최적화 및 활용

본 절차의 전반적인 목표는 아그로 인필트레이션(agro infiltration) 기술을 이용한 식물 기반 시스템에서 일시적 재조합 단백질 생산을 위한 간단하고 효율적이며 확장 가능한 방법을 개발하는 것입니다. 이는 먼저 식물 성장 조건을 최적화함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 식물 바이러스 구성 요소와 바이너리 플라스미드를 결합한 런칭 벡터로 아그로박테리움을 형질전환시킨 후, 아그로 실험에 사용할 수 있도록 형질전환된 아그로박테리움을 배양하는 것입니다.

아그로박테리움 침투(agrobacterium infiltration) 과정 동안, 식물을 거꾸로 뒤집어 지상부를 아그로박테리움 현탁액에 담급니다. 그 후 진공을 가해 잎 조직의 세포 간극에서 공기를 배출시킵니다. 진공 해제 후 급격한 재가압을 통해 아그로박테리움 현탁액이 잎 내부로 주입됩니다.

최종적으로, 침투시킨 식물 내에서 재조합 단백질이 생성되었음을 입증하기 위해 면역 블로팅 및 형광 분석법이 사용됩니다. 수동 침투와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 진공 침투법이 백신 및 치료용 단백질을 포함한 재조합 단백질의 산업적 생산을 위해 규모를 확장할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 식물 생명공학의 핵심적인 질문들에 대한 답을 제시하는 데 도움을 줄 수 있으며, 상업적 재조합 단백질 생산을 위한 대안적 플랫폼으로서 식물의 활용을 더욱 촉진할 수 있습니다.

우리는 토양 재배 식물의 아그로-여과(agro filtration) 규모를 확대하는 것이 어렵다는 점을 발견했을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 토양에는 바이러스, 박테리아, 선충과 같은 불순물이 포함되어 있고, 토양 성분과 관수 용수가 배치마다 그리고 계절마다 다르며, 저장 기간이 지남에 따라 토양이 노화되는 등 여러 가지 이유가 있습니다. 또한, 토양 재배 식물을 뒤집으면 침투 과정 중에 토양이 아그로박테리움 배양액으로 원치 않게 떨어지는 결과가 발생합니다.

본 절차는 식물 생물학 및 공학 실험실의 선임 연구원인 Rebecca Snow와 제 실험실의 연구원인 Emma Gut Robin Lobe, 그리고 Adam Trevor가 시연하겠습니다. 본 연구에서는 식물 성장의 균일성을 확보하고 토양 재배와 관련된 복잡성을 제거하기 위해 수경 재배 식물 성장 배지와 배양액을 사용합니다.

이 절차를 시작하려면, 암면 슬랩을 식물 비료 용액에 5분 동안 담근 후, 영양액이 흡수된 암면 표면에 씨앗을 수동으로 파종합니다. 본 연구에서는 세 가지 Nico Oceana 종을 사용하여 평가하며, 야생종인 Nico Oceana, Benham Ana, Nico Oceana Excelsior와 Benham, Ana 및 Excelsior의 교잡종인 Nico Oceana Excela가 이에 해당합니다. 씨앗으로부터 자란 식물은 제어된 조건 및 장일 광주기 하의 수경 재배 캐스케이딩 시스템에서 육성합니다.

Nico Oceana, Bentham Miana 및 Nico Oceana Excela는 4~5주 동안, Nico Oceana Excelsior는 5~6주 동안 배양합니다. 본 실험에 사용된 Agrobacterium tumor Fasion 균주들은 동반된 논문에 기술된 대로 적절한 launch vector로 형질전환되었습니다. 본 시연을 위해 다섯 가지의 형질전환된 agrobacterium 균주가 사용됩니다.

