배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

이 절차의 전반적인 목표는 단백질 기능의 향상된 설명 및/또는 단백질의 세포 이동을 위해 상업적으로 이용 가능한 곤충 세포 내에서 관심 형광 표지 단백질을 발현하는 것입니다. 이 방법은 단백질 기능, 단백질 상호 작용 및/또는 세포 내 단백질 국소화에 관한 주요 세포 생물학 및 생화학 기반 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 바큘로바이러스 발현과 관련된 유해한 영향 없이 살아있는 세포에서 단백질을 빠르게 생성하고 발현된 단백질을 기능적으로 평가할 수 있어 처리량을 향상시킬 수 있다는 것입니다.

이 방법은 곤충 단백질 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 단백질 기능 또는 세포 국소화 연구가 필요한 모든 시스템에도 적용할 수 있습니다. 곤충 세포 배양 및 transfection을 위한 절차는 제 연구실의 기술자인 Danni LeRoy가 시연할 것입니다. 이 절차를 시작하려면 영하 80도의 냉동고에서 냉동 SF9 및 Tni 세포의 스톡 바이알을 제거하고 섭씨 37도의 수조에서 해동합니다.

해동 후 바이알의 오염을 70% 에탄올로 제거하고 얼음 위에 올려 놓습니다. 바이알과 조직 배양 플라스크를 열어야 하는 모든 세포 조작은 멸균 상태를 유지하기 위해 층류 후드 내에서 수행해야 합니다. 새로운 T25 플라스크에 4ml의 무혈청 곤충 배지를 추가하고 다른 T25 플라스크에 4ml의 TNM-FH 배지를 추가합니다.

해동된 Tni 세포 1ml를 무혈청 곤충 배지가 있는 플라스크로 옮기고, 해동된 SF9 세포 1ml를 TNM-FH 배지가 있는 플라스크로 옮깁니다. 플라스크를 섭씨 28도의 비가습 인큐베이터에 넣고 세포가 30-45분 동안 부착되도록 합니다. 파종 배지를 5ml의 적절한 배지로 교체하십시오.

그리고 플라스크를 섭씨 28도의 비가습 인큐베이터로 되돌립니다. 매일 세포 합류를 모니터링하십시오. 이러한 대표적인 이미지에 표시된 것처럼 90% confluency에 도달하면 세포를 통과시킵니다.

배지가 세포 단층에서 멀리 떨어진 한쪽 모서리를 향해 흐르도록 융합 세포가 포함된 플라스크를 기울이고 멸균 5ml 혈청학 피펫을 사용하여 세포를 방해하지 않고 배지를 조심스럽게 제거합니다. Tni 세포의 경우, 새로운 멸균 5ml 혈청학 피펫을 사용하여 4ml의 무혈청 곤충 배지를 confluent monolayer에 부드럽게 첨가합니다. 피펫 팁을 플라스크를 가로질러 이동하고 천천히 관개하여 플라스크 바닥에 느슨하게 부착된 세포를 제거합니다.

세포가 적절하게 분리되었는지 확인하려면 모든 매체를 제거하고 플라스크를 뒤집어 플라스크 바닥이 깨끗한지 관찰하십시오. 더 단단히 부착되는 SF9 세포의 경우 4ml의 새로운 TNM-FH 배지를 추가하고 셀 스크레이퍼를 사용하여 부착된 세포를 제거합니다. 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합하고 세포 응집을 줄입니다.

세포를 분리한 후 약 0.1ml의 각 세포와 배지 혼합물을 1.5ml 마이크로 퍼지 튜브로 옮깁니다. 별도의 0.5 밀리리터 마이크로 퍼지 튜브에 각 셀과 배지 혼합물 10 마이크로 리터를 10 마이크로 리터의 트리판 블루에 추가합니다. 포장에서 세포 계수기 챔버 슬라이드를 제거하고 계수 슬라이드의 각 면에 10마이크로리터의 세포 배지 트리판 블루 혼합물을 추가합니다.

슬라이드를 자동화된 세포 카운터에 삽입하고 세포 밀도와 생존력을 측정합니다. 약 1.5배에서 10배를 6번째 세포로 신선한 배지가 있는 T25 플라스크로 이동합니다. 플라스크에 세포주, 날짜, 사용된 배지, 추가된 세포 수 및 계대 번호를 표시합니다.

플라스크를 섭씨 28도의 인큐베이터에 최대 72시간 동안 넣습니다. 곤충 세포 transfection을 위한 절차는 laminar flow hood 내에서도 수행해야 합니다. 적절한 곤충 세포 배지에 6번째 Tni 또는 SF9 세포를 최대 1배까지 1배까지 T25 플라스크에 파종합니다.

이 데모에는 Tni 세포가 사용됩니다. 섭씨 18도에서 72시간 동안 세포가 포화되도록 성장시킵니다. 72시간 후, 기존 배지를 제거 및 폐기하고 앞서 표시된 대로 4ml의 신선한 무혈청 곤충 배지로 Tni 세포를 제거합니다.

이 절차의 가장 어려운 측면은 transfection 중에 유리 바닥 접시에 부착된 세포의 적절한 밀도를 얻는 것입니다. 각 요리에 10에서 5번째 셀을 7배 이상 추가해서는 안 됩니다. 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 밀도를 추정한 후 튜브를 반전시켜 세포 현탁액을 철저하지만 부드럽게 혼합하고 개별 35mm 유리 바닥 접시에 5번째 세포에 약 7배의 10을 추가합니다.

