최적화 및 활용 아그로 박테 리움 매개 과도 단백질 생산는 담배

아그로 박테리아는 (담배 모자이크 바이러스 계는) 백신 항원과 치료 단백질을 생산하기 위해 신속하고 경제적 인 방식 발사 벡터를 들고있는 진공 침투에 근거 된 담배 식물에서 과도 단백질 생산. 우리는 절차를 간소화하고, 세균의 배양 조건을 최적화 호스트 종을 선택하고 RNA 침묵 억제를 공동 도입하여 대상 축적을 개선.

이 절차의 전반적인 목표는 농업 침투 기법을 사용하여 식물 기반 시스템에서 일시적인 재조합 단백질 생산을 위한 간단하고 효율적이며 확장 가능한 방법을 개발하는 것입니다. 이는 먼저 식물 성장 조건을 최적화하여 달성됩니다. 두 번째 단계는 식물 바이러스와 이진 플라스미드의 구성 요소를 결합한 발사 벡터로 아그로박테리움을 형질전환한 다음, 아그로 실험에 사용하기 위해 형질전환된 아그로박테리움을 배양

아그로박테리움이 침투하는 동안, 식물은 거꾸로 뒤집히고 공중 부분은 아그로박테리움 현탁액에 잠깁니다. 그런 다음 진공을 가하여 잎 조직의 세포 간 공간에서 공기를 배출합니다. St를 통해 진공 해제 후 신속한 재가압을 통해 아그로박테리움 현탁액이 잎에 주입됩니다.

궁극적으로 면역 블로팅 및 형광 분석은 침투된 식물에서 재조합 단백질 생산을 보여주는 데 사용됩니다. 수동 침투와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 진공 침투 방법을 백신 및 치료용 단백질을 포함한 재조합 단백질의 산업 생산으로 확장할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 식물 생명 공학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 상업적 재조합 단백질 생산을 위한 대체 플랫폼으로 식물을 사용하는 것을 더욱 촉진할 수 있습니다.

이 방법에 대한 아이디어는 토양 재배 식물에서 농업 여과를 확장하는 것이 어렵다는 것을 알았을 때 처음 떠올랐습니다. 여러 가지 이유로 토양에는 바이러스, 박테리아, 선충과 같은 우친이 포함되어 있으며, 또한 토양 함량과 관개 용수는 배치마다, 계절마다 다르며 토양 알은 시간이 지남에 따라 저장됩니다. 또한, 토양 성장 식물을 뒤집으면 침투하는 동안 아그로박테리움 배양액으로 원치 않게 토양이 떨어지게 됩니다.

이 절차를 시연하는 사람은 식물 생물학 및 공학 실험실의 선임 연구 조교인 Rebecca Snow와 Emma Gut Robin Lobe입니다. 그녀, 그녀, 그리고 아담 트레버는 내 연구실의 연구 조교입니다. 이 연구는 식물 성장의 균일성을 보장하고 식물 재배를 위한 토양 사용과 관련된 복잡성을 제거하기 위해 수경 식물 성장 배지 및 영양 용액을 사용합니다.

이 절차를 시작하려면 암면 석판을 식물 비료 용액에 5 분 동안 담그고 영양이 풍부한 암면 표면에 수동으로 씨앗을 파종합니다. 이 연구에서는 삼나무를 사용하여 3 개의 Nico Oceana 종, 2 개의 야생형 종, Nico Oceana, Benham Ana 및 Nico Oceana Excelsior와 Nico Oceana라는 Benham, Ana 및 Excelsior의 잡종을 평가합니다. Excela는 통제 된 조건에서 씨앗에서 식물을 성장시키고 수경 재배 계단식 시스템에서 긴 하루 사진 시간을 보냅니다.

니코 오세아나(Nico Oceana), 벤담 미아나(Bentham Miana), 니코 오세아나 엑셀라(Nico Oceana Excela)는 4-5주, 니코 오세아나 엑셀시어(Nico Oceana Excelsior)는 5-6주 동안 투여됩니다. 이 실험에 사용된 Agrobacterium tumor Fasion 균주는 첨부된 원고에 기술된 바와 같이 적절한 발사 벡터로 형질전환되었습니다. 이 시연을 위해 5개의 형질전환된 아그로박테리움 균주가 사용됩니다.

