Name: 최적화 및 활용 아그로 박테 리움 매개 과도 단백질 생산는 담배 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: 배우세요 담배에서 Agrobacterium 매개 진공 침투법을 이용한 과도적 재조합 단백질 생산 방법을 최적화하는 기술입니다. 이 방법은 백신 항원과 치료용 단백질의 대규모 생산에 활용됩니다.

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이 작품은 분자 생명 공학, iBio, 주식 회사와 방위 고등 연구 프로젝트 기관 (승인 번호의 HDTRA1-07-C-0054)를위한 프라운호퍼 미국 센터에 의해 지원되었다. 저자는 Drs에 의해 관대 한 선물을 인정합니다. 생물 과학과, 퍼듀 대학교 (아그로 박테 리움 균주를 투메 파시 엔스)와 대규모 생물학 사의 웨인 Fitzmaurice (N.의 excelsiana 씨)뿐만 아니라 미국 된 담배 컬렉션, 노스 캐롤라이나 주립 대학 (N. 엑셀 씨의 제니퍼 니콜슨의 스탠튼 Gelvin ). 저자는 식물과 뛰어난 기술 지원을 제공하는 마가렛 실링 크리스토퍼 헐 감사합니다. 저자는 또한 Drs에 감사드립니다. 편집에 도움 스티븐 Streatfield와 나타샤 Kushnir.

1. 식물 성장 이후 agroinfiltration 위해 우리는 두 개의 야생형 된 담배 종 실내 시설에서 암면에 수경 재배 (N.의 benthamiana와 N. 입시) 및 하이브리드 (N.의 excelsiana)을 평가 하였다. <ol><li> 식물 비료 용액에 암면 슬라브를 적시십시오. </li><li> 야생 형 N.의 씨앗을 뿌리다 benthamiana, N. 입시 및 N. 영양소에 excelsiana (N. 엑셀 × N.의 benthamiana의 하이브리드) 암면의 표면을 적신. </li><li> 에 대한 통제 된 조건 (24 ° C 및 40~65% 상대 습도)에서 씨앗에서 식물과 (130 ~ 150 μE 미터의 조명과 14 시간의 빛과 10 시간의 어둠, -2 초 -1) 긴 일 광주를 성장 N.에 대한 4~5주 benthamiana와 N. excelsiana 및 N.에 대한 5-6주 엑셀. </li></ol> Agroinfiltrat에 대한 벡터의 2. 건설이온 <ol><li> 인플루엔자 바이러스 (HAC1)의 A/California/04/2009 변형에서 합성 리포터 유전자 (녹색 형광 단백질 [GFP), 전체 길이의 헤 마글 루티 닌 (HA)를 삽입하고, 재 설계 lichenase 효소 (LicKM) 18 개별적으로 발사 벡터 pBID4-GFP, pBID4-HAC1 각각 pBID4-LicKM, 18,32,41,47을 얻기 위해 18 (TMV 기반 벡터) pBID4. </li><li> A.의 electrocompetent 세포로 10 ~ 50 GFP를 들고 pBID4의 NG 또는 HAC1 소개 A.의 electrocompetent 세포로 변형 GV3101과 LicKM을 투메 파시 엔스 튜메 파시 엔스는 유전자 MicroPulser의 electroporator와 GV3101, C58C1, GLA4404, At06, AT10, At77 및 A4를 변종. </li><li> 별도의 언급이없는 한 침투 실험을 위해 변환 된 아그로 박테리아를 사용합니다. </li></ol> 3. 된 담배 식물에 아그로 박테 리움의 침투를 진공 청소기로 청소 <ol><li> A. 성장 튜메 파시 엔스는 LB 매체 YEB 메드에서 (O / N) 하룻밤 변종IUM 또는 AB 매체는 200 ~ 250 rpm에서 진탕 28 ° C에서 카나마이신 50 ㎎ / L로 보충. </li><li> 4,000 ×에서 LB 또는 YEB 또는 AB 성장 0.5 원심 분리기 아그로 박테 리움 세포의 600 nm에서 광학 밀도 (600)에 밀리 Q 물에 아그로 박테리아를 희석 4 ° C에서 10 분 동안 G는 0.5의 600 유도 매체 (1X MS 소금, 10 밀리미터 MES, 200 μM 아세토 시린 곤, 2 % 자당 [MMA])에 다시 일시 중지, 1-3 실온에서 교반 시간,하지 않는 한 그렇지 않으면 지적했다. </li><li> 아그로 박테 리움 현탁액 된 담배 공장 공중 조직을 잠수함이 잠수, 30 또는 60 초 동안 50 ~ 400 mbar의 진공을 적용하여 진공 챔버에 식물을 침투. 최적의 침투는 정기적으로 60 초 동안 50 ~ 100 mbar에서 적용됩니다. </li><li> 진공이 깨진되면, 진공 챔버에서 식물을 제거 물에 씻어, 사전 침투 성장에 사용되는 것과 동일한 성장 조건에서 5-7일에 성장. </li><li> 효능을 테스트하려면아그로 박테 리움 VIR 유전자, 아세토 시린 곤의 상이한 농도 (0, 100, 200 또는 400 μM)을 유도하는 화학 물질은 침투 완충액 아그로 박테리아 (1X MS, 10 mM의 MES에, 2 % 글루코스)에 첨가 하였다. 비르 유전자, 포도당 (0, 1, 2 또는 4 %)의 다른 비율의 유도에 단당류의 효과를 침투 버퍼 (1X MS, 10 밀리미터 MES, 200 μM 아세토 시린 곤)에 현탁 아그로 박테리아에 추가되었습니다. N.은 단계 3.3 및 3.4)에서 전술 한 바와 같이 benthamiana 식물이 침투 하였다. </li><li> 아그로 박테 리움 연구소는 600 0.5. N.에 밀리 Q 물에 희석 GV3101, C58C1 및 LBA4404 및 야생형 균주 A4, At06, AT10, 그리고 At77 pBID4-LicKM 벡터를 숨겨을 변종 benthamiana 공장은 단계 3.3 및 3.4에서 위에서 언급 한 바와 같이 각각의 특정 변형에 침투했다. </li></ol> 바이러스 성 침묵의 억제 4. 공동 agroinfiltration 절차 <ol><li> 엠IX 1:1 GFP 유전자와 토마토 덤불 스턴트 바이러스 (TBSV)의 바이러스 성 침묵 억제 P19을 들고 밀리 Q 물 희석 된 아그로 박테 리움 GV3101 문화 2:1 3:1 4:1 비율. N. 침투 상술 한 바와 같이 benthamiana 공장. </li><li> N. 침투 두 밀리 Q 물 희석 된 아그로 박테 리움 GV3101 문화의 혼합물로 benthamiana 공장 : pBID4-HAC1 플라스미드를 전달하는 첫 번째와 침묵 진압 중 하나 들고 두 번째 - TBSV 또는 감귤 tristeza 바이러스의 P23의 P19, pCassp 플라스미드에서 ( pCassp19)와 35S 프로​​모터 비율 4:1에서 각각 (PGR-P23), 아래의 PGR 이진 플라스미드에. </li></ol> 5. 