Name: 최적화 STORM 슈퍼 해상도 현미경에 대한 테스트 샘플 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 52 s
Description: 배우세요 STORM 초고해상도 현미경을 위한 형광 표시 테스트 샘플 준비 방법을. Alexa 647 염료와 스위칭 버퍼를 사용하여 30-50nm 해상도의 이미지를 획득하고 재구성하는 과정을 익히세요.

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우리는 영국의 국가 측정 사무실의 화학 및 생물 계측 프로그램에서 자금을 인정합니다. 우리는 기술적 조언과 제안 세바스티안 반 데 린데, 미 크로스 Erdelyi 에릭리스 감사합니다. 우리가 도움의 의견과이 원고에 대한 논의를 위해 미 크로스 Erdelyi, 에릭리스 및 최대 Ryadnov 감사합니다.

참고 :이 프로토콜 전반에 걸쳐 조언과 제안은 특정 단계에 따라 발견된다. &quot;* 1&quot;표기는 주 1 등등이 특정 단계에 관련하고 있음을 나타냅니다. 1. 유리의 형광 덱스 트란 코팅 <ol><li> 8 챔버 커버 글라스의 각 웰에 0.01 %의 폴리-L-라이신 솔루션 200 μl를 추가하고 10 분 동안 품어. 더 남은 액체를 보장하기 위해 피펫으로 제거합니다. </li><li> 2 ㎎ / ㎖의 원액을 만드는 제조 업체의 지침에 따라 덱스 트란 - 알렉사 647 * 1을 재구성. 이로부터, 20 ㎍ / ㎖의 솔루션을 만들 탈 이온수 25 μL로 0.25 μl를 희석. </li><li> 덱스 트란 알렉사 647 용액의 고밀도 코팅을 만들려면 탈 이온수 200 μL의 전체에 20 ㎍ / ㎖의 용액을 20 ㎕를 희석. 중간 밀도 솔루션을 탈 이온수 (원래 원액에서 1:10,000 희석)의 200 μL 2 μL를 희석. 저에 대한밀도 솔루션은 탈 이온수 (원래 원액에서 1:100,000 희석)의 200 ㎕의 0.2 μl를 희석. </li><li> 각 웰에 희석 된 덱스 트란 - 알렉사 647 솔루션 200 μl를 추가하고 10 분 동안 품어. 긴 배양 시간은 밀도 덱스 트란 코팅을 초래할 수있다 사용될 수있다. 세 번을 제거하고 H 2 O로 세척 * 2 </li></ol> 주 1 : 기타 덱스 트란 염색 복합체를 사용할 수 있습니다. 원하는 조합은 상업적으로 사용할 수없는 경우 비 결합 덱스 트란은 염료에 접합 될 수있다. 주 2 : 형광의 균일 성이 저하 될 수 있지만, 동일한 덱스 트란 챔버 주에 걸쳐 재 이미징 할 수있다. 모든 버퍼가없는 상태에서 4 ° C에서 보관하는 것이 좋습니다. 2. 유리에 형광 액틴 필라멘트 <ol><li> 챔버의 각 웰에 0.01 %의 폴리-L-라이신 솔루션 200 μl를 추가하고 * 3 10 분 동안 품어. 다시어떤 액체가 남아 있지 않은지 확인하기 위해 피펫으로 이동합니다. </li><li> 각 실에 일반 말라 버퍼 (제조업체의 지침에 따라 재구성)의 90 μl를 추가합니다. (제조 업체의 지침에 따라 메탄올 1.5 ㎖에 용해하면 0.2 단위) 액틴 필라멘트 용액 1 μL phalloidin도 - 알렉사 647 미리 형성된 10 μM의 10 μl를 추가하고 부드럽게까지 피펫 믹스 다운. * 4 30 분 동안 품어. </li></ol> 주 3 : 폴리-L-라이신 코팅 유리에 결합 닫기 필라멘트 챔버 결과 내에 필라멘트 용액의 부피를 증가시킨다. 4 주 : 4 ° C에서 최대 48 시간의 배양 시간을 좋은 결과로 테스트되었습니다. 챔버가 하루 이상 동일한 샘플을 사용하는 것이 추천되지 않도록 버퍼를 스위칭에 노출 된 후에 액틴 필라멘트 이미지 품질이 저하된다. 3. 기준 마커로 미세 형광 구슬 <ol><li&gt; 200 ㎕의 PBS에 TetraSpeck 구슬 1 μl를 희석 혼합. </li><li> 영상 실에 희석 구슬을 추가하고 * 5 15 분을 기다립니다. 솔루션을 제거하고 이전의 영상을 PBS로 3 회 세척한다. </li></ol> 주 5 - 희석 배양 시간은 비드의 다른 밀도를 얻기 위해 조정될 수있다. 20.5 μm의 당 10 구슬 X 20.5 μm의 시야 -이 프로토콜은 일반적으로 3 사이에 발생합니다. 4. 표피 성장 인자 세포 염색법 <ol><li> 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 약 80 % 컨 플루로 촬상 챔버 농경 HeLa 세포는 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액으로 보충. </li><li> 배지를 제거하고 PBS로 세척. 그런 다음 10 분 동안 4 % 포름 알데히드 용액 (4 ㎖의 10 % 포름 알데히드 용액 1 ㎖ 10X PBS, 5 ㎖의 물)의 500 μl를 추가합니다. 포름 알데히드를 제거하고 PBS로 3 회 세척한다. 세포가 D 유지하는 것을 허용하지 않는다공예 항상 사용하는 PBS는 저장성 스트레스를 방지하기 위해 솔루션을 버퍼. </li></ol> 주의 - 포름 알데히드는 매우 독성이다. 적절한 장갑, 눈 보호 및 실험실 코트를 착용하고 있는지 확인합니다. 포름 알데히드의 처리를위한 로컬 가이드 라인을 확인합니다. <ol start="3"><li> 50 ㎍ / ㎖의 원액을 만드는 제조 업체의 지침에 따라 EGF - 알렉사 647을 재구성. (PBS에서) 0.1 % BSA 용액 200 μL이 원액 2 μl를 추가합니다. 세포에서 PBS를 제거, EGF 솔루션을 추가하고 30 분 동안 품어. </li><li> 솔루션을 제거하고 15 분 동안 (PBS에서) 0.1 % BSA의 차단 솔루션을 추가하기 전에 PBS로 3 회 세척한다. 이를 제거하고 이전의 이미지에 PBS에 추가하는 과정을 3 회 반복한다. </li></ol> 5. 버퍼 준비를 전환 <ol><li> 카탈라아제의 10 μL (20 ㎍ / ㎖), 1 M 트리스 (2 - carboxyelthyl) 포스 하이드로 클로라이드 (4 ㎜), 2.5 ml의 글리세린 (50 %) 20 ㎕, 125 ㎕ 씩 효소 원액 (A)를 확인1 M의 KCl (25 ㎜)의 1 M의 pH를 7.5 트리스 - 염산 (20 ㎜)의 100 μL, 5 포도당 산화 효소 (1 ㎎ / ㎖)의 MG와 diH20와 5 ㎖ 볼륨에 가득 부어. 이 -20 ° C에서 저장까지 1 년간 사용할 수있는 100 × 50 ㎕의 분취 량을 확인하기에 충분하다. </li><li> ) 4g 혈당 (100 ㎎ / ㎖), 4 ㎖의 글리세린 (10 %), 36 ML의 diH20과 포도당 주식 솔루션 (B)를 확인합니다. 