Name: 배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: 배우세요 배양된 곤충 세포에서 형광 표지 단백질을 과도 발현하여 단백질 기능과 세포 내 소포체 이동을 연구하는 방법을. 이 기술은 바이러스 기반 시스템 없이 살아있는 세포에서 단백질을 신속하게 분석할 수 있습니다.

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표현의 플라스미드의 건설 1. OE-PCR 참고 : OE-PCR에 사용 된 모든 프라이머는 표 1을 참조하십시오. 높은 충실도의 DNA 중합 효소의 사용은 모든 증폭하는 것이 좋습니다. 그러나 이러한 효소는 자주 방치하지 않기 때문에 3 &#39;A는, 그것의 Taq DNA 중합 효소와 간단한 비 증폭 배양을 실시 할 필요가에 &quot;A-꼬리&quot;를 PCR 제품 조교 곤충 세포 발현로 복제하기 전에 벡터. 이 프로토콜은 곤충 발현 플라스미드가 세포 내 마커 단백질 (두 Bemisia의 담배가 루이 아쿠아 포린 단백질이 경우), 또는 관심의 유전자의 카복실 말단에 인 - 프레임 융합 형광 단백질, 키 메릭 단백질을 형질 생성하는 방법을 보여준다 (도 1). <ol><li> 증폭 개의 독립적 인 발사 구성 OE-PCR을 사용하여 생성한다 : (1) 관심의 유전자를 코딩하는 서열 (B. 담배가 루이아쿠아 포린 1 : BtDrip1; B.의 담배가 루이의 아쿠아 포린 2 BtDrip2_v1) EGFP 또는 (2) 세포 내 마커 (초파리 melanogaster의 성 펩타이드 수용체라는 녹색 형광 단백질 변이체에 프레임 융합 : DmSPR 호모 사피엔스 포스 포 리파제 A2 : HsPLA2)에 mCherry 코딩 시퀀스. 직접 PIB / V5-그의-TA 플라스미드로 최종 OE-PCR 제품을 결찰. <ol><li> OE-PCR의 첫 번째 라운드를 들면, (표 1에 볼드체로 도시) 유전자 특이 적 센스 프라이머 및 키메라 안티센스 프라이머를 사용하여 (AD 및 A&#39;-D도 1은 &#39;로 표시됨)에 대응 (표 1 이탤릭체) 관심 / 세포 내 마커 유전자 (종결 코돈이없는) 최종 15 BP로 원하는 형광 단백질의 5 &#39;말단의 15 염기쌍 내지 (EGFP 또는 mCherry)는 3&#39;오버행을 갖는 제품을 생성한다. 참고 : PCR 조건은 표 2를 참조하십시오. </li><li> 별도의 튜브에있어서,과 특이 유전자를 사용원하는 형광체의 5&#39;- 말단으로부터 관심 / 세포 내 마커 유전자의 3 &#39;말단의 15 염기쌍, 15 염기쌍을 포함하고 키메라 센스 프라이머 (표 1의 밑줄로 표시) IC 형광 단백질 안티센스 프라이머 단백질은 5 &#39;오버행을 가진 제품을 생성합니다. 참고 : PCR 조건은 표 2를 참조하십시오. PCR 반응의 주형은 하나 이상의, 바람직하게 플라스미드 DNA는 목적하는 서열을 은닉하는 서열 확인 PCR 생성물 또는 일 수있다. 여기에 설명 된 연구는 순서 검증 된 플라스미드를 사용합니다. </li><li> (표준 분자 수준 오스를 사용하여) 1 % 아가로 스겔 전기 영동에 가진 PCR 산물을 분리한다. </li><li> 소비세 시판 DNA 겔 추출 키트를 사용하여 예상되는 크기 (표 2 참조)의 생성물을 정제 (이 프로토콜에서 사용되는 특정 키트 물질의 표를 참조). </li><li> 최종 오버랩 전자를 생성하는 단계 1.1.4에서 겔 정제 된 PCR 산물을 사용하여xtension 제품은 ( &#39;A로 표시된&#39;- D &#39;&#39;를도 1). 관심 / 아세포의 마커 유전자와 목적하는 키메라 서열을 생성 할 수있는 형광 단백질에 해당하는 유전자 특이 적 안티센스 프라이머위한 유전자 특이 적 센스 프라이머를 사용한다. 참고 : PCR 조건은 표 2를 참조하십시오. 경험적 최종적 전체 길이 키메라 PCR 생성물을 수득하기 위해, 반응 혼합물에 추가 1 라운드 오버랩 신장 산물의 최적 량을 결정하는 것이 필요할 수있다. </li><li> 1 % 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 제 2 라운드 PCR-OE 제품 별개. 소비세는 시중에서 판매하는 DNA 젤 추출 키트를 사용하여 제품을 정화. </li><li> TA 클로닝에 필요한 3 &#39;adenylated (즉, 꼬리) 제품을 생성하는 72 ° C에서 10 분 동안의 Taq DNA 중합 효소의 마스터 믹스를 1 개 유닛으로 겔 정제 2 라운드 OE-PCR 제품 인큐베이션. </li><li> 결과 adenylated 제품을 결찰이소 부틸 렌 발현 벡터에 화학적 능력 (열충격) 또는 electrocompetent (전기) 대장균 세포를 형질 전환 표준 분자 클로닝 기술을 사용한다. 