최적화 STORM 슈퍼 해상도 현미경에 대한 테스트 샘플

이 절차의 전반적인 목표는 고품질의 STORM 초해상도 이미지를 획득하는 방법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 형광 표지된 테스트 샘플을 준비합니다. 다음 단계로는 스위칭 버퍼를 준비한 후, 이미징 챔버를 해당 버퍼로 채웁니다.

다음으로, STORM 현미경을 통해 원시 데이터를 획득합니다. 마지막 단계는 RainStorm 처리 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터로부터 초고해상도 이미지를 재구성하는 것입니다. 최종적으로, 테스트 샘플을 통해 고품질의 원시 데이터를 획득하는 방법을 보여주며, 이를 처리하여 TIRF 및 공초점 현미경을 포함한 기존 형광 현미경 기술보다 5~10배 향상된 30~50 nm 분해능의 세포 내 STORM 초고해상도 이미지를 생성할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 양질의 희소 링크(sparse links)를 충분히 수집하는 것이 얼마나 중요한지 인식하지 못해 어려움을 겪습니다. 이는 적절한 스위칭 버퍼와 함께 Alexa 647 염료를 사용함으로써 훨씬 수월해집니다. 고품질의 원천 데이터를 확보하는 것이 SPR 해상도 이미지를 생성하는 데 결정적이므로, 이 기술에 대한 시각적 시연이 필수적입니다.

이 기술의 원본 비디오 시퀀스는 다른 형태의 형광 현미경 영상과는 완전히 다르게 보입니다. 유리를 형광 덱스트린으로 코팅하는 절차를 시작하려면, 8개의 챔버가 있는 커버 글라스의 각 웰에 0.01% polylysine 용액 200 µL를 넣고 10분 동안 배양하십시오. 10분 후, 피펫을 사용하여 polylysine 용액을 제거함으로써 액체가 남아있지 않도록 하십시오.

고밀도 dextrin Alexa 647 코팅 용액을 만들기 위해, 2 mg/mL 농도의 dextrin Alexa 647 스탁 용액 0.25 µL를 탈이온수 25 µL에 첨가하여 20 µg/mL 용액을 제조합니다.

20 µg/mL 용액 20 µL를 탈이온수에 희석하여 총 부피를 200 µL로 맞춥니다. 중간 밀도 용액의 경우, 2 µL를 탈이온수 200 µL에 희석합니다. 저밀도 용액의 경우에는 0.2 µL를 희석합니다.

탈이온수 200 µL가 담긴 각 웰에 희석된 dextrin Alexis X 47 용액 200 µL를 첨가하고 10분 동안 배양합니다. 더 긴 배양 시간을 사용할 수 있으며, 이 경우 덱스트린 코팅이 더 조밀해질 수 있습니다. 마지막으로 Dexter Xis X 47 용액을 제거하고 물로 3회 세척합니다.

유리 위에 형광 액틴 필라멘트를 준비하려면, 먼저 8챔버의 각 웰에 0.01% polylysine 용액 200 µL를 넣습니다. 커버 글라스를 덮고 10분 동안 배양합니다. 액체가 남지 않도록 피펫으로 제거합니다.

제조업체의 지침에 따라 미리 재구성한 일반 액틴 완충액(general actin buffer) 90 µL를 각 챔버에 넣습니다. 그런 다음 10 µM의 미리 형성된 액틴 필라멘트 용액 10 µL와 Alexa 647이 결합된 폴리머 1 µL를 추가하고, 피펫으로 가볍게 위아래로 섞어줍니다. 상온에서 30분 동안 배양하여 기준 마커로 사용할 마이크로구체 형광 비드를 준비합니다. 테펙 비드(tepec beads) 1 µL를 200 µL의 PBS에 희석하고 섞습니다. 희석된 비드를 이미징 챔버에 넣고 15분 동안 기다립니다.