GV 3 1 0 1, 리포터 녹색 형광 단백질 또는 GFP 유전자 GV 3 1 0 1, 토마토 덤불 스턴트 바이러스 P 19 및 A 4 GV 3 1 0 1 및 T 10의 침묵 억제기의 바이러스 유전자를 운반합니다. 운반 단백질 변형 liase 또는 핥기 KM의 유전자를 운반하여 LB 배지에서 하룻밤 사이에 agrobacterium 균주를 성장시키고 다음 날 200-250 RPM에서 흔들면서 섭씨 28도에서 캔 마이신 리터당 50 밀리그램을 보충합니다. 일시적인 단백질 생산을 위해 여러 아그로박테리움 균주를 사용하는 타당성을 조사하고, 실험실 균주와 2개의 야생형 균주를 희석하여 PBI 4 lick km 벡터를 milli Q 물에 600 나노미터의 0.5의 광학 밀도로 보유하는 타당성을 조사하기 위해 원하는 실험을 위한 아그로박테리움 현탁액을 준비합니다.

침투 전 아그로박테리움 독성 유전자 유도의 필요성을 조사하기 위해 먼저 P bid 4G FP 벡터를 운반하는 아그로박테리움 배양물을 4, 000배 G의 LB 배지에서 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 MMA 유도 매체에서 0.5의 600 나노미터에서 광학 밀도로 재현탁하고 실온에서 2시간 동안 교반하여 아세틸 콘이 일시적인 단백질 생산, 원심분리기 및 아그로박테리움 배양을 향상시키는지 테스트합니다. LB 배지에서 하룻밤 동안 배양한 PBI 4G FP 벡터를 운반하고 1 X ms 염 10 밀리몰, MES 및 2% 포도당을 포함하는 침투 완충액에 재현탁합니다.

세포 현탁액을 4개의 용기로 나눕니다. 각 아그로박테리움 현탁액에 다른 농도의 아세토 콘을 추가하고 실온에서 3시간 동안 배양합니다. 일시적인 GFP 단백질 생산 믹스에 대한 바이러스 침묵 억제제의 공동 침투 효과를 테스트합니다.

GFP 유전자를 운반하는 milli Q 물 희석 아그로박테륨 배양물과 바이러스 침묵 억제제 P 19를 4:1 비율로 운반하는 배양물을 식물의 진공 침투 중에 시연할 것입니다. 다음은 진공 압력을 제어하는 것이 중요하며 진공 침투 기간, 진공 침투 식물을 진공 청소기로 청소하는 것이 중요합니다. 먼저, 준비된 아그로박테리움 현탁액을 진공 챔버 내부의 용기로 옮깁니다.

그런 다음 희석된 아그로박테리움에서 식물을 거꾸로 뒤집고 30 또는 60초 동안 50-400mbar 진공 청소기를 적용합니다. 최적의 침투는 일반적으로 50-100mbar에서 60초 동안 적용됩니다. 진공 상태가 깨지면 진공 챔버에서 식물을 제거하고 물로 헹구고 사전 여과 성장에 사용되는 것과 동일한 성장 조건에서 5-7일 동안 자랍니다.

서양 분석을 위한 샘플을 준비하려면 먼저 침투 후 4-7일 후에 Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior 또는 Nico Oceana Excela 식물에서 무작위 잎 샘플을 수집하거나 DPI에서 액체 질소로 잎 샘플을 미세한 분말로 분쇄합니다. 각 샘플에 0.5%Triton X 100을 함유한 하나의 XPBS 버퍼 3개를 추가하고 샘플을 einor 튜브로 옮깁니다. 추출된 샘플을 섭씨 4도에서 15분 동안 부드럽게 흔들거나 회전시킵니다.

추출물을 5분 동안 돌리고 총 용해성 단백질을 깨끗한 einor 튜브에 모읍니다. 추출물을 XPBS 추출 완충액 1개에서 적절한 희석으로 희석하고 최종 1X 농도에 5개의 시료 완충액을 추가합니다. SDS 페이지로 단백질을 분리하기 전에 샘플을 5분 동안 끓입니다.