적절한 선별 마커 (예, 암피실린 또는 베니 실린)을 함유하는 배지에서 밤새 플레이트. </li><li> 발현 플라스미드는 5&#39;-3 &#39;방향 인서트를 형질 형질 전환 된 인서트 양성 콜로니를 확인하기 위해 벡터 특이 프라이머 및 삽입 특이 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR을 수행한다 (12). 예상 된 크기의 PCR 제품을 생성하는 식민지의 야간 문화를 준비합니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 시판되는 DNA 정제 키트 (이 프로토콜에서 사용되는 특정 키트 재료 표 참조)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리. 직접적인 DNA 서열 분석에 의해 각각의 삽입 체의 서열 무결성을 검증. </li></ol></li></ol> 주 : 무균 상태를 유지 층류 후드 내 조직 배양 플라스크의 개방을 요구하는 모든 셀의 조작을 수행하기 위해. 종래 셀 조작에 층류 후드 UV 살균 램프에 적어도 1 시간 우회전. 니트릴 장갑을 착용하고 그들의 사용하기 전에 70 % 에탄올로 벤치, 피펫,기구, 튜브 및 플라스크의 표면 오염을 제거. 기본 세포 배양 기술에 대한 지식 (13)를 권장합니다. <ol><li> 혈청이없는 배지에 적응 TNI 세포 (트리코 NI 난소 조직 유래의 확립 된 세포 배양 라인)을 사용하여 28 ° C T25의 조직 배양 플라스크에서 무 혈청 곤충 배지에서 점착성 단층 배양로 유지한다. </li><li> Sf9 세포 (스포 도프 테라 프 루기 페르 난소 조직 유래의 확립 된 세포 배양 라인)와 유사하게 사용되지만 TNM-FH 곤충 배양 배지 보충 유지10 % 소 태아 혈청 (FBS) 에드. </li><li> -80 ° C에서 재고의 튜브를 제거하고는 37 ° C의 물을 욕조에 해동 할 수 있도록하여 냉동 인 Sf9 또는 TNI 세포에서 배양 초기 종자. 해동 후 70 % 에탄올로 유리 병의 오염을 제거하고 얼음에 배치합니다. </li><li> 새로운 T25 플라스크 전송 해동 곤충 세포 현탁액 1 ㎖에 곤충 세포 배지 4 mL를 넣고. 28 ° C, 비 가습 인큐베이터에 플라스크를 배치하고, 세포를 30-45 분 동안 부착 할 수있다. </li><li> 적절한 배지 5 mL를 시딩 배지를 교체하고 28 ° C 비 가습 인큐베이터 플라스크 옮긴다. 매일 세포의 합류를 모니터링합니다. 통로 세포는 90 %의 포화 상태에 도달했을 때. 참고 : T25 플라스크의 전체 범위는 ~ 5 × 10 6 세포에 해당합니다. </li><li> 곤충 세포 통로. <ol><li> 세포 통로, 제 5 ㎖ 멸균 피펫을 사용하여 혈청 학적 융합 세포를 포함하는 플라스크에서 배출 된 매체를 제거한다.매체가 얻어 세포 단층에서, 하나 개의 코너로 흐르도록 플라스크를 기울인다. 조심스럽게 세포를 방해하지 않고 피펫을 사용하여 매체를 제거합니다. </li><li> 부드럽게 새로운 살균 5 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 무 혈청 배지 곤충 4 mL를 합류 단층을 함유하는 T25 플라스크를 세척함으로써 세포를 TNI시키다. 플라스크에 걸쳐 피펫 팁을 이동 서서히 느슨하게 플라스크 바닥에 부착 된 세포를 제거하기 위해 관개. <ol><li> 모든 미디어를 제거를 통해 플라스크를 회전하고, 플라스크의 바닥이 깨끗한 지 관찰하여 세포의 적절한 분리를 확인합니다. </li></ol></li><li> 더 단단히 부착 Sf9 세포에 대해, 신선한 TNM-FH 배지 4 mL를 첨가하고, 세포 부착을 제거하는 셀 스크레이퍼를 사용한다. 부드럽게 혼합 세포 응집을 줄이기 위해 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용합니다. </li><li> 매체의 볼륨 당 가능한 곤충 세포의 수를 추정하는 자동 세포 계수기를 사용합니다. 1.5 mL의 세포 / 배지 혼합물에 0.1 mL의 전송미세 원심 분리 튜브. 별도의 0.5 mL의 미세 원심 분리 튜브에, 트리 판 블루 10 μL로 세포 / 배지 혼합물 10 μL를 추가한다. </li><li> 포장에서 셀 카운터 챔버 슬라이드를 제거하고 계산 슬라이드의 각 측면에 셀 / 중간 / 트리 판 블루 혼합물 10 μL를 추가한다. 세포 카운터에 슬라이드 삽입하고, 세포 밀도 및 생존 능력을 결정한다. </li><li> 세포 밀도를 사용하여 계산하고 새로운 무균 T25 플라스크에 곤충 세포 배지 (최대 5 ㎖까지)의 적절한 부피를 추가한다. </li><li> 신선한 미디어와 T25 플라스크에 약 1.5 × 10 6 세포로 이동; (P, N의 셀의 이전 세대 통로 번호 P의 N + 1 세대) 세포 라인을 사용 날짜, 중간 부가 세포 수 및 통로 번호 플라스크 라벨; 최대 72 시간 동안 28 ° C의 배양기에서 플라스크를 배치했다. 