Name: 준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: 배우세요 Xenopus laevis 올챙이 시각정점 신경회로의 전체세포 패치클램프 기록법을 통해 발달 중인 신경세포의 연결성과 전기생리학적 특성을 분석하는 방법입니다.

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NIH 그랜트 SBC COBRE 1P20GM121310-01에 의해 지원.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 와이오밍 대학에 의해 승인 되었습니다. Electrophysiological 녹음을 포함 한 모든 절차는 실 온, 약 23 ° c.에서 실시 여기에 설명 된 모든 방법은 tadpoles 발달 단계 42 및 49 (Neiuwkoop와 페이 버15에 따라 개최) 사이에서 tectal 신경 기록 최적화 되어 있다.
1. Vivo에서 준비
<ol><li>올챙이 anesthetize<ol>
<li>0.01% 스 테 인 버그의 솔루션을 포함 하는 작은 페 트리 접시에는 올챙이 놓고 약 5 분 동안 MS-222. 참고: MS-222 일명 "Tricaine"는 일반적인 물고기와 양서류 마 취. Tadpoles는 m m에서 스 테 인 버그의 솔루션에서 발생 하는: 0.067 4.9 HEPES 5.8 NaCl, KCl, 0.034 Ca (3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O.</li>
		<li>올챙이 깊이 anaesthetized (무응답과 이상 수영) 2 단계를 진행 하기 전에 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>해 부/녹음 접시의 바닥에 잠긴된 실리콘 블록을 마 취 올챙이 보안 합니다.<ol>
<li>처분할 수 있는 이동 피 펫을 사용 하 여 외부 기록 솔루션을 포함 해 부/녹음 접시 anaesthetized 올챙이 이동 (115 m m의 NaCl, KCl, 2mm CaCl23 m m, MgCl23 m m, 5mm HEPES, 1mm 포도 당; 조정 7.25 사용 하 여 pH 10 N NaOH, osmolarity 255 mOsm의).<ol>
<li>자발적인 근육을 최소화 하기 위해 기, 아 세 틸 콜린 수용 체 차단제, tubocurarine (100 µ M) 외부 솔루션에 추가 합니다. (일반적으로,이 이루어집니다 외부 솔루션의 10 mL를 100 µ L 10 mM tubocurarine 주식의 추가 200 µ L 피 펫을 사용 하 여).</li>
		</ol>
</li>
		<li>곤충 핀을 사용 하 여 보안 올챙이, 등 쪽, 실리콘 탄성 중합체의 침수 블록 (예: Sylgard 184 참조 자료 테이블 세부 정보에 대 한), 어떤 해 접시 바닥에 붙어 있다. 참고: 핀의 위치는 중요 한: 눈에서 그 프로젝트 뇌, 성의 RGC 축 삭을 impaling 피하기 위해 충분히 꼬리의 양쪽에 그들을 배치 하 고 그냥 눈 tectum (그림 1A) 앞쪽 뇌를 입력.</li>
	</ol>
</li>
	<li>중간 선 따라 뇌를 모 깎기.<ol>
<li>두뇌의 명확한 보기에 대 한 살 균 25 G 바늘을 사용 하 여 중간에 따라 표면 절 개 하 여 뇌를 overlying 피부를 제거 합니다.</li>
		<li>신경 관에 바늘을 삽입 하 고 당겨 부드럽게 위쪽으로 (dorsally) 등 튜브의 등 쪽 부분 깔끔하게 절단 (절단) 바닥 플레이트 그대로 (그림 1B)를 떠나 있는 동안 그 같은 중간 축 따라 뇌를 모 깎기. 참고: 때문에 구심 성 감각 입력 입력은 tectum는 바닥에 접시를 통해 신경 튜브의 바닥 접시 그대로 남아 있을 중요 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tectal 신경 세포를 포함 하는 투명 한 심 실 막을 제거 합니다.<ol>
<li>전기 생리학 장비에 기록 접시를 이동 하 고 깨진된 유리 피 펫 팁을 사용 하 여 심 실 막 overlying tectal 신경 셀 시체를 제거. 가볍게 섬세 한 작업와이 퍼에 걸쳐 그것을 드래그 하 여 팁을 휴식.</li>
		<li>피 펫 홀더에 피펫으로 나사와 micromanipulator 통해 광섬유 tectum 내려 낮은.</li>
		<li>깨진된 피 펫을 사용 하 여 껍질은 tectum에서 심 실 막. 참고: 그것은 전체 tectum;에서 멤브레인을 제거 하는 데 필요한 작은 창이 충분 하 고 충분 한 뉴런에 대 한 액세스를 제공.</li>
	</ol>
</li>
	<li>패치 클램프 기록을 전체 셀을 가져옵니다. 참고:이 시점에서 접근이 비슷합니다 Segev, 외. 에 설명 된 대로 마우스 뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음을 실시 16 (그림 1C).</li>
	<li>망막에 투영 하는 빛의 전체 필드 플래시 tectal 신경 응답을 기록 합니다.<ol>
<li>망막에 빛의 전체 필드 플래시 프로젝트, 광학 섬유를 올챙이 눈에 인접 한 장소. 광학 섬유의 다른 끝에 LED 빛 광도 제어할 수 있도록 가변 저항 라인 이다. 앰프의 디지털 출력으로 LED를 트리거하십시오. 이 방법에서는, 섬광 빛의 다양 한 농도의 수는 전체 필드(그림 4)를기록 했다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 뇌 준비
<ol><li>1.1 1.3 단계를 수행 합니다. 참고: tubocurarine이이 준비를 위한 외부 솔루션에 대 한 필요가 있다.</li>
	<li>뇌를 격리 합니다.<ol>
<li>25 G 바늘을 사용 하 여 서버 hindbrain (그림 2A).</li>
		<li>올챙이에서 뇌를 분리 하려면 부드럽게 모든 측면 및 복 부 결합 조직 및 신경 섬유를 절단 하는 꼬리-rostral 방향에서 뇌 밑 바늘을 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실리콘 엘라 스토 머의 블록에 두뇌를 보호 합니다.<ol>
<li>일단 완전히 해제 후 각 전구 중 하나를 통해 하나의 핀 hindbrain (그림 2B)를 통해 또 다른 핀을 배치 하 여 실리콘 탄성 중합체의 블록에 뇌를 보안 합니다. Tectal 신경에서 기록에 대 한 최적의 구성입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전기 생리학 장비에 해 범위에서 고정 된 뇌 준비를 포함 하는 접시를 이동 합니다. 1.4 단계에서 설명한 대로 깨진된 유리 피 펫을 사용 하 여 심 실 멤브레인을 제거 합니다.</li>
	<li>바이 폴라 자극 전극에 배치 시 chiasm (어디 각 눈에서 축 삭 책자는 midbrain에 크로스) RGC 축 삭을 직접 활성화 하.<ol>
<li>바이 폴라 자극 전극 rostral, 그리고 거의 옆에, 큰 중간 심 장소. 광학 chiasm는 즉시 rostral 큰 가운데 심 (그림 2B)에 있습니다.<ol>
<li>부드럽게 낮은 자극 전극 다운 시 chiasm에 되도록 작은 덴트 직물에서 형성 된다. 양극 전극은 정밀 하 게 제어 하는 자극의 강도 수 있는 펄스 자극에 의해 구동 됩니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Segev, 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 수행 하는 전체 셀 패치 클램프 기록 (그림 2C) 16
</li>
</ol>3. 수평 뇌 슬라이스 준비
<ol><li>2.1 2.3 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>면도날을 사용 하 여 하나의 광섬유 tectum의 한쪽의 가장 측면 4 (는 비보에 해당 하는 가장 등 4) 소비 세. 이 컷 평면에 평행 rostral 꼬리 그림 3A와 같이 이루어집니다.</li>
	<li>두뇌는 슬라이스 된 실리콘 엘라 스토 머의 측면에 다시 핀 사이드 (somata 및 neuropil는 기록에 대 한 직접 액세스할 수 있습니다)을 향하도록 하 고 실리콘 고무 블록 (그림 3 멀리 직면 하는 뇌의 심 실 표면 B) (있도록 양극 전극 광학 chiasm에 놓일 수 있다).</li>
	<li>전체 셀 패치 클램프 또는 로컬 출원된 잠재적인 기록 (그림 3C) Segev, 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 수행 16
</li>
</ol>

