최적화 STORM 슈퍼 해상도 현미경에 대한 테스트 샘플

이 절차의 전반적인 목표는 고품질 폭풍우 초고해상도 이미지를 획득하는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 먼저 형광 표지된 테스트 샘플을 준비하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 스위칭 버퍼를 준비한 다음 이미징 챔버를 버퍼로 채우는 것입니다.

다음으로, 원시 데이터는 폭풍 현미경에서 획득됩니다. 마지막 단계는 폭풍우 처리 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터에서 초고해상도 이미지를 재구성하는 것입니다. 궁극적으로, 테스트 샘플은 고품질 원시 데이터를 획득하는 방법을 보여주는 데 사용되며, 이를 처리하여 30-50나노미터 사이의 해상도를 가진 세포에서 폭풍 초해상도 이미지를 생성할 수 있으며, 이는 잔디 및 공막을 포함한 기존 형광 현미경 기술에 비해 5-10배 해상도 향상을 나타냅니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 고품질의 희소 링크를 많이 수집하는 것의 중요성을 깨닫지 못하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 올바른 스위칭 버퍼에서 Alexa 6 4 7 염료를 사용하면 훨씬 쉬워집니다. SPR 해상도 이미지를 생성하는 데 고품질 원시 데이터를 획득하는 것이 중요하기 때문에 이 기술의 시각적 시연이 필수적입니다.

이 기술의 원시 비디오 시퀀스는 다른 형태의 형광 현미경 검사와 완전히 다르게 보입니다. 8 개의 챔버 커버 유리의 각 웰에 200 마이크로 리터의 0.01 % 폴리 리신 용액으로 형광 덱스트린으로 유리를 코팅하는 절차를 시작하고 10 분 동안 배양합니다. 10분 후 피펫으로 폴리리신 용액을 제거하여 액체가 희석되지 않도록 합니다.

0.25 마이크로 리터의 밀리리터 당 2 밀리그램의 덱스트린 원액. Alexa 6 47을 25마이크로리터의 탈이온수에 넣어 밀리리터당 20마이크로그램 용액을 만들어 덱스트린의 고밀도 코팅을 만듭니다. Alexa 6 47 솔루션.

20마이크로리터의 밀리리터 용액 20마이크로리터를 총 200마이크로리터의 탈이온수에 희석합니다. 중간 밀도 용액의 경우 200마이크로리터의 탈이온수에 2마이크로리터를 희석합니다. 저밀도 용액의 경우 0.2 마이크로 리터를 희석하십시오.

200마이크로리터의 탈이온수에 희석된 덱스트린 Alexis X 47 용액 200마이크로리터를 각 웰에 넣고 10분 동안 배양합니다. 더 긴 배양 시간을 사용할 수 있으며, 이로 인해 더 조밀한 덱스트린 코팅이 발생할 수 있습니다. 마지막으로 Dexter Xis X 47 용액을 제거하고 물로 세 번 씻습니다.

유리에 형광 액틴 필라멘트를 준비하려면 먼저 8 개의 챔버의 각 웰에 200 마이크로 리터의 0.01 % 폴리 리신 용액을 첨가하십시오. 유리를 덮고 10분 동안 배양합니다. 액체가 남아 있지 않도록 피펫으로 제거하십시오.

각 챔버에 90 마이크로리터의 일반 액틴 완충액을 제조업체의 지침에 따라 이전에 재구성했습니다. 그런 다음 10마이크로몰의 프리폼된 액틴 필라멘트 용액 10마이크로리터와 1마이크로리터 포이드 및 Alexa 6 47을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합하고, 실온에서 30분 동안 배양하여 1마이크로리터의 테펙 비드를 200마이크로리터 PBS로 희석하여 혼합합니다. 희석된 비드를 이미징 챔버에 넣고 15분 동안 기다립니다.

15분 후, 용액을 제거하고 PBS로 3회 세척한 후 이미징 전에 약 80%co fluency로 배양된 세포를 본 실험에 사용합니다. 배양 배지를 제거하고 PBS로 세척합니다. 그런 다음 500 마이크로 리터의 4 % 포름 알데히드 용액을 10 분 동안 첨가합니다.

포름알데히드를 제거하고 PBS로 3회 세척합니다. 세포가 건조한 상태로 유지되지 않도록 하고 항상 PBS 완충 용액을 사용하십시오. 저장성 스트레스를 피하려면 EGF Alexa의 밀리리터당 50마이크로그램 스톡 용액 2마이크로리터, 0.1%BSA 용액 6 47-200마이크로리터를 첨가한 다음 이 용액을 헬라 세포에 첨가합니다.