주 : 곤충 세포가 연속적으로 전달 될 수 있고, 세포를 형질 감염 및 / 또는 이종 덜 들일 수도 있지만통로 (30) 후 단백질 발현. 10 % 표백제 용액으로 파기 세포 / 미디어를 처리하고, 처리 전에 일회용 플라스틱 제품을 오토 클레이브. </li></ol></li></ol> 3. 곤충 세포 형질 <ol><li> 와 T25 플라스크 시드 최대 1 × 적합한 곤충 세포 배지에서 6 TNI 또는 인 Sf9 세포 (인 Sf9위한 TNI 및 TNM-FH 용 무 혈청 곤충 배지), 28 ° C에서 72 시간 동안 포화 상태로 성장한다. </li><li> 제거하고 기존 매체를 버리고 신선한 혈청이없는 곤충 매체의 4 mL로 세포를 이동시키다 (위의 단계 2.6.2과 2.6.3을 참조). </li><li> 자동 세포 계수기 (위의 단계 2.6.4 참조)를 사용하여 세포 농도를 추정한다. </li><li> 각각의 35mm의 유리 - 바닥 접시에 약 7 × 105 세포를 첨가하고, 세포를 28 ℃에서 20-25 분 동안 부착 할 수있다. </li><li> 각각의 형질 감염을 위해, 플라스미드 DNA의 2 μg의 추가 (DO 중 하나에 대한 두 개의 플라스미드들 각각으로부터 하나의 플라스미드 형질 하나 또는 2 μg의 행멸균 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브 인 Sf9 및 형질 TNI) 모두 FBS가없는 무 혈청 곤충 배지 (0.1 mL를 행 uble 형질). </li><li> 별도의 튜브에, 무 혈청 곤충 배지 0.1 ㎖의 트랜 스펙 션 시약의 8 μL를 혼합하고 관심의 플라스미드 DNA를 함유하는 용액 튜브에 옮긴다. 가볍게 와동 및 20 RT 부화 - 30 분. </li><li> 전량을 1 mL로 같도록 혈청 곤충 배지 0.8 mL의 플라스미드 형질 단계 3.5 내지 3.6의 혼합물을 희석. </li><li> 조심스럽게 부착 된 세포를 포함하는 유리 접시에서 용지를 제거합니다. 희석 된 플라스미드 형질 감염 배지 부착 세포 오버레이. </li><li> 5 시간 동안 28 ℃에서 세포를 인큐베이션. 주 : 형질 조건은 최대 형질 전환 효율 (경험적 최적화를 필요로 예를 들면 밤새 형질보다 5 시간, 사용 된 플라스미드 DNA의 양, 형질 감염 시약 화학사용, 등.). </li><li> 제거하고 형질 매체를 폐기하고 부드럽게 세포를 꺼 내려하지 않도록주의, 무 혈청 곤충 매체의 1 mL로 세포를 씻어. </li><li> 신선한 곤충 세포 배지 (인 Sf9에 대한 TNI와 TNM-FH에 대한 혈청이없는 곤충 매체)의 2 mL를 추가하고 48 ~ 72 시간 동안 28 ° C에서 품어. 참고 : 다시, 조건이 최대 이종 단백질 발현에 대한 경험적 최적화가 필요합니다. </li></ol> 4. 공 초점 형광 현미경 <ol><li> 48-72 시간 후 형질 감염에서 IPL-41 곤충 배지 1 ㎖로 한번 세포를 세척하고 2 mL의 IPL-41 촬상 용 커버. 참고 :이 세척 단계는 정상 세포의 유지에 사용되는 곤충 세포 매체 관찰 배경 자동 형광을 줄일 수 있습니다. </li><li> 훽스트 살아있는 세포 염색 시약을 4 방울을 가하여 매체 (이 프로토콜에서 사용되는 특정 핵 염색 재료의 테이블 참조)를 20-25 분 동안 28 ℃에서 배양한다. 참고 : 추가 NUC염료 EGFP 및 mCherry에서 독특한 형광 프로파일을 가져야하지만 리어 얼룩은 치환 될 수있다. </li><li> 자기 밀폐 된 공 촛점 현미경 스캐닝 레이저로 35mm 접시 (이 프로토콜에 사용되는 특정 악기 재료의 표 참조)을 놓습니다. </li><li> 훽스트, EGFP 및 mCherry 관찰 조건 현미경 조정 : 훽스트 여기 / 방출 - 461분의 359 나노 미터; EGFP 여기 / 방출 - 510분의 489 나노 미터; mCherry 여기 / 방출 - 610분의 580 내지. </li><li> 형광 발현을 확인한 후 60X 위상 대조 물 액침 대물 주사를 사용 모드로 전환하기 위해 10 배 대물 렌즈를 사용하여 초기 검사를 수행한다. </li><li> 화상 콘트라스트, 해상도를 최적화하기위한 레이저 파워 (5-7 %), 검출 감도 (47-49 %), 주사 속도, Z 축 깊이, 디지털 줌을 조정한다. 이미지 1.5 배 디지털 줌의 세포는 90X 증폭의 총을 제공합니다. 참고 : 현미경 매개 변수를 최적화에 대한 경험적 조정 필요및 이미지 컬렉션 사용 기기에 특정 될 수있다. </li><li> TIFF 이미지 파일로 원시 데이터를 내보내고 그림 세대 (작물 및 오버레이)를 수정합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