<ol><li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).</li>
<li>Pratt, K. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s40139-015-0075-1">Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole.</a> Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).</li>
<li>Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+and+function+of+the+Xenopus+tadpole+retinotectal+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).</li>
<li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+regulation+of+voltage-gated+intrinsic+currents+in+the+developing+optic+tectum+of+the+Xenopus+tadpole%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole.</a> J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).</li>
<li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+regulation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+transmission+in+a+developing+visual+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit.</a> J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).</li>
<li>Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+analysis+of+electrophysiological+diversity+of+Xenopus+visual+neurons+during+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity.</a> Elife. 4, 11351(2015).</li>
<li>Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+driven+regulation+of+intrinsic+neuronal+excitability+improves+stimulus+detection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo.</a> Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).</li>
<li>Wu, G., Malinow, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8875937">Cline H.T. of a central glutamatergic synapse.</a> Science. , 972-976 (1996).</li>
<li>Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory-evoked+spiking+behavior+emerges+via+an+experience-dependent+plasticity+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism.</a> Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).</li>
<li>Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+transcription+of+BDNF+enhances+visual+acuity+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development.</a> Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).</li>
<li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705(2008).</li>
<li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+avoidance+in+Xenopus+tadpoles+is+correlated+with+the+maturation+of+visual+responses+in+the+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum.</a> J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li>
<li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+horizontal+brain+slice+preparation%3A+a+novel+approach+for+visualizing+and+recording+from+all+layers+of+the+tadpole+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum.</a> J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland. New York. (1994).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27341060">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (112), e54024(2016).</li>
<li>Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Relationships+Impact+Neuronal+Tuning+within+a+Phylogenetically+Ancient+Vertebrate+Brain+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure.</a> Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).</li>
<li>Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation+and+inhibition+in+recurrent+networks+mediate+collision+avoidance+in+Xenopus+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles.</a> Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).</li>
<li>Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+to+see%3A+patterned+visual+activity+and+the+development+of+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function.</a> Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).</li>
<li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisensory+integration+in+mesencephalic+trigeminal+neurons+in+Xenopus+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles.</a> J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 작품에서 설명 하는 모든 방법 tadpoles 발달 단계 42 및 49 (Neiuwkoop와 페이 버15에 따라 개최) 사이에서 tectal 신경 기록 최적화 되어 있다. 무대 42는 tadpoles는 충분히 크고 충분히 개발 곤충 핀 vivo에서 녹음 한 뇌 해 부를 수행 하기 위한 뇌의 양쪽에 배치 될 수 있도록. 이전 단계에서는 tadpoles는 근본적으로 2 차원 (즉, 평면), 여기서 설명 하는 접근은 최적이 아닙니다.
용이성에 tectal 신경 수 액세스 하 고 전체 셀 구성에 기록으로 인해이 모델 회로가 되었습니다 어떻게 신경 회로 형태에 대 한 기본적인 발견에 대 한 온상-기능과 기능 하는 동안19를 형성 하는 동안. 여기 우리가 전체 셀 패치 클램프 기록 vivo에서 올챙이 뇌 준비, 다른 녹음 구성, 및 데이터의 다른 유형의 ...

