Name: 항생제 내성 황색 포도상 구균 박테리아의 검출을위한 바이오 센서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-08T09:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: 배우세요 MRSA와 MSSA를 구분하는 용해성 파지 바이오센서 기술을 이용한 황색포도상구균 검출 방법입니다. 석영 결정 미세저울 센서에 파지를 고정하여 DNA 추출 없이 빠르게 항생제 내성 균주를 식별할 수 있습니다.

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여기에보고 된 연구는 오번 대학교 AUDFS 및 USAF CRADA 07-277 - 60MDG-01에서 교부금에 의해 지원되었다. 이 문서에 표현 된 뷰는 저자의 사람이며, 공식적인 정책이나 미국 공군, 국방부, 또는 미국 정부의 입장을 반영하지 않습니다.

1. 스테이지 설정 <ol><li> 형 균주 S.를 얻을 구균 ATCC 12600, S. 구균 ATCC의 27690과 바실러스 서브 틸리 스 ATCC는 6051입니다. S.의 메티 실린 내성 구균 - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis의 Sterne 다음, 살모넬라 티피 뮤 리움 LT2, 시겔 flexneri, 예 르시 니아 enterocolotica, 프로 테우스 mirabilis의, 폐렴 간균 13882, 용해성 파지 12600. </li><li> PBP 2a에 항체 결합 라텍스 구슬을 구하십시오. </li><li> 21 설명 된대로 NZY 매체를 준비합니다. </li><li> 인산를 얻기는 생리 식염수 (PBS)를 버퍼. </li><li> 랭 뮤어 - 블로 젯 (LB) 단층 증착 subphase로 증류수를 준비합니다. </li></ol> 2. 박테리오파지 전파 및 적정 <ol><li> S.의 하룻밤 문화 5 mL를 품다 파지의 500 μL (3 구균 ATCC 12600 (3.6 × 10 8 콜로니 형성 단위 (CFU) / ㎖) × 10 9 &lt;/ 37 ° C에서 하룻밤 쉐이커 인큐베이터에 2 L 플랙 500 ML의 NZY 매체에)&gt; PFU / ㎖을 먹다. </li><li> 4시 10 분 4,424 XG에 문화를 원심 분리기 ° C. </li><li> 4 10 분 11,325 XG에서 다시 원심 분리 상층 ° C. </li><li> 0.22 μm의 밀리 포아 필터를 통해 필터 상층 액. </li><li> 1.5 시간 동안 75,395 XG에서 여과 액을 원심 분리기. </li><li> 증류수 100 μL에 펠렛을 녹인다. </li><li> NZY 매체에 파지 현탁액의 10 배 희석을 준비합니다. </li><li> S.의 하룻밤 (ON) 문화 판 1 ML 모든 표면이 포함되어 있는지 확인하는 NZY 한천 2 플레이트의 각 상 구균 ATCC 12600을. 문화의 과잉을 제거하고 30 분 동안 표면을 건조 할 수 있습니다. </li><li> 판의 표면에 적절한 파지 희석 시료 (10 μL)을 발견하고 18-24 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 플라크의 형성을 검토하고 파지 역가를 계산합니다. 살균 역가 (T)가 P의 수에 기초하여 추정laques (N)는 파지 서스펜션과 희석 계수 (F) 10 μL 부피 (V) 당 형성했다. . T는 = N / (VXF) 예를 들어, 희석 10-7에서 플라크의 수를 75 부피 10 μL (10 × 10 -3 ML)의 경우, 역가가 75 / 같습니다 : 역가가 공식으로 계산 하였다 (10 × 10 -3 × 10 -7) = 7.5 × 10 10 플라크 형성 단위 (PFU) 당 ML 정지. </li></ol> 3. 