웨스턴 블롯 분석 <ol><li> N.에서 임의의 잎을 채취 benthamiana, N. 엑셀 또는 N. excelsiana의 4-7 dpi 해상도에서 식물과 미세 분말을 액체 질소에 분쇄. </li><li> 트리톤 0.5 %를 포함 1X PBS 버퍼의 세 볼륨을 추가X-100 각 샘플에. </li><li> 조심스럽게 4 ℃에서 15 분 동안 추출 된 샘플을 흔들 </li><li> 5 분 동안 추출 스핀 깨끗한 에펜 도르프 튜브에 총 수용성 단백질을 수집합니다. </li><li> 1X PBS 추출 버퍼에 적절한 희석 (1시 50분 1:100)에 추출물을 희석하고, 5 × 샘플 버퍼 (250 MM 트리스 - 염산 [산도 6.8], 10 % SDS, 파랑 0.5 % 브로 모 페놀, 50 % 글리세롤을 추가 최종 1 × 농도에 부착 V / V 및 500 mM의 DTT). </li><li> 5 분 동안 삶아 샘플. </li><li> 10 % SDS-PAGE에 의해 분리 된 단백질은 Immobilon-P 전달 막에 전송하고, 0.5 %의 I-블록과 블록. </li><li> 1:5,000에서 토끼 다 클론 항-GFP 항혈청을 사용하고 HAC1 1 시간 동안 차단 솔루션에 1:1,000에서 마우스 항 - 폴리 히스티딘 단일 클론 항체를 사용하여 GFP를 감지합니다. </li><li> 차 항체 라벨링 한 후, 10 분간 1 × PBST-20 각의 세포막을 세 번 씻어 1:5,000의 복합 - 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 항 토끼 항체 또는 HRP-공액과 부화1 GFP 및 HAC1 검출을위한 시간, 각각에 대한 1:10,000의 D 항 마우스 항체. </li><li> SuperSignal 웨스트 피코 화학 발광 기판을 사용하여 서양 말을 처리합니다. </li><li> 단백질의 밴드 강도를 분석하고 밴드 보정 양을 얻기 위해 GeneTools 소프트웨어를 사용합니다. </li></ol> 단백질 생산 (샘플의 교정 양의 X 희석) /로드 샘플의 양) 4 = ㎎ / ㎏을 x. 식 : 단백질 생산 (P), 교정 량 (C), 시료 (D)의 희석 및 적재 샘플의 양 (S). 6. Zymogram 분석 <ol><li> 수집 pBID4-LicKM - 침투 N. benthamiana 임의의 조직 샘플. </li><li> 웨스턴 블롯 분석을 위해 전술 한 바와 같은 방법을 사용하여 단백질을 추출하고 0.1 % lichenan으로 10 % SDS-PAGE에 의해 분석이 젤에 포함되어 있습니다. </li><li> 전기 영동 한 후, 100 mM 트리스 - 염산 [pH를 8.0] 0.1 % 트리톤 X보기 (세척 완충액에서 10 분마다 겔 두 번 씻어-100) 한 후 1 시간 동안 65 ° C에서 세척 버퍼에 품어. </li><li> 배양 후, 세척 완충액을 버리고, 실온에서 5 분 동안 0.5 % 콩고 레드로 겔을 염색. </li><li> 10 분마다 밀리 Q 물에 젤 세 번 씻어하고 lichenase 활동을 시각화하기 위해 1 M의 NaCl을 추가합니다. 정제 된 박테리아 lichenase 단백질은 효소 활성에 대한 양성 대조군으로 사용 하였다. </li></ol> 7. GFP 이미징 <ol><li> 휴대용 장파장 UV 램프를 사용하여 전체를 일시적으로 형질 전환 식물체에서 GFP 형광의 시각적 검출을 수행. </li><li> 사진은 일시적으로 노란색 (8)를 통해 디지털 카메라로 식물을 전환, 52 필터 (노출 시간, 15 초) ES. </li><li> 웨스턴 블롯 이미지를 구하는 것은 GeneGnome에 GeneSnap 소프트웨어를 사용하여 정제하여 GFP 표준을 기반 검량선과, GeneTools 소프트웨어를 사용하여 결과를 정량 분석​​한다. </li><li> purifi에 기초하여 검량선을 사용 HAC1 단백질 정량화인플루엔자 바이러스의 A/Indonesia/05/05 균주로부터 ED HAC 단백질 표준. </li><li> 3-4 평균 값을 계산하는 모든 실험에 복제합니다. </li></ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

이 연구에서, 우리는 시작 벡터를 운반하는 아그로 박테 리움 균주를 사용하여 선택한 된 담배 종의 일상 과도 단백질 생산을위한 간단한 agroinfiltration 프로토콜을 개발했습니다. 또한, 우리는 우리의 과도 식물 발현 시스템에서 가장 높은 재조합 단백질 생산 수준을 달성하기 위해 최적의 조건을 확인했다. 희석 A. 진공 침투 N.에 출시 벡터 pBID4를 숨겨 변형 GV3101을 투메 파시 엔스 benthamiana, N. excelsiana 및 N. 엑셀 시어는 알팔파 모자이크 바이러스를 숨겨 GV3101에 침투 피섬 새 티범 다른 식물 종에 비해 7 dpi로 내 표적 단백질 생산의 높은 수준, 결과 - 나 오이 모자이크 35S 프로모터에서 GFP의 리포터 유전자를 발현하는 바이러스 기반의 벡터 41, 또는 락 투카 사티, 까 lycoA.의 C58C1 변형으로 침투 persicum 및 애기 장대 베타 - 글루 쿠로니다 아제 리포터 유전자 57. N.을 들고 튜메 파시 엔스 benthamiana와 N. excelsiana는 90 % -95 %의 침투 효율이 30 ~ 60 초 동안 50 mbar에서 침투 진공 청소기로 청소하기 쉽게했다. 잎 지역의 나머지 10 % 때문에 진공의 응용 프로그램 중 아그로 박테 리움 현탁액의 표면에 잎의 일부 부동의 침투되지 않았습니다. 발사 벡터가 세포 간 이동 18 능력을 가지고 있기 때문에, 과도 단백질의 축적은 7 dpi로에 전체 잎뿐만 아니라 잎자루에서 발생합니다. pBID4 발현 벡터가 셀 사이를 이동시킬 수 있지만, 체계적 18 움직이지 때문에 10 dpi로에서 잡은 GFP 생산은 다소 낮았다; 따라서, 새로 자란 잎은 벡터를 포함하지 않고 대상의 생산에 기여하지 않습니다. 또한, 재조합 단백질의 열화 이상의 시간 mAY 10 dpi로에서 환원 단백질 수준에 기여한다. 우리의 결과는 A.의 침투를 보여 주었다 N. 