치된 대로 정확하게 알 수 없는 칩 샘플로 웰에 라벨을 붙입니다.

표준 곡선을 사용하여 알려지지 않은 특이형 및 동형 샘플에서 DNA 양을 보간하면 샘플에서 발견되는 농도 범위에 걸쳐 모든 프라이머 세트의 품질과 효율성을 평가하고 일치시킬 수 있습니다. subset editor로 이동하여 입력 샘플이 있는 well과 unknown chip samples를 포함한 서브셋을 표시합니다. 미지의 샘플은 분석을 위해 알려진 입력 샘플 농도에서 생성된 표준 곡선을 사용하여 정량화됩니다.

PCR 증폭이 완료된 후 ABS quant로 분석을 수행합니다. 2차 미분 최대 분석할 하위 집합을 선택하고 를 누릅니다. 그래.

입력 샘플의 알려진 농도를 사용하여 표준 곡선을 생성하고 DNA의 품질이 양호하고 프라이머가 대상 영역에 특별히 결합하는 경우 알 수 없는 샘플에 존재하는 DNA의 절대량을 표시하는 계산을 누르면 PCR 효율이 2에 가까워야 합니다. 사용 가능한 경우 동일한 하위 집합을 호출하는 TM을 사용하여 용융 곡선 분석을 수행합니다. 단일 피크는 하나의 특정 제품만 증폭되었음을 나타냅니다.

특정 DNA의 증폭은 AROS 겔을 통한 DNA 래더와 함께 PCR 산물을 전기로 테스트하여 테스트할 수도 있습니다. 그런 다음 얻은 데이터는 탭으로 구분된 텍스트 파일로 내보내지며 추가 분석을 위해 Microsoft Excel에서 열 수 있습니다. 특정 항체에 대한 DNA 양을 표적 프라이머에 대한 isotype control로 나눕니다.

제어 영역 Primers에 대해 이 단계를 반복합니다. 서로 다른 면역 침전에 동일한 isotype의 여러 항체가 사용되는 경우, 동일한 isotype control의 값으로 각 항체를 정규화합니다. 또한, 여러 개의 targeted primer pair를 사용하는 경우, 각 target의 normalization을 위해 single control primer repair set의 DNA 수량을 사용해야 합니다.

출력 값은 비특이적 항체에 상대적인 각 위치에서의 특이적 항체 면역침전 폴드 농축을 나타냅니다: 배경 면역침전은 표적 프라이머에 대한 폴드 농축을 대조군 영역 프라이머에 대한 폴드 농축으로 나누어 대조군 결합되지 않은 영역에 대한 상대적인 농축을 얻습니다. 중요한 것은 각 샘플에 대한 총 입력 DNA가 있는 표준 곡선이 생성되기 때문에 표준에서 보간된 각 면역침전 값은 이미 정규화되어 기계 소프트웨어에 의해 총 입력의 비율로 표현된다는 것입니다. 여기에서 입증된 염색질 immunoprecipitation 프로토콜은 게놈의 결합되지 않은 영역을 증폭하는 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 사용되는 DNA의 양에서 차이를 제어하여 로딩 제어 역할을 합니다.

본 실시예에서는 마우스 beta actin 유전자의 암호화 영역을 관심 단백질에 결합되지 않은 영역으로 사용하였고, 마우스의 전사 인자 및 지방 결합 부위, IL 2 promoter를 타겟 영역으로 사용하였다. 이 Excel 스프레드시트의 스냅샷은 노란색, 녹색 및 보라색 상자에서 세 가지 실험 반복의 분석 데이터에 설명된 계산 프로토콜의 사용을 세 가지 기술 복제와 함께 보여줍니다. 각각은 폴드 농축을 계산하는 데 사용되었습니다.

게놈의 다른 영역에 결합된 단백질의 상대적 농축은 동일한 세트의 동형, 대조군 및 특정 항체가 선택되는 경우 비교할 수 있습니다. 항체의 특이성이 양호한 경우, unbound control region에 대해 2배에서 10배의 농축이 일반적으로 관찰됩니다. 이 그림은 마우스에서 분리된 기존 CD 4개의 T 세포 및 조절 CD 4개의 T 세포를 사용한 칩 실험의 결과를 보여줍니다.

기존 T 세포의 작은 부분을 PMA와 이온 마이신으로 30분 동안 자극했습니다. IL 2 프로모터에서 NFA 전사 인자 Nfat C 1 및 NFA C 2의 상대적 농축이 관찰되었으며, 본 명세서에서는 이 절차에 따른 결합되지 않은 영역에 대한 폴드 농축으로 묘사된다. ChIP-seq와 같은 다른 방법은 자극에 대한 반응으로 전사 인자의 전체 점유 또는 후성유전학적 표시의 전 세계 변화를 해결하기 위해 사용할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 제한된 수의 세포를 사용하여 염색질 면역침전을 수행하는 방법과 QPCI 데이터를 분석하여 대조군 결합되지 않은 영역과 비교하여 전사 인자 밴딩을 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.