이종 단백질 발현 시스템은 다수의 다운 스트림 애플리케이션 4에 사용되는 재조합 단백질의 생산을위한 중요한 도구입니다. 사용할 수있는 다양한 발현 시스템에서 선택하면 관심있는 단백질의 최종 목표에 따라 달라집니다. 여러 곤충 세포 발현 시스템은 원핵 생물과 진핵 세포 발현 시스템 5, 6 유연한 대안을 제공하는 사용할 수 있습니다. 단백질 발현을 유도하는 배큘로 바이러스 감염을 필요로하는 곤충 시스템은 연구 및 치료 응용 프로그램 1, 2, 3에서 사용되는 많은 단백질로, 지금까지 가장 인기 있고 널리 사용되는 곤충 시스템이다. 배큘로 바이러스 발현은, 그러나, 포함한 한계가 1) 바이러스의 라이프 사이클은 숙주 세...

곤충 세포 발현 시스템을 사용하여 재조합 단백질의 생산은 진핵 세포 단백질의 연구에 많은 이점을 제공합니다. 즉, 곤충 세포 유사 번역 후 변형, 가공, 적절히 접힌 단백질 1, 2, 3의 제조에 유리하다 포유류 세포에 존재하는 것과 같은 정렬 메커니즘을 갖는다. 곤충 세포 시스템은 일반적으로 포유 동물 세포주 4, 5에 비해 유지 보수를 위해 더 적은 자원과 적은 시간과 노력을 필요로한다. 배큘로 바이러스 발현 시스템은 단백질의 특성화 및 치료제 외국 펩타이드 백신 생산 용 바이러스 단백질의 면역 원성 프레젠테이션 다중 합성 용 재조합 단백질의 생산을 포함하여 널리 다양한 분야에서 사용되는 하나의 곤충 세포 기반 시스템이며 - 단백질 복합체등의 당화 단백질의 제조. 1, 2, 4, 6. 있다, 그러나, 상황이되는 배큘로 바이러스 발현은 3, 7 적용되지 않을 수 있으며, nonlytic 과도 곤충 발현 시스템의 사용이 더 적합 할 수있다. 특히, 과도 곤충 세포 발현 재조합 단백질의 빠른 합성을위한 가능성을 제공, 바이러스 부과 세포 용해를 포함하지 않는 덜 개발 및 유지 보수를 필요로하고, 더 나은 단백질 합성 7, 8, 9시 세포 인신 매매를 연구하는 수단을 제공, 10. 이 프로토콜을 이용하여 발현 벡터의 신속한 생성을 설명 두 단계 PCR 중첩 확장 (OE-PCR) 및, 대장균에서 플라스미드 DNA의 표준 클로닝. 플라스미드는 이중 트랜 상업적으로 이용 가능한 배양 된 곤충 세포에 사용되는 대표적인 단백질을 생산 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 두 개의 서로 다른 형광 표지 세포 내 마커 단백질의 생산과 사용을 설명하고 곤충 Bemisia의 담배가 루이의 두 아쿠아 포린 단백질 colocalization을 보여줍니다. 다음 프로토콜 OE-PCR, 표적 단백질의 세포 지역화 곤충 세포 및 형질 유지하고, 형광 현미경의 기본 방법을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>KOD DNA 중합효소</td><td>EMD Millipore</td><td>71085-3</td><td>중첩 확장 PCR 제품의 PCR 증폭에 사용되는 고충실도 DNA 중합효소</td></tr><tr><td>ExTaq DNA 중합효소</td><td>TaKaRa-Clontech</td><td>RR001B</td><td>PCR 제품의 A-테일링에 사용되는 DNA 중합효소</td></tr><tr><td>EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA 중합효소 마스터 믹스</td><td>Lucigen</td><td>30033-1</td><td>DNA 중합효소 박테리아 콜로니 PCR</td></tr><tr><td>에 사용Biometra T전문 구배 Thermocycler</td><td>Biometra/LABRepCo</td><td>070-851</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>벤치마크 Scientific</td><td>A1705</td><td></td></tr><tr><td>SYBR 안전 DNA 겔 염색</td><td>ThermoFisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Montage DNA 겔 추출 키트</td><td>EMD Millipore</td><td>LSKGEL050</td><td></td></tr><tr><td>pIB/V5-His TOPO TA 발현 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>K89020</td><td>선형화 및 토포이소머라제 I-활성화 pIB/V5-His-TOPO 벡터, One Shot TOP10 화학적 적성 대장균 및 염 용액을 포함하여 중첩 확장 PCR 산물을 복제하는 데 필요한 구성 요소가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube 로봇 워크스테이션</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td></td></tr><tr><td>정수기 수직 클린 벤치</td><td>Labconco</td><td>3970401</td><td></td></tr><tr><td>Tni 배양 곤충 세포주</td><td>대립유전자 생명공학</td><td>ABP-CEL-10005</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 배양 곤충 세포주</td><td>대립유전자 생명공학</td><td>ABP-CEL-10002</td><td></td></tr><tr><td>무혈청 곤충 배양 배지</td><td>대립 유전자 생명공학</td><td>ABP-MED-10002</td><td></td></tr><tr><td>TNM-FH 곤충 배양 배지</td><td>대립 유전자 생명 공학</td><td>ABP-MED-10001</td><td></td></tr><tr><td>IPL-41 곤충 배지</td><td>ThermoFisher</td><td>11405081</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II 형질 주입 시약</td><td>ThermoFisher</td><td>10362100</td><td></td></tr><tr><td>16cm 일회용 세포 스크레이퍼</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td>세포 2위치 블레이드가 있는 스크레이퍼</td></tr><tr><td>25 cm2 (T25) 벤트 필터 캡이 있는 조직 배양 플라스크</td><td>생명 과학 제품</td><td>CT-229331</td><td></td></tr><tr><td>트랜스퍼 피</td><td>펫 Fisher</td><td>1371120</td><td></td></tr><tr><td>멸균, 50 mL 생체 반응 튜브</td><td>생명 과학 제품</td><td>CT-229475</td><td></td></tr><tr><td>PipetteBoy</td><td>VWR</td><td>14222-180</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 혈청학적 피펫</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 플랫 캡 PCR 튜브</td><td>Fisher</td><td>14230200</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 생물학적 위험 오토클레이브 백</td><td>Fisher</td><td>01828C</td><td></td></tr><tr><td>35 mm #1.5 유리 바닥 접시</td><td>Matsunami 유리</td><td>D35-14-1.5-U</td><td>35 mm 접시 직경, 14 mm 유리 직경, 1.5 mm 유리 두께, 코팅되지 않은</td></tr><tr><td>인큐베이터, 모델 1510E</td><td>VWR</td><td>35823-961</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 세포 계수기</td><td>ThermoFisher</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>백작 세포 계수 챔버 슬라이드(0.4% 트리판 블루 시약</td><td>포함) ThermoFisher</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview FV10i-LIV 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV10i-LIV</td><td></td></tr><tr><td>HsPLA2/pCS6 플라스미드 DNA</td><td>트랜스OMIC 기술</td><td>TCH1303</td><td></td></tr><tr><td>pmCherry Vector</td><td>Clontech</td><td>632522</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes 시약(Hoechst 33342)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37605</td><td></td></tr></tbody></table>