세포가 섭씨 28도에서 20-25분 동안 부착되도록 합니다. 각 transfection에 대해 멸균 1.5ml micro-fuge 튜브에 FBS가 없는 0.1ml의 무혈청 곤충 배지에 2마이크로그램의 플라스미드 DNA를 추가합니다. 별도의 튜브에서 8마이크로리터의 트랜스펙션 시약과 0.1ml의 무혈청 곤충 배지를 혼합합니다.

그런 다음 용액을 관심 플라스미드 DNA가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 가볍게 소용돌이치고 실온에서 20-30분 동안 배양합니다. 다음으로, 플라스미드 형질주입 혼합물을 0.8ml의 무혈청 곤충 배지로 희석하여 총 부피를 최대 1ml까지 가져옵니다.

부착된 세포가 들어 있는 유리 접시에서 매체를 조심스럽게 제거합니다. 부착된 세포를 희석된 플라스미드 형질주입 배지로 오버레이합니다. 세포를 섭씨 28도에서 5시간 동안 배양합니다.

5시간 후, transfection 배지를 제거하여 버리고 세포가 제거되지 않도록 주의하면서 1ml의 무혈청 곤충 배지로 세포를 부드럽게 세척합니다. 2ml의 신선한 무혈청 곤충 세포 배지를 넣고 섭씨 28도에서 48-72시간 동안 배양합니다. 곤충 세포의 형질주입 후 48-72시간이 지나면 1ml의 IPL-41 곤충 배지로 세포를 한 번 세척한 다음 이미징을 위해 2ml의 IPL-41로 덮습니다.

Hoechst 라이브 셀 염색 시약 4방울을 배지에 추가하고 섭씨 28도에서 20-25분 동안 배양합니다. 35mm 접시를 자체 밀폐형 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에 넣습니다. 많은 유리 접시가 상업적으로 이용 가능하지만 현미경 스테이지에 맞는 것이 중요하며 어떤 유리 그릇이 세포 부착과 가장 호환되는지 경험적으로 결정해야 할 수도 있습니다.

Hoechst, EGFP 및 mCherry 관찰 조건에 맞게 현미경을 조정합니다. Hoechst 여기 및 방출을 위해 359나노미터 및 461나노미터. EGFP 여기 및 방출을 위해 489나노미터 및 510나노미터.

그리고 580 나노 미터 및 610 나노 미터는 mCherry 여기 및 방출을 위해. 10X 대물렌즈를 사용하여 초기 스캔을 수행하여 형광 발현을 확인합니다. 그런 다음 60X 위상차 침수 대물렌즈를 사용하여 스캔 모드로 전환합니다.

레이저 출력, 검출기 감도, 스캔 속도, Z축 깊이 및 디지털 줌을 조정하여 이미지 대비와 해상도를 최적화합니다. 1.5X 디지털 줌으로 셀을 이미지화하여 총 90X 증폭을 제공합니다. 나중에 분석할 수 있도록 원시 데이터를 TIFF 이미지 파일로 저장하고 내보냅니다.

Tni 세포는 지시된 플라스미드로 형질주입되고 재조합 단백질의 발현은 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 시각화되었습니다. 재조합 BtDrip1-EGFP의 성공적인 transfection 및 발현은 세포 표면에 녹색 형광이 존재한다는 점에서 분명합니다. BtDrip2 버전 1 EGFP로 transfection된 세포는 BtDrip2 버전 1의 세포 내 발현을 나타내는 녹색 형광을 나타냅니다.

마찬가지로, PIB DmSPR-mCherry 또는 PIB PLA2G15-mCherry로 transfection된 세포는 각 키메라의 발현을 나타내는 적색 형광을 나타냅니다. 병합된 이미지에서 주황색 또는 노란색 영역은 EGFP와 mCherry의 발현을 나타내며, 이는 단백질이 동일한 세포 내 구조 내에서 공동 국소화되어 있음을 시사합니다. PIB BtDrip1-EGFP 및 PIB DmSPR-mCherry로 이중 transfection된 세포의 오버레이는 세포 표면에서 BtDrip1-EGFP 및 DmSPR-mCherry의 공동 국소화를 시사합니다.

BtDrip2 버전 1, EGFP 및 PIB DmSPR-mCherry로 이중 transfection된 세포는 녹색 및 적색 형광 신호의 공동 국소화가 거의 없어 BtDrip2 버전 1의 세포 내 발현을 확인합니다. 대조적으로, PIB BtDrip2 버전 1 EGFP와 PIB PLA2G15-mCherry 리소좀 마커의 동시 발현은 세포질 녹색 및 적색 형광 신호에서 상당한 중복을 초래했습니다. 이는 BtDrip2가 세포간 리소좀으로 이동한다는 것을 강력하게 시사합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 배양된 곤충 세포 내에서 형광 단백질 키메라를 발현하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 시스템은 단백질 합성에서 신속한 벡터 구성을 제공하고, 바이러스 기반 발현 시스템의 문제를 방지하며, 세포 이동 단백질을 관찰할 수 있는 강력한 수단을 제공합니다.