20 ° C와 1 년까지 사용 -이 저장 될 수있는 100 × 400 ㎕의 분취 량을 확인하기에 충분하다. </li><li> MEA-염산 (1M)의 113.6 밀리그램 DIH 2 0 1 ㎖와 환원제 원액 (C)를 ​​확인합니다. 신선한를 사용하거나 -20 ° C에서 저장까지 1 달 동안 사용할 수있는 10 × 100 ㎕의 분취 량을, (분취 량을 재 냉동하지 않음)합니다. </li><li> 직전 이미징, 효소 (A), 포도당 (B) 및 비율 50 μL에서 함께 에이전트 (C) 주식 솔루션을 감소, 400 μL, 100 μL를 혼합 * 6 PBS 1 ml로 구성한다. 이 버퍼는 현재 산소를 폐품 및 환원 환경 (100 MM의 MEA을해야합니다염산) * 7. 최종 pH의 범위는 6.0에 있어야합니다 - 8.5 (조정은 일반적으로 필요하지 않습니다) * 8. </li></ol> 6 주 -이 버퍼는 Cy5에 알렉사 647로 carbocyanine 기반의 염료로 사용하기에 적합하다. 7 주 - 최종 효소 농도는 포도당 산화 효소의 50 μg / ㎖ (5 개 / ㎖), 카탈라제의 1 ㎍ / ㎖ (40 ~ 60 단위 / ㎖)이다. 효소 활성 (단위) 공급 업체에 의해 부여 될 수 있습니다. 카탈라제에 대한 계산 단계 5.4 이후 1 ㎍ / ㎖의 최종 농도는 효소의 50 단위를 포함한다고 가정합니다. 유사한 산소 소거 성분 등 여러가지 버퍼 조성물은 21,30,40 찾을 수있다. 버퍼와 염료의 조합에 대한 요약 참조 (28, 29)을 참조하십시오. 글리세린과 TCEP는 -20 ° C에서 장기 저장에 필요한 8 주 - 영상 액틴 필라멘트 t을 안정화하는 데 도움이 2 mM의 MgCl2를 0.2 mM의 ATP를 추가하는 경우그는 필라멘트. 6. (알렉사 647 염료를 사용하여) STORM 데이터의 현미경 취득 <ol><li> 열 평형에 도달 할 수 있도록 STORM / PALM 현미경, 영상 전에 바람직하게는 3 시간에 스위치. 이 전 영상은 드리프트의 증가 기회가있다. </li><li> 현미경 단계 샘플 홀더에 영상 실을 삽입합니다. 샘플 홀더에 단단히하고 평평한 지 확인합니다. </li><li> 영상 실에서 PBS를 제거하고 스위칭 버퍼 상단에 입력합니다. 조심스럽게 확인 기포가 전혀 없다고하고 전체 챔버가 적용되어 제작, 챔버의 상부에 커버 슬립을 배치합니다. 기포가 보이는 경우 추가 버퍼 또는 PBS와 맨 그렇지 않으면 성능이 감소 할 수 있습니다 버퍼. </li></ol> 주의 - 대물 렌즈와 관련하여 샘플의 횡 방향 및 축 드리프트의 가능성을 최소화하기 It는 샘플 및 버퍼 평형화 남아있는 것을 권장이전 영상에 적어도 15 분 동안 실온에. <ol start="4"><li> 몇 군데에 관심 형광 구조를 찾습니다. 이것은 세포 샘플에 특히 이익이다 포커스 아웃 광을 최소화하여 신호 대 잡음비를 향상이 경우 조명의 원하는 각도, TIRF 또는 높은 경사각을 선택 추천. 이전 STORM 영상에 구조의 기준 회절 제한 이미지를 가져 가라. </li><li> 약 2 킬로와트 / cm (2)에 대응하는, 높은 전력으로 (약 640 ㎚의 적절한 여기 파장을 가진) 여기 레이저를 증가하는 동안 10 msec의 노출의 카메라 설정, 약 50 Hz의 사이클 시간에 이미징 (초당 프레임) . 형광 (대부분의 샘플 아마 10 초 이내) 스파 스 점멸 패턴으로 전환 한 후 * 9 10,000 프레임을 수집합니다. </li></ol> 9 주 - 10,000 프레임은 여기에 설명 된 샘플에 적합합니다그러나, 다른 샘플 50000 이상으로 프레임 번호를 증가시킬 필요가있을 수있다. 7. 원시 데이터에서 최고 해상도의 이미지를 재구성 (폭풍우를 사용) <ol><li> MATLAB 내에서 rainSTORM.m 파일을 열고 (그림 1A)를 실행합니다. </li><li> 폭풍우 창 (그림 1B)에서 찾아보기 버튼을 사용하여 분석 할 수있는 이미지 파일을 선택합니다. 이것은. TIF 파일 (ImageJ에가 TIF 포맷으로 다른 파일 형식을 변환하는 데 이용 될 수있다)이어야한다. * (10) 데이터를 획득하는 데 사용되는 현미경 시스템의 원시 데이터와 일치하는 픽셀 너비를 바꾼다. 기본값으로 다른 값을 둡니다. </li></ol> 10 주 - 이미지의 픽셀 크기가 160 나노 될 것 100X 대물 렌즈와 시스템에 따라서 일반적인 EMCCD 카메라는 16 ㎛의 픽셀 크기를 가지고 있습니다. 상용 시스템의 픽셀 크기는 일반적으로 소프트웨어에 표시됩니다. 픽셀 크기는 대부분의 현지화 현미경 100 nm의 160 nm의 사이에 다릅니다.<ol start="3"><li> &#39;공정 이미지&#39;버튼을 누르면 예비 이미지가 나타날 때까지 기다립니다. 처리 시간은 파일 크기, 컴퓨터 명세서 및 * 11 원시 데이터 내의 후보 점멸의 수에 의존 할 것이다. </li></ol> 주 11 - 액틴과 EGF 데이터 10,000 프레임 시퀀스는 인텔 제온 E5420의 CPU와 함께 PC를 사용하여 각각 처리하는 데 23 초, 25 초를했다. MATLAB에서 병렬 처리 도구 상자없이 동일한 컴퓨터를 사용하거나 여러 개의 코어 처리하지 않고 컴퓨터와, 시간은 각각 66 초와 81 초이었다. <ol start="4"><li> 업데이트 된 최고 해상도의 이미지를 눌러 &#39;열기 리뷰어&#39;버튼을 생성하고 두 번째 창 (그림 1C)가 나타납니다. (그림 1D) 원하는대로 이미지 표시를 변경하기 위해 &#39;명암 조정&#39;버튼을 누릅니다. 일부의 경우, 화상이 매우 어두운 곳 최대 값은 감소한다. </li><li> 회전을 사용하여유용한 이미지 품질 메트릭을 생성하고, 상기 초 - 해상도 화상을 세분화하기 iewer 창 (도 1C). 각각 4000, 0.1 및 0.8 ~ 2.0의 값 * (12)에 처음 세 개의 품질 제어 파라미터를 설정한다. 어느 광자 캘리브레이션 측정 또는 특정 EM 게인 카메라 제조자에 의해 지정된 광자 곡선 검량선 값을 이용에 근거한다 광자 값마다 카운트를 업데이트한다. 이것은 정확한 정밀도와 * 13 해상도의 측정을 얻기위한 중요합니다. </li></ol> 12 주 - 신호의 수는 밝기 기준에 따라 깜박을 거부합니다. 값이 밝은 높은 깜짝 최종 이미지에서 지역화로 인정 될 수 있어야합니다. 이 염료 및 노출 시간과 카메라의 감도의 광자 출력에 따라 변경해야 할 수 있습니다. 