배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

이종 단백질 발현 시스템은 재조합 단백질의 생산에 사용되는, 셀룰러 피킹 / 제이션의 해석 및 서브 유기체 수준에서 단백질의 생화학 적 기능의 결정. 배큘로 바이러스 발현 시스템은 점점 더 많은 생명 공학, 제약 및 산업용 애플리케이션이 분명한 혜택을 바이러스 감염을 포함하지 않지만 종종 간과하고 충분히 활용하는 nonlytic 시스템에서 단백질 생산을 위해 사용되지만. 여기서는 nonlytic 발현 벡터 및 과도 재조합 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 재조합 단백질의 효율적인 세포 제이션을 허용하고 신속하게 세포 내 단백질 피킹을 식별하는데 사용될 수있다. 우리는뿐만 아니라, 곤충 Bemisia의 담배가 루이의 두 아쿠아 포린 단백질을 포함하여 시중에서 판매하는 곤충 세포주에서 네 개의 재조합 단백질의 발현을 보여세포 원형질막 세포 이하의 특정 마커 단백질로서 세포 내 리소좀에 대한. 모든 재조합 단백질은 재조합 단백질의 직접 검출을 가능하게 그들의 카복실 말단에서 형광 단백질 마커 키메라 같이 제조 하였다. 플라스미드 관심과 알려진 세포 내 마커의 유전자 구조를 숨겨와 세포의 이중 형질 전환 라이브 세포 이미징 및 세포 단백질 현지화의 개선 확인이 가능합니다.

OE-PCR OE-PCR 일단 관심 형광 마커 단백질의 임의의 테스트에 대응하는 유전자 재조합 키 메릭 단백질의 생성을 허용, 발현 벡터에 삽입 키메라 DNA 산물의 합성을 허용한다. 도 1은 형광 단백질 마커 EGFP에 프레임 시퀀스 (BtDrip1 및 BtDrip2_v1)를 부호화 B.의 담배가 루이의 아쿠아 포린 PIB를 함유하는 발현 벡터의 제조에 대한 일반적인 구조를 나타낸다. 이 경우, 그 카르복실기 말단에서 EGFP를 포함하는 두 BtDrip 키메라 단백질을 제조 하였다. 이 프로토콜은 또한 카복실 테르 mCherry 키메라와 같이 제조 개의 곤충 세포 내 마커 단백질과 DmSPR PLA2G15 (도 1)를 개발하기위한 방법을 설명했다. 그 방출 스펙트럼은 충분히 발산 때문에 ...