일시적인 단백질 생산의 튜메 파시 엔스 균주 GV3101 매개 높은 수준 benthamiana. 또한, 목적 단백질은 lichenase하는 N-말단, C-말단 또는 내부 융합체 (LicKM), β-1 ,3-1, 4 - 글루 카나 아제, 클로스 트리 디움 thermocellum에서 열 안정성 효소이고 많은 타겟에 내열성을 부여로 설계 될 수있다 단백질 융합 18. N.의 침투 A.과 benthamiana 잎 말림, 잎자루의 신장, 컬링 : 가벼운 또는 심한 증상을 유발 관심의 유전자를 품고 야생형 균주 (AT6, AT10 및 at77를) 투메 파시 엔스. 어떤 병적 인 증상은 N.에서 관찰되지 않았다 일부 유전자가 GV3101을 변종 pBID4에 삽입 실험실로 변환하는 동안 benthamiana는, 빈 pBID4 벡터를 숨겨 실험실 변형 GV3101에 침투, C58C1 또는 LBA4404 가벼운 괴사 반응과 잎을 이끌어백화 / 잎의 침투 지역에서 증상을 황변. 야생 형 아그로 박테 리움 또는 가지과 식물 기폭 장치를 제거하는 균주에 의한 괴사 증상은 이전에 56, 57가보고되었습니다. 괴사 반응은 유형 III 분비 시스템의 유형 IV 분비 시스템에 의해 식물 세포에 전달 세균의 단백질 및 / 또는 편모 58-60 감도의 독성 요인에서 발생할 수 있습니다. 우리는 이종 단백질의 일시적인 생산도 병원성을 유도 할 수 있으며 침투 공장에서 과민 반응이 나뭇잎 것으로 나타났습니다. 많은 연구자들은 안정적으로 형질 전환 식물 28,57에 비해 과도 단백질 생산의 5 ~ 20 배 높은 수준까지 생산 공장 이진 벡터와 다른 식물 종의 agroinfiltration을보고했다. 우리의 데이터는 보여줍니다 N. benthamiana는 GV3101에 대해보고 된 GFP 수익률과 유사 GFP의 pBID4-GFP 일시적으로 발현 높은 수준을 품고으로 침투N.의 benthamiana는 아그로 박테리아가 롯트-GFPSYS 바이러스 벡터 (총 수용성 단백질의 80 %) 44 운반과 침투. 런칭 벡터를 이용 Agroinfiltration이 내열성 단백질 LicKM의 높은 생산 결과, 표준 플라스미드 바이너리 (18)를 사용하여 관찰 된 것보다 50 배. A.의 감염을 테스트하려면 튜메 파시 엔스 및 발사 벡터의 안정성, 우리는 N.의 플랫 침투 benthamiana pBID4-GFP 플라스미드를 숨겨 GV3101의 동일한 밀리 Q 물 희석 문화권을 사용하여 최대 8 시간 동안 매 시간마다. 우리의 데이터는 GV3101의 변형을 효율적으로 최소 8 시간 및 pBID4 (발사 벡터)에 대한 감염성 것으로 나타났다은 8 시간 긴 침투하는 동안 매우 안정적입니다. -80 ° C에 저장된 발사 벡터 pBID4-HAC1 (세포 은행을) 숨겨 GV3101 균주의 글리세롤 주식은 과도 PROTE의 변화없이 3 년 동안 매우 안정적인 것으로 나타났다침투 공장에서 생산. 최적의 조건에서 35 사이의 42 일 후 파종에서 재배 N. benthamiana의 식물 진공 침투 매개 일시적인 유전자 발현 (40)에 대한 최적이었다. (3-4 주령) 이하 식물 때문에 세포 현탁액 표면 및 진공을인가하는 기계적 효과에서 조직 손상에 떠있는 나뭇잎 완전히 침투 할 수 없다. 사십오일, N.보다 오래된 식물 benthamiana 사용 된 최적의 광 조건에서, 무대를 볼트, 일시적 발현의 수준이 낮습니다. 저분자 페놀 화합물 (아세토 시린 곤) 및 monosaccharaides (글루코오스) 55,61을 A. 투메 파시 엔스는 소재 VIR 유전자를 유도하는 것으로 알려져있다. 또한, N.의 침투 50-600 μM의 농도에서 아세토 시린 곤의 존재 이진 벡터 pCAMBIA (GFP)와 benthamiana 약간 과도을 증가 표시했다유전자 발현 40. 우리는 3 시간 동안 MMA에 pBID4-GFP를 숨겨 GV3101의 문화에 이들 화합물을 첨가하여 우리의 시스템에서 아세토 시린 곤과 포도당의 서로 다른 농도의 효과를 연구하고, GFP 발현에 차이를 찾을 수 없습니다. 흥미롭게도, pBID4-GFP를 숨겨 0.5의 600 밀리 Q 물에 희석하고 비르 유전자의 유도없이 침투 GV3101의 문화에 의한 문화 침투와 그로서 GFP의 동일한 금액을 표명했다. A. 튜메 파시 엔스의 비르 유전자 (들)은 잠재적으로 공장의 페놀 화합물 (아세토 시린 곤 및 sinapinic 산)과 잎의 조직에 존재하는 식물 monosaccharaides (포도당과 과당)에 의해 유도 될 수있다. 따라서 외인성 VIR 유전자 유도제의 존재 또는 부재에서 GFP 발현의 유사한 수준이 식물 세포에서 GFP 발현 발사 벡터의 복제 중에 본 세포질 VIR 유전자 유도제의 효과의 결과 일 수 있다는 것을 추측. N. benthamiana 과도 단백질 생산 49 모델 호스트로 사용되어왔다. 그러나, N. benthamiana의 상대적으로 낮은 바이오 매스 수율은 재조합 단백질의 대량 생산에 대한 응용 프로그램을 방해한다. 최적의 호스트는 일시적 발현의 높은 수준의 온실 쉬운 성장을 결합하고, 아그로 박테 리움의 침투 2에 민감해야한다. 다른 호스트를 선택하기 위해, 우리는 하이브리드 N.에게 된 담배 (N.의 benthamiana와 N. 엑셀)의 두 개의 서로 다른 야생 형 종을 침투하고 A.와 excelsiana (N. 엑셀 × N.의 benthamiana) pBID4-GFP 플라스미드를 숨겨 변형 GV3101을 투메 파시 엔스. 이러한 세 가지 종 중에서, GFP 발현 수준 N. 약간 높았다 benthamiana. N. 엑셀 시어 식물 인해 가죽 같은 잎을 진공 agroinfiltration에 어려움을 보였으며, N. excelsiana생산 거의 같은 성장 조건에서 더 많은 바이오 매스를 두 배. 7 dpi 해상도에서 GFP의 일시적인 생산 N. 상대적으로 유사하다 benthamiana와 N. excelsiana. 따라서, N. excelsiana은 재조합 단백질 생산에 더 적합한 호스트 일 수있다. 아그로 박테 리움 매개 과도 단백질 생산 유전자가 식물 바이러스의 기원 (62)의 억제를 침묵의 공동 식으로 극복 할 수 PTGS 26 일에 의해 제한됩니다. 과도 단백질 생산 이전에 함침 조직 (34)에 PTGS를 억제 TBSV의 P19 단백질의 존재하에 50 배 향상된 것으로 나타났다. 