15분 후, 용액을 제거하고 PBS로 3회 세척한 다음 세포를 이미지화합니다. 이 실험에는 약 80%의 밀도로 배양된 세포가 사용됩니다. 배양액을 제거하고 PBS로 세척합니다. 그다음 4% formaldehyde 용액 500 µL를 첨가하고 10분 동안 처리합니다.

포름알데하이드를 제거하고 PBS로 3회 세척합니다. 세포가 건조해지지 않도록 하며 항상 PBS 완충 용액을 사용하십시오. 저삼투압 스트레스를 방지하기 위해, 50 µg/mL 농도의 EGF Alexa 647 스톡 용액 2 µL를 0.1% BSA 용액 200 µL에 추가한 후, 이 용액을 HeLa 세포에 첨가합니다.

실온에서 30분 동안 배양합니다. 용액을 제거하고 PBS로 3회 세척합니다. 0.1% BSA 블로킹 용액을 첨가하고 실온에서 15분 동안 둡니다.

그 후, 블로킹 솔루션을 제거하고 이미징 전 PBS로 3회 더 세척합니다. 이미징 직전에 효소 글루코스 및 환원제 스톡 솔루션을 50 µL, 400 µL, 100 µL의 비율로 혼합하여 스위칭 버퍼를 준비하고, 최종 부피가 1 mL가 되도록 PBS를 추가합니다. 이미징 챔버에서 PBS를 제거한 다음, 스위칭 버퍼를 상단까지 채웁니다.

커버슬립을 챔버 상단에 조심스럽게 덮고, 기포가 전혀 없으며 챔버 전체가 덮였는지 확인하십시오. 기포가 보이면 버퍼 또는 PBS를 추가로 채우십시오. 그렇지 않으면 버퍼의 성능이 저하될 수 있습니다.

이 절차의 성공을 위해서는 고품질의 희소 연결 데이터를 수집하는 것이 필수적이므로, 현미경의 초점이 적절히 맞았는지와 정확한 획득 설정이 사용되었는지 확인하십시오. 이미징할 관심 형광 구조를 찾으십시오. 원하는 조명 각도를 선택하십시오.

이 경우, 초점이 맞지 않는 빛을 최소화하여 신호 대 잡음비를 개선하므로 터프(turf) 또는 매우 가파른 각도를 권장하며, 이는 특히 세포 시료에 유용합니다. STORM 이미징을 수행하기 전, 구조의 분해능 제한 이미지(diffraction limited image)를 참조용으로 촬영하십시오. 카메라 설정을 10 millisecond 노출과 약 50 hertz 또는 초당 프레임 수의 사이클 시간으로 설정하여 이미징하는 동안, 여기 레이저를 약 2 kilowatts per centimeter squared에 해당하는 고출력으로 높이십시오.

Flora fours가 희소 깜빡임 패턴(sparse blinking pattern)으로 전환되면, 10,000프레임을 수집하십시오. 재구성을 시작하려면, MATLAB 내에서 RAINSTORM M 파일을 열고 rainstorm 창에서 실행하십시오.

찾아보기 버튼을 사용하여 분석할 이미지 파일을 선택하십시오. 파일은 TIF 형식이어야 합니다. 픽셀 너비를 데이터 수집에 사용된 현미경 시스템의 원본 데이터와 일치하도록 변경하십시오.

나머지 값들은 기본값으로 둡니다. process images 버튼을 누르고 예비 이미지가 나타날 때까지 기다립니다. 처리 시간은 파일 크기, 컴퓨터 사양 및 원시 데이터 내의 후보 링크 수에 따라 달라집니다.

최신 초해상도 이미지를 생성하려면 open reviewer 버튼을 누르십시오. 그러면 두 번째 창이 나타납니다. 원하는 대로 이미지 표시를 변경하려면 adjust contrast 버튼을 누르십시오. 이미지가 매우 어두운 일부 경우에는 최대값을 낮추어야 합니다.

