공유 결합은 자기 조립 단분자막의 접근 방식을 사용하여 표면에 BMP-2의 결합

이 절차의 전반적인 목표는 BMP 두 분자를 생체 활성을 잃지 않고 표면에 공유 결합하는 것입니다. 이것은 먼저 물리적 기상 증착에 의해 기판에 금 층을 형성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 mu NHSA 이중 기능 NHS Thiol 링커의 자체 조립 단층을 만드는 것입니다.

다음으로, RH BMP 2는 링커에 공유 결합됩니다. 마지막 단계는 초음파 처리에 의해 비 결합 BMP 2를 제거하는 것입니다. 궁극적으로, 항체 결합 분석법은 BMP 2가 표면에 성공적으로 결합하는 것을 보여주기 위해 사용되며, SMA 1 5 8 인산화를 분석하여 세포 내에서 표면 결합 BMP 2의 생물학적 활성을 측정합니다.

이 방법은 세포 표면의 수용체에 대한 성장 인자의 초기 결합이 신호 반응을 유발하기에 충분한지와 같은 성장 인자 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 두 구성원인 Teresa Paul과 Elizabeth Schwab입니다. 이 절차를 시작하려면 정밀 와이프로 유리 커버 슬립을 청소하고 에틸 아세테이트와 메탄올의 일대일 혼합물에서 5분 동안 초음파 처리합니다.

초음파 처리 후, 기판을 메탄올로 헹구고 질소 흐름으로 건조시킵니다. 깨끗한 기판을 스퍼터 코팅 장치에 넣고 챔버를 비우십시오. 60초 동안 스퍼터링하여 크롬 타겟에서 가장 위쪽의 크롬 산화물 층을 제거합니다.

그런 다음 기판을 10나노미터 크롬 층으로 코팅한 다음 40나노미터 금 층으로 코팅합니다. 완료되면 챔버에서 금 기판을 제거하고 따로 보관하십시오. 금 기질을 2 넥 둥근 바닥 플라스크로 옮기고 질소 분위기에서 4 시간 동안 실온의 DMF에서 1 밀리 몰 M-U-N-H-S로 배양합니다.

배양 후 DMF에서 기질을 2분 동안 초음파 처리합니다. DMF와 메탄올로 헹구고 질소 흐름에서 건조시킵니다. RHB MP 2 원액을 PBS에 1몰 염화나트륨으로 희석하여 최종 농도가 밀리리터당 3.5마이크로그램이

사용 직전에 이 작업 용액을 멸균 8.5밀리몰 수산화칼륨으로 pH 10로 조정하십시오. 샘플 위에 A-P-D-M-S 링을 놓습니다. 기판을 6웰 플레이트로 옮겨 기판 표면만 배양 용액에 노출되도록 합니다.

그런 다음 기능화된 M-U-N-H-S 기판을 섭씨 4도에서 RHB MP 2 작업 솔루션으로 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 상층액을 제거한 후 PBS에 1 몰 염화나트륨을 첨가하고 2 분 동안 기질을 초음파 처리합니다. 완료되면 PBS에서 멸균 1몰 염화나트륨으로 기질을 세 번 세척하여 항체의 불특이적 흡수를 차단합니다.

PBS의 5%BSA에 함유된 기판을 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 완성되면 실온에서 1 시간 동안 항 BMP 2 항체 솔루션으로 기판을 배양하고 PBS로 기판을 두 번 세척하고 30 초 동안 초음파 처리합니다. 다음으로, HRP 접합 2차 항체 용액에 기질을 실온에서 30분 동안 배양한 다음 PBS로 2회 세척합니다.

Amply Flu Red Assay를 사용하여 570 나노 미터에서 플레이트 리더 시드로 HRP 효소 활성을 측정하고 성장 배지의 6 웰 플레이트에서 웰 당 10 번 10 번 C 2 개의 C 12 개의 근 아세포를 측정하고 섭씨 37도 및 5 % CO2에서 24 시간 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 제거한 후 웰에서 배지를 흡인하고 단기 신호 유도 조사를 위해 기능화된 BMP 2개의 기질 표면에 파종하기 전에 3-5시간 동안 혈청이 없는 DMEM에서 세포를 굶주립니다. 배지를 200마이크로리터의 새로운 무혈청 DMEM으로 교체하고 섭씨 37도 및 5%CO2에서 배양한 후 미세한 팁 핀셋을 사용하여 고정된 BMP 두 개의 기질을 세포 위에 놓습니다.