금 고정 파지 <ol><li> 다음 10 분 동안 아르곤 에칭 플라즈마에 의한 깨끗한 골드 코팅 된 석영 조각 (60mm 2) 살균 캐비닛에 UV 빛의 밑에 6 시간 동안 살균. </li><li> 멸균 페트리 접시에있는 각 조각의 금 표면에 1 × 10 9 PFU / ㎖ 파지 현탁액의 50 μl를 추가하고 실온에서 습기 챔버에서 하룻밤 배양한다. </li><li> 나머지 파지 현탁액을 제거하고 역가. </li><li> 언 바운드를 제거하는 PBS로 파지와 조각 5 번 씻으십시오파지. </li></ol> 4. 건조한 표면에 고정 파지 감염성 테스트 <ol><li> NZY 한천 배지에 S. 구균 ATCC 12600의 O / N 문화를 확산하고 건조 할 수 있습니다. </li><li> 플레이트 얼굴에 고정 파지와 금 조각을 아래로 놓습니다. </li><li> 37 12 시간 배양 한 후 용해의 영역을 관찰 ° C 그 감염을 나타냅니다. </li><li> 제어 실험없이 파지와 골드 커버 조각을 사용합니다. </li></ol> 5. 액체의 무료와 바인딩 파지의 용해성 활동의 테스트 <ol><li> S.의 ON 문화 추가 네 300 ML 사이드 암 플라스크의 모든 (6 × 10 6 CFU / 각 플라스크에 ml)에 NZY의 구균 ATCC 12600-10 ML. </li><li> 두 개의 플라스크 2 × 10 6 PFU / 무료 파지의 ML에 추가합니다. </li><li> 컨트롤과 같은 다른 두 플라스크를 사용합니다. </li><li> S.의 시간 경과를 모니터링 모든 플라스크 30 분 간격으로 광학 밀도 측정 (OD 600)의 570 분 구균 세포 용해.</li><li> 24 시간에서 최종 측정을 가져 가라. </li><li> 단계 5.1-5.5를 반복하지만, 제어 플라스크 없음 파지 골드 바운드 파지 대신 무료로 파지와 조각, 골드 조각을 사용합니다. </li></ol> 6. 부화하는 동안 바인딩 파지 손실 <ol><li> 실온에서 하룻밤 습도 챔버에 배치됩니다 페트리 접시에 무균 금 조각의 표면에 1 × 10 9 PFU / ㎖ 파지의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 금 표면과 역가에서 언 바운드 파지와 서스펜션을 제거합니다. </li><li> 8 시간 동안 37 ° C에서 5 PBS로 시간과 장소 쉐이커 배양기에서 15 ML 튜브 1 ML의 NZY 솔루션 바운드 파지와 금 조각을 씻으십시오. </li><li> 2에 설명 된대로 분리 된 파지의 역가를 결정합니다. </li></ol> 7. 파지 상체 준비 <ol><li> 1 ML 유리 병의 분광 등급 클로로포름의 동일한 볼륨 스톡 파지 12600 서스펜션 (10 11 PFU / ㎖)의 400 μl를 결합실온에서. </li><li> 부드럽게 소용돌이 5-6 시간 (5 초 간격) 일분 기간 동안 파지 - 클로로포름 서스펜션. </li><li> 30 초 동안 안정하고 상체는 단층 준비를 위해 전원 피펫되었다가 포함 된 상위 단계의 피펫 현탁액을 허용했다. </li><li> 전송 및 주사 전자 현미경 상체 현탁액의 몇 마이크로 리터를 가져 가라. </li><li> 바이오 센서의 제조에 남아있는 회전 타원체 현탁액을 사용합니다. </li></ol> 8. 