실온에서 30분 동안 배양합니다. 용액을 제거하고 PBS로 세 번 씻으십시오. 0.1%BSA의 차단 용액을 넣고 실온에서 15분 동안 그대로 둡니다.

그 후, 차단 용액을 제거하고 이미징 전에 PBS로 3회 더 세척합니다. 이미징 직전에 효소 포도당과 환원제 원액을 50마이크로리터, 400마이크로리터 및 100마이크로리터의 비율로 혼합하여 PBS를 추가하여 최종 부피를 1ml로 구성하여 스위칭 버퍼를 준비합니다. 이미징 챔버에서 PBS를 제거한 다음 스위칭 버퍼로 상단까지 채웁니다.

챔버 상단에 커버 슬립을 조심스럽게 놓고 기포가 전혀 없고 챔버 전체가 덮여 있는지 확인합니다. 기포가 보이면 추가 버퍼 또는 PBS를 보충하십시오. 그렇지 않으면 버퍼 성능이 저하될 수 있습니다.

이 절차의 성공에는 고품질의 희박한 연결 데이터를 수집하는 것이 필수적이므로 현미경의 초점이 적절하게 맞춰지고 올바른 획득 설정이 사용되는지 확인하십시오. 이미징할 관심 형광 구조를 찾습니다. 원하는 조명 각도를 선택합니다.

이 경우 잔디 또는 고도로 기울어진 각도가 권장되는데, 이는 초점이 맞지 않는 빛을 최소화하여 신호 대 잡음비를 개선하므로 세포 샘플에 특히 유용합니다. 폭풍 이미징 전에 구조물의 분획 제한 이미지를 참조합니다. 여기 레이저를 제곱센티미터당 약 2킬로와트에 해당하는 고출력으로 증가시키는 동시에 10밀리초 노출의 카메라 설정과 약 50헤르츠 또는 초당 프레임의 사이클 시간으로 이미징합니다.

플로라 4가 드문드문 깜박이는 패턴으로 전환되면 10, 000 프레임을 수집합니다. 이 재구성을 시작합니다. MATLAB에서 RAINSTORM M 파일을 열고 rainstorm 창에서 실행합니다.

찾아보기 버튼을 사용하여 분석할 이미지 파일을 선택합니다. TIF 파일이어야 합니다. 데이터를 획득하는 데 사용된 현미경 시스템의 원시 데이터와 일치하도록 픽셀 너비를 변경합니다.

다른 값은 기본값으로 둡니다. 이미지 처리 버튼을 누르고 예비 이미지가 나타날 때까지 기다립니다. 처리 기간은 파일 크기, 컴퓨터 사양 및 원시 데이터 내의 후보 링크 수에 따라 달라집니다.

업데이트된 초고해상도 이미지를 생성하려면 열린 검토자 버튼을 누르면 두 번째 창이 나타납니다. 대비 조정 버튼을 눌러 이미지 표시를 원하는 대로 변경합니다. 이미지가 매우 어두운 경우에는 최대값을 줄여야 합니다.

reviewer 창을 사용하여 유용한 이미지 품질 메트릭을 생성하고 초고해상도 이미지를 더욱 구체화할 수 있습니다. 처음 세 개의 품질 관리 매개 변수를 각각 기본값인 5, 000, 0.1 및 0.8에서 3.5로 둡니다. Photon 값당 개수를 업데이트합니다.

현지화 정밀도 컷오프를 변경하여 평균 현지화 최적화와 현지화 수치에 대한 정밀도 사이에서 균형을 맞춥니다. 최종 이미지에서는 데이터와 샘플의 품질에 따라 30-50나노미터의 값이 권장됩니다. 재구성 스케일 팩터 기본값은 5이며, 원본 이미지 내의 픽셀이 160나노미터라고 가정할 때 32나노미터의 초고해상도 픽셀을 생성합니다.

원시 이미지의 픽셀 크기가 100나노미터인 경우 20나노미터의 픽셀을 가진 초고해상도 이미지가 생성됩니다. 배율 계수를 늘려 더 작은 초해상도 픽셀을 생성합니다. 최종 이미지에서 run reviewer 버튼을 눌러 업데이트된 초고해상도 이미지를 생성합니다.

view histograms 버튼을 눌러 이미지 품질 메트릭을 표시합니다. 마지막으로 이 모든 데이터를 저장하기 위해 검토자에서 이미지 저장 버튼을 누릅니다. 앞에서 설명한 것과 동일한 방법으로 이미지를 생성하여 이 절차를 시작합니다.

검토자에서 상자 추적 버튼을 누르고 검토된 이미지의 기준 마커 위로 상자를 클릭하여 드래그합니다. 박스형 위치가 표시되는 새 이미지가 나타날 때까지 기다립니다. 원하는 경우 관심 개체가 기준 마커인 경우 이 이미지를 저장합니다.

