항생제 내성 황색 포도상 구균 박테리아의 검출을위한 바이오 센서

다음 실험의 전반적인 목표는 특별히 선택된 항-변형 용해성 박테리오파지를 이용하여 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA)과 메티실린 감수성 황색포도상구균(MSSA) 균주를 구별하는 것입니다. 박테리아가 용해성 파지의 길고 유연한 꼬리에 부착되면, 부착된 세포와 센서 표면 사이의 거리가 QC m의 음파 침투 깊이보다 커집니다. 따라서 결합 이벤트에 의한 신호가 생성되지 않습니다.

온전한 파지를 스페로이드로 교체하면 꼬리가 짧은 완전 기능성 파지가 생성되며, 이는 QCM 음향 파동의 침투 깊이 내에서 박테리아와 결합하여, 파지 스페로이드가 AQCM-D 결정에 증착되고 혼합 박테리아 현탁액에 노출되었을 때 주파수 및 소산 변화에 기여하게 됩니다. 이들은 Staphylococcus aureus의 MRSA 및 MSSA 균주 모두와 결합하지만 다른 박테리아와는 결합하지 않으므로, 결정 표면에서 Staphylococcus aureus를 다른 박테리아와 분리합니다. 마지막으로, MRSA 특이적 PPP2A 항체 결합 비드를 추가하면 Staphylococcus aureus의 MRSA 균주가 존재할 때 신호가 생성됩니다. PCR과 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 DNA 추출이 필요하지 않으며 효소의 영향에 민감하지 않다는 점입니다.

이 방법은 황색포도상구균(staphylococcus aureus)의 선별 및 소독에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 다른 항생제 내성 박테리아에도 적용할 수 있습니다. 바이오센서 제작에는 정밀함, 정확성 및 인내심이 필요하므로 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 먼저 Argonne에서 10분 동안 플라즈마 식각을 통해 금 코팅된 쿼츠 조각을 세척하고, 멸균 캐비닛 내에서 UV 광선으로 6시간 동안 멸균합니다. 멸균 후, 멸균 페트리 접시에 담긴 각 조각의 금 표면에 50 µL의 파지 현탁액을 처리한 다음, 습윤 챔버에서 실온으로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 역가 측정을 위해 남은 파지 현탁액을 제거한 후, 결합되지 않은 파지를 제거하기 위해 PBS로 결합된 파지가 있는 각 쿼츠 조각을 5회 세척합니다.

건조 표면에서 고정화된 파지의 감염력을 테스트하려면, 먼저 Staphylococcus aureus의 밤샘 배양액을 NZY eRate 배지에 도말하고 현탁액을 건조시킵니다. 그 다음, 파지가 고정화된 금 코팅 쿼츠 조각을 플레이트 위에 뒤집어 놓습니다. 37 °C에서 12시간 후에, 감염력을 나타내는 용해 구역(zone of lysis)을 관찰함으로써 액체 상태인 유리 파지의 용해 활성을 테스트할 수 있습니다.

먼저, 4개의 300 milliliter 사이드암 플라스크 각각에 10 milliliters의 NZY와 하룻밤 동안 배양한 staphylococcus aureus 박테리아 배양액을 첨가합니다. 그다음, 플라스크 중 2개에 2 × 10⁶ PFU/milliliter의 유리 파지를 첨가합니다. 이제 각 플라스크에 대해 30분 간격으로 흡광도를 측정하여 570분 동안 staphylococcus 세포 용해의 시간 경과를 모니터링하고, 24시간째에 최종 측정을 수행합니다.

액체 내 결합된 파지의 용균 활성을 테스트하려면, 앞서 시연한 단계를 반복하되 유리 파지 대신 결합된 파지가 부착된 금 입자를 실험 플라스크에 추가하십시오. 파지 스테로이드를 준비하려면 먼저 상온에서 1 mL 바이알에 400 µL의 stock phage 1 2600 현탁액과 동일한 부피의 분광 광도계 등급 클로로포름을 혼합하십시오. 다음으로, 1분 동안 5초 간격으로 파지-클로로포름 현탁액을 5~6회 부드럽게 볼텍싱하십시오.

현탁액을 30초 동안 안정화시킨 후, 스테로이드 현탁액이 포함된 상층액 부분을 수집합니다. 투과 전자 현미경 및 주사 전자 현미경 관찰을 위해 스테로이드 현탁액 몇 µL를 500 µL 바이알로 옮깁니다. 남은 스테로이드 현탁액은 바이오센서 제작을 위해 1 mL 바이알에 보관합니다.

