Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of <em>Xenopus laevis</em> Tectal Neurons

Zhenyu Liu; Katelynne B. Donnelly; Kara G. Pratt

doi:10.3791/57465

준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

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Neuroscience

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Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

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05:25 min

March 15, 2018

DOI: 10.3791/57465-v

Zhenyu Liu¹, Katelynne B. Donnelly¹, Kara G. Pratt¹

¹Department of Zoology and Physiology and Program in Neuroscience,University of Wyoming

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study explores whole cell patch clamp recording techniques to study the retinotectal circuit in Xenopus laevis tadpoles. By utilizing different brain preparations, the research aims to understand the connectivity patterns of neurons in the tadpole optic tectum during development and the overall function of neural circuits.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Electrophysiology
Neural Circuitry

Background

Investigating how neural circuits form and function in developing organisms.
The retinotectal circuit is crucial for visual processing in amphibians.
Xenopus laevis tadpoles serve as a valuable model for studying neural connectivity.
Whole cell recordings provide detailed insights into neuronal activity.

Purpose of Study

To understand the patterns of connectivity among neurons in the optic tectum.
To analyze how neurons change throughout development.
To explore how neural circuits contribute to behavior.

Methods Used

Whole cell patch clamp methods were used for electrophysiological recordings.
The biological model involved dissected tadpole brains to study optic tectum neurons.
No multiomics workflows were mentioned.
Specific steps included immobilizing the tadpole, isolating the brain, and performing targeted recordings.
The methods allow recording within a crucial timeframe of 10 minutes, typically lasting for several hours.

Main Results

The preparations successfully facilitated the recording of neuron activity in the tectum.
Electrophysiological changes indicative of neural connectivity were observed.
The results prompted discussions on the functional implications of the retinotectal circuit.
Findings contribute to understanding developmental neural circuitry.

Conclusions

This research demonstrates effective methods for studying neural connectivity in developing tadpole brains.
The study enhances understanding of neural circuit function during development.
Results have broader implications for examining neurological processes and behaviors in amphibians.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using Xenopus laevis tadpoles for neural studies?

Xenopus laevis tadpoles offer a simplified model for studying neural circuits and are amenable to electrophysiological techniques due to their transparent bodies and accessible brain structures.

How are whole cell recordings performed on tadpole neurons?

Whole cell recordings are performed after isolating the tadpole brain, allowing direct access to tectal neurons via a recording pipette.

What types of outcomes can be obtained from this method?

Electrophysiological data such as action potentials, synaptic responses, and neuronal connectivity can be obtained from the recordings.

How might these techniques be adapted for use in other species?

The dissection and recording techniques could be modified to fit other amphibians or vertebrates with similar brain structures for comparative neuroscience studies.

Are there any limitations to this method?

One limitation is that the preparation requires significant skill and may have variable success rates depending on the operator.

What insights do the findings provide regarding neural circuit function?

The findings highlight the importance of specific connectivity patterns in the retinotectal circuit, elucidating how these connections may evolve during development.

이 종이 전체 셀 패치 클램프 기록 Xenopus laevis tadpoles의 retinotectal 회로 공부 하는 데 사용 하는 세 뇌 준비를 다루겠습니다. 그것의 자신의 특정 이점 각 준비 신경 회로 기능을 공부 하는 모델로 Xenopus 올챙이의 실험 추적성에 기여 한다.

이 절차의 전반적인 목표는 발달 중 연결 패턴을 배우고 궁극적으로 신경 회로가 어떻게 형성되고 기능하는지 이해하기 위해 올챙이 시신경의 뉴런에서 전체 세포 전기생리학적 기록을 얻는 것입니다. 이 방법은 발달 과정에서 뉴런이 어떻게 변화하는지, 회로가 어떻게 기능을 하여 행동을 유발하는지와 같은 신경 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 제제의 주요 장점은 시신경 뉴런의 전기 생리학적 기록을 통해 발달 중인 신경 회로의 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Zhenyu Lui입니다. 폐기 이송 피펫을 사용하여 마취된 올챙이를 외부 기록 용액이 들어 있는 해부 기록 접시로 옮깁니다. 마취된 올챙이를 해부 기록 접시 바닥에 있는 물에 잠긴 실리콘 블록에 고정합니다.