여기의 경우와 같이 set anchor 버튼을 클릭한 다음 subtract drift 버튼을 클릭하여 드리프트 보정을 수행합니다. 마지막으로 run reviewer(검토자 실행)를 다시 클릭하여 새 폭풍우 이미지를 생성합니다. 덱스트린의 성공적인 코팅은 형광 단층을 생성해야 하며 일반적인 덱스트린 데이터가 이 그림에 나와 있습니다.

회절 제한 이미지는 폭풍 이미징 전에 다양한 농도의 덱스트린을 보여줍니다. 초고해상도 재구성의 픽셀 크기는 25나노미터입니다. 10, 000 이미지는 1 28 x 1 28 픽셀 프레임 크기로 수집되었으며 개별 프레임은 해당 시퀀스에서 표시됩니다.

높은 덱스트린 농도에서. 형광 단층은 이러한 이미지와 이 비디오 세그먼트에 표시된 것처럼 비교적 균일하게 나타나야 합니다. 농도가 낮으면 깜박임이 더 희박하고 초점이 맞춰져 나타납니다.

일정한 레이저 조명에서 이 이미지 획득 단계 동안 뚜렷한 배경이 없으면 고밀도 샘플에서 프레임 2000과 프레임 8, 000을 비교한 결과에서 알 수 있듯이 깜박임 횟수는 시간이 지남에 따라 감소합니다. 높은, 중간 및 낮은 덱스트린 농도의 초고해상도 이미지 간의 주요 차이점은 국소화 수가 감소한다는 것입니다. 이 그래프는 각 덱스트린 농도의 3 개의 10, 000 프레임 시퀀스의 평균을 보여 주며 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다.

그러나 형광 분자의 농도, 원시 데이터의 깜박임 횟수 및 국소화 수 사이의 이러한 비례 관계는 프레임당 허용되는 국소화 수에 대한 이 그래프에서 볼 수 있듯이 단순한 선형 관계가 아닙니다. 이 소프트웨어는 매우 높은 분자 밀도에서 평균 롤링 100 프레임을 사용하여 샘플을 이미징할 때 분자의 위치를 성공적으로 파악하지 못합니다. 일반적인 문제는 매체를 통해 확산되는 형광력으로 인해 이미지 전체에 걸쳐 밝지만 초점이 맞지 않는 형광 연무가 존재할 수 있습니다.

이러한 분리된 형광 분자는 스위칭 버퍼를 추가하기 전에 PBS로 세척 단계 수를 늘리거나 챔버 처리에 새로운 스위칭 버퍼를 추가하고 각 이미지 시퀀스의 데이터를 비교하여 매우 다른 초고해상도 이미지를 생성함으로써 방지하거나 제거할 수 있습니다. 패널 C 및 D는 패널 A 및 B에서 각각 수집된 데이터에 해당하는 초고해상도 이미지 구성물입니다. 이 그래프는 롤링 100 프레임 평균을 사용하여 프레임당 허용되는 현지화 수를 표시합니다.

빨간색 선은 배경이 높은 폭풍 시퀀스 A와 C에 해당하고, 파란색 선은 배경이 낮은 B와 D에 해당합니다. 높고 낮은 배경 데이터에 해당하는 이미지에 대해 허용되는 현지화 번호가 두 번째 그래프에 표시되어 있습니다. 이 세 가지 회절 제한 이미지는 스위칭 버퍼 및 폭풍 이미징을 추가하기 전에 유리 표면에 붙어 있는 미리 형성된 액틴 필라멘트의 일반적인 데이터를 보여줍니다.

다양한 길이의 필라멘트를 볼 수 있습니다. 매우 밝은 필라멘트는 종종 여러 필라멘트가 서로 얽혀 있습니다. 얽힌 영역보다 상대적으로 밝은 단일 필라멘트를 선택하면 획득 단계에서 더 나은 품질의 이미지를 얻을 수 있습니다.

필라멘트의 길이를 따라 밝은 초점 깜박임이 보여야 합니다. 드문드문 깜박임은 수집 단계에서 볼 수 있어야 하며 이후에는 프로세스 데이터에서 볼 수 있어야 합니다. 프레임당 지역화에 얇은 연속 필라멘트가 있어야 하며 점진적인 감소를 보여야 합니다.

일반적으로 필라멘트의 절반 최대값 또는 FWHM이 있는 전체는 이미지 J의 플롯 프로파일 기능을 사용하여 액틴 필라멘트의 확대된 영역을 통해 직선을 그린 후 가우스 피팅을 수행하여 해상도의 경험적 추정치로 제공됩니다. FWHM은 43.2나노미터로 계산됩니다. 잘못된 국소화 문제는 여러 액틴 필라멘트가 프레임의 하위 집합을 처리하고 첫 번째 5, 000 프레임을 비교하여 서로 분기 및/또는 교차하는 경우에 발생할 수 있습니다.