Retinotectal 회로 양서류 비주얼 시스템의 주요 구성 요소. 그것은 광섬유 tectum postsynaptic tectal 신경 세포와 시 냅 스 연결을 형성 하는 어디에 그들의 축 삭을 프로젝트 눈에서 RGCs 구성 됩니다. Xenopus 올챙이 retinotectal 회로 신경 회로 형성 기능을 공부 하 고 인기 있는 개발 모델입니다. 그것은 강력한 실험 모델,12,3렌더링이 올챙이 retinotectal 회로의 많은 특성이 있습니다. 한 주요 특성, 그리고이 문서의 초점 tectal 신경, vivo에서 또는 뇌의 준비를 사용 하 여 전체 셀 패치 클램프 기록 수행 하는 기능입니다. 전압 및 전류 클램프 녹음 모드를 지원 하는 앰프와 복 전기 생리학 장비, 전체 셀 패치 클램프 기록 수 높은 해상도에서 특징에 뉴런의 전기 생리학. 그 결과, 전체 셀 패치 클램프 기록 retinotectal 회로 형성의 주요 단계에 걸쳐 tectal 뉴런에서 개발의 상세 하 고 포괄적인 이해 하 고 내장4,5 의 소성 제공 , 6 , 7 고 시 냅 스8,9,,1011 속성. 전체 셀 패치 클램프 tectal 신경 녹음을 결합, 유전자 또는 morpholinos 이러한 뉴런12, 그리고 설립된 시각적 회피 테스트13 통해 시각적 가이드 동작을 평가 하는 방법에 관심을 표현 하는 능력을 촉진 합니다 분자, 회로 기능 및 행동 사이 연결의 id입니다.
데이터 전체 셀 패치 클램프 기록에서 취득 불가능 유전 칼슘 표시기 GCaMP6, 같은 새로운 이미징 접근을 사용 하 여 있기 때문에 높은 해상도의 종류 칼슘 표시기를 사용 하 여 비록 허가 이미징 주의 하는 것이 중요 하다 칼슘의 신경 세포의 큰 인구에 걸쳐 역학 동시에, 아니 직접 또는 확실 한 방법은 특정 전기 매개 변수 somata에서 델타 형광을 측정 하 여 얻을 수 있습니다 그리고 거기 방법은 전압 클램프 측정 하 신경 전류-전압 관계입니다. 명확 하 게이 두 가지 접근, electrophysiological 녹음 및 칼슘 이미징, 겹치지 않는 강점가지고 고 다른 유형의 데이터를 생성. 따라서, 가장 좋은 방법은 해결 되 고 특정 실험적인 질문에 따라 달라 집니다.
여기, 우리가 올챙이 눈 tectum는 vivo에서 준비, 뇌 준비를 사용 하 여의 뉴런에서 전체 셀 패치 클램프 기록 인수에 대 한 우리의 방법을 설명 하 고 새로운 수정14 연구소에서 개발 된 뇌 준비 . 대표적인 결과 섹션에서 각 준비와 얻을 수 있는 데이터의 종류의 실험적인 장점을 보여 줍니다. 문제 해결을 위한 팁 뿐만 아니라 다른 준비의 강점과 한계 토론 섹션에 포함 됩니다.