바이오 센서 제조 <ol><li> 10 분 PDC-32G Harrick 플라즈마 클리너 아르곤 플라즈마 에칭에 의한 청소 QCM-D 센서. </li><li> 모든 유기 불순물을 제거하는 헥산으로 센서를 씻어. </li><li> 준비하고 22에 설명 된 필름의 균형 구유를 청소하십시오. </li><li> subphase 솔루션 LB 트로프를 입력하고 여물통 장벽을 청소하고 20 통을 안정화 ± 0.1 ° C </li><li> 수성 suspensi에있는 파지 12600 300 μL 나누어지는 확산LB의 subphase 상 (10 11 PFU / ㎖)에. </li><li> 부분적으로 subphase 22,23으로 침수되는 경사 적실 유리 막대를 실행하는 파지 12600 현탁액 300 μL 나누어지는 (10 11 PFU / ㎖)함으로써 LB의 subphase 솔루션에 파지 단층을 준비합니다. </li><li> 10 분 동안 준비된 단일 층을 안정화하고 일정한 압력까지 19 N / m를 달성되어, 30mm / 분 (45cm 2 / 분)의 비율로 압축합니다. </li><li> 연속적으로 단층의 일곱 번 센서에서 찍기에 의해 밖으로 4.5 mm / min의 속도로 수직으로 QCM-D 센서에 수직 증착을 수행합니다. 박테리아 샘플에 노출 레이어 (데이터 표시되지 않음), 연속 균질하고 균일 한 것으로 나타났다 전에 전자 현미경으로는 파지 단일 층을 증착. </li><li> 반복 3 준비 파지 구형 서스펜션 4.5-4.8 단계를 반복합니다. </li><li> MRSA 검출, 전자에 대한 제작 파지 바이오 센서를 사용하여현미경, 및 타원. </li></ol> 9. 바이오 센서 테스트, 메티 실린 저항의 차별과 민감한 황색 포도상 구균 박테리아 <ol><li> 이 프로토콜에서는 수정되지 않은 수정 된 파지 및 파지 상체와 바이오 센서는 준비가되어 있습니다. 네 개의 센서 유량 용기를 가진 석영 크리스탈 마이크로는 QCM 센서의 표면에 고정 파지에 박테리아의 바인딩을 모니터링하는 데 사용됩니다. PBP 2a에 항체 결합 라텍스 구슬 메티 실린 내성 (MRSA) 및 민감한 황색 포도상 구균 박테리아를 구별하기 위하여 이용된다. 모든 측정은 5 MHz에서 유동 모드 (50 μL / 분)에서 실시하고 있습니다. </li><li> 물 (~ 30 분)에 QCM 센서의 기본 라인 공진 주파수를 설정합니다. </li><li> 테스트 셀을 통해 물에 살고있는 메티 실린 민감 황색 포도상 구균 박테리아 세포 (10 9 CFU / ㎖)의 현탁액을 그립니다. </li><li> 지속적으로 최초의 배음, USI에 대한 센서의 공진 주파수와 에너지 소모의 변화를 모니터링NG는 Q-소프트 소프트웨어입니다. </li><li> 센서의 공진 주파수와 손실의 변화가 포화 수준에 도달 할 때, 주파수와 소비의 지속적인 모니터링 중에 흐름 PBP 항체 결합 라텍스 구슬 (6.77 배 10 비즈 / ML)의 정지를 추가합니다. </li><li> 반복 메티 실린 내성 포도상 구균 박테리아 세포 (MRSA)에 대한 9.2-9.5 단계를 반복합니다. </li><li> C는 상수 (C = 17.7 NG X cm -2 X Hz에서 -1 5 MHz의 질량 감도 Sauerbrey 식 24,25 Δf에 =-ΔM XN / C에 의해 바인딩 세균에 의한 질량 변화를 통해 주파수 변화를 정의 ), M은 질량 n은 배음의 수 (N = 1)입니다. </li><li> 기록에서 에너지 소비의 변화 (Δ D)를 정의 진동의 지수 감쇠 (주파수와 진폭 진동의 한주기 동안 소비 및 저장 에너지의 정량화를 허용하는 완충,각각 E는 소비와 E가 저장 : Δ D = E 소산 / 2 πE가 저장됩니다. Δ D는 분산 단위 (DU), 하나의 DU = 10 -6 상대 단위)로 측정됩니다. </li></ol>

