원자 힘 현미경을 사용하여 재조합 DNA와 단백질 단지의 시각화

이 절차의 전반적인 목표는 원자력 현미경을 사용하여 수성 완충액에 있는 DNA 및 단백질과 같은 생체 분자를 실시간으로 이미지화하는 것입니다. 이것은 먼저 이미징할 생체 분자를 준비함으로써 달성됩니다. 다음으로, 원자력 현미경이 설정되고 FM 캔틸레버 프로브가 배치됩니다.

그런 다음 관심 있는 샘플 표면과 생체 분자를 이미지화하고 분석합니다. 궁극적으로 원자력 현미경을 통해 완충 조건에서 DNA와 단백질 및 이질적인 생체 분자 복합체의 일반적인 크기, 양 및 조직을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 분자 샤페론 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 샤페론의 STO 기하학은 무엇인지, 그리고 클라이언트에게는 코스 샤페론이 복합체입니다.

단백질: 이 방법의 시각적 시연은 A FM 및 Kent 레버 프로브 준비 단계가 물리적 조작과 관련된 복잡성으로 인해 인쇄된 지침에서 배우기 어려울 수 있으므로 유용합니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 두 학생인 Morgan Shannon과 John Gertz가 이미징할 단백질 또는 DNA 분자를 분리하고 수성 완충액에 현탁시키기 시작합니다. 샘플의 순도를 확인한 후 얼음 위의 FM 흡수 버퍼에서 배양하여 샘플이 운모에 부착되는 것을 촉진합니다.

단백질 샘플의 경우 10밀리몰 힙 버퍼를 사용합니다. 그리고 10 밀리몰 트리스, pH 7.5 10 밀리몰 염화나트륨, 2 밀리몰 염화 마그네슘으로 구성된 DNAA 마그네슘 함유 버퍼의 경우 A FM 프로브를 장착하는 데 적합합니다. 액체 셀 프로브 홀더를 해당 캔틸레버 설치 도킹 스테이션에 놓습니다.

이미징에 사용할 날카로운 질화물 레버 프로브의 길고 두꺼운 캔틸레버를 찾습니다. 팁이 똑바로 세워지도록 액체 셀 프로브 홀더에 조심스럽게 옮깁니다. 다음으로, 광학 현미경으로 캔틸레버를 검사하여 캔틸레버가 손상되지 않고 액체 셀 프로브 홀더에 제대로 장착되었는지 확인합니다.

그런 다음 신경 헤드 cl을 조여 기기 더브테일 어셈블리에서 FM 헤드를 조심스럽게 제거합니다.amp 나사. FM 헤드를 뒤집고 액체 전지 프로브 홀더를 FM 헤드 바닥에 있는 4개의 핀에 단단히 밀어 넣습니다. 마지막으로, FM 헤드를 테일 어셈블리 기기로 조심스럽게 되돌립니다.

샘플을 이미징하기 전에 FM을 추가로 준비하려면 온보드 광학 현미경의 손잡이를 움직여 캔틸레버 팁을 찾고 소프트웨어에서 광학 컨트롤러의 위쪽 및 아래쪽 화살표를 조정하여 캔틸레버 팁에 초점을 맞춥니다. 레이저 조정 손잡이를 사용하여 레이저를 캔틸레버 팁에 정렬합니다. 이것은 프로토콜에서 기술적으로 가장 어려운 단계 중 하나입니다: 포지셔닝은 수동으로 수행되며 정확한 노브 조정이 필요합니다.

반사 스폿과 조명 스폿에서 레이저를 주의 깊게 모니터링하면 성공적인 정렬 가능성이 높아집니다. 그런 다음 FM 헤드의 광 검출기 손잡이를 조정하여 광 검출기를 중앙에 배치합니다. 자화된 샘플 홀더에 금속 A FM 표본 디스크에 부착된 갓 절단된 MICA 시트를 놓습니다.ampA FM 홀더 플레이트 위에 있는 le 홀더.

FM 홀더 플레이트를 회전하여 표본 디스크가 초기 이미징을 위해 배치되도록 합니다. 기기 소프트웨어의 초점 표면 제어를 사용하여 FM 헤드를 MICA 표본 디스크 표면 쪽으로 아래로 이동합니다. 운모 표면의 뚜렷한 특징이나 팁 반사에 초점이 맞춰질 때까지 기기 소프트웨어에서 튜닝 아이콘을 선택하고 캔틸레버를 튜닝합니다.

