준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜
2018년 3월 15일
이 종이 전체 셀 패치 클램프 기록 Xenopus laevis tadpoles의 retinotectal 회로 공부 하는 데 사용 하는 세 뇌 준비를 다루겠습니다. 그것의 자신의 특정 이점 각 준비 신경 회로 기능을 공부 하는 모델로 Xenopus 올챙이의 실험 추적성에 기여 한다.
이 절차의 전반적인 목표는 발달 중 연결 패턴을 배우고 궁극적으로 신경 회로가 어떻게 형성되고 기능하는지 이해하기 위해 올챙이 시신경의 뉴런에서 전체 세포 전기생리학적 기록을 얻는 것입니다. 이 방법은 발달 과정에서 뉴런이 어떻게 변화하는지, 회로가 어떻게 기능을 하여 행동을 유발하는지와 같은 신경 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 제제의 주요 장점은 시신경 뉴런의 전기 생리학적 기록을 통해 발달 중인 신경 회로의 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있다는 것입니다.
이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Zhenyu Lui입니다. 폐기 이송 피펫을 사용하여 마취된 올챙이를 외부 기록 용액이 들어 있는 해부 기록 접시로 옮깁니다. 마취된 올챙이를 해부 기록 접시 바닥에 있는 물에 잠긴 실리콘 블록에 고정합니다.
뇌를 명확하게 보려면 멸균된 25게이지 바늘을 사용하여 정중선을 따라 표재성 절개를 하여 뇌 위에 있는 피부를 제거합니다. 바늘을 신경관에 삽입하고 바닥판은 그대로 두고 튜브의 등쪽 부분이 깨끗하게 절단되도록 부드럽게 위로 당겨 동일한 정중선 축을 따라 뇌를 필링합니다. 뇌를 분리하려면 먼저 25게이지 바늘을 사용하여 뒷뇌를 절단합니다.
그런 다음 뇌 아래의 바늘을 꼬리에서 꼬리 방향으로 부드럽게 움직여 모든 측면 및 복부 결합 조직과 신경 섬유를 절단합니다. 다음으로, 후각구 중 하나에 핀 하나를 삽입하고 후뇌에 다른 핀을 삽입하여 뇌를 실리콘 엘라스토머 블록에 고정합니다. 이것은 지각 뉴런에서 기록하기 위한 최적의 구성입니다.
그런 다음 고정된 전뇌 제제가 들어 있는 접시를 해부 스코프에서 전기생리학 장비로 옮깁니다. 깨진 유리 피펫을 사용하여 심실막을 제거합니다. 망막 신경절 축삭돌기를 직접 활성화하려면 양극성 자극 전극을 시신경 관절 위로 부드럽게 내려 조직에 작은 움푹 들어간 곳이 형성되도록 합니다.
양극성 자극 전극은 상부에 있어야 하며 시신경이 위치한 큰 중뇌실에 거의 인접해야 합니다. 바이폴라 전극은 펄스 자극기에 의해 구동되어 자극의 강도를 정밀하게 제어할 수 있습니다. 수평 뇌 슬라이스를 준비하려면 전체 뇌 준비부터 시작하십시오.
그런 다음 면도날을 사용하여 한 시신경의 한쪽 측면에서 가장 측면이 있는 4분의 1을 절제합니다. 이 절단은 꼬리 편과 평행하게 만들어집니다. 그런 다음, 얇게 썬 면이 위를 향하도록 뇌를 실리콘 엘라스토머 측면에 다시 고정하여 체세포와 뉴로필에 직접 접근하여 기록을 위해 접근할 수 있고 뇌의 심실 표면이 실리콘 엘라스토머 블록에서 반대쪽을 향하도록 하여 바이폴라 전극을 시신경 카이즘에 배치할 수 있습니다.
그런 다음 전체 세포 패치 클램프 또는 국소 자기장 전위 기록을 수행합니다. 다음은 수평 뇌 절편 준비의 구성을 보여주는 개략도입니다. 자극 전극은 시신경 카이즘에 남아 있지만, 기록 피펫은 이제 수평 뇌 절편 준비에 의해 노출된 모든 구조층의 세포에 접근할 수 있도록 배치됩니다.