리뷰어 창을 사용하여 유용한 이미지 품질 메트릭을 생성하고 초고해상도 이미지를 더욱 정밀하게 개선하십시오. 처음 세 가지 품질 관리 파라미터는 각각 기본값인 5,000, 0.1 및 0.8에서 3.5로 유지하십시오. 광자당 카운트(counts per photon) 값을 업데이트하십시오.

평균 국소화 정밀도와 국소화 횟수 사이의 균형을 최적화하기 위해 국소화 정밀도 컷오프 값을 조정하십시오. 최종 이미지의 경우, 데이터와 샘플의 품질에 따라 30에서 50 nanometers 사이의 값을 권장합니다. 재구성 배율 인수의 기본값은 5이며, 원본 이미지의 픽셀이 160 nanometers라고 가정할 때 32 nanometers의 초해상도 픽셀을 생성합니다.

원본 이미지의 픽셀 크기가 100 nanometers인 경우, 픽셀 크기가 20 nanometers인 초고해상도 이미지가 생성됩니다. 배율 인자(scale factor)를 높이면 더 작은 초고해상도 픽셀을 생성할 수 있습니다. 최종 이미지에서 run reviewer 버튼을 눌러 업데이트된 초고해상도 이미지를 생성하십시오.

이미지 품질 지표를 표시하려면 히스토그램 보기 버튼을 누르십시오. 마지막으로, 이 모든 데이터를 저장하려면 리뷰어의 이미지 저장 버튼을 누르십시오. 이전에 시연한 방식과 동일하게 이미지를 생성하여 이 절차를 시작하십시오.

리뷰어의 박스 추적 버튼을 누른 다음, 검토 중인 이미지의 피듀셜 마커 위에 박스를 클릭하여 드래그하십시오. 박스 표시 위치가 나타나는 새 이미지가 표시될 때까지 기다리십시오. 관심 대상이 피듀셜 마커인 경우, 원한다면 이 이미지를 저장하십시오.

여기와 마찬가지로, 'set anchor' 버튼을 클릭한 후 'subtract drift' 버튼을 클릭하여 드리프트 보정을 수행합니다. 마지막으로 'run reviewer'를 다시 클릭하여 새로운 STORM 이미지를 생성합니다. 덱스트린 코팅이 성공적으로 이루어지면 형광 단분자층이 형성되며, 전형적인 덱스트린 데이터가 이 그림에 표시되어 있습니다.

회절 한계 영상은 STORM 이미징 전의 서로 다른 덱스트린 농도를 보여줍니다. 초고해상도 재구성 영상의 픽셀 크기는 25 nanometers입니다. 128 by 128 픽셀 프레임 크기로 총 10,000장의 영상을 수집하였으며, 해당 시퀀스에서 추출한 개별 프레임들이 표시되어 있습니다.

높은 덱스트린 농도에서는 이 이미지들과 비디오 세그먼트에서 보여주는 것처럼 형광 단분자층이 비교적 균일하게 나타나야 합니다. 낮은 농도에서는 깜빡임이 더 드물게 나타나며 초점이 맞게 보일 것입니다.

일정한 레이저 조사 하에 이미지 획득 단계에서 뚜렷한 배경 신호가 없는 경우, 고밀도 시료의 프레임 2000과 프레임 8,000의 비교에서 알 수 있듯이 깜빡임 횟수가 시간이 지남에 따라 감소합니다. 고, 중, 저 농도의 덱스트린 초고해상도 이미지 간의 주요 차이점은 국소화 횟수가 감소한다는 점입니다. 이 그래프는 각 덱스트린 농도에 대해 10,000프레임 시퀀스 3회의 평균값을 나타내며, 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다.

