생성 및 마우스의 동맥 병변의 3 차원 정량 광학 프로젝션 단층 촬영을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 광학 투영 단층 촬영을 사용하여 마우스의 죽상경화성 및 신생강 병변을 시각화하고 3차원으로 정량화하는 방법을 보여주는 것입니다. 이것은 먼저 수술을 통해 또는 죽상동맥경화증이 발병하기 쉬운 생쥐에게 고콜레스테롤 식단을 공급함으로써 생쥐에서 동맥 병변을 생성함으로써 달성됩니다. 다음 단계는 표적 동맥을 분리하고 광학 투영 단층 촬영을 사용하여 스캔하는 것입니다.

마지막 단계는 이미지 재구성을 수행하고, 병변을 식별하고, 병변 부피를 측정하는 것입니다. 궁극적으로 결과는 이미지 분석을 통해 병변의 해부학적 재구성과 병변 부피 및 동맥 협착의 정량화를 보여줄 수 있습니다. 우리 그룹은 심장 마비 및 뇌졸중과 같은 생명을 위협하는 합병증으로 이어지는 동맥 협착을 유발하는 병변 형성의 기저에 있는 메커니즘을 이해하는 데 관심이 있습니다.

이 광학 프로젝션 단층 촬영의 응용 프로그램은 Lucy Lowe 박사와 함께 Nicholas Kirkby 박사가 우리 그룹에서 개발했으며, 우리 실험실에서 일하는 박사후 연구원인 Jung Shi Wu 박사가 시연할 것입니다. 조직학 및 면역조직화학과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 노동 집약적이지 않고 2차원 분석이 아닌 3차원 분석이 가능하다는 것입니다. 대퇴 동맥 병변을 유발하는 이 기술은 R and company 및 Sada and company의 기술에서 수정되었습니다.

텍스트 프로토콜은 식이 조작을 통해 죽상경화성 병변을 유발하는 방법을 설명합니다. 10-12주 된 C 57 블랙 식스 마우스로 시작하여 무게가 25-30g 사이입니다. 마취가 끝나면 마우스를 따뜻한 패드에 올려 체온을 유지하고 콧물을 통해 2-3%의 불소를 제공합니다.

마우스가 발가락 꼬집음에 반응하지 않으면 부프레노르핀을 킬로그램당 0.1mg으로 투여합니다. 그런 다음 마우스를 등에 대고 왼쪽 뒷다리의 복부 표면을 면도합니다. 그런 다음 슬와동맥과 복벽의 분기점 사이에 있는 위쪽 뒷다리의 근육을 노출시키기 위해 절개를 합니다.

시술 내내 대퇴 동맥과 정맥에서 대퇴 신경을 분리하기 위해 둔기를 절개합니다. 조직을 1 % 부피로 촉촉하게 유지하십시오. 다음으로, 임시 6.0 Mers 실크 결찰은 대퇴 동맥과 정맥 주위, 복벽에 가깝고 슬와동맥이 있는 가지 바로 아래에 있습니다.

이것은 혈류를 조절하기 위한 것입니다. 그런 다음 대퇴 동맥이 있는 분지에서 원위로 2-5mm 떨어진 슬와동맥을 분리하고 슬와동맥 아래에 슬와동맥을 결찰합니다. 두 번째 합자를 배치합니다.

이제 대퇴 동맥이 있는 분지 바로 원위부에 있는 슬와동맥에 와이어를 삽입하기 위해 작은 절개를 만듭니다. 근위 임시 결찰부에 압력을 가하여 절개 부위를 통해 복벽을 향한 대퇴 동맥으로 출혈이 발생하는 것을 방지합니다. 0.014인치 G선을 약 1-1.5cm 정도 삽입합니다.

30초 동안 그대로 두었다가 제거합니다. 그런 다음 절개 부위 위의 슬와동맥인 ligatures liggate를 사용합니다. 대퇴 동맥을 막지 않도록 주의하십시오.

이제 임시 합자를 제거합니다. 5.0 mercal을 사용하여 불연속적인 러닝 봉합사로 상처를 봉합합니다. 그런 다음 EMLA 크림을 바르십시오.

동물이 회복 케이지에서 의식을 회복하고 움직일 수 있도록 한 후 가정용 케이지로 되돌려 보냅니다. 다리는 2-3일 동안 절뚝거릴 것으로 예상되지만 이것이 마우스를 격리해야 한다는 의미는 아닙니다. OPT의 경우 마우스를 안락사시키고 펜토바르비탈에서 말단 마취를 유도해야 합니다.

그런 다음 출혈과 함께 트랜스 심장 관류 고정을 만듭니다. 이제 대퇴 동맥 또는 대동맥궁과 그 가지를 분리하십시오. 이 과정에서 불필요한 perial 물질을 제거합니다.