신호 및 장착 가우스 즉, D 사이에 상당한 광장에 에러가 발생했을 경우 공차가 깜박 거부ouble 봉우리. PSF의 장착 폭이 범위를 벗어난에있는 경우 PSF 시그마 범위가 깜박 거부, 즉 좁은 범위의 포커스 아웃 신호와 일정한 형광의 큰 집계 얼룩을 거부 할 수 있습니다. 넓은 범위를 사용하여 최종 이미지에 나타나는 mislocalization 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 실제로,이 지역화 정밀 컷오프 파라미터를 이용하여 초기 품질 관리를 실시하도록 권장한다. 13 주 - 해상도 메트릭에 대한 자세한 내용은 참고 문헌 23, 27을 참조하십시오. 각에 의해 생성 된 광자의 수는 각 지역화의 현지화 정도를 계산하고 그 결과 전체 이미지 전체에 대한 정밀 추정치를 평균 산출 할 수있다 깜박 아는하여 간단히. 광자 값 당 200 카운트의 이득 설정과 도르 IXON DU-897E를 사용하면 9.04입니다. <ol start="6"><li> 평균 현지화 PRECIS을 최적화 사이의 절충 현지화 정밀 컷오프 (그림 1C)를 변경최종 이미지의 현지화 수에 이온. 30-50 ㎚의 값은 데이터의 품질과 샘플에 따라 추천된다. 히스토그램 및 info.txt 파일은 모두이 결정 (그림 1 층 및 1G)를 알릴 수 있습니다. </li><li> 재구성 스케일 팩터 (도 1C)는 기본적 원래 이미지에서 픽셀 폭이 160 ㎚이다 가정 32 ㎚의 초 - 해상도의 화소를 생성하는 것, 5이다. RAW 이미지는 100 nm의 픽셀 크기가있는 경우이 20 ㎚의 화소 최고 해상도의 이미지를 생성합니다. * 14 최종 이미지에서 작은 슈퍼 해상도 픽셀을 생산하는 규모 계수를 증가시킨다. </li></ol> 주 14 - 지역화 현미경의 분해능은 (간단한 히스토그램 재구성 픽셀 크기 즉) 시각화뿐만 아니라 지역화 정밀도에 필요에 따라 평활. 실제, 재구성 픽셀 크기는 일반적으로 지역화보다 작아야정밀도는 (정보 텍스트 파일의 평균 정밀 견적 메트릭을 참조 - 6.11 및 6.12 단계). 이 경우에 의한 재구성 화소 크기로 해상도의 손실 23,27 작은 것이다. 예를 들어 행과도 4E의 ​​열 방향의 평균 추정 정밀도는 16.1 nm 내지 16.2 nm의이다. 16 ㎚의 픽셀 크기는 (160 ㎚의 원래 픽셀 폭 (10)의 재구성 스케일 팩터)이 데이터를 시각화하는데 사용되었다. <ol start="8"><li> 예를 들어, 원시 데이터의 하위 집합에 재건을 제한하는 제한 프레임 범위 (그림 1C)을 수정 [2001-INF] 원시 데이터의 초기 2,000 프레임을 제외한다. </li><li> 업데이트 된 최고 해상도 이미지 (그림 1E)를 생성하는 &#39;실행 리뷰어&#39;버튼 (그림 1C)를 누릅니다. </li><li> 화상 품질 메트릭 (도 1F) * 15을 표시하기 위해, &#39;뷰 히스토그램&#39;버튼 (도 1C)을 누른다. </li></ol&gt; 주 15 - 카메라의 프레임 번호와 오른쪽 아래 (그림 1 층)에서 톰슨 현지화 정밀도 히스토그램에 대한 허용 현지화의 수를 묘사 오른쪽 상단에있는 그래프는 현지화 정밀 차단 검토 옵션을 알릴 수 있습니다. 예를 들어, 50 nm의 컷오프를 사용하여 최종적인 수퍼 - 해상도 화상에 포함되는 나쁜 정밀도 모두 현지화 제외 된 것이다. <ol start="11"><li> 이 모든 데이터 * 16을 저장하기 위해 검토 (그림 1C)에서 &#39;이미지 저장&#39;버튼을 누릅니다. </li></ol> 16 주 - 3에서 5 사이의 파일 (합계 이미지, STORMdataImage, STORMprocessed, 정보 및 hists) 선택한 옵션에 따라 저장 될 수있다, 그림 1G 참조하십시오. STORM 처리 된 이미지가 수정 명암 및지도와 함께 표시됩니다. STORMdataImage 각 픽셀의 그레이 레벨이 마비에 해당하는, 그레이 스케일 이미지입니다그 안에 확인 된 현지화의 어. <ol start="12"><li> 7.6 단계 원하는 경우 다른 검토 매개 변수를 사용하여 다음 단계를 반복 할 데이터를 검사 한 후 (예 : Info.txt 파일 및 히스토그램)으로 돌아갑니다. 단계 7.11에서 &#39;이미지 저장&#39;을 누르면 이전에 저장된 데이터를 덮어 쓰게됩니다. </li></ol> 8. 박스 추적 및 편차 수정 (폭풍우를 사용) <ol><li> 일반적인 방법으로 이미지를 생성하는 7.9 - 7.1 단계를 따릅니다. </li><li> 검토 (그림 1C)의 &#39;상자 추적&#39;버튼을 눌러 클릭하고 검토 된 이미지에 대한이자의 기준 마커 또는 구조에 상자를 드래그합니다. </li><li> 새로운 이미지가 나타날 때까지 &#39;박스형 포지션&#39;(예제 그림의 (b), (c) 및 6 층 참조) 표시되는, 기다립니다. 원하는 경우이 이미지를 저장합니다. </li><li> 관심의 대상이 기준 마커 인 경우, 정정을 표류하는 &#39;하위 다음&#39;설정 앵커 &#39;버튼을 클릭하여 수행 할 수 있습니다요로 드리프트 &#39;버튼을 누릅니다. 마지막으로 &#39;실행 리뷰어&#39;다시 이제 현지화가 기준 마커의 위치에 따라 해결해야 할 새로운 STORM 이미지를 생성합니다. 구슬의 위치는 최종 검토 이미지에서 삭제됩니다. </li><li> 최종 드리프트 보정 된 이미지 내의 다른 기준 마커가있는 경우, 이러한 &#39;상자 추적&#39;을 눌러 제거 할 수있다, &#39;박스형 삭제&#39;를 한 후 원하는대로 &#39;실행 리뷰어&#39;로 여러 번. </li></ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