단백질이 움직이지 않는 P 이동 막에 옮겨진 후에 1에서 5, 막는 해결책에서 000의 희석에 토끼 polyclonal 반대로 GFP anti-serum를 사용하여 GFP를 검출하십시오. X-P-B-S-T 20 1개로 멤브레인을 3회 세척한 후 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 말 무 peroxidase에 의하여 활용된 반대로 광견병에 걸린 항체로 잠복하십시오, 1개에서 5의 희석을, GFP 탐지를 위한 1 시간 동안 000를 추가하십시오.

그 후, 웨스턴 블롯을 처리하고 단백질에 해당하는 밴드 강도를 동반된 원고에 설명된 대로 분석합니다. 전체 과도 형질전환된 식물에서 GFP 형광의 시각적 검출은 휴대용 장파장 UV 램프를 사용하여 수행되며, 디지털 카메라를 사용하고 15초의 노출 시간으로 노란색 8 ES 52 필터를 통해 일시적으로 형질전환된 식물을 촬영합니다. 게놈에서 유전자 스냅 소프트웨어를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에서 이미지를 얻습니다.

정제된 GFP 표준을 기반으로 하는 보정 곡선이 있는 유전자 도구 소프트웨어를 사용하여 결과를 정량화하는 Nick Oceana Bentham Miana는 식물 성장 및 바이오매스 축적을 위한 최적의 조건을 결정하기 위해 상업적으로 이용 가능한 비료에 담근 로크웰 슬래브에서 재배되었습니다. 인의 존재는 NICO Oceana의 발아 및 성장을 달성하는 데 중요합니다. 벤담 씨앗은 4.8%의 인을 함유한 비료 용액 또는 0%의 인을 함유한 비료 용액에서 자라는 이 6주 된 식물에서 볼 수 있습니다.

식물 건강과 단백질 생산에 대한 아그로박테리움 성장 및 침투 배지의 영향은 니코티아나의 GFP 생산을 비교하여 조사되었습니다. Hamana 식물은 PBI 4G FP로 진공 침투하여 세 가지 다른 배지에서 성장한 아그로박테리움 배양을 보유하고 있습니다. YEB 또는 LB 배지에서 밤새 성장한 YEB AB 및 LB 배양물을 저속으로 원심분리하고 MMA 유도 배지에 재현탁시키거나 YEB LB 또는 AB 배지에서 밤새 성장시킨 후 Milli Q 물로 1 내지 5 또는 1 내지 10을 직접 희석한 이 웨스턴 블롯 결과에서 나타난 바와 같이, YEB LB 또는 AB 배지에서 성장한 아그로박테리움 배양물에 침투하고 Milli Q.Water로 희석한 식물은 유의한 차이를 보이지 않았다 MMA에서 원심분리되고 재현탁된 배양물로부터의 평균 GFP 생산.

따라서 milli Q 물은 식물 침투를 위한 아그로박테리움 배양액을 희석하는 데 권장되며, 600나노미터에서 0.5의 광학 밀도를 얻기 위해 후속 실험에서 일상적으로 사용되었습니다. 다음으로, 아그로박테리움 세포 현탁액 밀도와 시간 경과가 표적 발현에 미치는 영향을 조사했습니다. PBI 4G FP를 운반하는 아그로박테륨의 4가지 다른 세포 현탁 밀도를 평가하고 잎 샘플을 4일, 7일 및 10일 후 또는 4개의 DPI에서 웨스턴 블롯 분석을 위해 DPI에서 채취했으며, 아그로박테륨의 다른 세포 현탁 밀도로 침투한 식물 간에 GFP 형광에 현저한 차이가 있었으며, GFP 발현은 7개의 D-P-I-G-F-P에서 600/0.05에서 관찰되지 않았습니다.

형광은 세포 현탁액에 침투한 식물에서도 유사했습니다. 밀도는 601.0, 0.5 및 0.1이지만 10DPI에서 대조적으로 0.05의 A 600으로 침투 한 임플란트가 낮았습니다. 일시적인 단백질 생산에 유효한 agrobacterium 균주의 다양성을 증가시키기 위하여 4개의 세포 현탁 조밀도의 어느 것이든으로 침투된 식물 사이에서는 GFP 생산에 있는 아무 차이도 관찰되지 않았습니다.