우리의 연구에서, 우리는 개별적으로 발사 벡터 pBID4-HAC1와 공동 침투 두 바이러스 성 침묵 억제 (P19 및 P23)의 효과를 평가 하였다. 이러한 침묵 억제의 공동 침투 HAC1 만 약간의 증가와 함께, HAC1의 일시적 발현에 거의 영향을 미칠 듯공동 침투 P23 또는 P19의 존재 단백질의 축적 (15~25%). 단백질 생산에 긍정적 영향을 미치는 것으로, 침묵 억제 구체적 대상 식물 종 및 바이러스 벡터 (63)에서 유효로 선정 될 필요가있다. TMV의 헬리는 RNA 침묵 활동 (64), (65)의 억제가 있습니다. pBID4-HAC1와 P23 또는 P19의 공동 침투는 GFP의 증가없이 또는 과도 HAC1 단백질 생산에 약간의 증가의 결과로 우리의 데이터는 이러한 관찰을 확인합니다. 결론적으로, 우리는 수정 및 최적화 식물과 아그로 박테 리움의 성장 조건을 진공 침투의 효율성을 개선했습니다. 이 기술은 몇 시간에 식물 재료의 수백 킬로그램의 성장과 침투 할 수있었습니다. 우리는 성공적으로 현재 좋은 제조 관리 기준 (cGMP의) 조건에서 산업 규모에서 높은 처리량 백신 생산을위한 공장 일시적 발현 기술을 자동화. ABO 자세한 내용은UT 자동화 및 cGMP의 조건 하에서 서브 유니트 백신 후보를 포함한 재조합 단백질의 생산을위한 식물 과도 단백질 생산 시스템의 활용은, 독자는 홈페이지 칭한다 <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

식물은 이제 이종 재조합 바이오 의약품 및 산업용 단백질 1-3의 제조, 안전 신뢰성, 확장 성 및 저렴한 플랫폼으로 인식하고 미생물 및 동물 세포 발현 시스템 4에 중요한 장점을 가지고있다. 식물은 조립 된 다중 체 항체 5-7 등의 번역 후 변형, 제대로 접힌 단백질을 표현 할 수 있습니다. 여러 식물 유래 재조합 의약품 단백질은 임상 평가 8을 겪고있다. 이러한 비호 지킨 림프종 9, 헤 마글 루티 닌 기반 유행성 계절 독감 백신 후보는 10, 11 (커밍스 등., 백신에 제출), 안티 - 연쇄상 구균의 표면 항원 I의 치료를위한 환자 특정 재조합 이디 백신 (scFv를)를 포함 / 치아 우식증 (12)의 치료, 당뇨병 (13)의 치료를위한 인간의 인슐린 II 항체. 또한, 인간의 RECO고셔병 환자에서 효소 대체 요법에 대한 mbinant glucocerebrosidase 이스라엘과 미국에서 승인 된 제품으로, 미국 (14, 15)의 외부로 확장 된 액세스 프로그램에 따라 제공된다. 이종 단백질을 안정적으로 변형 (유전자 변형 또는 Plastid 형질 전환) 또는 일시적으로 형질 전환 식물에서 생산 될 수있다. 과도 단백질 생산은 식 (16) 및 축적을 달성하기 위해 짧은 시간 포함한 형질 전환 식물에서의 생산에 비해 여러 가지 장점을 제공하고, 식물 조직 (4) 내에 세균 이진 벡터 또는 재조합 식물 바이러스 벡터를 도입함으로써 달성 될 수있다. 가장 진보 된 일시적인 발현 시스템은 식물 바이러스 및 이진 플라스미드의 성분을 배합하고, agroinfiltration 17,18 의해 전달되는 &#39;발사 벡터&#39;의 사용에 기초한다. 담배 모자이크 바이러스 (TMV)에 기초하여 발사 벡터의 Agroinfiltration 성공적 실험실에서 적용된이러한 인간 유두종 바이러스 19, 예 르시 니아 페스티 20 병원균에 대한 백신의 항원을 생산하기 위해 확장, 인플루엔자는 21, 22, 탄저균 23 바이러스 및 N.에 천연두 바이러스 (24) benthamiana 잎. 아그로 박테 리움 매개 일시적 발현은 여러 단백질 2,25-27의 동시 생산을위한 유망한 방법이다. 예를 들어, 식물, 일시적인 발현 시스템은 종양 특정 재조합 항체 28,29, 표피 성장 인자 수용체 (30)에 대하여 당화 재조합 항체 및 탄저균 방어 항원에 특이 31,32 모노클로 날 항체를 생산하는 데 사용되었다. 표적 유전자 및 향상된 표적 단백질의 발현 33, 34의 유전자 침묵 결과의 회로 부착 된 담배의 benthamiana 공장의 공동 침투. Agroinfiltration 균일 introdu을위한 일반적인 방법입니다식물에 관심의 유전자를 숨겨의 cing 박테리아는 35-37를 조직. 그대로 공장에서 일시적인 유전자 발현에 나뭇잎 아그로 박테 리움의 진공 침투 형질 전환 식물 38 ~ 41을 생성 할 필요없이 외래 단백질의 생산을위한 신속한 확장 성, 유용한 방법입니다. 진공 agroinfiltration 동안, 식물이 거꾸로 뒤집 및 공중 부분은 아그로 박테 리움 현탁액에 잠긴. 그런 다음 진공 가스가 기공을 통해 잎의 세포 간 공간에서 철수하는 원인이 적용됩니다. 잎에 아그로 박테 리움 현탁액의 주입에 진공 결과의 신속한 재 가압 다음 릴리스. 아그로 박테리아의 진공 침투에 따라, 식물은 더 이상 재배 및 목표 표현이 모니터링됩니다. 표적 발현의 가장 높은 수준은 전형적으로 2-3 일 이후 발현 수준은 일반적 decrea 발사 벡터와 이진 벡터 및 4-7 dpi로, 함께 침투 (DPI)을 남기 관찰SES 17,18,42-45. 아그로 박테 리움 튜메 파시 엔스는 단백질 생산을위한 식물에 관심 유전자를 전달하기위한 가장 널리 사용되는 수단이다. Agroinfiltration는 N.에 매우 잘 작동합니다 benthamiana하지만 상대적으로 저조한 애기 장대 (46)를 포함하여 대부분의 다른 식물에서. 본 연구에서는 5 ~ 6 주 된 N.에 과도 단백질 생산을위한 간단하고 효율적이며 경제적 인 방법을 개발 benthamiana는 A.를 사용하여 침투를 투메 파시 엔스. agroinfiltration 기술의 산업 스케일링의 주요 단점은 &#39;수확 박테리아 및 4&#39;-히드 록시-3을 함유하는 배지에서 세균 펠릿 재 부유 원심 분리하고, 5&#39;-디메 (아세토 시린 곤), 단당류, 및 2 - (N-모르 폴리 노) - 에탄 설 폰산 (MES) 비르 유전자의 유도를위한 버퍼. 우리는 아그로 박테 리움을 최적화함으로써 이러한 문제를 극복 할 수 있었다 </EM&gt; AB 매체 (최소 배지)의 성장은 직접 밀리 Q 물과 침투 기간 및 조건을 제어하여 희석 하였다. 우리는 또한 야생형 담배 숙주 종 N.에서 목적 단백질의 생산을 비교 한 benthamiana와 N. 입시뿐만 아니라 하이브리드 N.에 excelsiana.