우리는 몇 가지 간단한 테스트 샘플하고 STORM 최고 해상도의 이미지를 최적화 할 수있는, 자유롭게 사용 가능한 처리 소프트웨어 비바람 보여. 이러한 도구 및 방법은 새로운 사용자와 사용자의 현미경에 대한 자신감과 전례없는 세부 사항을 생물학적, 세포 구조를 연구하기 위해 그들의 사용을 증가하는 숙련 된 사용자를위한 방법에 대한 유용한 시작점을 제공 할 것입니다. 그것은 이미지 품질을 향상시키기 위해 더 큰 신뢰를 갖는 것이 가능하다 보여주는 그러한 평균 정밀 추정 지역화 번호 및 히스토그램으로 유용한 이미지 품질 메트릭의 개수를 생산할 수 알려진 또는 널리 알려진 구조 및 알고리즘과 함께 시료의 조합을 사용하여 STORM 이미징 과정에서. 아무도 크기가 사용될 수있는 다른 상업적 자체 내장 현미경 구성 개수가로 데이터를 획득하는 모든 방법을 적합하지가있다. 또한, influ 수있는 많은 샘플 준비 및 이미지 수집 단계가 있습니다최종 이미지는 따라서 소프트웨어 툴과 테스트 샘플을 갖는 이해와 STORM 이미지 품질을 최적화하는 데 중요합니다 줬어. 또한이 프로토콜은 발생할 수있는 모든 문제를 해결하는 유용한 덜 모호한 방법을 제공 할 수 있습니다. 예를 들어 덱스 트란 시료는 레이저 빔의 오정렬 또는 샘플의 고르지 조도가 있는지 확인하기 위해 매우 유용한 방법이다. 스위칭 버퍼가 어떤 &#39;깜박이&#39;가 도움이 될 것입니다가 있는지 확인하기 위해 매우 간단한 시각적 테스트를 작동하지 않을 우려가있는 경우. 액틴 필라멘트 FWHM 비교를 사용하여뿐만 아니라 드리프트 mislocalization 유물을 강조 해상도를 측정하는 유용한 방법입니다. 그러나, 지역화 기반 수퍼 - 해상도 방법과 같은 노출 시간, 프레임 속도, 레이저 파워 및 화상 처리 방법과 같은 다른 요인에도 불구 민감한 형광 물질 농도가 될 수 있음을 유의해야한다, 그것은 할당 불가 의 해결특히 현미경 모든 이미지는 그 해결책이있을 것이라는 점을 가정합니다. 무엇을 할 수는 있지만, 이러한 평균 현지화 정밀도, 현지화 번호와 같은 해상도의 다양한 측면을 측정하고 27 표류하는 것입니다. 기준 마커는 그들이 할 수있는 모든 실험에 포함되지 않을 수 있더라도, 적어도, 현미경 시스템, 그 환경의 특성과 잘 같은 많은 시간 후에 시작 열 평형에 도달하는 데 필요한 방법으로서 작동 고려 사항을 이해하는데 사용될 수. 이것은 이미지 (43)를 획득되는 동안 샘플 위치를 보정하는 난시 렌즈의 사용 및 피드백 메커니즘을 필요하지만뿐만 아니라 측 방향 드리프트 보정으로서, 기준 마커는, 특성화하기 위해 사용 및 축 드리프트에 대한 정확한 수있다. 상용 최고 해상도 시스템은 일반적으로 안정성 제어 또는 초점 드리프트를 보정하기위한 실제적인 솔루션이 될 수 있습니다 초점 잠금을 메커니즘의 일종을 포함 할 것이다. 이비 구체적으로 염료 직접 또는 보조 항체와 같은 다른 공액 분자를 사용하는 등 덱스 트란과 유리 코팅에 대한 대안 재. 이러한 방법의 한계는 유리에 결합 분자의 개수를 알 수없는 점이다. 사용 된 대체 필라멘트 구조는 미세 소관 (28)와 DNA 21이 (가) 있습니다. 그러나, 매우 작은 크기와 편리한 시판 시약의 조합이 발산 또는 분지 필라멘트의 이격 거리가 또한 시스템 성능 (27)의 유용한 측정 될 수 특별히, 매력적인 대안 악틴 만든다. 테스트 샘플의 발전을위한 공간이 지역 28,29,46,47 최근 진행에도 불구하고 있습니다. 특히, 다색 화상이 촬상 모든 세 주요 측면에서 도전의 개수, 샘플 라벨링 화상 획득 (하드웨어), 소프트웨어 (영상 처리 및 정렬)을 제시한다. 가 있었다출판물 이러한 측면 4-6을 해결하고 적절한 시료 및 방법은 이미지의 이러한 유형을 생성하고 신뢰성 해석에 중요한 것을 따라서 분명하다의 수. 실제로, 최근은 dSTORM는 두 가지 컬러 이미지를 가지고 가고, 해결, 핵 기공 복합체의 높은 대칭성하는 데 사용할 수와 저자는이 색수차 보정 (45)의 성능을 평가하는 이상적인 방법이 될 것이라고 제안 것으로 나타났다. 또 다른 흥미로운 방법은 떨어져 46 특정 하위 회절 거리에 위치 형광체의 가능성을 만들어 nanoruler을 만들 수있는 DNA 종이 접기를 사용하는 것입니다. 이것은 해상도를 평가하고 거리 측정의 제조 방법을 제공한다. 그러나, 궁극적 인 목적은 복잡한 3 차원 구조이다 같은 세포 같은 비 이상화 샘플, 이러한 초 해상 기술을 적용하는 것이다. 이때, t의보다 철저한 이해를 배합그 데이터를 취득하는 적절한 방법으로 처리하고, 화상 메트릭스를 제공 한 사용자를 돕는 소프트웨어 도구와 결합 기법은 궁극적 해답이 될 가능성이있다. 28,29,47,48

최근 광학 현미경 기술의 범위는 일반적으로 회절 한계를 우회하고 100 ㎚ 이상 1,2 나은 해상도의 이미지를 생성 할 수있는 초 - 해상도 현미경 또는 nanoscopy,라고도 개발되었다. 2008 년 올해의 방법 자연 방법 것으로 초 고해상도 현미경의 발표 이후, 현지화 기반 현미경의 개발의 큰 거래되고있다. 예를 들어, 다색 애플리케이션 3-6, 3D 구현 7-12, 심지어 생균 애플리케이션 5,13-17있다. 이 시스템은 세포 생물학의 손에 광학 실험실 밖으로 상용화되고 있으며, 지금 그들의 방법을하고 있습니다 더욱이, 생물 의학 질문에 대한 자신의 사용 및 응용 프로그램에서 더 증가 될 가능성이있다. 이 가족의 한 지점은 이미지 분자에 의해 분자를 구축하여 작동 현지화 기반의 방법입니다. 나는단지 약간 공간적으로 분리 된 분자는 한번에 활성화되도록 이렇게 N 순서는, 샘플 내의 형광 분자의 대부분은 스위치 오프되어야한다. 이 분자는 빠른 속도에 꺼지는 인구의 상당 부분이 서브 회절 정밀도의 기본 구조를 반영하는 이미지가 될 수 있도록 많은 이미지를 촬영하고 있습니다. 방법의 수는 GSDIM 18, PALM 19 fPALM 20, STORM 21 RESOLFT 22 등의 발표되었다. 단일 분자 검출의 위치를 측정하는 알고리즘은 다음 예 rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, 12 palm3d 및 비바람 27, 가우시안 피트 (23)를 사용하여 20 nm의보다 좋은 정밀도로 분자의 실제 위치를 찾는 데 사용될 수있다. 셀 또는 높은 분자 밀도가 다른 생물학적 샘플을 영상화 할 때, 프레임의 수천을 취할 필요가있다이것은, 공간적으로 분리, 깜박 이미지 순서라는 분자의 상당한 부분에 신호. 확률 적 광학 재건 현미경 (STORM)과 매우 관련 dSTORM 및 GSDIM 방법은 상업적으로 이용 가능한 유기 염료 (21)와 함께 작동하도록 입증 된 현지화 기반 슈퍼 확인 방법입니다. 그들은 이후 때문에 특이 형광 현미경을 수행 할 수있는 잘 설립 immunolabeling 방식의 상대적 편익의 방법론은 특히 매력에게 서로 다른 염료의 번호 28 ~ 30에 해당하는 것으로 표시되었습니다. 따라서, 지역화 기반 수퍼 - 해상도 이미징에 사용될 가능성이있는 색소 및 항체 염색 생체 분자 접합체의 범위로 접근이 용이하다. 