권장되는 MSNL 또는 SNL 프로브의 공진 주파수는 20-60kHz입니다. 5% 피크 오프셋을 선택하여 MICA 샘플을 이미지화합니다. 먼저 프로브를 MICA 표면에 맞물리고 초기 스캔 크기를 10마이크로미터로, 스캔 속도를 1헤르츠로 설정합니다.

10마이크로미터 필드의 전체 스캔 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 스캔 크기를 5, 1, 0.5마이크로미터로 줄이고 각 필드의 전체 이미지를 캡처합니다. 기기 소프트웨어의 해제 아이콘을 한 번 클릭하여 프로브를 해제합니다.

관심 생체 분자를 이미지화하려면 준비된 시료 5마이크로리터와 신선한 흡수 완충액 45마이크로리터를 혼합합니다. 50마이크로리터의 0.5마이크로리터 생체 분자 함유 용액을 MICU 표면에 직접 조심스럽게 첨가합니다. 샘플의 생체 분자가 운모 표면에 부착될 수 있도록 5분 동안 일시 중지합니다.

그런 다음 추가로 50-100마이크로리터의 흡수 완충액을 액체 셀 프로브 홀더에 피펫으로 주입합니다. 피펫 팁으로 프로브, FM 헤드 또는 MICA를 만지지 않도록 주의하고 광 검출기를 재조정하고 필요에 따라 레이저를 캔틸레버에 다시 정렬합니다. 그런 다음 기기 소프트웨어를 사용하여 프로브를 다시 맞춥니다.

스캔 크기를 늘려 관심 영역을 식별합니다. 이미징이 완료되면 기기 소프트웨어에서 회수 아이콘을 여러 번 선택하여 프로브를 분리합니다. 마지막으로 증류수를 사용하여 액체 세포 프로브 홀더와 표본 디스크를 철저히 헹굽니다.

그런 다음 압축 공기로 사용해 보십시오. A FM 이미지의 예가 여기에 나와 있습니다. 운모 기질은 DNA와 단백질이 흡수할 수 있는 분자적으로 평평한 표면을 제공합니다.

생체 분자 샘플 이전에 MICA를 이미징하면 음성 제어 및 이미징 노이즈에 대한 평가를 제공합니다. 또한 캔틸레버가 적절하게 조정되고 후속 샘플 이미징이 성공할 것이라는 수준의 확신을 제공합니다. 이중 가닥 플라즈마 DNA는 추정 슈퍼 코일은 비대칭 모양과 이전에는 눈에 띄지 않았던 미카 기질에 균일 한 침전으로 쉽게 식별됩니다.

개별 입자 크기의 단백질 복합체는 또한 Micah 기질과 고유하게 구별됩니다. 입자 크기 차이는 시료의 이질성을 나타내며 단백질, 복잡한 스토아 형상 또는 생화학적 활성을 근사화하는 데 유용할 수 있습니다. 관찰된 단백질 입자의 일반적인 대각선 모양과 일관된 방향.

다음은 단백질이 무작위 방식으로 Micah 기질에 배향될 것으로 예상되는 이미징 아티팩트입니다. 관찰된 인공물 또는 물리적 팁 이상 또는 스캔 속도의 2 빠른 FM 이미징의 가능한 원인은 팁 컨볼루션이 x 및 Y축 높이 측정 또는 Z축 및 상대 X 및 Y 측정에서 절대 길이 측정 계산을 방해하는 반면, 그럼에도 불구하고 이미징된 생체 분자의 생물물리학적 특성을 추정하는 데 유용할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 캔틸레버를 정확하게 조정하고 광 검출기를 정렬하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기본 FM 절차를 따릅니다.

완충 교환 유체 세포를 사용하는 것을 포함한 다른 단계를 추가하여 분자 샤페론이 DNA 반응 요소에서 스테로이드 수용체의 방출에 영향을 미치는 능력과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 완충 상태에서 원자력 현미경을 사용하여 DNA 단백질과 생체 분자 복합체를 이미지화하는 방법을 더 잘 이해할 수 있을 것입니다.