Nonlytic 곤충 세포 발현 시스템은 생산 세포 트래 피킹 / 제이션, 및 재조합 단백질의 기능 분석을 위해 충분히 활용된다. 여기서 우리는 상업적으로 이용 가능한 나비목 세포주에서 발현 벡터 및 후속 과도 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명합니다. 세포 내 형광 마커 단백질과 Bemisia의 담배가 루이의 아쿠아 포린의 공동 제이션 또한 제공된다.

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

본 절차의 전반적인 목표는 상용 곤충 세포 내에서 형광 표지된 표적 단백질을 발현시켜, 단백질의 기능 및 세포 내 단백질 이동을 보다 명확히 규명하는 것입니다. 이 방법은 단백질 기능, 단백질 상호작용 및 세포 내 단백질 국소화와 관련된 세포 생물학 및 생화학 기반의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 컨스트럭트를 빠르게 생성할 수 있으며, 바큘로바이러스 발현과 관련된 유해한 영향 없이 살아있는 세포에서 발현된 단백질의 기능을 기능적으로 평가할 수 있어 처리량을 향상시킬 수 있다는 점입니다.이 방법은 곤충 단백질 연구에 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 단백질 기능이나 세포 내 국소화 연구가 필요한 모든 시스템에 적용할 수 있습니다. 곤충 세포 배양 및 형질전환 절차의 시연은 저희 실험실의 기술자인 Danni LeRoy가 진행하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, -80 °C 냉동고에서 냉동된 SF9 및 Tni 세포 스톡 바이알을 꺼내 37 °C 항온수조에서 해동하십시오.해동 후, 바이알을 70% ethanol로 소독하고 얼음에 둡니다. 바이알과 조직 배양 플라스크를 열어야 하는 모든 세포 조작은 멸균 상태를 유지하기 위해 층류 후드(laminar flow hood) 내에서 수행해야 합니다. 새로운 T25 플라스크에 무혈청 곤충 배지 4 mL를 넣고, 다른 T25 플라스크에 TNM-FH 배지 4 mL를 넣습니다.해동된 Tni 세포 1 mL를 무혈청 곤충 배지가 담긴 플라스크로 옮기고, 해동된 SF9 세포 1 mL를 TNM-FH 배지가 담긴 플라스크로 옮깁니다. 플라스크를 28 °C 비가습 인큐베이터에 넣고 세포가 부착될 때까지 30~45분 동안 둡니다. 이후 시딩 배지를 각각 적절한 배지 5 mL로 교체합니다.그런 다음 플라스크를 28 °C의 비가습 배양기에 다시 넣습니다. 매일 세포 융합도를 모니터링하십시오. 이 대표 이미지들에 나타난 것과 같이 세포 융합도가 90%에 도달하면 세포를 계대 배양하십시오.세포가 융합된 플라스크를 기울여 배지가 세포 단층에서 떨어진 한쪽 구석으로 흐르게 한 다음, 멸균된 5 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 세포가 흐트러지지 않도록 주의하며 배지를 조심스럽게 제거합니다. Tni 세포의 경우, 새로운 멸균 5 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 융합된 단층 위에 무혈청 곤충 배지 4 mL를 부드럽게 첨가합니다. 피펫 팁을 플라스크 전체로 움직이며 천천히 세척하여 플라스크 바닥에 느슨하게 부착된 세포들을 제거합니다.세포가 적절하게 분리되었는지 확인하려면 모든 배지를 제거한 다음 플라스크를 뒤집어 바닥면이 깨끗한지 관찰하십시오. 부착력이 더 강한 SF9 세포의 경우, 4 mL의 신선한 TNM-FH 배지를 추가하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 부착된 세포를 떼어내십시오. 5 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합함으로써 세포 응집을 줄이십시오.세포를 분리한 후, 각 세포 및 배지 혼합물 약 0.1 milliliters를 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 별도의 0.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 각 세포 및 배지 혼합물 10 microliters를 trypan blue 10 microliters에 추가합니다. 세포 계수 챔버 슬라이드를 포장에서 꺼내고, 세포 배지 trypan blue 혼합물 10 microliters를 계수 슬라이드의 각 쪽에 추가합니다.슬라이드를 자동 세포 계수기에 삽입하여 세포 밀도와 생존율을 측정합니다. 약 1~1.5 × 10⁶개의 세포를 신선한 배지가 담긴 T25 플라스크로 옮깁니다. 플라스크에 세포주, 날짜, 사용한 배지, 접종 세포 수 및 계대 배양 횟수를 표시합니다.플라스크를 28 °C 인큐베이터에 최대 72시간 동안 보관하십시오. 곤충 세포 형질전환 과정 또한 층류 후드 내에서 수행해야 합니다. 적절한 곤충 세포 배지를 사용하여 T25 플라스크에 최대 1 × 10⁶개의 Tni 또는 SF9 세포를 분주하십시오.본 시연에서는 Tni 세포가 사용됩니다. 18 °C에서 72시간 동안 세포를 배양하여 합류(confluency) 상태가 되도록 합니다. 72시간 후, 기존 배지를 제거하여 버리고 이전에 설명한 대로 4 mL의 신선한 무혈청 곤충 배지로 Tni 세포를 떼어냅니다.이 절차에서 가장 어려운 점은 transfection 동안 유리 바닥 디쉬에 부착된 세포의 적절한 밀도를 확보하는 것입니다. 