폭풍과 유사한 방식의 일반적인 원리는 비교적 간단하다, 한눈에 하드웨어 및 샘플 준비는 상대적으로 스트라 보인다 동안ightforward, 품질 이슈없는, 최고 해상도의 이미지를 달성하기위한 중요한 공정 단계들의 수가있다. 모든 현미경 기술과 마찬가지로 처리는 3 가지 주요 단계로 간주 할 수있다 : 첫 번째, 두 번째 샘플 준비, 화상 취득하고, 셋째, 화상 처리 및 / 또는 이미지를 분석 및 해석. 추가 해결 능력과 현지화 기반의 접근 방식을 사용하여 최고 해상도의 이미지를 생성하는 방법은 몇 가지 새로운 문제 및 고려 사항 31-33을 소개합니다. immunolabeling, 일차 및 이차 항체의 조합이 사용되는 특히 간접 면역 형광을 수행 할 때 샘플 준비를 시작으로, 그 형광 염료가 떨어져 그 분자로부터 최대 20 ㎚에있을 수 있다는 것을 주목해야한다. 미세 소관의 경우, 이것은 25 nm의 28, 30의 예상 미세 소관 직경에 비해 35 ~ 50 ㎚의 직경을 초래한다. 또한, 표시 밀도가해야 m고품질의 이미지 (14)를 생성하기 위해 나이 퀴 스트 기준을 EET. 필라멘트 구조를 따라 20 ㎚의 예상 이미지 해상도에 대한 예를 들어 적어도 매 10 나노 27 염료 분자가 있어야합니다. 에 평형 - 많은 염료는 현지화 기반의 염료의 전반적인 성능은 적어도 네 가지 중요한 기준, 이벤트를 전환 당, 즉 검출 된 광자 (밝은이 더 각 깜박임의 밝기)의 혼합이다 접근을 위해 일에 게시 된 반면 오프 듀티 사이클 (국가에 비해 떨어져있는 염료의 명암비 - 오프 더 일반적으로 더 나은), 생존 분획 (낮은 표백 속도가 더 낫다) 및 스위칭주기의 수 (형광 당 깜박의 수 - 더 형광 당 깜박임)이 분자 계산을 위해 장점이 될 수 있지만, 높은 해상도를 위해 더 낫다. 상황은 더 이상 특정 염료에 대한 이러한 속성은 다른 버퍼 조건이 다를 수 있다는 사실에 의해 복잡레이저 전원 (28, 29)와 함께. 또, 물론 이들 고유 STORM 고려로서, 화질이 정착 조건의 변형 및 급냉 시약의 사용에 의해 자기 형광을 최소화하여, 예를 들어 전통적인 형광 현미경 기술과 동일한 방식으로 샘플 준비를 최적화함으로써 개선 될 수있다. 또한, 비특이적 결합 형광체를 최소화 라벨 농도, 배양 시간 및 차단 및 세척 단계를 조정함으로써 수행 될 수있는 것이 중요하다. 화상 획득의 두 번째 단계는 매우 중요하다. 현미경의 최적 설정은 염료, 버퍼 상태, 레이블링 밀도 및 샘플 타입, 유리, 세포 또는 조직 샘플에서 예를 들어 단층에 의존 할 것이다. 주요 고려 사항은 카메라 노출 시간, 프레임 번호, 조명 각 (TIRF, HILO, 에피) 및 레이저 파워이다. 목표는 가능한 한 빨리 많은 밝은 공간적으로 분리 깜박를 수집하는 것입니다. 만약 배경 I재구성 알고리즘이 정확하게 위치를 지역화 할 수 없을 것이며, 매우 높은 발 또는 점멸은 매우 밝지 않다 즉 신호 대 잡음비가 좋지 않습니다. 뿐만 아니라 측정 할 수있는 각 분자의 위치와 정확성, 즉 지역화 정밀도를 극대화로, 이미지 품질도 현지화의 높은 수에 따라 달라집니다. 또한 분자의 수가 충분하지가 묘화되는 경우에는 나이키 스트 기준 14,27을 충족하지 않으므로, 어느 빈약 라벨링 효율 과도한 광표백 또는 불충분 프레임 번호로 다음 결과 초해 콘텐츠 점상 불연속 것 . 그리고 마지막 세 번째 단계, 화상 처리는, 표준 형광 현미경 기술과 비교하여 특히 중요하다. 그것은 w를 알고 혼란 스러울 수 있다는 점에서 선택의 측면에서 장점과 단점이 둘 다 자유롭게 상업적으로 이용 가능한 알고리즘의 범위가있다HICH는 사용하기에 가장 적합합니다. 예를 들어, 원시 데이터가 공간적으로 구별 깜박 잘 간격 경우 다음 단일 분자 피팅 알고리즘은 폭풍우 27에서 사용할 수있는 스파 스 피팅 알고리즘에 의해, 예를 들어, 매우 정확하고 효율적으로 할 수있다, rapidSTORM (24, 25)는 QuickPALM 26 소프트웨어 (12)를 palm3d 및 . 원시 데이터가 다음 더 적합 할 수 있습니다 알고리즘을 신호를 중복이 많이 포함되어있는 경우 DAOSTORM (34), (b) 35 deconSTORM 36 (가) 있습니다. 더욱이, 이러한 알고리즘은 그러한 신호 카운트 또는 깜박임 당 광자뿐만 아니라, 평활화 가우시안 함수로 시각화로서 또는 초해 픽셀 크기가 될 수있는 픽셀 그리드와 히스토그램 같은 각종 다른 이미지 디스플레이 옵션과 같은 다양한 기준에 대한 임계 값을 포함 사용자에 의해 선택된. 이러한 모든 옵션은 최종 이미지의 모양을 변경하고 이미지의 해석과 분석에 영향을 미칠 수있다. <p class="jove_content"&gt; 따라서 우리는 명확성을 위해 우리가 폭풍을 참조한다 염료 기반의 현지화 기반의 슈퍼 해상도 실험하고, 더 경험이있는 기회에 대한 출발점으로 새 사용자를 제공 할 것입니다 3 테스트 샘플을 제시 더 이상 자신의 실험을 최적화 할 수 있습니다. 첫째, 코팅하는 덱스 트란 염료 접합체의 형광체 층으로 유리 표면 가능하다. 이 현미경, 염료 및 버퍼 형광 신호를 점멸 생성하기 위해 노력하고 있음을 설정하는 빠르고 간단한 방법을 제공합니다. 방법은, 버퍼의 조건을 최적화 화상 획득 설정 및 다른 염료를 테스트하는 비바람에 의해 생성 된 평균 지역화 정밀도 및 개수 메트릭과 비교하여 확장 될 수있다. 둘째, 우리는 쉽게 phalloidin도 염색 복합체를 사용하여 표시 할 수 있습니다 유리에 액틴 필라멘트를 제조하는 간단한 프로토콜을 제시한다. 이 해상도 27 일반적으로 전체 폭의 절반 최대 (FWHM)의 측정을 수행하는 이상적인 구조를 제공의 필라멘트는 해상도 (37)의 경험적 추정치로 주어진다. 그것은 지역화 기반 수퍼 - 해상도 현미경 해상도 형광 광도, 배경 잡음 및 지역화 밀도 (27)의 함수이며, 이들 시험편에 걸쳐 반드시 일정하지 않기 때문에 해상도는 샘플 사이와 동일한 샘플 내의 이미지 사이에서 변화 주목해야한다. 액틴 필라멘트와 같은 mislocalizations 잠재적 이슈를 설명하고 표류하는 데 사용하고 그들이 폭풍우 내에서 소프트웨어의 기능을 식별 할 수있는 방법을합니다. 더욱이, 우리는 측정 및 올바른 드리프트 모두에 형광 기준 마커의 사용을 설명한다. 셋째, 표피 성장 인자 (EGF) - 염료 접합체와 세포의 염색을 설명한다. 세포 표면 수용체의 비율은 약 50 ~ 150 N의 서브 회절 크기의 구조이다 소체를 통해 엔도 시토 시스를 겪는다 때문에 EGF는, 초 - 해상도 이미지 성능의 유용한 지표를 제공한다직경 27,38,39에서 m.