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<li>Gervals, L., Gel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+biotinylated+bacteriophages+on+biosensor+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%22%5BJournal%5D)">Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces.</a> Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).</li>
<li>Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+as+a+molecular+recognition+element+in+biosensors+immobilized+by+physical+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).</li>
<li>Sorokulova, I., Watt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+biopolymer+for+preservation+of+microorganisms+during+sampling+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage.</a> J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Plating+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).</li>
</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

그것은 잘 파지는 세균 병원체 28 바이오 센서 프로브로 사용할 수있는 것으로 알려져 있습니다. 빠른 차별 항생제 내성 민감한 균주 : 그것은 PBP 2a에 항체과 함께 파지 이전 문제를 해결하기 위해 활용 될 수있는이 작품에서 보여줍니다. 그것은 그러나 이러한 일반적인 수정되지 않은 포도상 구균 파지들이 박테리아를 바인딩에도 불구하고, QCM 장치와 세균 검출에 적합하지 않습니다 발견되었다. 파지의 꼬리는 음향 파도 파지 꼬리의 끝 부분에 바인딩 박테리아 &quot;에 도달 할 수 없습니다&quot;너무 깁니다. 이 조건은 (그림 3A 및 3B) EM에 의해 이미지를 보여 상당한 바인딩에도 불구하고 공진 주파수 및 분산 변경 사항을 등록하는 &quot;누락 매스&quot;효과 29 무능력의 결과. 이 문제는 쉽게 상체에 그대로 파지를 교체하여 해결되었다, 파지는 클로로포름 물 처리에 의해 수정. 이 치료는...

