항생제 내성 황색 포도상 구균 박테리아의 검출을위한 바이오 센서

다음 실험의 전반적인 목표는 특별히 선택된 항변형 용해균 파지에 의해 메티실린 내성 또는 MRSA와 황색포도상구균의 MSSA 균주를 구별하는 것입니다. 박테리아가 용해성 파지의 길고 유연한 꼬리에 부착되면 부착된 세포와 센서 표면 사이의 거리가 QC m의 음파의 침투보다 커집니다. 따라서 바인딩 이벤트의 신호가 생성되지 않습니다.

온전한 파지를 스페로이드로 대체하면 짧은 꼬리를 가진 완전한 기능을 하는 파지가 생성되며, 이는 QC m의 음파의 침투 깊이 내에서 박테리아를 결합하므로 파지 스테로이드가 A-Q-C-M-D 결정에 증착되고 혼합 박테리아 현탁액에 노출될 때 주파수 및 소산 변화에 기여하며, 이는 황색포도상구균의 MRSA 및 MSSA 균주와 결합하고, 그러나 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 결정 표면의 다른 박테리아와 분리하는 다른 박테리아는 없습니다. 마지막으로, Mr.RSA 특이적 PPP 2개의 A 항체 결합 비드가 추가되면 황색포도상구균의 Mr.RSA 균주가 있는 상태에서 신호가 생성됩니다. PCR과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 DNA 추출을 필요로 하지 않고 경험론에 민감하지 않다는 것입니다.

이 방법은 포도상구균의 스크리닝 및 소독에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 항생제 내성 박테리아에도 적용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 바이오센서를 제작하는 데 정밀도, 정확성 및 인내가 필요하기 때문에 매우 중요합니다. 아르곤에서 10분 동안 플라즈마 에칭으로 금으로 코드화된 석영 조각을 세척하는 것으로 시작한 다음 멸균 페트리 접시에 있는 각 조각의 금 표면에 50마이크로리터의 파지 현탁액에서 멸균한 후 멸균 캐비닛에서 자외선 아래에서 6시간 동안 조각을 살균한 다음 다음날 아침 실온의 습한 챔버에서 밤새 조각을 배양합니다. 적정을 위해 남아 있는 파지 현탁액을 제거한 다음 결합된 파지가 있는 각 석영 조각을 PBS로 5회 세척하여 결합되지 않은 파지를 제거합니다.

건조한 표면에서 고정되지 않은 파지 감염성을 테스트하기 위해 먼저 황색포도상구균 배양물을 밤새 NZY eRate에 펴고 현탁액을 건조시킵니다. 그런 다음 고정되지 않은 파지가 있는 금으로 코팅된 석영 조각을 앞면이 아래로 향하게 하여 플레이트에 놓습니다. 섭씨 37도에서 12시간 후 감염성을 나타내는 용해 영역을 관찰하여 액체 내 유리 파지의 용해 활성을 테스트할 수 있습니다.

먼저, 300ml 사이드암 플라스크 4개당 10ml의 NZY에 황색포도상구균의 하룻밤 동안 박테리아 배양을 추가합니다. 그런 다음 유리 파지 밀리리터당 6개의 PFU에 10의 2배를 2개의 플라스크에 추가합니다. 이제 24시간에 최종 측정을 수행하는 각 플라스크에 대해 30분 간격으로 광학 밀도 측정을 통해 포도상구균 세포 용해의 시간 경과를 570분 동안 모니터링합니다.

액체에서 결합된 파지의 용해 활성을 테스트하려면 방금 설명한 단계를 반복하되 자유 파지 대신 결합된 파지가 있는 금 조각을 실험 플라스크에 추가합니다. 파지 스테로이드를 준비하려면 먼저 400마이크로리터의 스톡 파지 1 2600 현탁액과 동일한 부피의 스펙트럼 광도 측정 등급 클로로포름을 실온에서 1밀리리터 바이알에 결합합니다. 다음으로, 파지 클로로포름 현탁액을 1분 동안 5초 간격으로 5-6회 부드럽게 소용돌이칩니다.

현탁액이 30초 동안 안정화되도록 한 후 스테로이드 현탁액을 포함하는 상위 부분을 수집합니다. 투과 및 주사 전자 현미경을 위해 몇 마이크로리터의 스테로이드 현탁액을 500마이크로리터 바이알로 옮깁니다. 바이오센서 제조를 위해 1ml 바이알에 남아 있는 스테로이드 현탁액을 보관하십시오.