각 디쉬에 7 × 10⁵개 이상의 세포를 추가해서는 안 됩니다. 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 밀도를 추정한 후, 튜브를 뒤집어 세포 현탁액을 철저히 하지만 부드럽게 혼합하고, 개별 35 millimeter 유리 바닥 디쉬에 약 7 × 10⁵개의 세포를 추가합니다.세포가 28 °C에서 20~25분 동안 부착되도록 둡니다. 각 transfection을 위해, 멸균된 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 FBS가 포함되지 않은 serum-free insect medium 0.1 mL와 plasmid DNA 2 µg을 넣습니다. 별도의 튜브에 transfection 시약 8 µL와 serum-free insect medium 0.1 mL를 혼합합니다.그런 다음 용액을 목적 플라스미드 DNA가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 가볍게 볼텍싱하고 상온에서 20~30분 동안 배양합니다. 다음으로, 플라스미드 형질전환 혼합물을 0.8 milliliters의 무혈청 곤충 배지로 희석하여 총 부피를 1 milliliter로 맞춥니다.부착된 세포가 들어 있는 유리 디쉬에서 배지를 조심스럽게 제거합니다. 희석된 플라스미드 트랜스펙션 배지를 부착된 세포 위에 덮어줍니다. 세포를 28 °C에서 5시간 동안 배양합니다.5시간 후, transfection 배지를 제거하고 버린 다음, 세포가 떨어지지 않도록 주의하며 1 mL의 무혈청 곤충 배지로 세포를 부드럽게 세척합니다. 2 mL의 신선한 무혈청 곤충 세포 배지를 첨가하고 28 °C에서 48~72시간 동안 배양합니다. 곤충 세포 transfection 후 48~72시간이 지나면, 1 mL의 IPL-41 곤충 배지로 세포를 한 번 세척한 다음, 이미징을 위해 2 mL의 IPL-41로 덮어줍니다.배지에 Hoechst 생세포 염색 시약을 네 방울 추가하고 28 °C에서 20~25분 동안 배양합니다. 35 mm 디쉬를 밀폐형 레이저 스캐닝 공초점 현미경에 넣습니다. 시중에서 많은 유리 디쉬를 구할 수 있지만, 현미경 스테이지에 적합한 제품을 사용하는 것이 중요하며, 세포 부착에 가장 적합한 유리 기구를 경험적으로 결정해야 할 수도 있습니다.Hoechst, EGFP 및 mCherry 관찰 조건에 맞게 현미경을 조정합니다. Hoechst의 들뜸 및 방출 파장은 각각 359 nanometers와 461 nanometers로 설정합니다. EGFP의 들뜸 및 방출 파장은 각각 489 nanometers와 510 nanometers로 설정합니다.mCherry의 여기 및 방출을 위해 580 nanometers와 610 nanometers를 사용합니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 초기 스캔을 수행함으로써 형광 발현을 확인합니다. 그 후, 60X 위상차 수침 대물렌즈를 사용하여 스캔 모드로 전환합니다.이미지 대비와 해상도를 최적화하기 위해 레이저 출력, 검출기 민감도, 스캐닝 속도, Z축 깊이 및 디지털 줌을 조정하십시오. 총 90배의 배율이 되도록 1.5X 디지털 줌으로 세포를 촬영하십시오. 이후 분석을 위해 로우 데이터를 TIFF 이미지 파일로 저장하고 내보내십시오.Tni 세포에 표시된 플라스미드를 형질전환하고, 재조합 단백질의 발현을 공초점 형광 현미경으로 시각화했습니다. 세포 표면에 녹색 형광이 나타나는 것으로 보아 재조합 BtDrip1-EGFP의 형질전환 및 발현이 성공적으로 이루어졌음을 알 수 있습니다. BtDrip2 버전 1 EGFP가 형질전환된 세포는 내부에서 녹색 형광을 나타내며, 이는 BtDrip2 버전 1이 세포 내에서 발현되었음을 보여줍니다.마찬가지로, PIB DmSPR-mCherry 또는 PIB PLA2G15-mCherry가 형질전환된 세포는 각각의 키메라 발현을 나타내는 적색 형광을 보입니다. 병합된 이미지에서 주황색 또는 노란색 영역은 EGFP와 mCherry가 모두 발현되었음을 나타내며, 이는 해당 단백질들이 동일한 세포 내 구조 내에 공동 국소화되어 있음을 시사합니다. PIB BtDrip1-EGFP와 PIB DmSPR-mCherry가 이중 형질전환된 세포의 오버레이 이미지는 BtDrip1-EGFP와 DmSPR-mCherry가 세포 표면에서 공동 국소화되어 있음을 보여줍니다.BtDrip2 version one EGFP와 PIB DmSPR-mCherry를 이중 형질전환한 세포에서는 녹색과 적색 형광 신호의 공동 국소화가 거의 나타나지 않았으며, 이는 BtDrip2 version one의 세포 내 발현을 확인시켜 줍니다. 반대로, PIB BtDrip2 version one EGFP와 리소좀 마커인 PIB PLA2G15-mCherry를 공동 발현시킨 결과, 세포질의 녹색 및 적색 형광 신호가 상당 부분 중첩되었습니다. 이는 BtDrip2가 세포 내 리소좀으로 운반된다는 점을 강력하게 시사합니다.이 영상을 시청하신 후, 배양된 곤충 세포 내에서 형광 단백질 키메라를 발현시키는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 이 시스템은 단백질 합성을 위한 신속한 벡터 구축이 가능하고, 바이러스 기반 발현 시스템의 문제점들을 피할 수 있으며, 세포 내 트래픽킹 단백질을 관찰할 수 있는 강력한 수단을 제공합니다.