그런 다음 하룻밤 동안 10% 중성 완충 포르말린에 조직을 접미합니다. 다음날 조직을 70% 에탄올에 보관하거나 여과된 1.5% LMP 에어로에 동맥을 삽입하여 진행합니다. 조직을 약 섭씨 40도에서 용융된 공기로 부드럽게 내립니다.

에어로를 다듬어 원뿔 모양을 만듭니다. 이제 이 제제를 100% 메탄올에서 최소 12시간 동안 탈수합니다. 탈수가 완료되면 벤조 알코올과 벤조 벤조에이트를 1-2개 섞은 혼합물로 혈관을 청소합니다.

혈관이 이 용액에서 12-24시간 동안 배양하도록 합니다. 다음 날, 투명해진 샘플을 사전 보정해야 하는 단층 촬영기에 로드합니다. 해상도는 1024로 설정되어 있습니다.

1024 픽셀로. 관심 영역의 배율을 설정합니다. Z축은 자동으로 동일한 해상도로 설정됩니다.

복셀 크기는 약 200미크론입니다. 다음으로, Brightfield 채널을 사용하여 시야 중심에서 자체 축을 중심으로 회전하도록 샘플을 배치합니다. GFP one 필터 방출 채널을 사용하여 초점을 설정하고 노출을 조정하여 이미지의 다이내믹 레인지를 최대화합니다.

과포화를 피하십시오. 이제 GFP 하나의 방출 채널에서 0.9도 단계로만 용기를 스캔합니다. 그런 다음 샘플을 왁스에 삽입하기 전에 최소 24시간 동안 100% 메탄올로 되돌려 놓아야 합니다.

조직학적 분석을 위해 데이터 뷰어 소프트웨어를 사용하여 n recon 소프트웨어 또는 유사한 소프트웨어에서 획득한 이미지를 엽니다. 이미지 재구성의 품질을 확인하고, 이미지 품질을 개선하고, 이미지 강도를 조정하고, 소프트웨어가 이상적인 회전 축에서 샘플의 정렬 불량을 보정하도록 합니다. 각 스캔에 대해 병변을 포함하는 수직 관심 영역을 정의합니다.

50번째 스캔 라인마다 매체 사이의 경계와 내부 탄성 층의 위치를 추적합니다. 그런 다음 소프트웨어는 다른 모든 스캔에서 테두리를 보간하고 이러한 보간을 수동으로 확인하고 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 이제 흰색 픽셀은 neointima를 나타내고 검은색 픽셀은 patent lumen을 나타내는 이진 이미지 세트를 생성합니다.

이는 intensity thresholds를 정의하여 수행됩니다. 이 작업이 완료되면 물체 부피는 총 병변 부피가 되고 발광 부피는 총 부피에서 물체 부피를 뺀 값이 됩니다. 따라서, 축 길이를 따라 병변과 내강의 분포가 평가됩니다.

쥐의 대퇴동맥은 와이어 유도 또는 결찰 유도 손상 후 28일 후에 적출했습니다. Neointimal thickening은 재구성된 2차원 슬라이드의 방출 투영에서 분명했습니다. 동심원 신내막 병변을 구별할 수 있습니다.

APOE 결핍 마우스의 전체 대동맥궁에 대한 광학 프로젝션 단층 촬영 방출 이미지는 대동맥궁, 상완두동맥의 작은 곡률, 좌측 경동맥 및 쇄골하 동맥의 기원에서 예상되는 병변을 식별했습니다. 동일한 병변이 분절되어 빨간색으로 표시되었습니다. 원본 이미지에 겹쳐졌을 때 플라크의 분포를 강조하기 위해, 배지와 루멘은 이것이 편심 병변임을 보여주는 단면 이미지에서 구별할 수 있었습니다.

여기서, 스캔이 이 가지를 따라 원위부로 이동함에 따라 병변은 처음에는 쇄골하 동맥에서, 그 다음에는 경동맥에서, 마지막으로 상완두동맥에서 점차 줄어들고 사라집니다. 흥미롭게도, 상완두동맥의 이 병변은 이 혈관이 오른쪽 경동맥과 오른쪽 쇄골하 동맥으로 분열됨에 따라 흐름 분배기로 이동합니다. OPT 절차에 따라 병변의 구성이 무엇인지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 조직학 및 면역조직화학과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

따라서 개발 후 이 기술은 혈관 연구 분야에서 일하는 과학자들이 신생내막 및 죽상경화성 병변의 발병에서 내피 수용체, 렉틴 및 스테로이드 대사 효소의 역할을 조사할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 광학 프로젝션 단층 촬영을 사용하여 강낭 동맥에서 병변을 얻고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.