니코티아나 벤햄 미아나 식물은 벡터 KBI 4 lick km를 보유한 7 개의 다른 농업 박테리아 균주에 의해 진공 침투되었습니다. 침투한 잎은 7DPI에서 수집하였고, 키나아제 발현 수준은 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 추정되었다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이, GV 3 1 10, 1 A 4 및 LBA 4 4 0 4 균주에서 가장 높은 수준의 liase 생산이 달성되었으며 약간의 차이가 있었습니다.

가장 낮은 수준의 발현은 C, 5, 8, C, 1개의 중간 용해효소 생산은 균주와 함께 달성되었으며, T, 77, A, T, 0, 6 및 T 10 용해효소 활성이 XMO Graham 분석을 사용하여 입증되었습니다. 정제된 박테리아 리아제 단백질은 효소 활성에 대한 양성 대조군으로 사용되었습니다. A 4 및 T 7 7 야생형 아그로박테리움 균주에 침투한 nicotiana Benham miana 식물이 발육 부진, 애완 동물 신장 및 컬링, 7DPI에서 잎 컬링과 같은 병리학적 증상을 보였다는 점은 흥미롭습니다.

증상은 T 10 균주에서 야생형으로 침투한 nicotiana benham 식물에서 경미했습니다. 실험실 균주 GV 3 1 0 1에 침투 한 Nico Oceana Benham 식물에서는 증상이 관찰되지 않았습니다. 야생형 종의 식물 바이오매스 생산량을 비교한 결과, 동일한 성장 조건에서 Nico Oceana Excela에서 생성할 수 있는 가장 높은 잎 바이오매스는 Nico Oceana에 비해 약 2배 더 높은 것으로 나타났습니다.

벤햄 단백질 생산은 아그로박테리움 균주에 침투한 니코 오세아나 벤햄(Nico Oceana Benham), 니코 오세아나 엑셀시어(Nico Oceana Excelior) 및 니코 오세아나 엑셀라(Nico Oceana Excela)에서 조사되었다. GV 3 1 0 1 PBI 4G F-P-G-F-P 축적은 전체 침투 잎에서 7 DPI로 평가되었습니다. 자외선 하에서 GFP 발현을 육안으로 검사한 결과, Nico Oceana Hamana와 Nico Oceana Excela에서 GFP의 균일한 분포를 보였고, Nico Oceana Excelsior의 전체 잎 면적에 침투하는 것이 어렵기 때문에 Nico Oceana Excelsior에서 고르지 않은 분포를 보였으며, 7개의 DPI에서 이러한 침투된 잎에서 GFP 축적의 웨스턴 블롯 분석은 GFP 수준이 Nico Oceana Excela 및 Nico보다 Nico Oceana Hamana에서 더 높았음을 보여주었습니다 Oceana Excelsior 니코 오세아나의 낮은 단백질 생산 수준.

Excelsior는 수집된 잎에 축적된 GFP의 불균일한 침투 및 불균일한 분포 때문입니다. 진공 압력이 잎에 미치는 영향을 테스트하기 위해 Nico Oceana Benham 식물에 30 또는 60초의 진공 유지 시간에서 400, 200, 100 또는 50밀리바의 진공 압력에서 PBI 4G FP를 품고 있는 아그로박테리움 균주 GV 3 1 0 1에 침투했습니다. 5, 100 및 200 밀리바의 진공 압력을 30 또는 60 초 동안 적용했을 때 GFP 생산의 차이와 식물 건강에 대한 미미한 또는 해로운 영향이 관찰되지 않았습니다.

진공 지속 시간이 표적 발현에 미치는 영향은 8시간 동안 PBI 4G FP를 품고 있는 GV 3 1 0 1의 0.5의 A 600으로 매 시간마다 Nico Oceana Benham 공장의 한 플랫에 침투하여 평가되었습니다. 이 대표적인 결과에서 보인 것과 동일한 agrobacterium 배양에서 GFP 생산의 수준은 항상 비슷했다, 8 시간까지, 이 기간 동안 agrobacterium가 단 하나 가닥 DNA를 발사하는 그것의 능력을 유지한다는 것을 건의한다. 많은 화학 물질과 단당류가 다양한 식물 종에서 일시적인 단백질 생산을 향상시키는 것으로 보고되었기 때문입니다.