이것은 지각층의 표재층에 있는 뉴런에서 유발된 망막 신경절 유발 반응입니다. 이 그림에서는 뉴로필(neuropil)에 걸쳐 기록된 전위(field potentials)와 변환된 전류 소스 밀도(current source density)가 이미지 플롯으로 표시됩니다. 이 기술은 일단 마스터하면 10분 이내에 완료할 수 있으며 일반적으로 최대 3-4시간 동안 완료할
수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 지각 뉴런의 전기적 특성과 연결성을 정량화하기 위해 전체 세포 기록을 위해 전체 뇌 및 수평 뇌 절편 준비를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
본 연구에서는 Xenopus laevis 올챙이의 망막-시각덮개 회로를 연구하기 위한 전세포 패치 클램프 기록 기술을 탐구합니다. 다양한 뇌 표본 준비법을 활용하여, 발달 과정 중 올챙이 시각덮개 내 뉴런의 연결 패턴과 신경 회로의 전반적인 기능을 이해하는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 전기생리학
- 신경 회로
배경
- 발달 중인 생물체에서 신경 회로가 어떻게 형성되고 기능하는지 조사합니다.
- 망막-시각덮개 회로(retinotectal circuit)는 양서류의 시각 처리에 매우 중요합니다.
- Xenopus laevis 올챙이는 신경 연결성을 연구하는 데 유용한 모델이 됩니다.
- 전세포 기록법(Whole cell recordings)은 뉴런 활동에 대한 세부적인 통찰을 제공합니다.
연구 목적
- 시각덮개(optic tectum) 내 뉴런 간의 연결 패턴을 이해하기 위함입니다.
- 발달 과정 전반에 걸쳐 뉴런이 어떻게 변화하는지 분석하기 위함입니다.
- 신경 회로가 행동에 어떻게 기여하는지 탐구하기 위함입니다.
사용된 방법
- 전기생리학적 기록을 위해 전세포 패치 클램프(Whole cell patch clamp)법이 사용되었습니다.
- 생물학적 모델로는 시각덮개(optic tectum) 뉴런을 연구하기 위해 해부된 올챙이 뇌가 사용되었습니다.
- 멀티오믹스 워크플로우는 언급되지 않았습니다.
- 구체적인 단계에는 올챙이 고정, 뇌 분리 및 표적 기록 수행이 포함되었습니다.
- 이 방법은 보통 수 시간 동안 지속되며, 10분이라는 중요한 시간 범위 내에서 기록이 가능합니다.
주요 결과
- 이 전처리를 통해 시각덮개(tectum) 내 뉴런 활동 기록이 성공적으로 이루어졌습니다.
- 신경 연결성을 나타내는 전기생리학적 변화가 관찰되었습니다.
- 이 결과는 망막-시각덮개 회로(retinotectal circuit)의 기능적 함의에 대한 논의를 촉발했습니다.
- 본 연구 결과는 발달 중인 신경 회로를 이해하는 데 기여합니다.
결론
- 본 연구는 발달 중인 올챙이 뇌의 신경 연결성을 연구하기 위한 효과적인 방법들을 제시합니다.
- 이 연구는 발달 과정 중 신경 회로 기능에 대한 이해를 높여줍니다.
- 연구 결과는 양서류의 신경학적 과정과 행동을 조사하는 데 있어 더 광범위한 시사점을 제공합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
Xenopus laevis 올챙이에서의 전세포 패치 클램프 기록(Whole cell patch clamp recording)은 신경 회로의 형성 및 기능에 대한 고해상도 조사를 가능하게 하여, 발달 과정 중의 시냅스 연결성과 신경 세포 흥분성에 대한 기전적 통찰을 제공합니다. 이 접근 방식은 시각 피개(optic tectum)에서 망막 신경절 세포에 의해 유도된 활동과 같이, 정의된 자극에 대한 신경 세포의 반응을 직접 측정함으로써 신경과학 분야의 표적 검증을 지원합니다. 생체 내(in vivo), 전체 뇌, 그리고 수평 절편 표본 전반에 걸친 이 방법의 적응성은 신경 발달 표적의 전임상 위험 제거를 위한 재현성과 확장성을 향상시킵니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 감각 입력에 대한 신경 세포의 반응을 정량화하여 치료 가설의 검증을 가능하게 하며, 발달 중인 회로의 기능적 연결성을 명확히 합니다.