<table><tbody><tr><td>Stemi 스테레오 508</td><td>Zeiss</td><td>495009-0006-000&nbsp;</td><td>해부 현미경</td></tr><tr><td>MS-222 "Tricane"</td><td>Finquel</td><td>ARF5G</td><td>양서류 전신 마취</td></tr>제 <tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Stienberg의 용액 및 외부 용액</td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td>을 준비하는 데 사용 <td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Stienberg의 용액 및 외부 용액을 준비하는 데 사용</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-1KG</td><td>Stienberg의 용액 및 외부 용액을 준비하는 데 사용</td></tr><tr><td>질산 칼슘 테트라 히레이트 (Ca (NO 3 ) &bull; 4H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237124-500G</td><td>Stienberg의 솔루션을 준비하는 데 사용됩니다&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate (MgSO4)</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6066-04</td><td>Steinberg의 용액</td></tr><tr><td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>를 제조하는 데 사용 <td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>외부 기록 용액을 제조하는 데 사용</td></tr><tr><td>염화마그네슘 (MgCl2)</td><td>J.T. Baker</td><td>2444-01</td><td>외부 기록 용액을 제조하는 데 사용</td></tr><tr><td>D-glucose 무수</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6066-04</td><td>외부 기록 용액</td></tr><tr><td>Tubocurarine hydrochloride pentahydrate</td><td>Sigma</td><td>T2379</td><td>니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 길항제</td></tr><tr><td>곤충 핀</td><td>미세 과학 도구</td><td>26002-10</td><td>0.1mm 직경 스테인레스 스틸 핀</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>다우 코닝</td><td>761028</td><td>미리 계량된 단량체 및 경화제 키트</td></tr><tr><td>멸균 폴리스티렌 페트리 접시 - 60x15mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS4052</td><td>작은 페트리 접시</td></tr><tr><td>PrecisionGlide 바늘 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>주사기 바늘</td></tr><tr><td>1mL 슬립 팁 투베르큘린 주사기&nbsp;</td><td>BD</td><td>309659</td><td>일회용 멸균 주사기</td></tr><tr><td>붕규산 피펫 유리</td><td>셔터 기기</td><td>BF150-86-10HP</td><td>피펫 풀링 머신을 사용하여 원하는 사양으로 끌어 올림</td></tr><tr><td>화염 / 갈색 마이크로 피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-97</td><td>전기 생리학 기록을위한 마이크로 피펫 제작</td></tr><tr><td>Kimwipes Kimtech 와이프</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>섬세함 작업 보푸라기가없는 와이퍼</td></tr><tr><td>Axon Instruments MultiClamp 700B 헤드 스테이지 CV-7B</td><td>분자 장치</td><td>1-CV-7B</td><td>전류 클램프 및 전압 클램프 헤드 스테이지</td></tr><tr><td>MP-285 전동 매니퓰레이터 탁상용 컨트롤러</td><td>셔터 기기</td><td>MP-285 / T</td><td>전기 생리학 장비의 헤드 스테이지 용 제어</td></tr><tr><td>광섬유 결합 LED (녹색)</td> <td>Thorlabs</td><td>M530F2</td><td>녹색 LED와 쌍을 이루는 광섬유 케이블</td></tr><tr><td>클러스터 바이폴라 전극 (25&micro; m 직경)</td><td>FHC</td><td>30207</td><td>바이폴라 자극 전극</td></tr><tr><td>ISO-Flex 자극기</td><td>A.M.P.I. (이스라엘)&nbsp;</td><td>제조업체에 연락하십시오</td>. 유연한 <td>자극 절연체</td></tr><tr><td>Axon Instruments 700B 멀티패치 증폭기</td><td>분자 장치</td><td>2500-0157</td><td>전압 및 전류 클램프 녹음용 증폭기&nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1322A 디지타이저</td><td>분자 장치</td><td>2500-135</td><td>전기생리학 기록을 위한 데이터 수집 시스템</td></tr><tr><td>Axio Examiner.A1</td><td>Zeiss</td><td>491404-0001-000&nbsp;</td><td>전기생리학용 현미경</td></tr><tr><td>Micro-g Lab Table</td><td>TMC</td><td>63-533</td><td>전기생리학 현미경용 에어 테이블</td></tr><tr><td>Inspiron 620 개인용 데스크탑 컴퓨터 Windows 7 64비트</td><td>Dell</td><td>D06D001</td><td>컴퓨터 전기생리학 소프트웨어를 실행하는</td>컴퓨터</tr><tr><td>c2400 CCD 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>70826-5</td><td>전기생리학 이미징용 전하 결합 장치 카메라</td></tr><tr><td>7시 방향 슈퍼 플래티넘 스테인리스 면도날</td><td>질레트</td><td>CMM01049</td><td>플래티넘 코팅 스테인리스 면도날</td></tr><tr><td>트랜스퍼 피펫</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>13-711-7M</td><td>일회용 폴리에틸렌 트랜스퍼 피펫</td></tr></tbody></table>