리포터 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 보유한 GV 3 1 0 1, 토마토 bushy stunt virus P 19 silencing suppressor의 바이러스 유전자를 보유한 GV 3 1 0 1, 그리고 modified liase 또는 lick KM 운반체 단백질 유전자를 보유한 GV 3 1 0 1 및 T 10 agrobacterium 균주를 50 mg/L의 can mycin이 첨가된 LB 배지에서 28 °C, 200~250 RPM의 진탕 조건으로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 일시적 단백질 생산을 위해 여러 agrobacterium 균주를 사용하는 가능성을 조사하기 위한 실험용 agrobacterium 현탁액을 준비합니다. PBI four lick km 벡터를 보유한 실험실 균주 하나와 야생형 균주 두 개를 milli Q water로 희석하여 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)를 0.5로 맞춥니다.

침투 전 아그로박테리움(agrobacterium)의 병원성 유전자를 유도해야 할 필요성을 조사하기 위해, 먼저 LB 배지에서 배양한 P bid 4G FP 벡터 함유 아그로박테리움 배양액을 4 °C에서 4,000 ×g로 10분간 원심분리합니다. 그 다음, MMA 유도 배지에 현탁하여 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)를 0.5로 맞춘 후 실온에서 2시간 동안 교반합니다. 아세틸 코인이 일시적 단백질 생산을 향상시키는지 테스트하려면, LB 배지에서 하룻밤 동안 배양한 PBI 4G FP 벡터 함유 아그로박테리움 배양액을 원심분리하고 1X MS 염, 10 mM MES 및 2% glucose가 포함된 침투 완충액에 재현탁합니다.

세포 현탁액을 4개의 용기에 나누어 담습니다. 각 아그로박테리움(Agrobacterium) 현탁액에 서로 다른 농도의 aceto cone을 첨가하고 실온에서 3시간 동안 배양합니다. 바이러스 소음 억제제(viral silencing suppressor)의 공동 침투가 일시적인 GFP 단백질 생성에 미치는 영향을 테스트하려면 혼합합니다.

GFP 유전자를 포함하는 Milli-Q 워터 희석 아그로박테리움 배양액과 바이러스 소음 억제제 P 19를 포함하는 배양액을 4:1 비율로 혼합합니다. 이어서 식물의 진공 침투 과정을 시연하겠습니다. 식물을 진공 침투시킬 때는 진공 압력과 침투 시간을 제어하는 것이 매우 중요합니다. 먼저, 준비된 아그로박테리움 현탁액을 진공 챔버 내부의 용기에 옮깁니다.

그 다음 희석된 agrobacterium 용액에 식물을 거꾸로 뒤집어 넣고 50에서 400 millibar의 진공을 30초 또는 60초 동안 가합니다. 최적의 침투를 위해 통상적으로 50에서 100 millibar의 진공을 60초 동안 적용합니다. 진공을 해제한 후, 진공 챔버에서 식물을 꺼내 물로 헹구고, 침투 전 성장 단계와 동일한 성장 조건에서 5일에서 7일 동안 배양합니다.

Western 분석을 위한 시료를 준비하려면, 먼저 침투 후 4~7일(DPI)이 지난 Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior 또는 Nico Oceana Excela 식물에서 무작위로 잎 시료를 수집하여 액체 질소로 미세한 분말이 될 때까지 분쇄합니다. 각 시료에 0.5% Triton X 100이 포함된 1X PBS 버퍼를 3배 부피로 첨가하고, 시료를 에펜도르프 튜브로 옮깁니다. 추출된 시료를 4 °C에서 15분 동안 부드럽게 흔들거나 회전시킵니다.

추출물을 5분 동안 원심분리하고, 총 수용성 단백질을 깨끗한 에펜도르프 튜브에 수집합니다. 추출물을 1X PBS 추출 버퍼를 사용하여 적절한 농도로 희석하고, 5X 샘플 버퍼를 최종 농도가 1X가 되도록 첨가합니다. SDS-PAGE로 단백질을 분리하기 전, 샘플을 5분 동안 가열합니다.

단백질을 고정된 P 전이 막으로 전이시킨 후, 블로킹 용액에서 1:5,000으로 희석한 토끼 다클론 anti GFP 항혈청을 사용하여 GFP를 검출합니다. 막을 1 X-P-B-S-T 20으로 3회 세척한 후, 완만한 로킹 상태로 실온에서 1시간 동안 배양합니다. GFP 검출을 위해 1:5,000으로 희석한 horseradish peroxidase 접합 항-토끼 항체와 함께 1시간 동안 배양합니다.