뇌를 명확하게 보려면 멸균된 25게이지 바늘을 사용하여 정중선을 따라 표재성 절개를 하여 뇌 위에 있는 피부를 제거합니다. 바늘을 신경관에 삽입하고 바닥판은 그대로 두고 튜브의 등쪽 부분이 깨끗하게 절단되도록 부드럽게 위로 당겨 동일한 정중선 축을 따라 뇌를 필링합니다. 뇌를 분리하려면 먼저 25게이지 바늘을 사용하여 뒷뇌를 절단합니다.

그런 다음 뇌 아래의 바늘을 꼬리에서 꼬리 방향으로 부드럽게 움직여 모든 측면 및 복부 결합 조직과 신경 섬유를 절단합니다. 다음으로, 후각구 중 하나에 핀 하나를 삽입하고 후뇌에 다른 핀을 삽입하여 뇌를 실리콘 엘라스토머 블록에 고정합니다. 이것은 지각 뉴런에서 기록하기 위한 최적의 구성입니다.

그런 다음 고정된 전뇌 제제가 들어 있는 접시를 해부 스코프에서 전기생리학 장비로 옮깁니다. 깨진 유리 피펫을 사용하여 심실막을 제거합니다. 망막 신경절 축삭돌기를 직접 활성화하려면 양극성 자극 전극을 시신경 관절 위로 부드럽게 내려 조직에 작은 움푹 들어간 곳이 형성되도록 합니다.

양극성 자극 전극은 상부에 있어야 하며 시신경이 위치한 큰 중뇌실에 거의 인접해야 합니다. 바이폴라 전극은 펄스 자극기에 의해 구동되어 자극의 강도를 정밀하게 제어할 수 있습니다. 수평 뇌 슬라이스를 준비하려면 전체 뇌 준비부터 시작하십시오.

그런 다음 면도날을 사용하여 한 시신경의 한쪽 측면에서 가장 측면이 있는 4분의 1을 절제합니다. 이 절단은 꼬리 편과 평행하게 만들어집니다. 그런 다음, 얇게 썬 면이 위를 향하도록 뇌를 실리콘 엘라스토머 측면에 다시 고정하여 체세포와 뉴로필에 직접 접근하여 기록을 위해 접근할 수 있고 뇌의 심실 표면이 실리콘 엘라스토머 블록에서 반대쪽을 향하도록 하여 바이폴라 전극을 시신경 카이즘에 배치할 수 있습니다.

그런 다음 전체 세포 패치 클램프 또는 국소 자기장 전위 기록을 수행합니다. 다음은 수평 뇌 절편 준비의 구성을 보여주는 개략도입니다. 자극 전극은 시신경 카이즘에 남아 있지만, 기록 피펫은 이제 수평 뇌 절편 준비에 의해 노출된 모든 구조층의 세포에 접근할 수 있도록 배치됩니다.

이것은 지각층의 표재층에 있는 뉴런에서 유발된 망막 신경절 유발 반응입니다. 이 그림에서는 뉴로필(neuropil)에 걸쳐 기록된 전위(field potentials)와 변환된 전류 소스 밀도(current source density)가 이미지 플롯으로 표시됩니다. 이 기술은 일단 마스터하면 10분 이내에 완료할 수 있으며 일반적으로 최대 3-4시간 동안 완료할

수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 지각 뉴런의 전기적 특성과 연결성을 정량화하기 위해 전체 세포 기록을 위해 전체 뇌 및 수평 뇌 절편 준비를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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