황색 포도상 구균의 메티 실린 내성은 필수 감염과 원내 발생 4-8에 영향을 미치는 요인으로 제시되었다. 이러한 디스크를 확산 oxacillin 한천 스크린 테스트, 또는 국물 microdilution으로 메티 실린 저항의 인식의 일반적인 방법은, 저항의 표현을 향상시키기 위해 맞춤형 배양 조건에 의존한다. 변경은 oxacillin의 활용, ° C보다는 37 ° C 이상 30 35 배양 및 성장 매체의 NaCl의 포함이 (가) 있습니다. 또한, 기술의 이러한 유형으로 정확한 탐지를 위해, 24 시간의 긴 잠복기 대신에 16-18 시간의 필요합니다. 메티 실린 저항의 식별을위한 감도 적절한 (&gt; 96 %) 수준의 빠른 기술은 3-11 시간 후 결과를 같은 VITEK GPS-SA 카드, 신속한 ATB 포도상 구균 시스템 및 신속한 Microscan은 패널 시스템으로 자동 microdilution 기술을 포함 9-11. 크리스탈 MRSA ID 시스템은 S.의 성장 인식에 따라 빠른 방법입니다 2 % 염화나트륨과 산소에 민감한 형광 센서 리터 당 oxacillin 4 MG의 존재 구균. 주장 감도는 배양 12-14 4 시간 후에 100-91 % 사이가 다양합니다. 이러한 표현형 방법은 서로 다른 저항을 표현하는 유행 균주의 영향으로 자신의 정확도에 제한됩니다. 따라서 메티 실린 저항의 인식을위한 가장 널리 사용되는 방법은 메카 유전자 15의 PCR 또는 DNA 혼성화입니다. 그러나이 기술은 정제 된 DNA가 필요하며 세포 파편 16 등 각종 혼화제 (불순물)에 매우 민감합니다. 또한, 이러한 기술을 수행하는 데 오랜 시간이 필요합니다. 메카 유전자 제품, 단백질 PBP 2a에의 인식 전략은 저항을 결정하기 위해 활용 될 수 있으며 표준 시험 방법 17에 비해 더 신뢰할 수 있습니다. 1,2,18을 갖는 포함 황색 포도상 구균의 변종에 대한 인식 조사로 활용 될 수 있음을 표시했다. 이 작품에서 우리는 실시간으로 MRSA의 형태와 함께 박테리아의 인식과 같은 MRSA의 특정 인식 및 탐지에있는 새로운 기술을 제안 하였다. 이 특정한 목적 S.에 대한 단백질에 대한 단클론 항체와 결합 된 호스트의 다양한 스펙트럼 (MRSA 균주 포함) 구균 살균은 (PBP 2a에) 사용되었습니다. PBP 2a에는 세포벽 단백질이며 MRSA의 항생제 저항의 원인입니다. 그러나 PBP 2a에 항체는 S.에 대한 구체적인 없습니다 다른 박테리아 이후 구균 PBP 2a에 19,20에 서열의 유사성과 항생제 결합 단백질이 있습니다. 따라서 본 연구에서는 S. PBP 2a에 단백질에 대한 구균 살균 및 항체가 사용되었습니다. specifi에 바이오 센서를 개발 할 수 있으려면,으로 두 단계 동작을 활용 한로 장치를 인식하고 MRSA를 식별합니다. 초기 단계는 S.를 사용 센서 프로브와 같은 구균 살균의 단층, 두 번째 단계는 PBP 2a에 특정 항체를 고용하면서. 따라서 하나 S를 인식 단계 구균 박테리아, 다른 하나 항생제 결합 단백질에 민감 할 것입니다. 두 단계에서 수신 신호가 긍정적 인 경우는 MRSA의 특정 감지를 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Phosphate buffered Saline (PBS) </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계 등급 클로로포름 </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>154733</td><td>(99.8% A.C.S.) </td></tr><tr><td>Hexane-Anhydrous </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>29609-0</td><td>(95%)</td></tr><tr><td>에틸 알코올 </td><td>Pharmco products Inc. Brookfield, CT</td><td>64-17-5</td><td>190 Proof</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>PBP 2a 항체 접합 라텍스 비드</td><td>Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan</td><td>MRSA-Screen test</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 및 American Type Culture Collection(버지니아주 머내서스)의 Bacillus subtilis ATCC 6051</td><td>;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. 탄저병 Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; 용해성 파지 12600 </td><td>Auburn University, Auburn, AL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge </td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-90K Ultra Centrifuge</td><td></td></tr><tr><td>KSV 2200 LB 필름 밸런스</td><td>KSV Chemicals, 핀란드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경 광학 시스템 </td><td>CitoViva Technology Inc., Auburn, AL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QCM-D</td><td>Q-Sense AB, V&#228; 스트라 Fr&#246; 룬다, 스웨덴</td><td>E4</td><td></td></tr><tr><td>주사전자현미경(SEM)</td><td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td><td>JEOL-7000F SEM</td><td></td></tr><tr><td>투과전자현미경(TEM)</td><td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td><td>JEOL, JEM 2010</td><td></td></tr><tr><td>Stericup, Presterilized</td><td>Millipore Corporation, Billerica, MA</td><td>SCGPU05RE</td><td>0.22 &mu; m, GP Express PLUS</td></tr><tr><td>멤브레인 바이오 분석 접시</td><td>NUNC A/S, 덴마크</td><td>240835</td><td>치수(mm), 245 x 245 x 25</td></tr><tr><td>피펫</td><td>Gilson, Pipetman, 프랑스</td><td>P100, P200, P1000</td><td></td></tr><tr><td>C24 인큐베이터 셰이커</td><td>뉴브런즈윅 사이언티픽, CT</td><td>클래식 C24</td><td></td></tr><tr><td>골드 코팅 석영 조각</td><td>Auburn University, AL</td><td></td><td>수제</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Brand, 미국</td><td></td><td>0875713 100 mmX15 mm </td></tr><tr><td>SterilGard III Advance</td><td>The Baker Company, ME</td><td>SG403</td><td></td></tr><tr><td>배양 플라스크</td><td>Corning Incorporated, NY</td><td>4995</td><td>PYREX 250 ml 삼각 플라스크 </td></tr><tr><td>광학 분광계</td><td>Genesys 20. 써모 스펙트로닉, 미국.</td><td>4001</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma, 미국</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Millipore 정수 시스템</td><td>Millipore</td><td>Direct-Q</td><td></td></tr><tr><td>이미징 타원계</td><td>Accurion, 미국</td><td>nanofilm_ep3se</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어 </td><td>Q-Sense AB, 스웨덴</td><td>QSoft, QTools</td><td></td></tr></tbody></table>