하지만, 원시 데이터 내 형광 분자의 농도, 깜빡임 횟수 및 국소화 횟수 사이의 이러한 비례 관계는 프레임당 수용된 국소화 횟수를 나타내는 이 그래프에서 알 수 있듯이 단순한 선형 관계가 아닙니다. 매우 높은 분자 밀도에서 100프레임 이동 평균을 사용하면, 소프트웨어가 어떤 샘플을 이미징하더라도 분자를 성공적으로 국소화하지 못할 수 있습니다. 흔히 발생하는 문제로는 매질을 통해 확산되는 형광 물질로 인해 이미지 전체에 밝지만 초점이 맞지 않는 형광 헤이즈가 나타나는 경우가 있습니다.

이러한 분리된 형광 분자들은 스위칭 버퍼를 추가하기 전 PBS 세척 단계를 늘리거나, 챔버에 신선한 스위칭 버퍼를 추가하여 방지 또는 제거할 수 있으며, 각 이미지 시퀀스의 데이터를 처리하고 비교하면 매우 상이한 초고해상도 이미지가 생성됩니다. 패널 C와 D는 각각 패널 A와 B에서 수집된 데이터에 해당하는 초고해상도 이미지 구성입니다. 이 그래프는 100프레임 이동 평균을 사용하여 프레임당 허용된 로컬라이제이션 횟수를 나타냅니다.

빨간색 선은 배경 신호가 높은 스톰 시퀀스 A와 C에 해당하며, 파란색 선은 배경 신호가 낮은 B와 D에 해당합니다. 높은 배경 신호와 낮은 배경 신호 데이터에 해당하는 이미지의 인정된 국소화 횟수가 두 번째 그래프에 표시되어 있습니다. 이 세 개의 회절 한계 이미지는 스위칭 버퍼 첨가 및 스톰 이미징 전에 유리 표면에 부착된 미리 형성된 액틴 필라멘트의 전형적인 데이터를 보여줍니다.

다양한 길이의 필라멘트가 관찰될 수 있습니다. 매우 밝은 필라멘트는 종종 여러 개의 필라멘트가 서로 엉켜 있는 경우입니다. 엉킨 부위보다는 상대적으로 밝은 단일 필라멘트를 선택하는 것이 획득 단계에서 더 고품질의 이미지를 얻는 방법입니다.

필라멘트의 전체 길이를 따라 초점이 뚜렷한 깜빡임이 관찰되어야 합니다. 획득 단계와 이후의 프로세스 데이터에서는 드문드문 깜빡임이 보여야 합니다. 가느다란 연속 필라멘트가 나타나야 하며, 프레임당 국소화 횟수는 점진적으로 감소하는 양상을 보여야 합니다.

일반적으로 필라멘트의 반치폭(FWHM)은 Image J의 플롯 프로필 기능을 사용하여 확대된 액틴 필라멘트 영역에 직선을 긋고 가우스 피팅(Gaussian fit)을 수행함으로써 해상도의 경험적 추정치로 제시됩니다. FWHM은 43.2 nanometers로 계산됩니다. 프레임의 하위 집합을 처리하고 처음과 마지막 5,000 프레임을 비교함으로써, 다수의 액틴 필라멘트가 분지하거나 서로 교차함에 따라 위치 지정 오류(mislocalization) 문제가 발생할 수 있습니다.

처음 5,000 프레임을 사용하여 생성한 초고해상도 이미지에서는 다른 결과가 나타납니다. 이미지 중앙에 많은 국소화 지점들이 관찰됩니다. 그러나 마지막 5,000 프레임을 사용했을 때는 이러한 국소화 지점이 거의 나타나지 않으며, 이미지 내 국소화 지점의 수가 적기 때문에 다소 불연속적이지만 필라멘트 구조만 남게 됩니다.

블링크 밀도가 너무 높다고 의심되는 경우, 프레임당 국소화(localization) 데이터와 이미지를 비교하면 첫 번째 프레임 세트 동안 이 문제가 발생하고 있음을 강력하게 시사할 수 있습니다. 마지막 프레임 세트에서는 프레임당 평균 국소화 횟수가 약 4회인 반면, 여기서는 10회를 초과합니다. STORM 현미경 검사에서 발생할 수 있는 또 다른 잠재적 문제는 드리프트(drift)로, 이는 시료가 대물렌즈에 대해 이동할 때 발생합니다. 데이터 획득 단계에서는 이미지 획득 단계 중에 감지하기 매우 어렵지만, actin 필라멘트와 같이 알려진 구조의 초해상도 이미지에서 드리프트를 감지할 수 있습니다.