<table><tbody><tr><td>Labtek 이미징 챔버 유리</td><td>Fisher</td><td>CBR-166-390E</td><td>시료 준비</td></tr><tr><td>도립 현미경 </td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>* 대안은 아래 참조</td></tr><tr><td>100 X TIRF 대물 렌즈</td><td>Olympus</td><td>UAPON 100XOTIRF</td><td>* 대안은 아래 참조</td></tr><tr><td>EMCCD 카메라</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>* 대안은 아래 참조</td></tr><tr><td>640nm 레이저</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td>*150 mW - Alexa 647 또는 Cy5 염료 이미징용</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>*수집 소프트웨어(하드웨어 제어)</td></tr><tr><td>PC </td><td>Dell</td><td></td><td>Windows XP(64비트), Intel Xeon E5420 CPU, 16GB RAM *기기 제어 및 이미지 처리</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>이미지 분석 및 처리 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>rainSTORM</td><td>Laser Analytics Group (Cambridge) 소프트웨어</td><td></td><td><a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources" target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources</a></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Running rainSTORM</td><td></td><td><a href="http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/" target="_blank">http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/</a></td></tr><tr><td>*자체 제작 STORM/PALM 현미경</td><td></td><td></td>의 예 <td>참조 29도 참조 <a href="http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope" target="_blank">http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope</ 참조 a></td></tr><tr><td>*상업용 STORM/PALM 초고해상도 현미경</td><td></td><td></td><td>Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze(Monet Localization) 자체 제작 현미경의 대안</td></tr><tr><td colspan="4">Table 1. 재료 및 장비 </td></tr><tr><td colspan="4">[헤더]</td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Fisher</td><td>VX70013065</td><td>1; 2; 3; 4</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td>1.1; 2.1</td></tr><tr><td>Dextran-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>D-22914</td><td>1.2</td></tr><tr><td>General actin buffer</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>BSA01</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Preformed-actin filaments</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>AKF99</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Phallodin-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>2.2</td></tr><tr><td>TetraSpeck 마이크로스피어(0.1 미크론)</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>3.1</td></tr><tr><td>HeLa 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>4.1</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher</td><td>VX31966021</td><td>4.1</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>VX10500064</td><td>4.1</td></tr><tr><td>Pen/Step</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td>4.1</td></tr><tr><td>플라스틱 접시</td><td>Invitrogen</td><td>734-0006</td><td>4.1</td></tr><tr><td>EGF - Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>E35351</td><td>4.3</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>4.3, 4.4</td></tr><tr><td>포름 알데히드 - 10 % 용액 EM grade</td><td>Polysciences</td><td>04018-1</td><td>4.2</td></tr><tr><td>카탈라제</td><td>시그마</td><td>C100</td><td>5.1</td></tr><tr><td>포도당 산화 효소</td><td>시그마</td><td>G2133</td><td>5.1</td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P9541</td><td>5.1</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>시그마</td><td>C4706</td><td>5.1</td></tr><tr><td>트리스</td><td>시그마</td><td>93352</td><td>5.1</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마</td><td>C7528</td><td>5.2</td></tr><tr><td>MEA-HCl</td><td>시그마</td><td>M6500</td><td>5.3</td></tr><tr><td>글리세린</td><td>시그마</td><td>G2289</td><td>5.1; 5.2</td></tr><tr><td colspan="4">표 2. 시약</td></tr></tbody></table>

최적화 storm 슈퍼 해상도 현미경에 대한 테스트 샘플

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM 표준 형광 현미경 기술보다 최대 10 배 더 좋은 해상도로 최근에 개발 된 초 고해상도 현미경 기술이다. 이미지가 이미지 분자에 의해 분자를 구축하여, 평소보다 매우 다른 방식으로 획득 그러나, 자신의 이미지 수집을 최적화하기 위해 노력하고있는 사용자에 대한 몇 가지 중요한 문제가 있습니다. 이 과정을 돕고 STORM 우리가 3 시료의 준비와 30 ~ 50 나노 미터 사이의 일반적인 해상도가 최고 해상도의 이미지를 수집하고 처리 STORM의 방법론을 제시 작동하는 방법에 더 많은 통찰력을 얻기 위해. 개방 비바람 처리 소프트웨어를 이용하여 시험 샘플을 조합하여 이미지 품질 및 해상도에 대한 많은 정보를 얻을 수있다. 이러한 메트릭을 사용하여 그 제제, 염료의 선택, 버퍼 상태, 및 화상 획득 설정을 샘플링하기 위해, 광학 이미징에서 절차를 최적화하는 것이 가능하다. 우리이러한 이미지 수집 및 밀도 동안 시료가 이동 &#39;mislocalization&#39;현상이 발생하는 문제를 관련 측면 드리프트, 가난한 이미지 품질이 저하 될 몇 가지 일반적인 문제의 lso의 예를 보여줍니다.