준비 및 xenopus laevis tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Xenopus 올챙이 retinotectal 회로, 어떤 형태로 광섬유 tectum에 신경에 직접 synapses 눈에서 망막 신경 절 세포 (RGCs)의 구성 어떻게 신경 회로 공부 하는 인기 모델은 자기 조립. 전체 수행 하는 기능 패치 클램프 기록 중 vivo에서 기록 RGC 갖는 응답을 tectal 뉴런에서 셀 또는 전체 두뇌 준비를 사용 하 여 일반 기본 메커니즘에 대 한 고해상도 데이터의 큰 몸 생성 했다 비정상적인, 회로 형성 및 기능. 여기 우리가 준비 vivo에서 , 원래 뇌 준비를 수행 하는 방법을 설명 하 고 더 최근 개발 tectal 뉴런에서 전체 셀 패치 클램프 녹음을 얻기 위해 수평 뇌 조각을 준비. 각 준비 독특한 실험 장점이 있습니다. Vivo에서 준비 tectal 신경의 눈에 투영 하는 시각적 자극에 직접 응답의 녹음 수 있습니다. 뇌 준비 매우 제어 방식에서 활성화 RGC 축 삭에 대 한 허용 하며 수평 두뇌 슬라이스 준비에서 녹음은 tectum의 모든 레이어에서

빛 갖는 응답를 빛의 전체 필드 플래시 결과 응답 개별 tectal 뉴런(그림 4)에서 기록 하는 동안 망막에 예상 된다. 이 특정 프로토콜은 모두 빛 ("에" 응답) 켜기 한 다음 15 신경의 응답을 측정 하도록 설계 되어 나중 "에서 응답." 측정 하는 s Tectal 신경은 일반적으로 응답에 이따금 강력한 전시 (표시 여기에 기록 된 전압 클램프 모드, 신경으로 고정-60mV 측정 시 냅 스 전류 (그림 4B)). 어떤 한 뉴런에서 수신 시 냅 스 드라이브의 양은 자발적 시 냅 스 이벤트 (그림 4C) 기록 하 여 측정할 수 있습니다. 전류-전압 관계 (I-v 곡선)을 신경 점점 depolarized 전위를 스텝으로 ...