항생제 내성 황색 포도상 구균 박테리아의 검출을위한 바이오 센서

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

황색 포도상 구균 균주의 광범위한 호스트 범위와 페니실린 결합 단백질 (PBP 2a에) 항체 결합 라텍스 구슬이 메티 실린 내성 (MRSA)에 민감 (MSSA) S의 차별을 위해 디자인 된 바이오 센서를 만드는 데 활용 된 데 구조적 변화 용해성 살균 . 구균 종 1,2. 용해성 파지는 물에 클로로포름 인터페이스와의 접촉에 의해 파지 상체로 변환되었습니다. 파지 회전 타원체 단층은 랭 뮤어 - 블로 젯 (LB) 기법에 의하여 바이오 센서의 표면에 이동되었습니다. 생성 된 바이오 센서는 박테리아 파지 상호 작용을 평가하기 위해 분산 추적을 가진 석영 크리스탈 마이크로 (QCM-D)로 조사되었다. 박테리아 회전 타원체 상호 작용은 감소 공진 주파수와 MRSA와 MSSA 균주 모두에 대한 분산 에너지 상승했다. 세균 바인딩 한 후,이 센서는 또한 페니실린 결합 단백질 항체 라텍스 비드에 노출 된의. MRSA로 분석 센서는 2A 항체 비즈 PBP에 응답, MSSA에 검사 센서는 응답을 준 없지만. 이 실험 구별은 메티 실린 저항하고 민감한 S. 사이에 명확한 차별을 결정 구균의 변종. 마찬가지로 바운드 및 언 바운드 살균은 표면에 물 현탁액에있는 박테리아의 성장을 억제합니다. 용해성 파지가 상체로 변경되면, 그들은 그들의 강한 용해성 활동을 유지하고 높은 세균 캡처 기능을 보여줍니다. 파지와 파지 상체는 항생제 내성 미생물의 테스트 및 살균을 위해 이용 될 수있다. 다른 응용 프로그램은 박테리오파지 요법과 항균 표면에서의 사용을 포함 할 수 있습니다.

파지는 S.의 시험 균주에 대한 용해성 활동을 보여 로 파지 현장 시험에 의해 표시 MRSA 균주를 포함 구균. 플라크의 크기는 일반적으로 5 ~ 15 mm까지였다. 활동은 다른 테스트 배양 (표 1)에 대해 찾을 수없는 경우. S.의 정상적인 성장 37 쉐이커 인큐베이터에 NZY 매체 구균 ATCC 12600는 ° C는 그림 1A (빈 원으로 표시된 곡선)에 표시됩니다. 세균의 수는 4.0으로 X 10 6 3.2로 증가 × 10 8 CFU / ㎖. 그림 1A는 (채워진 원으로 표시된 곡선) 2.0 × 10의 공동 재배의 결과를 보여줍니다 6 PFU / ㎖ 무료 파지 동시에로 추가 S.의 동일한 농도 구균 ATCC 12600. 금 표...

용해성 파지 바이오 센서 및 항체 비즈 메티 실린 내성 (MRSA) 및 민감한 황색 포도상 구균 박테리아를 구별 할 수 있습니다. 파지는 석영 크리스탈 마이크로 센서의 표면에 랭 뮤어 - 블로 젯 방식으로 고정 넓은 범위 포도상 구균 프로브로 근무 하였다. 항체 비즈 MRSA를 인식하고 있습니다.