우리는 세 개의 시험 샘플의 제조 방법들이 최적화 STORM 현미경의 성능을 평가하는 데 사용될 수를 기술한다. 이 예제를 사용하여 우리는 원시 데이터를 수집 한 후 약 30 ~ 50 nm의 해상도의 세포에서 최고 해상도의 이미지를 얻기를 처리하는 방법을 보여줍니다.

최적화 STORM 슈퍼 해상도 현미경에 대한 테스트 샘플

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

이 절차의 전반적인 목표는 고품질의 STORM 초해상도 이미지를 획득하는 방법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 형광 표지된 테스트 샘플을 준비합니다. 다음 단계로는 스위칭 버퍼를 준비한 후, 이미징 챔버를 해당 버퍼로 채웁니다.다음으로, STORM 현미경을 통해 원시 데이터를 획득합니다. 마지막 단계는 RainStorm 처리 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터로부터 초고해상도 이미지를 재구성하는 것입니다. 최종적으로, 테스트 샘플을 통해 고품질의 원시 데이터를 획득하는 방법을 보여주며, 이를 처리하여 TIRF 및 공초점 현미경을 포함한 기존 형광 현미경 기술보다 5~10배 향상된 30~50 nm 분해능의 세포 내 STORM 초고해상도 이미지를 생성할 수 있습니다.일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 양질의 희소 링크(sparse links)를 충분히 수집하는 것이 얼마나 중요한지 인식하지 못해 어려움을 겪습니다. 이는 적절한 스위칭 버퍼와 함께 Alexa 647 염료를 사용함으로써 훨씬 수월해집니다. 고품질의 원천 데이터를 확보하는 것이 SPR 해상도 이미지를 생성하는 데 결정적이므로, 이 기술에 대한 시각적 시연이 필수적입니다.이 기술의 원본 비디오 시퀀스는 다른 형태의 형광 현미경 영상과는 완전히 다르게 보입니다. 유리를 형광 덱스트린으로 코팅하는 절차를 시작하려면, 8개의 챔버가 있는 커버 글라스의 각 웰에 0.01% polylysine 용액 200 µL를 넣고 10분 동안 배양하십시오. 10분 후, 피펫을 사용하여 polylysine 용액을 제거함으로써 액체가 남아있지 않도록 하십시오.고밀도 dextrin Alexa 647 코팅 용액을 만들기 위해, 2 mg/mL 농도의 dextrin Alexa 647 스탁 용액 0.25 µL를 탈이온수 25 µL에 첨가하여 20 µg/mL 용액을 제조합니다.20 µg/mL 용액 20 µL를 탈이온수에 희석하여 총 부피를 200 µL로 맞춥니다. 중간 밀도 용액의 경우, 2 µL를 탈이온수 200 µL에 희석합니다. 저밀도 용액의 경우에는 0.2 µL를 희석합니다.탈이온수 200 µL가 담긴 각 웰에 희석된 dextrin Alexis X 47 용액 200 µL를 첨가하고 10분 동안 배양합니다. 더 긴 배양 시간을 사용할 수 있으며, 이 경우 덱스트린 코팅이 더 조밀해질 수 있습니다. 마지막으로 Dexter Xis X 47 용액을 제거하고 물로 3회 세척합니다.유리 위에 형광 액틴 필라멘트를 준비하려면, 먼저 8챔버의 각 웰에 0.01% polylysine 용액 200 µL를 넣습니다. 커버 글라스를 덮고 10분 동안 배양합니다. 액체가 남지 않도록 피펫으로 제거합니다.제조업체의 지침에 따라 미리 재구성한 일반 액틴 완충액(general actin buffer) 90 µL를 각 챔버에 넣습니다. 그런 다음 10 µM의 미리 형성된 액틴 필라멘트 용액 10 µL와 Alexa 647이 결합된 폴리머 1 µL를 추가하고, 피펫으로 가볍게 위아래로 섞어줍니다. 상온에서 30분 동안 배양하여 기준 마커로 사용할 마이크로구체 형광 비드를 준비합니다. 테펙 비드(tepec beads) 1 µL를 200 µL의 PBS에 희석하고 섞습니다. 희석된 비드를 이미징 챔버에 넣고 15분 동안 기다립니다.15분 후, 용액을 제거하고 PBS로 3회 세척한 다음 세포를 이미지화합니다. 이 실험에는 약 80%의 밀도로 배양된 세포가 사용됩니다. 배양액을 제거하고 PBS로 세척합니다. 그다음 4% formaldehyde 용액 500 µL를 첨가하고 10분 동안 처리합니다.포름알데하이드를 제거하고 PBS로 3회 세척합니다. 세포가 건조해지지 않도록 하며 항상 PBS 완충 용액을 사용하십시오. 저삼투압 스트레스를 방지하기 위해, 50 µg/mL 농도의 EGF Alexa 647 스톡 용액 2 µL를 0.1% BSA 용액 200 µL에 추가한 후, 이 용액을 HeLa 세포에 첨가합니다.실온에서 30분 동안 배양합니다. 용액을 제거하고 PBS로 3회 세척합니다. 0.1% BSA 블로킹 용액을 첨가하고 실온에서 15분 동안 둡니다.그 후, 블로킹 솔루션을 제거하고 이미징 전 PBS로 3회 더 세척합니다. 이미징 직전에 효소 글루코스 및 환원제 스톡 솔루션을 50 µL, 400 µL, 100 µL의 비율로 혼합하여 스위칭 버퍼를 준비하고, 최종 부피가 1 mL가 되도록 PBS를 추가합니다. 이미징 챔버에서 PBS를 제거한 다음, 스위칭 버퍼를 상단까지 채웁니다.커버슬립을 챔버 상단에 조심스럽게 덮고, 기포가 전혀 없으며 챔버 전체가 덮였는지 확인하십시오. 기포가 보이면 버퍼 또는 PBS를 추가로 채우십시오. 그렇지 않으면 버퍼의 성능이 저하될 수 있습니다.이 절차의 성공을 위해서는 고품질의 희소 연결 데이터를 수집하는 것이 필수적이므로, 현미경의 초점이 적절히 맞았는지와 정확한 획득 설정이 사용되었는지 확인하십시오. 이미징할 관심 형광 구조를 찾으십시오. 원하는 조명 각도를 선택하십시오.이 경우, 초점이 맞지 않는 빛을 최소화하여 신호 대 잡음비를 개선하므로 터프(turf) 또는 매우 가파른 각도를 권장하며, 이는 특히 세포 시료에 유용합니다. STORM 이미징을 수행하기 전, 구조의 분해능 제한 이미지(diffraction limited image)를 참조용으로 촬영하십시오. 카메라 설정을 10 millisecond 노출과 약 50 hertz 또는 초당 프레임 수의 사이클 시간으로 설정하여 이미징하는 동안, 여기 레이저를 약 2 kilowatts per centimeter squared에 해당하는 고출력으로 높이십시오.Flora fours가 희소 깜빡임 패턴(sparse blinking pattern)으로 전환되면, 10,000프레임을 수집하십시오. 재구성을 시작하려면, MATLAB 내에서 RAINSTORM M 파일을 열고 rainstorm 창에서 실행하십시오.찾아보기 버튼을 사용하여 분석할 이미지 파일을 선택하십시오. 파일은 TIF 형식이어야 합니다. 픽셀 너비를 데이터 수집에 사용된 현미경 시스템의 원본 데이터와 일치하도록 변경하십시오.나머지 값들은 기본값으로 둡니다. process images 버튼을 누르고 예비 이미지가 나타날 때까지 기다립니다. 처리 시간은 파일 크기, 컴퓨터 사양 및 원시 데이터 내의 후보 링크 수에 따라 달라집니다.최신 초해상도 이미지를 생성하려면 open reviewer 버튼을 누르십시오. 그러면 두 번째 창이 나타납니다. 원하는 대로 이미지 표시를 변경하려면 adjust contrast 버튼을 누르십시오. 이미지가 매우 어두운 일부 경우에는 최대값을 낮추어야 합니다.리뷰어 창을 사용하여 유용한 이미지 품질 메트릭을 생성하고 초고해상도 이미지를 더욱 정밀하게 개선하십시오. 처음 세 가지 품질 관리 파라미터는 각각 기본값인 5,000, 0.1 및 0.8에서 3.5로 유지하십시오. 광자당 카운트(counts per photon) 값을 업데이트하십시오.평균 국소화 정밀도와 국소화 횟수 사이의 균형을 최적화하기 위해 국소화 정밀도 컷오프 값을 조정하십시오. 최종 이미지의 경우, 데이터와 샘플의 품질에 따라 30에서 50 nanometers 사이의 값을 권장합니다. 재구성 배율 인수의 기본값은 5이며, 원본 이미지의 픽셀이 160 nanometers라고 가정할 때 32 nanometers의 초해상도 픽셀을 생성합니다.원본 이미지의 픽셀 크기가 100 nanometers인 경우, 픽셀 크기가 20 nanometers인 초고해상도 이미지가 생성됩니다. 배율 인자(scale factor)를 높이면 더 작은 초고해상도 픽셀을 생성할 수 있습니다. 최종 이미지에서 run reviewer 버튼을 눌러 업데이트된 초고해상도 이미지를 생성하십시오.이미지 품질 지표를 표시하려면 히스토그램 보기 버튼을 누르십시오. 마지막으로, 이 모든 데이터를 저장하려면 리뷰어의 이미지 저장 버튼을 누르십시오. 이전에 시연한 방식과 동일하게 이미지를 생성하여 이 절차를 시작하십시오.리뷰어의 박스 추적 버튼을 누른 다음, 검토 중인 이미지의 피듀셜 마커 위에 박스를 클릭하여 드래그하십시오. 