바이오센서를 먼저 준비하려면 플라즈마 클리너에서 아르곤을 10분 동안 플라즈마 에칭하여 QCMD 센서를 청소합니다. 그런 다음 센서를 헥산으로 헹구어 유기 불순물을 제거합니다. 다음으로, Journal of Microbiological methods에서 Olson Etal이 이전에 설명한 대로 필름 저울의 골을 청소합니다.

LB 트로프에 하위 상 용액을 채우고 트로프 장벽으로 청소합니다. 그런 다음 10분 동안 섭씨 20도에서 물마루를 안정화합니다. 이제 300 마이크로 리터의 파지 1 2600 수성 현탁액을 조심스럽게 적하 하 여 LB 하위 상 용액에 파지 단층을 생성하고, SOPH 상에 부분적으로 잠긴 경사 식용 유리 막대를 수행 한 후 단층이 10 분 동안 안정화되도록 한 후, 미터당 19 뉴턴의 일정한 압력에 도달 할 때까지 분당 30 밀리미터의 속도로 단층을 압축한다.

수직 필름 증착은 이 절차에서 가장 까다로운 부분입니다. 성공을 보장하려면 이 절차의 모든 구성 요소가 깨끗한지 확인하고 단층 증착 매개변수도 최적화해야 합니다. 이제 분당 4.5mm의 속도로 센서를 단층 안팎으로 7회 연속으로 담그면 수직 필름 증착을 수행할 수 있습니다.

수직으로 배치된 QCMD 센서에. 수직 필름 증착은 온전한 파지를 바이오센서 표면에 결합합니다. 마지막으로, MRSA 검출, 전자 현미경 및 자유 파지와 결합 파지 모두의 엘 검안을 위해 제작된 파지 바이오센서를 사용합니다.

qof T 소프트웨어를 사용하여 수중에서 QCM 센서의 기준선, 공진 주파수 및 에너지 소산을 설정하여 이 단계를 시작합니다. 약 30분 후, 테스트 셀을 통해 물 속의 살아있는 메티실린에 민감한 황색포도상구균 또는 MSSA 박테리아 세포의 현탁액을 뽑습니다. 파란색 선은 주파수 값을 나타내고 빨간색 선은 에너지 소산 수준을 나타냅니다.

수평선은 기준선의 설정을 나타냅니다. 화면 중간에 있는 숫자 2는 이벤트가 센서와 관련이 있음을 나타냅니다. 4개 중 2개는 표시된 첫 번째 배음에 대한 센서의 공진 주파수 및 에너지 소산의 변화를 지속적으로 모니터링합니다.

다음은 박테리아가 테스트 셀을 통과한 후의 변화입니다. 센서의 변화, 공진 주파수 및 내부 에너지 소산의 변화가 PVP 항체의 현탁액에서 포화 수준에 도달하고 라텍스 속도를 흐름에 연결하고 주파수 소산에 대한 지속적인 모니터링을 계속할 때 주파수가 감소하고 에너지 소산이 증가하는 데 몇 초 밖에 걸리지 않습니다. 여기에 표시된 것은 기준선 설정, 박테리아 첨가 후 빈도 및 에너지 소산의 몇 초 변화, 포화 상태 및 마지막으로 비드 첨가 후의 변화를 보여주는 전체 검출 프로세스입니다.

이 표는 파지 스폿 테스트에서 나타난 MRSA 균주를 포함하여 테스트된 모든 S reus 균주에 대해 입증된 파지 용해 활성을 보여줍니다. 명판의 크기는 일반적으로 5mm에서 15mm 사이였습니다. 다른 실험 배양에 대한 활동은 발견되지 않았다.

여기서, 섭씨 37도의 쉐이커 인큐베이터에서 NZ Y 배지에서 포도상구균 Urus A TCC 1 2600의 정상적인 성장은 박테리아의 수가 3.2 곱하기 10에서 6, 4.0 곱하기 10, 밀리리터당 8 CFU로 증가하여 입증됩니다. 약 24시간 동안, 금 표면에 고정된 파지는 현탁액 내 파지의 활성과 유사한 용해 활성을 보여주었습니다. 움직이지 않는 파지는 24시간 동안 배양 실험을 하고, 섭씨 4도에서 6일 동안 PBS에 여러 번 세척하고 보관한 후에도 새로운 박테리아 감염에 감염성을 유지했습니다.

이 이미지에서 금 조각 주위의 리소좀을 관찰할 수 있는데, 이는 고정되지 않은 파지가 박테리아 세포를 용해시킬 수 있음을 나타냅니다. 그러므로, 여기에 예시된 바와 같이, 박테리아와 해동화된 파지의 공동 배양에서 발견되는 박테리아 성장의 효과적인 감소는 물 부유 박테리아와 결합된 파지의 1차 상호 작용의 결과입니다. 여기서, 금 기질 표면에 있는 온전한 용해 파지 1 2600의 투과 및 주사 전자 현미경 사진은 파지 현탁액이 클로로포름 처리를 받고, 파지의 꼬리가 길이가 수축하고 두꺼워지며, 다각형 머리가 둥글거나 스테로이드가 될 때 보여집니다.