<table><tbody><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>Tobacco 생식질 수집, 작물 과학과, 노스 캐롤라이나 주립 대학</td><td>PI 555478 TW16</td><td>침투</td></tr><tr><td>Nicotiana excelsior</td><td>담배 생식 질 수집, 작물 과학과, 노스 캐롤라이나 주립 대학</td><td>PI 555685 TW47</td><td>침투</td></tr><tr><td>Nicotiana excelsiana</td><td>Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td><td>LSBC EBA 042304.02</td><td>침투</td></tr><tr><td>진공 스키드</td><td>Abbas, Ashland, MA</td><td>맞춤형</td><td>식물 침투</td></tr><tr><td>Rockwool</td><td>Grodan Inc., 온타리오, 캐나다</td><td>AO 50/40</td><td>식물 성장용 수경 매체</td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino) 에탄술폰산</td><td>Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ</td><td>172595000</td><td>버퍼</td></tr><tr><td>무라시게 & Skoog salt (MS salt)</td><td>Phyto Technology Lab</td><td>M524</td><td>조직 배양 매체</td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D134406-5G</td><td>Agrobacterium induction</td></tr><tr><td>Immobilon-P transfer membrane</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>IPVH00010</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>I-block</td><td>Applied Biosystems, Foster City, CA</td><td>T2015</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>토끼 다클론 항-GFP 항혈청&nbsp;</td><td>Washington Biotechnology, Baltimore, MD</td><td></td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>마우스 안티&ndash; poly-histidine monoclonal antibody</td><td>Qiagen GmbH, Hilden</td><td>34670</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit 항체&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>111-035-003</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse anti-mouse antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115-035-003</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>SuperSignal&reg; West Pico 화학발광 기질</td><td>Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td><td>34078</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td><td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland</td><td>P-LICHN</td><td>Lichenase Activity</td></tr><tr><td>Congo Red&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>C6277</td><td>젤 염색</td></tr><tr><td>디지털 카메라&nbsp;</td><td>Olympus, Center Valley, PA</td><td>C-8080</td><td>화학발광 이미징</td></tr><tr><td>GeneGnome</td><td>Syngene, Frederick, MD</td><td></td><td>화학발광 이미징&nbsp;</td></tr><tr><td>GFP 표준&nbsp;</td><td>사내에서</td><td></td> 제작 <td>된 화학 발광 이미징&nbsp;</td></tr><tr><td>식물 비료 솔루션</td><td>Griffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE</td><td>67-23-20</td><td>식물 성장</td></tr><tr><td>Lichenase 표준</td><td>집에서</td><td></td> 정제 <td>Western blotting</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>BioRad, Hercules, CA</td><td>165-2100</td><td>Agrobacterium transformation&nbsp;</td></tr></tbody></table>

최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

식물체에서 아그로 박테 리움 - 매개 변이 단백질 생산을 단시간 내에 백신 항원 및 치료 용 단백질을 생산하는 유망한 접근법이다. 그러나,이 기술은 이제 막 극복되고 수직 확장 대규모 생산 많은 기술적 장애물에 적용되기 시작한다. 여기, 우리는 아그로 박테리아가 시작 벡터를 들고와는 담배 식물의 진공 침투를 기반으로 산업 규모의 과도 단백질 생산을위한 간단하고 재현성있는 방법을 보여줍니다. AB 매체에있는 아그로 박테 리움 재배의 최적화는 침투 과정을 단순화, 밀리 Q 물에있는 세균의 문화를 직접 희석을 할 수 있습니다. 는 담배, N.의 세 가지 시험 종 중 excelsiana (N. 엑셀 × N.의 benthamiana는) 때문에 침투의 용이성에 가장 유망한 호스트로 선정되었다, 고 기자 단백질 생산 수준, 약 2-F통제 된 환경 조건에서 오래된 높은 바이오 매스 생산. 아그로 같은 아세토 시린 곤 및 단당류로서 화학 약품을 사용 pBID4-GFP (담배 모자이크 바이러스 계)를 은닉의 유도는 단백질 생산 수준에 영향을 미치지 않았다. 30 일 또는 60 초 동안 50 ~ 100 밀리바에서 침투 식물은 식물 잎 조직의 약 95 % 침투의 결과. 아그로 박테 리움 실험실 변형 GV3101와 침투는 아그로 박테리아 실험실 변종 LBA4404 및 C58C1 및 야생 형 아그로 박테리아가 at77와 A4, AT10, AT6를 균주에 비해 가장 높은 단백질 생산을 보여 주었다. N.에서 바이러스 성 RNA 침묵 억제, P23 또는 P19, 공동 식 benthamiana는 표적 단백질 (인플루엔자 바이러스의 헤 마글 루티 닌) 이전 축적과 생산 증가 (15~25%)였다.

아그로 박테리아는 (담배 모자이크 바이러스 계는) 백신 항원과 치료 단백질을 생산하기 위해 신속하고 경제적 인 방식 발사 벡터를 들고있는 진공 침투에 근거 된 담배 식물에서 과도 단백질 생산. 우리는 절차를 간소화하고, 세균의 배양 조건을 최적화 호스트 종을 선택하고 RNA 침묵 억제를 공동 도입하여 대상 축적을 개선.