이 종이 전체 셀 패치 클램프 기록 Xenopus laevis tadpoles의 retinotectal 회로 공부 하는 데 사용 하는 세 뇌 준비를 다루겠습니다. 그것의 자신의 특정 이점 각 준비 신경 회로 기능을 공부 하는 모델로 Xenopus 올챙이의 실험 추적성에 기여 한다.

준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

이 절차의 전반적인 목표는 발달 중 연결 패턴을 배우고 궁극적으로 신경 회로가 어떻게 형성되고 기능하는지 이해하기 위해 올챙이 시신경의 뉴런에서 전체 세포 전기생리학적 기록을 얻는 것입니다. 이 방법은 발달 과정에서 뉴런이 어떻게 변화하는지, 회로가 어떻게 기능을 하여 행동을 유발하는지와 같은 신경 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 제제의 주요 장점은 시신경 뉴런의 전기 생리학적 기록을 통해 발달 중인 신경 회로의 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Zhenyu Lui입니다. 폐기 이송 피펫을 사용하여 마취된 올챙이를 외부 기록 용액이 들어 있는 해부 기록 접시로 옮깁니다. 마취된 올챙이를 해부 기록 접시 바닥에 있는 물에 잠긴 실리콘 블록에 고정합니다.뇌를 명확하게 보려면 멸균된 25게이지 바늘을 사용하여 정중선을 따라 표재성 절개를 하여 뇌 위에 있는 피부를 제거합니다. 바늘을 신경관에 삽입하고 바닥판은 그대로 두고 튜브의 등쪽 부분이 깨끗하게 절단되도록 부드럽게 위로 당겨 동일한 정중선 축을 따라 뇌를 필링합니다. 뇌를 분리하려면 먼저 25게이지 바늘을 사용하여 뒷뇌를 절단합니다.그런 다음 뇌 아래의 바늘을 꼬리에서 꼬리 방향으로 부드럽게 움직여 모든 측면 및 복부 결합 조직과 신경 섬유를 절단합니다. 다음으로, 후각구 중 하나에 핀 하나를 삽입하고 후뇌에 다른 핀을 삽입하여 뇌를 실리콘 엘라스토머 블록에 고정합니다. 이것은 지각 뉴런에서 기록하기 위한 최적의 구성입니다.그런 다음 고정된 전뇌 제제가 들어 있는 접시를 해부 스코프에서 전기생리학 장비로 옮깁니다. 깨진 유리 피펫을 사용하여 심실막을 제거합니다. 망막 신경절 축삭돌기를 직접 활성화하려면 양극성 자극 전극을 시신경 관절 위로 부드럽게 내려 조직에 작은 움푹 들어간 곳이 형성되도록 합니다.양극성 자극 전극은 상부에 있어야 하며 시신경이 위치한 큰 중뇌실에 거의 인접해야 합니다. 바이폴라 전극은 펄스 자극기에 의해 구동되어 자극의 강도를 정밀하게 제어할 수 있습니다. 수평 뇌 슬라이스를 준비하려면 전체 뇌 준비부터 시작하십시오.그런 다음 면도날을 사용하여 한 시신경의 한쪽 측면에서 가장 측면이 있는 4분의 1을 절제합니다. 이 절단은 꼬리 편과 평행하게 만들어집니다. 그런 다음, 얇게 썬 면이 위를 향하도록 뇌를 실리콘 엘라스토머 측면에 다시 고정하여 체세포와 뉴로필에 직접 접근하여 기록을 위해 접근할 수 있고 뇌의 심실 표면이 실리콘 엘라스토머 블록에서 반대쪽을 향하도록 하여 바이폴라 전극을 시신경 카이즘에 배치할 수 있습니다.그런 다음 전체 세포 패치 클램프 또는 국소 자기장 전위 기록을 수행합니다. 다음은 수평 뇌 절편 준비의 구성을 보여주는 개략도입니다. 자극 전극은 시신경 카이즘에 남아 있지만, 기록 피펫은 이제 수평 뇌 절편 준비에 의해 노출된 모든 구조층의 세포에 접근할 수 있도록 배치됩니다.이것은 지각층의 표재층에 있는 뉴런에서 유발된 망막 신경절 유발 반응입니다. 이 그림에서는 뉴로필(neuropil)에 걸쳐 기록된 전위(field potentials)와 변환된 전류 소스 밀도(current source density)가 이미지 플롯으로 표시됩니다. 이 기술은 일단 마스터하면 10분 이내에 완료할 수 있으며 일반적으로 최대 3-4시간 동안 완료할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 지각 뉴런의 전기적 특성과 연결성을 정량화하기 위해 전체 세포 기록을 위해 전체 뇌 및 수평 뇌 절편 준비를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이것은 Xenopus laevis oocytes에서 클​​램프의 녹음 패치에 대한 소개로서 것입니다. 그것은 vitelline 막 제거, gigaohm 인감 (gigaseal)의 형성, 그리고 외부 아웃 토폴로지에 패치의 선택 변환을 다룹니다.

Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

BK 채널 이온 전류는 패치 클램프 기법을 사용하여 기록됩니다. BK 채널로...

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 Mauthner 뉴런 및 기타 망상 척수 세포의 전기적 특성을 연구하는 방법인 전체 세포 패치 클램프 전기생리학이라는 기술을 설명합니다.

Whole-Cell Patch Clamp 전기생리학: 뉴런의 전기적 특성을 연구하는 방법

이 비디오는 플랫 마운트 마우스 망막에서 전기 생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 기술을 보여줍니다. 전극이 있는 얇은 유리 피펫을 사용하여 망막 내의 별방울 무축삭 세포(SAC)에 접근합니다. 씰을 형성한 후 흡입이 가해져 멤브레인을 파열하고 전체 세포 패치 클램프 구성을 형성합니다. 마지막으로, SAC 시냅스 수용체를 통한 이온의 흐름은 구성을 사용하여 측정됩니다.

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

이 비디오는 전체 세포 패치 전류 클램프를 사용하여 형광 단백질을 발현하는 신경 세포의 흥분성을 연구하는 방법을 보여줍니다. 전류 클램프 모드에서는 신경 흥분성을 나타내는 활동 전위가 생성됩니다.

Whole-Cell Patch Clamp를 사용한 형광 뉴런의 흥분성 연구

이 비디오는 뉴런 발화 패턴을 분석하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 척수 절편의 SG(substantia gelatinosa) 뉴런에서 전기생리학적 기록을 수행하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 척수의 SG 뉴런의 자극에 대한 신경 반응을 연구할 수 있습니다.

척수 절편의 실질체 젤라티노사 뉴런에서 기록하는 전체 세포 패치 클램프

이 비디오는 패치 클램프 기술을 사용하여 유변기저와 막 전위를 측정하고 증분 전류 주입에 대한 뉴런의 반응을 분석하여 등쪽 신경절의 감각 뉴런 흥분성을 검사하는 방법을 보여줍니다.

온전한 쥐 등쪽 뿌리 신경절에 대한 전체 세포 패치 클램프 기록

우리는 zebrafish의 배아에서 MAUTHNER 뉴런과 다른 reticulospinal 세포 패치 클램프 녹음을 통해 전기적 활동을 기록하고 모니터링 할 수있는 그대로 뇌 - 척수 준비를 개발했습니다. 따라서, 우리는 배아의 주요 신경 세포에서 흥분성과 억제 성 시냅스 전류, 전압 문 채널 활동 및 활동 전위를 기록 할 수 있습니다.

배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

이 논문은 단일 세포 수준과 형광 표지 된 뉴런의 흥분성 뉴런의 연결 구조를 설명하는 자궁 전기 (IUE)에서 사용하는 프로토콜을 제공한다. 조직학은 수지상 및 축삭 돌기를 특성화하는 데 사용됩니다. 급성 슬라이스 전체 셀 기록 흥분성을 조사하기 위해 사용된다.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

우리는 쥐 cauda epididymides에서 일차 해부 상피 세포의 전기적 특성을 측정하기 위해 세포 격리와 whole-cell patch-clamp recording을 결합한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 epididymis의 생리적 인 역할을 더 해명하기 위해 원발성 부고환 상피 세포의 기능적 특성을 조사 할 수있게합니다.

부고환에서 분리 된 1 차 상피 세포의 전체 세포 패치 - 클램프 기록

배우세요 Xenopus laevis 올챙이 시각정점 신경회로의 전체세포 패치클램프 기록법을 통해 발달 중인 신경세포의 연결성과 전기생리학적 특성을 분석하는 방법입니다.

준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

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