바이오센서를 먼저 준비하려면, 플라스마 세척기에서 아르곤 플라스마 에칭을 10분 동안 수행하여 QCMD 센서를 세척합니다. 그다음, 헥산으로 센서를 헹구어 유기 불순물을 제거합니다. 다음으로, Journal of Microbiological methods에서 Olson 등이 이전에 설명한 방식에 따라 필름 밸런스의 트로프(trough)를 세척합니다.

LB 트러프를 하층액(sub phase solution)으로 채우고 트러프 배리어(trough barrier)로 세척합니다. 그 다음 트러프를 20 °C에서 10분 동안 안정화합니다. 이제 하층액에 부분적으로 담근 경사진 유리 막대를 사용하여 phage 1 2600 수용액 현탁액 300 µL를 조심스럽게 떨어뜨려 LB 하층액 위에 파지 단분자층(phage monolayer)을 형성합니다. 단분자층을 10분 동안 안정화한 후, 19 N/m의 일정한 압력에 도달할 때까지 분당 30 mm의 속도로 단분자층을 압축합니다.

수직 박막 증착은 이 절차에서 가장 까다로운 부분입니다. 성공적인 수행을 위해서는 이 절차의 모든 구성 요소가 청결한지 확인해야 하며, 단분자층 증착 파라미터를 최적화해야 합니다. 이제 수직 박막 증착을 수행하기 위해 센서를 단분자층 용액에 4.5 millimeters per minute의 속도로 연속해서 7회 담갔다 뺍니다.

수직으로 배치된 QCMD 센서 위로 진행합니다. 수직 박막 증착을 통해 온전한 파지를 바이오센서 표면에 결합시킵니다. 마지막으로, 제작된 파지 바이오센서를 사용하여 MRSA 검출, 전자 현미경 관찰 및 유리 파지와 결합 파지 모두의 광학 측정을 수행합니다.

qof T 소프트웨어를 사용하여 물속에서 QCM 센서의 기선(baseline), 공진 주파수 및 에너지 소실 값을 측정함으로써 이 단계를 시작하십시오. 약 30분 후, 살아있는 메티실린 감수성 황색포도상구균(methicillin sensitive staphylococcus aureus 또는 MSSA) 세균 세포의 수성 현탁액을 테스트 셀에 통과시킵니다. 파란색 선은 주파수 값을 나타내며, 빨간색 선은 에너지 소실 수준을 보여줍니다.

수평선은 베이스라인의 설정을 나타냅니다. 화면 중앙의 숫자 2는 이벤트가 센서와 관련되어 있음을 나타냅니다. 4개 중 2번 센서가 표시된 1차 오버톤의 공진 주파수 및 에너지 소산 변화를 지속적으로 모니터링합니다.

박테리아가 테스트 셀을 통과한 후의 변화입니다. 센서의 공진 주파수와 내부 에너지 소실의 변화가 PVP 항체 결합 라텍스 비드의 부유 상태에서 포화 수준에 도달하면, 주파수가 감소하고 에너지 소실이 증가하는 데 단 몇 초밖에 걸리지 않는다는 점에 유의하십시오. 흐름에 맞추어 주파수 소실을 지속적으로 모니터링합니다. 여기에는 베이스라인 설정, 박테리아 첨가 후 수 초간의 주파수 및 에너지 소실 변화, 포화 상태, 그리고 마지막으로 비드 첨가 후의 변화를 포함한 전체 검출 과정이 나타나 있습니다.

이 표는 파지 스팟 테스트를 통해 확인된 MRSA 균주를 포함하여, 테스트한 모든 S reus 균주에 대해 입증된 파지 용해 활성을 보여줍니다. 플라크 크기는 일반적으로 5에서 15mm 범위였습니다. 다른 테스트 배양물에 대해서는 활성이 발견되지 않았습니다.

본 영상에서는 37 °C의 진탕 배양기 내 NZ Y 배지에서 staphylococcus Urus A TCC 1 2600의 정상적인 성장을 보여주며, 박테리아 수는 mL당 3.2 × 10⁶ CFU에서 4.0 × 10⁸ CFU로 증가하였습니다. 약 24시간 후, 금 표면에 고정된 파지는 부유 상태의 파지와 유사한 용해 활성을 나타냈습니다. 고정된 파지는 24시간 배양 실험에 사용되고 여러 번의 세척 과정을 거쳐 4 °C의 PBS에서 6일간 보관된 후에도 새로운 박테리아 감염 시 감염력을 유지하였습니다.