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

본 절차의 전반적인 목표는 아그로 인필트레이션(agro infiltration) 기술을 이용한 식물 기반 시스템에서 일시적 재조합 단백질 생산을 위한 간단하고 효율적이며 확장 가능한 방법을 개발하는 것입니다. 이는 먼저 식물 성장 조건을 최적화함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 식물 바이러스 구성 요소와 바이너리 플라스미드를 결합한 런칭 벡터로 아그로박테리움을 형질전환시킨 후, 아그로 실험에 사용할 수 있도록 형질전환된 아그로박테리움을 배양하는 것입니다.아그로박테리움 침투(agrobacterium infiltration) 과정 동안, 식물을 거꾸로 뒤집어 지상부를 아그로박테리움 현탁액에 담급니다. 그 후 진공을 가해 잎 조직의 세포 간극에서 공기를 배출시킵니다. 진공 해제 후 급격한 재가압을 통해 아그로박테리움 현탁액이 잎 내부로 주입됩니다.최종적으로, 침투시킨 식물 내에서 재조합 단백질이 생성되었음을 입증하기 위해 면역 블로팅 및 형광 분석법이 사용됩니다. 수동 침투와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 진공 침투법이 백신 및 치료용 단백질을 포함한 재조합 단백질의 산업적 생산을 위해 규모를 확장할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 식물 생명공학의 핵심적인 질문들에 대한 답을 제시하는 데 도움을 줄 수 있으며, 상업적 재조합 단백질 생산을 위한 대안적 플랫폼으로서 식물의 활용을 더욱 촉진할 수 있습니다.우리는 토양 재배 식물의 아그로-여과(agro filtration) 규모를 확대하는 것이 어렵다는 점을 발견했을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 토양에는 바이러스, 박테리아, 선충과 같은 불순물이 포함되어 있고, 토양 성분과 관수 용수가 배치마다 그리고 계절마다 다르며, 저장 기간이 지남에 따라 토양이 노화되는 등 여러 가지 이유가 있습니다. 또한, 토양 재배 식물을 뒤집으면 침투 과정 중에 토양이 아그로박테리움 배양액으로 원치 않게 떨어지는 결과가 발생합니다.본 절차는 식물 생물학 및 공학 실험실의 선임 연구원인 Rebecca Snow와 제 실험실의 연구원인 Emma Gut Robin Lobe, 그리고 Adam Trevor가 시연하겠습니다. 본 연구에서는 식물 성장의 균일성을 확보하고 토양 재배와 관련된 복잡성을 제거하기 위해 수경 재배 식물 성장 배지와 배양액을 사용합니다.이 절차를 시작하려면, 암면 슬랩을 식물 비료 용액에 5분 동안 담근 후, 영양액이 흡수된 암면 표면에 씨앗을 수동으로 파종합니다. 본 연구에서는 세 가지 Nico Oceana 종을 사용하여 평가하며, 야생종인 Nico Oceana, Benham Ana, Nico Oceana Excelsior와 Benham, Ana 및 Excelsior의 교잡종인 Nico Oceana Excela가 이에 해당합니다. 씨앗으로부터 자란 식물은 제어된 조건 및 장일 광주기 하의 수경 재배 캐스케이딩 시스템에서 육성합니다.Nico Oceana, Bentham Miana 및 Nico Oceana Excela는 4~5주 동안, Nico Oceana Excelsior는 5~6주 동안 배양합니다. 본 실험에 사용된 Agrobacterium tumor Fasion 균주들은 동반된 논문에 기술된 대로 적절한 launch vector로 형질전환되었습니다. 본 시연을 위해 다섯 가지의 형질전환된 agrobacterium 균주가 사용됩니다.리포터 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 보유한 GV 3 1 0 1, 토마토 bushy stunt virus P 19 silencing suppressor의 바이러스 유전자를 보유한 GV 3 1 0 1, 그리고 modified liase 또는 lick KM 운반체 단백질 유전자를 보유한 GV 3 1 0 1 및 T 10 agrobacterium 균주를 50 mg/L의 can mycin이 첨가된 LB 배지에서 28 °C, 200~250 RPM의 진탕 조건으로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 일시적 단백질 생산을 위해 여러 agrobacterium 균주를 사용하는 가능성을 조사하기 위한 실험용 agrobacterium 현탁액을 준비합니다. PBI four lick km 벡터를 보유한 실험실 균주 하나와 야생형 균주 두 개를 milli Q water로 희석하여 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)를 0.5로 맞춥니다.침투 전 아그로박테리움(agrobacterium)의 병원성 유전자를 유도해야 할 필요성을 조사하기 위해, 먼저 LB 배지에서 배양한 P bid 4G FP 벡터 함유 아그로박테리움 배양액을 4 °C에서 4,000 ×g로 10분간 원심분리합니다. 그 다음, MMA 유도 배지에 현탁하여 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)를 0.5로 맞춘 후 실온에서 2시간 동안 교반합니다. 아세틸 코인이 일시적 단백질 생산을 향상시키는지 테스트하려면, LB 배지에서 하룻밤 동안 배양한 PBI 4G FP 벡터 함유 아그로박테리움 배양액을 원심분리하고 1X MS 염, 10 mM MES 및 2% glucose가 포함된 침투 완충액에 재현탁합니다.세포 현탁액을 4개의 용기에 나누어 담습니다. 각 아그로박테리움(Agrobacterium) 현탁액에 서로 다른 농도의 aceto cone을 첨가하고 실온에서 3시간 동안 배양합니다. 바이러스 소음 억제제(viral silencing suppressor)의 공동 침투가 일시적인 GFP 단백질 생성에 미치는 영향을 테스트하려면 혼합합니다.GFP 유전자를 포함하는 Milli-Q 워터 희석 아그로박테리움 배양액과 바이러스 소음 억제제 P 19를 포함하는 배양액을 4:1 비율로 혼합합니다. 이어서 식물의 진공 침투 과정을 시연하겠습니다. 식물을 진공 침투시킬 때는 진공 압력과 침투 시간을 제어하는 것이 매우 중요합니다. 먼저, 준비된 아그로박테리움 현탁액을 진공 챔버 내부의 용기에 옮깁니다.그 다음 희석된 agrobacterium 용액에 식물을 거꾸로 뒤집어 넣고 50에서 400 millibar의 진공을 30초 또는 60초 동안 가합니다. 