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

다음 실험의 전반적인 목표는 특별히 선택된 항-변형 용해성 박테리오파지를 이용하여 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA)과 메티실린 감수성 황색포도상구균(MSSA) 균주를 구별하는 것입니다. 박테리아가 용해성 파지의 길고 유연한 꼬리에 부착되면, 부착된 세포와 센서 표면 사이의 거리가 QC m의 음파 침투 깊이보다 커집니다. 따라서 결합 이벤트에 의한 신호가 생성되지 않습니다.온전한 파지를 스페로이드로 교체하면 꼬리가 짧은 완전 기능성 파지가 생성되며, 이는 QCM 음향 파동의 침투 깊이 내에서 박테리아와 결합하여, 파지 스페로이드가 AQCM-D 결정에 증착되고 혼합 박테리아 현탁액에 노출되었을 때 주파수 및 소산 변화에 기여하게 됩니다. 이들은 Staphylococcus aureus의 MRSA 및 MSSA 균주 모두와 결합하지만 다른 박테리아와는 결합하지 않으므로, 결정 표면에서 Staphylococcus aureus를 다른 박테리아와 분리합니다. 마지막으로, MRSA 특이적 PPP2A 항체 결합 비드를 추가하면 Staphylococcus aureus의 MRSA 균주가 존재할 때 신호가 생성됩니다. PCR과 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 DNA 추출이 필요하지 않으며 효소의 영향에 민감하지 않다는 점입니다.이 방법은 황색포도상구균(staphylococcus aureus)의 선별 및 소독에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 다른 항생제 내성 박테리아에도 적용할 수 있습니다. 바이오센서 제작에는 정밀함, 정확성 및 인내심이 필요하므로 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 먼저 Argonne에서 10분 동안 플라즈마 식각을 통해 금 코팅된 쿼츠 조각을 세척하고, 멸균 캐비닛 내에서 UV 광선으로 6시간 동안 멸균합니다. 멸균 후, 멸균 페트리 접시에 담긴 각 조각의 금 표면에 50 µL의 파지 현탁액을 처리한 다음, 습윤 챔버에서 실온으로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 역가 측정을 위해 남은 파지 현탁액을 제거한 후, 결합되지 않은 파지를 제거하기 위해 PBS로 결합된 파지가 있는 각 쿼츠 조각을 5회 세척합니다.건조 표면에서 고정화된 파지의 감염력을 테스트하려면, 먼저 Staphylococcus aureus의 밤샘 배양액을 NZY eRate 배지에 도말하고 현탁액을 건조시킵니다. 그 다음, 파지가 고정화된 금 코팅 쿼츠 조각을 플레이트 위에 뒤집어 놓습니다. 37 °C에서 12시

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

세균성 병원체 진단을위한 간단 하루 워크플로우 방식의 디자인은 혈류 감염의 급속한 인식을 가능하게합니다. 여덟 임상적으로 관련성이 높은 세균성 대상과 항생제 저항 프로파일을 포함하는 더 적절한 치료로 이어질 수있는 당일에 임상 초기 통찰력을 제공합니다.

혈액 배양에서 세균 병원체 탐지 및 항균 저항 테스트를위한 하루 워크플로 계획

우리는 빠른 세균 검출 및 식별을 위해 전기 센서 분석 방법을 설명합니다. 분석은 리보솜 RNA (rRNA의) 종의 특정 시퀀스 DNA 올리고 뉴클레오타이드 캡처 프로브 작용 센서 어레이를 포함한다. 캡처 프로브와 고추 냉이 과산화 효소 연결된 DNA 올리고 뉴클레오타이드 검출기 프로브 대상 rRNA의의 샌드위치 하이브리드는 측정 전류 측정 전류를 생성합니다.

전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

출처: Zhang, M. 외, 단일 박테리아 내 중수소 통합 자극 라만 산란 영상을 통한 신속 항균 감수성 검사. J. Vis. Exp. (2022)이 영상은 자극 라만 산란 현미경을 활용해 중수소 표지된 대사 활동을 추적하여 항생제에 대한 감수성을 평가하는 방법을 시연합니다. 탄소-중수소 신호를 모니터링함으로써 내성 및 감수성 박테리아 집단을 신속히 검출할 수 있게 합니다.