이 이미지에서 금 조각 주변의 용균 현상을 관찰할 수 있으며, 이는 고정화된 파지가 박테리아 세포를 용해할 수 있음을 나타냅니다. 따라서 여기에서 설명된 바와 같이, 박테리아와 비동원화 파지의 공동 배양에서 나타난 박테리아 성장의 효과적인 감소는 수중 현탁 박테리아와 결합된 파지 사이의 일차적 상호작용의 결과입니다. 여기에서는 금 기판 표면에 있는 온전한 용균 파지 1 2600의 투과 및 주사 전자 현미경 사진이 제시되어 있으며, 파지 현탁액에 클로로포름 처리를 하면 파지의 꼬리 길이가 수축하고 두꺼워지며 다각형의 머리가 둥글거나 스테로이드 형태로 변합니다.

상당한 구조적 변화에도 불구하고, 플라크 수로 측정한 스테로이드의 용균 활성은 클로로포름 처리 결과로 인해 변하지 않았습니다. 용균성 파지가 고정된 QCM 센서를 MRSA에 노출시켰을 때 공진 주파수나 에너지 소산의 유의미한 변화가 나타나지 않았으며, 이는 MRSA와 파지의 상호작용으로 인한 질량 변화가 없었음을 나타냅니다.

하지만 QCM에 따르면, 분석 후 바이오센서의 전자현미경 사진에서 센서 표면에 상당한 박테리아 결합이 확인되었습니다. 파지 스테로이드 바이오센서가 포함된 유동 셀에 MRSA 현탁액을 주입했을 때, 주파수의 상당한 감소와 소산의 증가가 관찰되었습니다. 파지 스페로 박테리아 MRSA 결합 상호작용 이후, 분석 센서를 BBP two A 항체가 접합된 라텍스 비드 현탁액에 노출시켰습니다.

이러한 MRSA 분석 바이오센서는 BPP two A 항체가 접합된 라텍스 비드 현탁액에 반응하여 주파수의 추가적인 감소와 소산의 증가가 관찰되었습니다. MSA가 파지 프로브 및 PPP two A 항체 접합 라텍스 비드에 결합하는 것은 주사전자현미경 조사를 통해 확인되었습니다. 파지 스테로이드 바이오센서를 MSSA에 노출시켰을 때, 파지 스테로이드와 MSSA의 결합 상호작용에 따라 주파수의 상당한 감소와 소산의 증가가 관찰되었으며, 이후 분석 센서를 PPP two A 항체 접합 라텍스 비드 현탁액으로 테스트하였습니다.

초기에 MSSA 분석 바이오센서는 MSSA와 PPP two A 항체 접합 라텍스 비드 간의 상호작용이 시작된 후 몇 분 만에 주파수는 짧게 증가하고 소실은 감소하는 일시적인 변화를 보였습니다. 하지만 주파수는 PVP two A 항체 도입 후의 수준으로 돌아갔으며, 소실 에너지는 증가했습니다. 이후 주사 전자 현미경을 통해 MSSA와 파지 프로브의 결합을 분석하였으나, MSSA와 PPP two A 항체 접합 라텍스 비드 사이의 결합은 관찰되지 않았으며, 여기에는 용해성 파지의 타원계측법 두께 프로파일과 3D 두께 맵이 제시되어 있습니다.

두께 맵을 가로지르는 선을 그려 두께 프로파일을 생성했습니다. 마지막 이미지들은 A-Q-C-M-D 센서의 금 표면에 결합된 파지에 의해 포착된 MRSA의 대표적인 CCD 광학 카메라 이미지와, 10⁸ CFU/mL 및 10⁹ CFU/mL 농도의 파지 고정 유리 기판 상에 있는 MRSA의 3D 강도 프로파일을 보여줍니다. 각각의 원형은 단일 박테리아를 나타냅니다.

액체 현탁액 내의 박테리아 농도를 10⁸ CFU/mL에서 10⁹ CFU/mL로 증가시키면 3D 강도 프로파일에서 포획된 박테리아가 유의미하게 증가함이 분명합니다. 최상층의 흰색 피크 수는 포획된 박테리아의 수에 비례하며, 예상대로 박테리아 노출 농도가 10⁸에서 10⁹ CFU/mL로 증가함에 따라 피크의 밀도가 크게 증가합니다. 하단의 진한 파란색 층은 금 기판과 접촉하고 있는 파지 층에 해당합니다.

더 많은 박테리아가 포집됨에 따라, 파지가 박테리아와 결합하면서 파지의 광학적 성질이 변화하여 더 어둡고 진한 파란색을 띠게 됩니다. 이 절차를 통해, 개발 후 파지와 박테리아의 상호작용을 이해하기 위한 박테리아 포집 효율을 정의할 수 있습니다. 이 기술은 박테리아 파지 치료 분야의 연구자들이 동물 및 사람에서의 병원체 억제를 탐구할 수 있는 길을 제시합니다. 병원성 박테리아를 다루며 유기 용매를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 엄격한 규정을 준수하는 것이 매우 중요하다는 점을 잊지 마십시오.