다른 이미지는 처음 5, 000 프레임을 사용하여 초고해상도 이미지로 생성됩니다. 이미지 중간에 많은 지역화가 보입니다. 그러나 마지막 5, 000 프레임을 사용할 때 이러한 국소화 중 극히 일부만 뚜렷하게 나타나고 이미지의 국소화 수가 적기 때문에 다소 연속적이기는 하지만 필라멘트만 남아 있습니다.

너무 높은 점멸 밀도가 의심되는 경우 이미지를 프레임당 국소화 데이터와 비교하면 이 문제가 첫 번째 프레임 세트에서 발생하고 있음을 강력하게 암시할 수 있습니다. 프레임당 평균 현지화 횟수가 10 이상인 것에 비해 마지막 프레임 세트는 약 4 입니다. 폭풍우 현미경 검사의 또 다른 잠재적인 문제는 드리프트인데, 이는 샘플이 대물 렌즈와 관련하여 이동할 때 발생합니다.데이터 수집 단계를 통해 이미지 획득 단계에서는 감지하기가 매우 어렵지만 액틴 필라멘트와 같은 알려진 구조의 초고해상도 이미지에서 드리프트를 감지할 수 있습니다.

측면 이동이 발생했을 수 있는 첫 번째 징후는 구조가 예상보다 크다는 것입니다. 예를 들어, rainstorm의 정밀도 한계 데이터와 비교하여 최대 절반으로 상대적으로 큰 전체로,이 경우 90 나노 미터는 67 나노 미터에 비해 다릅니다. 드리프트를 감지하는 더 좋은 방법은 시간 IE의 함수로 지역화를 비교하여 이후 프레임의 지역화가 초기 프레임의 지역화와 비교하여 이동되었는지 확인하는 것입니다.

이는 액틴 필라멘트의 경우 색상 코드와 함께 표시될 때 명확하게 볼 수 있습니다. 패널 B와 C에서 볼 수 있듯이 rainstorm에서 상자 추적 기능을 사용하면 현지화가 획득된 시점의 프레임 번호에 해당하는 색상으로 표시됩니다. 예를 들어, 획득 시퀀스 초기의 지역화는 파란색이고 수집 시퀀스 후반부의 지역화는 빨간색입니다.

변위된 색상은 측정 및 보정을 위해 드리프트가 발생했음을 나타냅니다. 드리프트의 경우, 100 나노미터 직경의 형광 비드를 기준 마커로 사용할 수 있으며, 1번부터 4번까지는 크롭 및 확대/축소된 비드를 개별적으로 표시합니다. 획득 단계에서 3분 10초 동안 약 100나노미터의 비교적 심한 드리프트가 있는 예에서, 동일한 박스 추적 기능을 사용하여 거의 동일한 드리프트를 보여준 이 예에서 4개의 비드가 모두 표시됨에 따라 색상 코드를 지정하고 드리프트가 발생했는지 확인할 수 있으며, 이 경우 비드 2 중 하나를 선택하여 참조로 사용하고 드리프트를 뺄 수 있습니다 다른 구슬에서.

패널 E와 비교하면 측면 드리프트가 수정되었음을 알 수 있습니다. 마지막으로, 표피 성장 인자 염색된 발뒤꿈치 세포를 사용하여 이미지 해상도의 현실적인 예를 제공할 수 있습니다. 셀에서, 패널 A는 기저 세포 표면에 초점을 맞춘 헬라 셀의 일부에 대한 회절 제한 이미지를 보여주며, 노란색 상자는 회절 제한 이미지에서 관심 영역이 불분명하게 확대된 것과 대조적으로 패널 B 및 C에 표시된 관심 영역이 확대되었음을 나타냅니다.

초고해상도 이미지는 클러스터가 혼합되어 표시되어야 하며, 때때로 격리된 단일 픽셀이 표시되어야 합니다. 클러스터는 직경이 약 100나노미터이며 구덩이와 소포를 형성하는 데 해당할 가능성이 높습니다. EGF가 주로 하향 조절되고 패널 D의 프레임 데이터당 세포내 국소화가 이루어지는 경로는 그래프 G에 나와 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 몇 가지 간단한 테스트 샘플을 만들고, 데이터를 획득하고, 고품질 폭풍을 재구성하고, 해상도 이미지를 보는 방법을 잘 이해해야 합니다.

이러한 방법은 드리프트와 같은 일반적인 적합 위험을 피하고 폭풍을 최적화하는 데 도움이 됩니다. 해상도 실험을 참조하십시오.