박스 표시 위치가 나타나는 새 이미지가 표시될 때까지 기다리십시오. 관심 대상이 피듀셜 마커인 경우, 원한다면 이 이미지를 저장하십시오.여기와 마찬가지로, 'set anchor' 버튼을 클릭한 후 'subtract drift' 버튼을 클릭하여 드리프트 보정을 수행합니다. 마지막으로 'run reviewer'를 다시 클릭하여 새로운 STORM 이미지를 생성합니다. 덱스트린 코팅이 성공적으로 이루어지면 형광 단분자층이 형성되며, 전형적인 덱스트린 데이터가 이 그림에 표시되어 있습니다.회절 한계 영상은 STORM 이미징 전의 서로 다른 덱스트린 농도를 보여줍니다. 초고해상도 재구성 영상의 픽셀 크기는 25 nanometers입니다. 128 by 128 픽셀 프레임 크기로 총 10,000장의 영상을 수집하였으며, 해당 시퀀스에서 추출한 개별 프레임들이 표시되어 있습니다.높은 덱스트린 농도에서는 이 이미지들과 비디오 세그먼트에서 보여주는 것처럼 형광 단분자층이 비교적 균일하게 나타나야 합니다. 낮은 농도에서는 깜빡임이 더 드물게 나타나며 초점이 맞게 보일 것입니다.일정한 레이저 조사 하에 이미지 획득 단계에서 뚜렷한 배경 신호가 없는 경우, 고밀도 시료의 프레임 2000과 프레임 8,000의 비교에서 알 수 있듯이 깜빡임 횟수가 시간이 지남에 따라 감소합니다. 고, 중, 저 농도의 덱스트린 초고해상도 이미지 간의 주요 차이점은 국소화 횟수가 감소한다는 점입니다. 이 그래프는 각 덱스트린 농도에 대해 10,000프레임 시퀀스 3회의 평균값을 나타내며, 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다.하지만, 원시 데이터 내 형광 분자의 농도, 깜빡임 횟수 및 국소화 횟수 사이의 이러한 비례 관계는 프레임당 수용된 국소화 횟수를 나타내는 이 그래프에서 알 수 있듯이 단순한 선형 관계가 아닙니다. 매우 높은 분자 밀도에서 100프레임 이동 평균을 사용하면, 소프트웨어가 어떤 샘플을 이미징하더라도 분자를 성공적으로 국소화하지 못할 수 있습니다. 흔히 발생하는 문제로는 매질을 통해 확산되는 형광 물질로 인해 이미지 전체에 밝지만 초점이 맞지 않는 형광 헤이즈가 나타나는 경우가 있습니다.이러한 분리된 형광 분자들은 스위칭 버퍼를 추가하기 전 PBS 세척 단계를 늘리거나, 챔버에 신선한 스위칭 버퍼를 추가하여 방지 또는 제거할 수 있으며, 각 이미지 시퀀스의 데이터를 처리하고 비교하면 매우 상이한 초고해상도 이미지가 생성됩니다. 패널 C와 D는 각각 패널 A와 B에서 수집된 데이터에 해당하는 초고해상도 이미지 구성입니다. 이 그래프는 100프레임 이동 평균을 사용하여 프레임당 허용된 로컬라이제이션 횟수를 나타냅니다.빨간색 선은 배경 신호가 높은 스톰 시퀀스 A와 C에 해당하며, 파란색 선은 배경 신호가 낮은 B와 D에 해당합니다. 높은 배경 신호와 낮은 배경 신호 데이터에 해당하는 이미지의 인정된 국소화 횟수가 두 번째 그래프에 표시되어 있습니다. 이 세 개의 회절 한계 이미지는 스위칭 버퍼 첨가 및 스톰 이미징 전에 유리 표면에 부착된 미리 형성된 액틴 필라멘트의 전형적인 데이터를 보여줍니다.다양한 길이의 필라멘트가 관찰될 수 있습니다. 매우 밝은 필라멘트는 종종 여러 개의 필라멘트가 서로 엉켜 있는 경우입니다. 엉킨 부위보다는 상대적으로 밝은 단일 필라멘트를 선택하는 것이 획득 단계에서 더 고품질의 이미지를 얻는 방법입니다.필라멘트의 전체 길이를 따라 초점이 뚜렷한 깜빡임이 관찰되어야 합니다. 획득 단계와 이후의 프로세스 데이터에서는 드문드문 깜빡임이 보여야 합니다. 가느다란 연속 필라멘트가 나타나야 하며, 프레임당 국소화 횟수는 점진적으로 감소하는 양상을 보여야 합니다.일반적으로 필라멘트의 반치폭(FWHM)은 Image J의 플롯 프로필 기능을 사용하여 확대된 액틴 필라멘트 영역에 직선을 긋고 가우스 피팅(Gaussian fit)을 수행함으로써 해상도의 경험적 추정치로 제시됩니다. FWHM은 43.2 nanometers로 계산됩니다. 프레임의 하위 집합을 처리하고 처음과 마지막 5,000 프레임을 비교함으로써, 다수의 액틴 필라멘트가 분지하거나 서로 교차함에 따라 위치 지정 오류(mislocalization) 문제가 발생할 수 있습니다.처음 5,000 프레임을 사용하여 생성한 초고해상도 이미지에서는 다른 결과가 나타납니다. 이미지 중앙에 많은 국소화 지점들이 관찰됩니다. 그러나 마지막 5,000 프레임을 사용했을 때는 이러한 국소화 지점이 거의 나타나지 않으며, 이미지 내 국소화 지점의 수가 적기 때문에 다소 불연속적이지만 필라멘트 구조만 남게 됩니다.블링크 밀도가 너무 높다고 의심되는 경우, 프레임당 국소화(localization) 데이터와 이미지를 비교하면 첫 번째 프레임 세트 동안 이 문제가 발생하고 있음을 강력하게 시사할 수 있습니다. 마지막 프레임 세트에서는 프레임당 평균 국소화 횟수가 약 4회인 반면, 여기서는 10회를 초과합니다. STORM 현미경 검사에서 발생할 수 있는 또 다른 잠재적 문제는 드리프트(drift)로, 이는 시료가 대물렌즈에 대해 이동할 때 발생합니다. 데이터 획득 단계에서는 이미지 획득 단계 중에 감지하기 매우 어렵지만, actin 필라멘트와 같이 알려진 구조의 초해상도 이미지에서 드리프트를 감지할 수 있습니다.측방 드리프트(lateral drift)가 발생했을 가능성을 보여주는 첫 번째 징후는 구조체가 예상보다 크게 나타나는 것입니다. 예를 들어, rainstorm의 정밀도 한계 데이터와 비교했을 때 반치폭(full width at half maximum)이 상대적으로 더 큰 경우이며, 본 사례에서는 67 nanometers 대비 90 nanometers로 나타났습니다. 드리프트를 탐지하는 더 나은 방법은 시간의 함수로 국소화(localization)를 비교하는 것, 즉 후반부 프레임의 국소화 지점이 초반부 프레임과 비교하여 변위되었는지 확인하는 것입니다.이는 색상 코드로 표시된 액틴 필라멘트의 사례에서 명확하게 확인할 수 있습니다. 패널 B와 C에 표시된 것과 같이 rainstorm의 박스 추적 기능을 사용하면, 획득된 프레임 번호에 해당하는 색상으로 로컬라이제이션이 표시됩니다. 예를 들어, 획득 시퀀스의 초기 단계에서 얻은 로컬라이제이션은 파란색으로, 획득 시퀀스의 후기 단계에서 얻은 로컬라이제이션은 빨간색으로 표시됩니다.어긋난 색상은 측정 및 보정이 필요한 드리프트가 발생했음을 나타냅니다. 드리프트 측정을 위해 직경 100 nanometer의 형광 비드를 기준 표식(fiducial markers)으로 사용할 수 있으며, 1번부터 4번까지는 각각 자르고 확대한 비드의 모습을 보여줍니다. 획득 단계 동안 3분 10초에 걸쳐 약 100 nanometers의 비교적 심한 드리프트가 발생한 예시에서, 동일한 박스 추적 기능을 사용하여 색상 코드를 부여하고 드리프트 발생 여부를 확인할 수 있습니다. 이 예시에서는 네 개의 비드 모두 거의 동일한 드리프트를 보였으므로, 이 중 하나(여기서는 2번 비드)를 기준점으로 선택하여 다른 비드들에서 드리프트를 뺄 수 있습니다.패널 E와 비교하면 측방 드리프트(lateral drift)가 보정되었음을 알 수 있습니다. 마지막으로, 상피세포 성장인자(epidermal growth factor)로 염색된 HeLa 세포를 사용하여 이미지 해상도의 실제 사례를 제시할 수 있습니다. 세포의 경우, 패널 A는 기저 세포 표면에 초점을 맞춘 HeLa 세포 일부의 회절 한계 이미지(diffraction limited image)를 보여주며, 여기서 노란색 상자는 패널 B와 C에 확대하여 나타낸 관심 영역을 나타냅니다. 이는 회절 한계 이미지에서 관심 영역이 불분명하게 확대된 것과 대조적입니다.초고해상도 이미지는 클러스터와 간헐적으로 고립된 단일 픽셀이 혼합된 형태를 보여야 합니다. 클러스터의 직경은 약 100 nanometers이며, 이는 형성 중인 피트(pit) 및 소포(vesicle)에 해당할 가능성이 높습니다. EGF가 주로 하향 조절되고 내포 작용(endocytosis)되는 경로와 패널 D의 프레임당 위치 데이터가 그래프 G에 제시되어 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 간단한 테스트 샘플을 제작하고, 데이터를 획득하며, 고품질의 STORM 초고해상도 이미지를 재구성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이러한 방법들은 드리프트와 같은 일반적인 피팅 오류를 방지하고 STORM을 최적화하는 데 도움이 됩니다. 해상도 실험을 참조하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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