중대한 구조적 변화에도 불구하고. 플라크 번호로 측정 된 스테로이드의 용해 활성은 클로로포름 처리의 결과로 변하지 않았습니다. 고정된 용해 파지가 있는 QCM 센서는 MRSA에 노출되었을 때 공진 주파수나 에너지 소실에 큰 변화가 없었으며, 이는 MRSA 파지 상호 작용이 놈 질량 변화를 초래했음을 나타냅니다.

그러나 QCM에 따르면 분석 후 바이오센서의 전자 현미경 사진에서 센서 표면에서 상당한 박테리아 결합이 나타났습니다. MRSA 현탁액을 파지 스테로이드 바이오센서와 함께 플로우 셀에 주입했을 때 빈도가 크게 감소하고 소실이 증가하는 것이 관찰되었습니다. 파지 스페로 박테리아 MRSA 결합 상호 작용에 따라 분석 센서는 BBP 2 A 항체 접합 라텍스 속도 현탁액에 노출되었습니다.

이러한 MRSA 분석 바이오센서는 BPP 2개의 A 항체 결합 라텍스 속도 현탁액에 반응하여 주파수의 추가 감소와 소실의 증가가 관찰되었습니다. MSA와 파지 프로브에 대한 PPP 2 A 항체 접합 라텍스 속도의 결합은 주사 전자 현미경 조사를 사용하여 확인되었습니다. 파지 스테로이드 바이오센서가 MSSA에 노출되었을 때, 파지 스테로이드 MSSA 결합 상호 작용 후 주파수의 상당한 감소와 소멸의 증가가 관찰되었으며, 분석 센서는 PPP 2 A 항체 결합 라텍스 속도 현탁액으로 도전했습니다.

초기에 MSSA 분석 바이오센서는 MSSA와 PPP가 2개의 A 항체를 접합한 라텍스 속도 상호 작용의 몇 분 후 빈도 증가와 소산 감소의 짧은 과도도를 보여주었습니다. 그러나 PVP 2 A 항체 도입 후 빈도는 다시 증가하지만 deci 에너지는 증가했습니다. 그런 다음 주사 전자 현미경으로 MSSA와 파지 프로브의 결합을 분석했지만 MSSA와 PPP 사이의 결합은 관찰되지 않았습니다.여기에서 두 개의 항체 접합 라텍스 속도가 관찰되었으며 타원 대칭 두께 프로파일과 용해 파지의 3D 두께 맵이 표시됩니다.

두께 프로파일을 생성하기 위해 두께 맵을 가로지르는 선이 그려졌습니다. 이 마지막 이미지는 A-Q-C-M-D 센서의 금 표면에 결합된 파지에 의해 캡처된 MRSA의 대표적인 CCD 광학 카메라 이미지와 밀리리터당 10에서 8 CFU 및 10에서 밀리리터당 9 CFU의 농도로 파지로 고정된 유리 기판에서 MRSA의 3D 강도 프로파일을 보여줍니다. 각 둥근 원은 단일 박테리아를 나타냅니다.

액체 현탁액의 박테리아 농도가 10에서 밀리리터당 8 CFU로, 10에서 밀리리터당 9 CFU로 증가하면 3D 강도 프로파일에서 포획된 박테리아가 크게 증가한다는 것이 분명합니다. 최상층의 흰색 피크 수는 포획된 박테리아의 수에 비례하며, 예상대로 박테리아 노출이 10에서 8, 10, 밀리리터당 9CFU로 증가할 때 피크의 밀도가 크게 증가합니다. 하단의 짙은 파란색 층은 금 기질과 접촉하는 파지 층에 해당합니다.

더 많은 박테리아가 포획됨에 따라 파지의 광학 특성이 박테리아와 결합할 때 변화하여 더 어둡고 강렬한 파란색을 띠게 됩니다. 이 절차에 따라 개발 후 파지 박테리아 상호 작용을 이해하기 위해 박테리아 포획 효율성을 정의할 수 있습니다. 이 기술은 박테리아 파지 요법 분야의 연구자들이 동물과 인간의 병원체 억제를 탐구하는 방법을 보여줍니다.병원성 박테리아에서 유기 용제로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 엄격한 규정을 따르는 것이 매우 중요하다는 것을 잊지 마십시오.