기판을 부드럽게 제거하고 피펫으로 매체를 흡인합니다. 그런 다음 PBS로 세포를 두 번 세척하고 장기적인 생물학적 활성 분석을 위해 겔 전기영동과 웨스턴 블로팅을 사용하여 세포 반응 분석을 진행합니다. 앞서 설명한 대로 세포를 표면에 플레이트화하고 섭씨 37도에서 2%FBS에서 5%CO2에서 6일 동안 배양합니다.

배양 후. RH BMP를 검증하기 위해 형광 현미경으로 세포를 이미지화하여 고정된 RH BMP를 나타내는 두 개의 결합 표면, BMP 2개, 특이 항체 2개와 HRP와 결합된 2차 항체를 배양했습니다. 표면 고정 RH BMP 2 또는 I BMP 2는 세포 자극 전후에 검출되었습니다.

여기에 표시된 것은 항 BMP 2 IgG에 의해 인식된 확인에서 RH BMP 2를 표면에 성공적으로 결합한 것입니다. amli flu red chole metric assay를 사용하여 표면 고정 RH BMP 2를 정량화하고, 세포 자극 후에도 단백질이 여전히 표면에서 검출되었음을 보여주며, 고정된 RHB MP 2를 나타내는 표면에 대한 세포 반응을 평가하고 처리되지 않은 금 기질의 효과와 비교했습니다. 여기서, C, 2, C, 12 세포를 상부에서 접근하는 RHB MP 2개의 기능화된 표면에 의해 30분 동안 자극하였다.

이 모델에서 BMP two는 세포가 다핵 근관으로 분화되는 것을 억제하고 조골세포 표현형을 유도합니다. BMP 2 신호 경로의 다운스트림 리포터인 SMAD 1 5 8의 활성화는 여기에 표시된 바와 같이 웨스턴 블로팅에 의해 분석됩니다. SM 인산화는 I BMP 2에 의한 30분 자극 후 관찰되는 반면, 처리되지 않은 금 샘플에 노출된 세포에서는 SMAD 1 58의 인산화가 발생하지 않습니다.

이 결과는 고정화 과정이 BMP 2의 단기 활성을 변경하지 않고 I BM P 2가 장기적인 골형성 분화에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 SMAD 신호의 초기 단계를 트리거한다는 것을 나타냅니다. 알칼리성 인산가수분해효소의 발현 수준은 콜레 메트릭 분석법으로 조사되었습니다. C, 2, C, 12 세포의 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 일반 금 및 IBP 2개 표면에서 6일 동안 세포를 배양한 후 측정했습니다.

I BM P 두 표면에서 배양된 세포의 용해물에서 알칼리성 인산가수분해효소 활성은 대조군에 비해 상당히 높은 흡수율을 보여주었습니다. 이 결과는 IBMP 2가 IBP 2의 효과를 조사하기 위해 C 2 C 12 세포에서 알칼리성 인산가수분해효소의 발현을 유도한다는 것을 보여줍니다. Myogenesis C에서 두 개의 C 12 세포를 금 또는 기능화된 표면에 직접 도금하고 저혈청 조건에서 배양했습니다.

6일 후, 여기에 나타난 바와 같이 미오신 중쇄의 염색을 수행했습니다. C, 2, C, 12 세포는 금 기질의 세포와 대조적으로 I, BM, P, 2의 존재 하에서 미오신 중쇄 양성 근관을 형성하지 못했습니다. 이 절차에 따라 금 나노 입자에 BMP 2를 고정시키는 것과 같은 다른 방법을 수행하여 추가 질문에 답할 수 있습니다.

예를 들어, 신호 응답을 효율적으로 트리거하기 위해 고정된 BMP 2의 양이 로컬에서 얼마나 필요한지 알 수 있습니다.