이어서, 동반된 논문에 기술된 대로 웨스턴 블롯을 처리하고 단백질에 해당하는 밴드 강도를 분석합니다. 일시적으로 형질전환된 식물 전체에서 GFP 형광의 시각적 검출은 휴대용 장파장 UV 램프를 사용하여 수행하며, 디지털 카메라와 15초의 노출 시간을 사용하여 yellow eight ES 52 필터를 통해 일시적으로 형질전환된 식물을 촬영합니다. genome의 gene snapped 소프트웨어를 사용하여 웨스턴 블롯 분석 이미지를 획득하십시오.

정제된 GFP 표준물을 기반으로 한 검량선을 이용하여 유전자 분석 소프트웨어로 결과를 정량화합니다. 식물 성장 및 생물량 축적을 위한 최적 조건을 결정하기 위해 Nick Oceana Bentham Miana를 시판 비료에 적신 Rockwell 슬랩에서 배양하였습니다. 4.8% 인이 함유된 비료 용액 또는 0% 인이 함유된 비료 용액에서 성장한 이 6주 된 식물들의 모습에서 알 수 있듯이, NICO Oceana Bentham 종자의 발아와 성장을 위해서는 인의 존재가 결정적입니다.

agrobacterium 성장 및 침투 배지가 식물 건강과 단백질 생산에 미치는 영향을 Nicotiana hamana 식물의 GFP 생산량을 비교하여 조사하였습니다. PBI 4G FP를 보유한 agrobacterium 배양액을 세 가지 서로 다른 배지에서 배양하여 식물에 진공 침투시켰습니다. YEB 또는 LB 배지에서 하룻밤 동안 배양한 YEB, AB 및 LB 배양액을 저속으로 원심 분리한 후 MMA 유도 배지에 재현탁하거나, YEB, LB 또는 AB 배지에서 하룻밤 동안 배양한 후 Milli Q water로 1:5 또는 1:10으로 직접 희석하였습니다. 이 western blot 결과에서 알 수 있듯이, YEB, LB 또는 AB 배지에서 배양하고 Milli Q water로 희석한 agrobacterium 배양액을 침투시킨 식물은 원심 분리 후 MMA에 재현탁한 배양액과 비교했을 때 평균 GFP 생산량에서 유의미한 차이를 보이지 않았습니다.

따라서 식물 침투법을 위한 아그로박테리움 배양액 희석에는 milli Q water 사용이 권장되며, 이후 실험에서 600 nanometers에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)를 0.5로 맞추기 위해 이를 일상적으로 사용하였습니다. 다음으로, 아그로박테리움 세포 현탁액의 밀도와 시간 경과가 표적 발현에 미치는 영향을 조사하였습니다. PBI 4G FP를 보유한 아그로박테리움의 네 가지 서로 다른 세포 현탁액 밀도를 평가하였으며, 침투 후 4일, 7일 및 10일(DPI)에 잎 샘플을 채취하여 western blot 분석을 수행하였습니다. 4 DPI에서 서로 다른 아그로박테리움 세포 현탁액 밀도로 침투시킨 식물들 사이에 GFP 형광의 뚜렷한 차이가 나타났으며, 600 nanometers에서의 밀도가 0.05인 경우에는 GFP 발현이 관찰되지 않았습니다. 7 DPI에서는 GFP가 발현되었습니다.

세포 현탁액으로 침투시킨 식물들의 형광은 유사하게 나타났습니다. A 600 수치가 1.0, 0.5 및 0.1인 밀도에서는 비슷했으나, 10 DPI에서 A 600 수치가 0.05인 현탁액으로 침투시킨 식물에서는 형광이 더 낮았습니다. 일시적 단백질 생산에 사용할 수 있는 아그로박테리움 균주의 다양성을 높이기 위해 네 가지 세포 현탁액 밀도로 침투시킨 식물들 사이에서 GFP 생산의 차이는 관찰되지 않았습니다.