최적의 침투를 위해 통상적으로 50에서 100 millibar의 진공을 60초 동안 적용합니다. 진공을 해제한 후, 진공 챔버에서 식물을 꺼내 물로 헹구고, 침투 전 성장 단계와 동일한 성장 조건에서 5일에서 7일 동안 배양합니다.Western 분석을 위한 시료를 준비하려면, 먼저 침투 후 4~7일(DPI)이 지난 Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior 또는 Nico Oceana Excela 식물에서 무작위로 잎 시료를 수집하여 액체 질소로 미세한 분말이 될 때까지 분쇄합니다. 각 시료에 0.5% Triton X 100이 포함된 1X PBS 버퍼를 3배 부피로 첨가하고, 시료를 에펜도르프 튜브로 옮깁니다. 추출된 시료를 4 °C에서 15분 동안 부드럽게 흔들거나 회전시킵니다.추출물을 5분 동안 원심분리하고, 총 수용성 단백질을 깨끗한 에펜도르프 튜브에 수집합니다. 추출물을 1X PBS 추출 버퍼를 사용하여 적절한 농도로 희석하고, 5X 샘플 버퍼를 최종 농도가 1X가 되도록 첨가합니다. SDS-PAGE로 단백질을 분리하기 전, 샘플을 5분 동안 가열합니다.단백질을 고정된 P 전이 막으로 전이시킨 후, 블로킹 용액에서 1:5,000으로 희석한 토끼 다클론 anti GFP 항혈청을 사용하여 GFP를 검출합니다. 막을 1 X-P-B-S-T 20으로 3회 세척한 후, 완만한 로킹 상태로 실온에서 1시간 동안 배양합니다. GFP 검출을 위해 1:5,000으로 희석한 horseradish peroxidase 접합 항-토끼 항체와 함께 1시간 동안 배양합니다.이어서, 동반된 논문에 기술된 대로 웨스턴 블롯을 처리하고 단백질에 해당하는 밴드 강도를 분석합니다. 일시적으로 형질전환된 식물 전체에서 GFP 형광의 시각적 검출은 휴대용 장파장 UV 램프를 사용하여 수행하며, 디지털 카메라와 15초의 노출 시간을 사용하여 yellow eight ES 52 필터를 통해 일시적으로 형질전환된 식물을 촬영합니다. genome의 gene snapped 소프트웨어를 사용하여 웨스턴 블롯 분석 이미지를 획득하십시오.정제된 GFP 표준물을 기반으로 한 검량선을 이용하여 유전자 분석 소프트웨어로 결과를 정량화합니다. 식물 성장 및 생물량 축적을 위한 최적 조건을 결정하기 위해 Nick Oceana Bentham Miana를 시판 비료에 적신 Rockwell 슬랩에서 배양하였습니다. 4.8% 인이 함유된 비료 용액 또는 0% 인이 함유된 비료 용액에서 성장한 이 6주 된 식물들의 모습에서 알 수 있듯이, NICO Oceana Bentham 종자의 발아와 성장을 위해서는 인의 존재가 결정적입니다.agrobacterium 성장 및 침투 배지가 식물 건강과 단백질 생산에 미치는 영향을 Nicotiana hamana 식물의 GFP 생산량을 비교하여 조사하였습니다. PBI 4G FP를 보유한 agrobacterium 배양액을 세 가지 서로 다른 배지에서 배양하여 식물에 진공 침투시켰습니다. YEB 또는 LB 배지에서 하룻밤 동안 배양한 YEB, AB 및 LB 배양액을 저속으로 원심 분리한 후 MMA 유도 배지에 재현탁하거나, YEB, LB 또는 AB 배지에서 하룻밤 동안 배양한 후 Milli Q water로 1:5 또는 1:10으로 직접 희석하였습니다. 이 western blot 결과에서 알 수 있듯이, YEB, LB 또는 AB 배지에서 배양하고 Milli Q water로 희석한 agrobacterium 배양액을 침투시킨 식물은 원심 분리 후 MMA에 재현탁한 배양액과 비교했을 때 평균 GFP 생산량에서 유의미한 차이를 보이지 않았습니다.따라서 식물 침투법을 위한 아그로박테리움 배양액 희석에는 milli Q water 사용이 권장되며, 이후 실험에서 600 nanometers에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)를 0.5로 맞추기 위해 이를 일상적으로 사용하였습니다. 다음으로, 아그로박테리움 세포 현탁액의 밀도와 시간 경과가 표적 발현에 미치는 영향을 조사하였습니다. PBI 4G FP를 보유한 아그로박테리움의 네 가지 서로 다른 세포 현탁액 밀도를 평가하였으며, 침투 후 4일, 7일 및 10일(DPI)에 잎 샘플을 채취하여 western blot 분석을 수행하였습니다. 4 DPI에서 서로 다른 아그로박테리움 세포 현탁액 밀도로 침투시킨 식물들 사이에 GFP 형광의 뚜렷한 차이가 나타났으며, 600 nanometers에서의 밀도가 0.05인 경우에는 GFP 발현이 관찰되지 않았습니다. 7 DPI에서는 GFP가 발현되었습니다.세포 현탁액으로 침투시킨 식물들의 형광은 유사하게 나타났습니다. A 600 수치가 1.0, 0.5 및 0.1인 밀도에서는 비슷했으나, 10 DPI에서 A 600 수치가 0.05인 현탁액으로 침투시킨 식물에서는 형광이 더 낮았습니다. 일시적 단백질 생산에 사용할 수 있는 아그로박테리움 균주의 다양성을 높이기 위해 네 가지 세포 현탁액 밀도로 침투시킨 식물들 사이에서 GFP 생산의 차이는 관찰되지 않았습니다.Nicotiana benthamiana 식물에 vector KBI4lickkm을 포함하는 7가지 서로 다른 아그로박테리아 균주를 진공 침윤시켰습니다. 침윤된 잎을 7 DPI에 수집하였으며, 웨스턴 블롯을 통해 키나아제 발현 수준을 측정하였습니다. 이 그래프에서 알 수 있듯이, liase 생산 수준은 GV3110, IA4, LBA4404 균주에서 약간의 차이를 보이며 가장 높게 나타났습니다.가장 낮은 발현 수준은 C58C1에서 나타난 반면, AT77, AT06 및 AT10 균주에서는 중간 정도의 lyase 생산이 이루어졌으며, lyase 효소 활성은 XMO Graham assay를 사용하여 입증되었습니다. 정제된 박테리아 lyase 단백질은 효소 활성을 위한 양성 대조군으로 사용되었습니다. A4 및 AT77 야생형 agrobacterium 균주를 침윤시킨 Nicotiana benthamiana 식물에서 7 DPI에 생장 억제, 잎자루 신장 및 말림, 잎 말림과 같은 병리적 증상이 나타났다는 점은 주목할 만합니다.wild type T 10 균주를 침투시킨 nicotiana benham 식물에서는 증상이 경미하게 나타났습니다. 실험실 균주 GV 3 1 0 1을 침투시킨 Nico Oceana Benham 식물에서는 증상이 관찰되지 않았습니다. 야생종의 식물 바이오매스 생산량을 비교한 결과, 동일한 성장 조건에서 Nico Oceana Excela에서 생성될 수 있는 최대 잎 바이오매스는 Nico Oceana와 비교하여 약 2배 더 높은 것으로 나타났습니다.