- 운영적 가치: 신경 세포 활동의 직접적인 전기생리학적 판독을 통해 생물학적 리스크 감소(de-risking)를 지원하며, 표적 결합의 모호성을 줄입니다.
- 예측적 가치: 유전적 또는 약리학적 섭동을 시각덮개(tectal) 신경 세포의 흥분성 및 시냅스 통합의 측정 가능한 변화와 연결함으로써 포트폴리오 우선순위 결정(triage)을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 어세이 준비도: 정의된 자극-반응 특성을 가진 안정적이고 기록 가능한 신경세포 표본을 구축함으로써, 후속 화합물 스크리닝을 위한 검증된 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 정량적 출력: 시냅스 후 전류 및 장 전위와 같은 전기생리학적 측정값을 생성하여, 용량-반응 분석 및 화합물 효과의 정량화를 가능하게 합니다.
- 플랫폼 재사용: 수평 뇌 절편 표본 제작을 통해 모든 시각덮개 층에서 기록이 가능하며, 반복적인 실험 세션의 처리량과 일관성을 높여줍니다.
중개 및 전임상 연구
- 질병 관련성: 회로 오결선과 관련된 장애와 연관된 신경 발달 과정을 모델링하여, 중개 생체지표 탐색을 지원합니다.
- 전임상 연속성: 발달 단계별로 뉴런 기능을 일관되게 기록함으로써 발견과 검증 단계를 연결합니다.
- 위험 조정 결정: 전기생리학적 표현형에 기반한 진행/중단(go/no-go) 기준을 지원하여, 신경 발달 프로그램의 후기 단계 실패 위험을 줄입니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 방법은 리드 최적화 이전에 신경 세포 표적의 기능적 검증을 제공함으로써 초기 발굴 워크플로우에 통합되며, 그 결과는 표적 선택과 기전 이해 모두에 정보를 제공합니다.
- 발견 생물학: 망막 신경절 세포 축삭 자극 후 시개 뉴런에서 유발된 반응을 기록함으로써 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 재현 가능한 전뇌 및 절편 준비를 통해 분석 표준화를 가능하게 하여, 화합물 스크리닝을 위한 정량화 가능한 전기생리학적 판독값을 제공합니다.
- 분석: 전류 진폭 및 잠복기와 같은 정량적 종속 변수 측정을 제공하여 실험 조건 간의 비교를 용이하게 합니다.
- 중개 연구: 준비 과정 전반에 걸쳐 질환 관련 회로 특성을 유지함으로써 전임상 타당성과 연결하고 바이오마커 일치를 지원합니다.
- 기업 재사용: 다양한 실험 상황에 적응 가능한 재사용 가능한 전기생리학적 플랫폼을 구축하여 중복적인 방법 개발을 줄입니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 직접적인 신경세포 기록을 통해 기전적 모호성을 줄임으로써 표적 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운용적 가치: in vivo, 전뇌 및 슬라이스 방법론에 대한 정의된 준비 프로토콜을 통해 실험실 간 재현성과 표준화를 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 효능이 없는 화합물을 조기에 발견할 수 있게 하여 실행 불가능한 표적에 대한 투자를 줄임으로써 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 전기생리학적 결과와 회로 수준의 기능을 연결함으로써 리스크 조정된 추진 결정에 정보를 제공합니다.
구현 시 고려 사항
- 일관된 뇌 조직 준비를 위해 전기생리학 및 미세수술 해부 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 신뢰할 수 있는 유발 반응을 얻기 위해 안정적인 세포 외 기록 용액과 기능적인 자극 장비가 필요합니다.
- 데이터의 비교 가능성을 보장하기 위해 자극 파라미터 및 기록 설정에 대한 팀 간의 표준화가 필요합니다.
- 모델 시스템 간의 적용 시, 뇌의 크기와 접근성에 따라 해부 및 플레이팅 방법을 조정해야 할 수 있습니다.
- 실제적인 제한 사항으로는 작업자에 따른 성공률 차이와 장시간 기록 세션 동안의 준비물 안정성 등이 있습니다.