transient-expression-cellular-localization-recombinant-proteins

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

단백질 전달은 세포에 생물학적으로 활성화된 단백질의 직접 배달을 수 있습니다. 이러한 DNA의 transfection 또는 바이러스성 도입으로 종래의 방법과는 달리이 비침습 패러다임은 세포 독성 및 영구 유전자 조작에 의해 종양 발생 변화의 위험을 우회 titratable 방식으로 고효율 세포 조작이 가능합니다.

공학 세포 투과 단백질

이후 인간 게놈 시대에 원시 conformations에서 재조합 단백질의 가용성은 구조적 기능적 및 치료 연구와 개발에 매우​​ 중요합니다. 여기서는 테스트 및 재조합 단백질의 다양한 생산하는 데 사용할 수있는 인간의 배아 신장 293T 세포에 대규모 단백질 발현 시스템을 설명합니다.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

식물은 현재의 표현 패러다임을보다 더 확장 가능한 비용 효율적이고 안전 상업적 규모에 제약 단백질의 생산을위한 새로운 시스템을 제공합니다. 본 연구에서는, 우리는 포함하는 대상 유전자를 소개하는 간단하고 편리하면서도 확장 가능한 접근...

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

담배 식물은 일시적 발현 시스템을 통해, 진균 셀룰라아제, TrCel5A을 제조 하였다. 발현은 형광 융합 단백질을 사용하여 모니터링 할 수 있고, 단백질 활성은 사후 발현 분석되었다.

재조합 셀룰라아제 Cel5A의 표현에서<em&gt; 트리코더마 reesei</em&gt; 담배 식물에서

포유류 시스템에 의한 재조합 단백질의 발현은 구조 생물학을 위한 단백질 복합체를 생산하는 매력적인 방법이 되고 있습니다. 여기에서 우리는 구조 연구를 위해 단백질 복합체를 정제하기 위해 현탁액 성장 포유류 세포를 사용하는 간단하면서도 매우 효율적인 발현 시스템을 제시합니다.

소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

이 연구에서는 서로 다른 생산 플랫폼에서 표적 인간 재조합 단백질의 발현을 비교했습니다. 우리는 전통적인 발효기 기반 배양과 식물에 초점을 맞추고, 각 시스템의 설정을 설명하고, 보고된 결과를 기반으로 각 플랫폼의 고유한 한계와 장점을 강조했습니다.

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

적절한 번역 후 변형을 통한 진핵 단백질의 실험실 규모 생산은 상당한 장벽을 나타냅니다. 다음은 포유류 발현 시스템을 사용하여 단백질 발현을 위한 신속한 확립 및 전환을 제공하는 강력한 프로토콜입니다. 이 시스템은 선택적 아미노산, 단백질의 선택적 표지 및 글라이칸 조성의 저분자 조절제를 지원합니다.

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

이종 발현 시스템을 통해 공부하는 이온 채널은 생물 의학 연구의 핵심 기술이되고있다. 이 논문에서는, 유도 성 프로모터의 조절하에 일시적인 형질 감염을 수행함으로써 엄격하게 제어 이온 채널 표현을 달성하는 시간 효율적인 방법을 제안한다.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

이 프로토콜 열 충격 유발 단백질 식 시스템 (pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템), 외국 단백질을 표현 하거나 안티 apoptotic 활동의 잠재적인 외국 단백질 및 그들의 잘린 아미노 평가에 사용 될 수 있는 설명 곤충 세포에서 산입니다.

과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)

여기, 선물이 곤충 세포 및 잠재 단백질 식 시스템 단백질 결정 화에 대 한 분 비 하는 식물 단백질의 대량 생산에 활용에 대 한 프로토콜. 잠재 식 벡터 GP67 또는 곤충 hemolin 신호 펩 티 드 식물 곤충 세포에서 단백질 분 비 식에 대 한 수정 되었습니다.

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)는 임상 및 전임상 유전자 전달에 널리 사용됩니다. rAAV의 과소평가된 용도는 정제 없이 배양된 세포의 강력한 transduction입니다. rAAV를 처음 접하는 연구자를 위해 transgene cassette 클로닝, 미정제 벡터 생산 및 세포 배양 transduction을 위한 프로토콜을 제공합니다.

Unpurified Recombinant Adeno-associated Viral Vectors를 사용한 배양 세포에서의 전이유전자 발현

배우세요 배양된 곤충 세포에서 형광 표지 단백질을 과도 발현하여 단백질 기능과 세포 내 소포체 이동을 연구하는 방법을. 이 기술은 바이러스 기반 시스템 없이 살아있는 세포에서 단백질을 신속하게 분석할 수 있습니다.

배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

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