측방 드리프트(lateral drift)가 발생했을 가능성을 보여주는 첫 번째 징후는 구조체가 예상보다 크게 나타나는 것입니다. 예를 들어, rainstorm의 정밀도 한계 데이터와 비교했을 때 반치폭(full width at half maximum)이 상대적으로 더 큰 경우이며, 본 사례에서는 67 nanometers 대비 90 nanometers로 나타났습니다. 드리프트를 탐지하는 더 나은 방법은 시간의 함수로 국소화(localization)를 비교하는 것, 즉 후반부 프레임의 국소화 지점이 초반부 프레임과 비교하여 변위되었는지 확인하는 것입니다.

이는 색상 코드로 표시된 액틴 필라멘트의 사례에서 명확하게 확인할 수 있습니다. 패널 B와 C에 표시된 것과 같이 rainstorm의 박스 추적 기능을 사용하면, 획득된 프레임 번호에 해당하는 색상으로 로컬라이제이션이 표시됩니다. 예를 들어, 획득 시퀀스의 초기 단계에서 얻은 로컬라이제이션은 파란색으로, 획득 시퀀스의 후기 단계에서 얻은 로컬라이제이션은 빨간색으로 표시됩니다.

어긋난 색상은 측정 및 보정이 필요한 드리프트가 발생했음을 나타냅니다. 드리프트 측정을 위해 직경 100 nanometer의 형광 비드를 기준 표식(fiducial markers)으로 사용할 수 있으며, 1번부터 4번까지는 각각 자르고 확대한 비드의 모습을 보여줍니다. 획득 단계 동안 3분 10초에 걸쳐 약 100 nanometers의 비교적 심한 드리프트가 발생한 예시에서, 동일한 박스 추적 기능을 사용하여 색상 코드를 부여하고 드리프트 발생 여부를 확인할 수 있습니다. 이 예시에서는 네 개의 비드 모두 거의 동일한 드리프트를 보였으므로, 이 중 하나(여기서는 2번 비드)를 기준점으로 선택하여 다른 비드들에서 드리프트를 뺄 수 있습니다.

패널 E와 비교하면 측방 드리프트(lateral drift)가 보정되었음을 알 수 있습니다. 마지막으로, 상피세포 성장인자(epidermal growth factor)로 염색된 HeLa 세포를 사용하여 이미지 해상도의 실제 사례를 제시할 수 있습니다. 세포의 경우, 패널 A는 기저 세포 표면에 초점을 맞춘 HeLa 세포 일부의 회절 한계 이미지(diffraction limited image)를 보여주며, 여기서 노란색 상자는 패널 B와 C에 확대하여 나타낸 관심 영역을 나타냅니다. 이는 회절 한계 이미지에서 관심 영역이 불분명하게 확대된 것과 대조적입니다.

초고해상도 이미지는 클러스터와 간헐적으로 고립된 단일 픽셀이 혼합된 형태를 보여야 합니다. 클러스터의 직경은 약 100 nanometers이며, 이는 형성 중인 피트(pit) 및 소포(vesicle)에 해당할 가능성이 높습니다. EGF가 주로 하향 조절되고 내포 작용(endocytosis)되는 경로와 패널 D의 프레임당 위치 데이터가 그래프 G에 제시되어 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 간단한 테스트 샘플을 제작하고, 데이터를 획득하며, 고품질의 STORM 초고해상도 이미지를 재구성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이러한 방법들은 드리프트와 같은 일반적인 피팅 오류를 방지하고 STORM을 최적화하는 데 도움이 됩니다. 해상도 실험을 참조하십시오.