Nicotiana benthamiana 식물에 vector KBI4lickkm을 포함하는 7가지 서로 다른 아그로박테리아 균주를 진공 침윤시켰습니다. 침윤된 잎을 7 DPI에 수집하였으며, 웨스턴 블롯을 통해 키나아제 발현 수준을 측정하였습니다. 이 그래프에서 알 수 있듯이, liase 생산 수준은 GV3110, IA4, LBA4404 균주에서 약간의 차이를 보이며 가장 높게 나타났습니다.

가장 낮은 발현 수준은 C58C1에서 나타난 반면, AT77, AT06 및 AT10 균주에서는 중간 정도의 lyase 생산이 이루어졌으며, lyase 효소 활성은 XMO Graham assay를 사용하여 입증되었습니다. 정제된 박테리아 lyase 단백질은 효소 활성을 위한 양성 대조군으로 사용되었습니다. A4 및 AT77 야생형 agrobacterium 균주를 침윤시킨 Nicotiana benthamiana 식물에서 7 DPI에 생장 억제, 잎자루 신장 및 말림, 잎 말림과 같은 병리적 증상이 나타났다는 점은 주목할 만합니다.

wild type T 10 균주를 침투시킨 nicotiana benham 식물에서는 증상이 경미하게 나타났습니다. 실험실 균주 GV 3 1 0 1을 침투시킨 Nico Oceana Benham 식물에서는 증상이 관찰되지 않았습니다. 야생종의 식물 바이오매스 생산량을 비교한 결과, 동일한 성장 조건에서 Nico Oceana Excela에서 생성될 수 있는 최대 잎 바이오매스는 Nico Oceana와 비교하여 약 2배 더 높은 것으로 나타났습니다.

아그로박테리움 균주 GV 3 1 0 1(PBI 4G F-P-G-F-P 함유)을 침윤시킨 Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior 및 Nico Oceana Excela에서 Benham 단백질 생산을 조사하였다. 침윤된 잎 전체에서 7 DPI에 GFP 축적 정도를 평가하였다. UV 광 아래에서 GFP 발현을 시각적으로 확인한 결과, Nico Oceana Hamana와 Nico Oceana Excela에서는 GFP가 균일하게 분포되었으나, Nico Oceana Excelsior는 잎 전체 면적을 침윤시키는 데 어려움이 있어 불균일하게 분포되었다. 7 DPI에 침윤된 잎의 GFP 축적량을 Western blot 분석으로 확인한 결과, GFP 수준은 Nico Oceana Hamana가 Nico Oceana Excela 및 Nico Oceana Excelsior보다 높았으며, Nico Oceana에서는 단백질 생산 수준이 낮았다.

Excelsior 현상은 수집된 잎에서 불균일한 침투와 축적된 GFP의 불균일한 분포로 인해 발생합니다. 진공 압력이 잎에 미치는 영향을 테스트하기 위해, PBI 4G FP를 보유한 아그로박테리움 균주 GV 3 1 0 1을 사용하여 Nico Oceana Benham 식물에 400, 200, 100 또는 50 millibar의 진공 압력 하에서 30초 또는 60초 동안 진공 유지 시간을 두고 침투시켰습니다. 5, 100 및 200 millibar의 진공 압력을 30초 또는 60초 동안 적용했을 때, GFP 생성에는 차이가 없었으며 식물 건강에 미치는 부정적인 영향은 경미하거나 없었습니다.

진공 지속 시간이 표적 발현에 미치는 영향은 Nico Oceana Benham 식물 한 플랫을 대상으로 PBI 4G FP를 보유한 GV 3 1 0 1(A 600 = 0.5)을 8시간 동안 매시간 침투시켜 평가하였다. 이 대표적인 결과에 나타난 것과 동일한 아그로박테리움 배양액에서, GFP 생성 수준은 8시간까지의 모든 시점에서 유사하게 나타났으며, 이는 이 기간 동안 아그로박테리움이 단일 가닥 DNA를 방출하는 능력을 유지함을 시사한다. 다양한 식물 종에서 많은 화학 물질과 단당류가 일시적 단백질 생산을 증강시키는 것으로 보고되었기 때문에.