아그로박테리움 균주 GV 3 1 0 1(PBI 4G F-P-G-F-P 함유)을 침윤시킨 Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior 및 Nico Oceana Excela에서 Benham 단백질 생산을 조사하였다. 침윤된 잎 전체에서 7 DPI에 GFP 축적 정도를 평가하였다. UV 광 아래에서 GFP 발현을 시각적으로 확인한 결과, Nico Oceana Hamana와 Nico Oceana Excela에서는 GFP가 균일하게 분포되었으나, Nico Oceana Excelsior는 잎 전체 면적을 침윤시키는 데 어려움이 있어 불균일하게 분포되었다. 7 DPI에 침윤된 잎의 GFP 축적량을 Western blot 분석으로 확인한 결과, GFP 수준은 Nico Oceana Hamana가 Nico Oceana Excela 및 Nico Oceana Excelsior보다 높았으며, Nico Oceana에서는 단백질 생산 수준이 낮았다.Excelsior 현상은 수집된 잎에서 불균일한 침투와 축적된 GFP의 불균일한 분포로 인해 발생합니다. 진공 압력이 잎에 미치는 영향을 테스트하기 위해, PBI 4G FP를 보유한 아그로박테리움 균주 GV 3 1 0 1을 사용하여 Nico Oceana Benham 식물에 400, 200, 100 또는 50 millibar의 진공 압력 하에서 30초 또는 60초 동안 진공 유지 시간을 두고 침투시켰습니다. 5, 100 및 200 millibar의 진공 압력을 30초 또는 60초 동안 적용했을 때, GFP 생성에는 차이가 없었으며 식물 건강에 미치는 부정적인 영향은 경미하거나 없었습니다.진공 지속 시간이 표적 발현에 미치는 영향은 Nico Oceana Benham 식물 한 플랫을 대상으로 PBI 4G FP를 보유한 GV 3 1 0 1(A 600 = 0.5)을 8시간 동안 매시간 침투시켜 평가하였다. 이 대표적인 결과에 나타난 것과 동일한 아그로박테리움 배양액에서, GFP 생성 수준은 8시간까지의 모든 시점에서 유사하게 나타났으며, 이는 이 기간 동안 아그로박테리움이 단일 가닥 DNA를 방출하는 능력을 유지함을 시사한다. 다양한 식물 종에서 많은 화학 물질과 단당류가 일시적 단백질 생산을 증강시키는 것으로 보고되었기 때문에.본 연구에서는 또한 서로 다른 농도의 acetosyringone과 glucose가 Nicotiana benthamiana의 일시적인 GFP 단백질 생성에 미치는 영향을 평가하였습니다. PBI 4G FP를 보유한 agrobacterium strain GV 3 1 0 1을 접종하였습니다. Agrobacterium은 YEB 배지에서 하룻밤 동안 배양한 후, 원심 분리하여 표시된 농도의 acetyl syringone과 2% glucose가 함유된 MMA 또는 표시된 농도의 glucose와 200 µM acetophenone이 함유된 MMA에서 OD₆₀₀ 0.5가 되도록 재현탁하였습니다. 여기서 보는 바와 같이, 유도 배지에 acetophenone이나 glucose가 포함되지 않은 대조군과 비교했을 때, 테스트한 이러한 화합물의 어떤 농도에서도 GFP 단백질 생성의 유의미한 증가는 유도되지 않았습니다.다음으로, Nico Oceana. Benham 잎에서 GFP 및 HAC one 유전자의 일시적 발현에 대한 silencing suppressor의 공동 침투(co infiltration) 효과를 조사하였습니다. 침투 전, PBI 4G FP와 tomato bushy stunt virus의 viral silencing suppressor인 P 19를 보유한 agrobacterium GV three one ten one 배양액을 각각 1:1, 2:1, 3:1, 4:1의 비율로 혼합하였습니다. 7 DPI에서의 Western blot 분석 결과에서 나타나듯이, P 19의 존재는 두 agrobacterium 현탁액의 어떤 비율에서도 nicotiana Benham Miana의 GFP 생산을 증가시키거나 감소시키지 않았습니다.또한, 두 가지 바이러스 유전자 침묵 억제제인 P 23과 P 19가 HAC one의 전사 후 유전자 침묵 방지에 미치는 영향을 조사하였다. 런칭 벡터 PBI four HAC one을 포함하는 agrobacterium의 POS와 두 가지 바이러스 침묵 억제제 플라스미드 중 하나를 각각 4:1의 비율로 혼합하여 Nicotiana Bentham Miana에 공동 침투시켰다. 침투시킨 잎 샘플은 3~8 DPI에 수집하였다.이 그래프는 Western blot 분석으로 결정한 세 차례 실험의 HAC one 평균 발현 수준을 보여줍니다. Nico Oceana Benham을 P 23 또는 P 19와 공동 침투시킨 결과, 60 pi에서 silencing 억제제를 사용하지 않은 경우와 비교하여 HAC one 생성이 증가했습니다. 이는 P 23과 P 19가 이 시스템에서 효율적임을 시사합니다.또한 사이런싱 억제제의 존재 여부와 관계없이, HAC one 단백질 생산 수준이 7 DPI부터 감소하기 시작하는 것이 관찰되었습니다. 이는 런칭 벡터가 침투된 Nicotiana benthamiana에서 일시적인 단백질 생산의 감소 시점이 타겟 특이적임을 나타냅니다. 마지막으로, 동일한 배치의 Agrobacterium 세포 은행을 Nicotiana benthamiana 식물에 침투시켜 단백질 축적을 평가함으로써 Agrobacterium 세포 은행의 안정성을 매년 평가합니다.이러한 대표적인 결과들은 HA one 단백질 생산이 3년 이상 매우 안정적으로 유지되었음을 나타냅니다. Nicotiana benthamiana 식물에서의 평균 HAC one 생산량은 651 ± 49.4 mg/kg입니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 서브유닛 백신, 치료용 단백질 항체 및 진단 항원 제조에 활용될 수 있는 대규모 재조합 단백질 생산을 위한 아그로-침투(agro-infiltration) 기술의 적용 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.이 절차를 수행할 때는 수경 재배 방식으로 식물 교배를 제어하고, 생존 가능한 agro bacteria를 사용하며, 진공 압력과 시간을 조절하고, 단백질 발현 벡터를 모니터링하는 것이 중요합니다. 숙련되면, 제어된 조건 하에서 적절하게 수행될 경우 agro 여과 기술은 24시간 이내에 완료될 수 있습니다.

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