이 연구는 또한 아세토, 크리논 및 포도당의 다양한 농도의 효과를 평가했습니다. Nico Oceana Benham의 일시적인 GFP 단백질 생산에서 Ana는 PBI 4G FP를 품고 있는 아그로박테리움 균주 GV 3 1 0 1에 침투했습니다. 농업 박테리아를 YEB 배지에서 하룻밤 동안 성장시키고, 원심분리하고, 표시된 농도에서 아세틸 세론이 함유된 2% 포도당을 함유하는 MMA 또는 표시된 농도에서 포도당이 있는 200마이크로몰 아세토페논을 함유하는 MMA에서 0.5의 600으로 재현탁시켰습니다. 여기에서 보이는 바와 같이, 이 화합물의 시험한 농도의 어느 것도 감응작용 매체가 아세토페논 또는 포도당을 포함하지 않는 대조군과 비교된 GFP 단백질 생산에 있는 뜻깊은 증가를 유도하지 않았습니다.

다음으로, Nico Oceana에서 GFP 및 HAC one 유전자의 일시적 발현에 대한 침묵 억제제의 co 침투의 효과. 벤햄 잎은 PBI 4G FP를 함유한 아그로박테리움 GV 3 1 1 10 1 배양물과 토마토 덤불 스턴트 바이러스의 바이러스 침묵 억제제 P 19를 각각 1:1, 2:1, 3:1, 4:1의 비율로 혼합하여 침투하기 전에 조사하였다. 7 DPI에서 웨스턴 블롯 분석 결과에서 알 수 있듯이, P 19의 존재는 아그로박테리움 현탁액 중 2개의 비율로 니코티아나 벤햄 미아나(Benham Miana)에서 GFP 생산을 증가시키거나 감소시키지 않았다.

또한, HAC 1에 대한 전사 후 유전자 침묵 방지에 대한 두 개의 바이러스 유전자 침묵 억제자 P 23 및 P 19의 효과를 조사했습니다. 발사 벡터인 PBI 4개, HAC 1개, 2개의 바이러스 침묵 억제 플라스미드 중 하나를 운반하는 아그로박테리움의 POS를 각각 4:1의 비율로 혼합하여 Nicotiana Bentham Miana에 공동 침투시켰다. 침투된 잎 샘플은 3 - 8 DPI에서 수집되었습니다.

이 그래프는 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정된 3가지 실험에서 HAC 1 발현의 평균 수준을 보여줍니다. Nico Oceana Benham을 P 23 또는 P 19와 함께 공동 침투하면 60 파이에서 소음 억제기를 사용하지 않은 것과 비교하여 HAC 1 생산량이 증가했습니다. 이는 P 23 및 P 19가 이 시스템에서 효율적임을 시사합니다.

또한 침묵 억제제의 존재 유무에 따라 HAC 1 단백질 생산 수준이 7DPI에서 감소하기 시작하는 것이 관찰되었습니다. 이는 발사 벡터에 침투한 Nico Oceana Benham Miana의 일시적 단백질 생산 감소 시점이 표적에 따라 다르다는 것을 나타냅니다. 마지막으로, 단백질 축적을 평가하기 위해 매년 Agrobacterium cell bank와 동일한 배치의 nicotiana benham 식물에 침투하여 Agrobacterium cell Bank의 안정성을 평가합니다.

이러한 대표적인 결과는 HA one 단백질 생산이 3년 이상 매우 안정적임을 나타냅니다. Nicotiana benam 공장의 평균 HAC 1 생산량은 킬로그램 당 651 플러스 마이너스 49.4 밀리그램입니다. 이 동영상을 시청한 후에는 서브유닛 백신, 테오 단백질 항체 및 진단용 항원 제조에 사용할 수 있는 재조합 단백질을 대규모로 생산하기 위해 농업 침투 기술을 적용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안 수경법으로 식물 교배를 제어하고, 생존 가능한 농업 박테리아를 사용하고, 진공 압력과 이온을 제어하고, 단백질 발현 매개체를 모니터링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 일단 숙달되면 농업 여과 기술은 통제된 조건에서 적절하게 수행되면 24시간 내에 완료할 수 있습니다.