본 연구에서는 또한 서로 다른 농도의 acetosyringone과 glucose가 Nicotiana benthamiana의 일시적인 GFP 단백질 생성에 미치는 영향을 평가하였습니다. PBI 4G FP를 보유한 agrobacterium strain GV 3 1 0 1을 접종하였습니다. Agrobacterium은 YEB 배지에서 하룻밤 동안 배양한 후, 원심 분리하여 표시된 농도의 acetyl syringone과 2% glucose가 함유된 MMA 또는 표시된 농도의 glucose와 200 µM acetophenone이 함유된 MMA에서 OD₆₀₀ 0.5가 되도록 재현탁하였습니다. 여기서 보는 바와 같이, 유도 배지에 acetophenone이나 glucose가 포함되지 않은 대조군과 비교했을 때, 테스트한 이러한 화합물의 어떤 농도에서도 GFP 단백질 생성의 유의미한 증가는 유도되지 않았습니다.

다음으로, Nico Oceana. Benham 잎에서 GFP 및 HAC one 유전자의 일시적 발현에 대한 silencing suppressor의 공동 침투(co infiltration) 효과를 조사하였습니다. 침투 전, PBI 4G FP와 tomato bushy stunt virus의 viral silencing suppressor인 P 19를 보유한 agrobacterium GV three one ten one 배양액을 각각 1:1, 2:1, 3:1, 4:1의 비율로 혼합하였습니다. 7 DPI에서의 Western blot 분석 결과에서 나타나듯이, P 19의 존재는 두 agrobacterium 현탁액의 어떤 비율에서도 nicotiana Benham Miana의 GFP 생산을 증가시키거나 감소시키지 않았습니다.

또한, 두 가지 바이러스 유전자 침묵 억제제인 P 23과 P 19가 HAC one의 전사 후 유전자 침묵 방지에 미치는 영향을 조사하였다. 런칭 벡터 PBI four HAC one을 포함하는 agrobacterium의 POS와 두 가지 바이러스 침묵 억제제 플라스미드 중 하나를 각각 4:1의 비율로 혼합하여 Nicotiana Bentham Miana에 공동 침투시켰다. 침투시킨 잎 샘플은 3~8 DPI에 수집하였다.

이 그래프는 Western blot 분석으로 결정한 세 차례 실험의 HAC one 평균 발현 수준을 보여줍니다. Nico Oceana Benham을 P 23 또는 P 19와 공동 침투시킨 결과, 60 pi에서 silencing 억제제를 사용하지 않은 경우와 비교하여 HAC one 생성이 증가했습니다. 이는 P 23과 P 19가 이 시스템에서 효율적임을 시사합니다.

또한 사이런싱 억제제의 존재 여부와 관계없이, HAC one 단백질 생산 수준이 7 DPI부터 감소하기 시작하는 것이 관찰되었습니다. 이는 런칭 벡터가 침투된 Nicotiana benthamiana에서 일시적인 단백질 생산의 감소 시점이 타겟 특이적임을 나타냅니다. 마지막으로, 동일한 배치의 Agrobacterium 세포 은행을 Nicotiana benthamiana 식물에 침투시켜 단백질 축적을 평가함으로써 Agrobacterium 세포 은행의 안정성을 매년 평가합니다.

이러한 대표적인 결과들은 HA one 단백질 생산이 3년 이상 매우 안정적으로 유지되었음을 나타냅니다. Nicotiana benthamiana 식물에서의 평균 HAC one 생산량은 651 ± 49.4 mg/kg입니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 서브유닛 백신, 치료용 단백질 항체 및 진단 항원 제조에 활용될 수 있는 대규모 재조합 단백질 생산을 위한 아그로-침투(agro-infiltration) 기술의 적용 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 수행할 때는 수경 재배 방식으로 식물 교배를 제어하고, 생존 가능한 agro bacteria를 사용하며, 진공 압력과 시간을 조절하고, 단백질 발현 벡터를 모니터링하는 것이 중요합니다. 숙련되면, 제어된 조건 하에서 적절하게 수행될 경우 agro 여과 기술은 24시간 이내에 완료될 수 있습니다.