자극 라만 산란 현미경을 이용한 박테리아 항생제 감수성 검출

이 비디오는 트랜스듀서 칩에 고정된 표적 항원과 항체의 상호 작용을 연구하기 위한 전도도 측정 바이오센서 분석을 보여줍니다. 바이오센서는 고정되지 않은 표적 항원에 결합하기 위해 나노바디에 융합된 기능적 촉매 부위가 있는 β-락타마제 효소인 이중 기능 키메라 단백질을 갖도록 설계되었습니다. 결합시 β-락타마제 효소에 의한 항생제 기질의 촉매 가수분해는 전기 신호를 생성하여 항원-항체 상호 작용을 확인합니다.

단백질-단백질 상호작용을 위한 β-Lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay

급속한 균 검출 용 라벨없는 광 바이오 센서가 도입된다. 바이오 센서의 표면에 직접 표적 균 세포를 포착하기 위해 디자인 된 나노 다공성 실리콘에 기반하고있다. 우리는 포획 프로브로서, 다공질 변환기에 고정화 된 모노클로 날 항체를 사용한다. 우리의 연구는 (같은 세포 용해와 같은) 더 이전의 샘플 처리와 분 이내에 낮은 세균 농도의 검출에 대해 이러한 바이오 센서의 적용 가능성을 보여줍니다.

의 광학 검출 E. 대장균 박테리아

우리는 급속한 항생제 감수성 시험을 위한 미세유체 플랫폼을 개발했습니다. 유체는 미세 유체 채널의 바닥에 고정 된 박테리아를 통해 고속으로 전달됩니다. 스트레스와 항생제의 존재에서, 박테리아의 취약 한 긴장 은 급속 하 게 죽는다. 그러나, 저항하는 박테리아는 이 스트레스가 많은 조건을 살아남을 수 있습니다.

칩에 스트레스 유발 항생제 감수성 테스트

대부분의 박테리아 감염은 생물막을 생성합니다. 환경 덕분에, 생물막 관련 박테리아는 종종 표현형 약물 내성을 가지고 있습니다. 따라서 생물막에서 박테리아를 죽이는 새로운 항균 분자는 최우선 순위입니다. 당사는 생물막을 박멸하는 데 효과적인 항균 화합물을 신속하게 스크리닝하기 위한 분석을 수립합니다.

바이오 필름 관련 타겟팅<em&gt; 황색 포도상 구균</em&gt; 사용 레사 주린 기반 약물 감수성 분석

이 작품에서는, 우리는 하이브리드 β-lactamase 기술에 따라 conductimetric 바이오 센서를 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 새로운 방법을 보고 합니다. 이 메서드는 β-lactams의 가수분해 시 양성자의 출시에 의존합니다.

바이오 상호 작용을 검출 하는 β-lactamase 기반 Conductimetric 바이오 센서 분석 결과의 사용

여기, 선물이 커패시턴스 바이오 센서와 함께에서 각 인 분자를 사용 하 여 복잡 한 솔루션에서 검색 및 낮은 풍부한 분자의 정량화에 대 한 프로토콜.

분자 각 인을 사용 하 여 생체의 磁 검출 용량 성 바이오 센서 기반

그들은 kHz에서 속도 저렴 picoliter, 자기들에게만 혈관을 생성할 수 있기 때문에 비말 기반 microfluidic 플랫폼은 높은 처리량 실험을위한 유망한 후보자 있습니다. 빠르고, 민감하고 고해상도 형광 spectroscopic 방법과의 통합을 통해 이러한 시스템 내에서 발생하는 정보의 다량은 효율적으로 추출 무력화하고 이용하실 수 있습니다.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

배우세요 MRSA와 MSSA를 구분하는 용해성 파지 바이오센서 기술을 이용한 황색포도상구균 검출 방법입니다. 석영 결정 미세저울 센서에 파지를 고정하여 DNA 추출 없이 빠르게 항생제 내성 균주를 식별할 수 있습니다.

항생제 내성 황색 포도상 구균 박테리아의 검출을위한 바이오 센서

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