Name: 공유 결합은 자기 조립 단분자막의 접근 방식을 사용하여 표면에 BMP-2의 결합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 배우세요 자기 조립 단분자막을 이용한 BMP-2의 공유 결합 표면 고정화 방법을 통해 생물학적 활성을 유지하면서 성장 인자 신호 전달을 연구하는 기술입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

우리는 자신의 종류의 지원에 교수 JP 파츠 (생물 물리 화학과, 하이델베르크 대학교 및 새로운 재료 및 바이오 시스템학과, 지능형 시스템을위한 맥스 플랑크 연구소, 슈투트가르트) 감사합니다. 막스 플랑크 먼과 도이치 Forschungsgemeinschaft (EAC-A에 DFG SFB/TR79.)에서 재정 지원도 크게 인정합니다.

1. 11-Mercaptoundecanoyl-N-히드 록시 에스테르 (MU-NHS)의 합성 <ol><li> 실온 (RT)에서 40 ㎖ 디클로로 메탄 (PA)에있는 10 ㎖의 아세톤 (PA)에있는 (디메틸 아미노) 피리딘 1g에 11 mercaptoundecanoic 산 - 500 mg의 N-하이드 록시의 솔루션과 30 mg의 4 적하 추가합니다. </li><li> 0 ° C에 대한 반응을 냉각과 적하 1.1 g의 N (질소 분위기 하에서) 10 ㎖ 용액에 N &#39;- 디시 클로 헥실를 추가합니다. 1 시간 동안 저온에서 반응을 계속 한 후 실온에서 밤새 교반 하였다. </li><li> 침전물을 여과하고 감압 하에서 건조. 1:1 비율 석유 벤젠, 에틸 아세테이트 (PA)으로 플래쉬 크로마토 그래피에 의해 생성물을 정제 하였다. </li></ol> 2. 동종 골드 레이어의 준비 <ol><li> 정밀 물티슈 및 에틸 아세테이트 (PA) 및 메탄올 (PA)의 1:1 혼합물을 함유하는 용액에 5 분 동안 초음파 처리들을 깨끗한 유리 커버 슬립. RINS전자 메탄올 기판 및 질소 흐름 하에서 건조. </li><li> 스퍼터 코팅 장치의 깨끗한 기판을 놓습니다. 챔버 대피. 60 초간 스퍼터링에 의해 크롬 타겟으로부터 최상부의 크롬 산화물 층을 제거한다. 금속 빔과 40 nm의 금 층으로 코팅 한 다음에 10 nm의 크롬 층과 코트를 아래의 샘플을 놓습니다. </li></ol> 3. BMP-2의 표면 고정화 <ol><li> 약 1 ㎜의 최종 농도에서 N MU-NHS, N-dimethlyformamide (DMF)에 용해시키고, 질소 대기 하에서 4 시간 동안 RT에서 MU-NHS 용액에 금 기판을 부화. </li><li> 2 분 DMF에 초음파 처리 표면은, DMF 및 MeOH로 세척하고 질소 흐름 하에서 건조. </li><li> 100 ㎍ / ㎖ (-80 ° C에서 보관 분량 씩)의 농도로 멸균 4 mM의 염산에 rhBMP-2의 주식 솔루션을 준비합니다. 작업 희석액 (3.5 ㎍ / ㎖)의 경우, PBS / 염화나트륨 (PBS 1 M NaCl을 함유)과의 원액을 희석사용하기 직전에 pH를 8.5로 djust. </li><li> 4 ° C 하룻밤에 rhBMP-2 작업 솔루션에 MU-NHS를 기능화 표면을 품어. 배양 상층 액을 제거합니다. 초음파 처리 2 분 동안 PBS / 염화나트륨의 표면과 멸균 PBS / NaCl로 3 배 씻는다. </li></ol> 4. 표면 특성 <ol><li> 항체의 비특이적 흡착을 차단하기 위해, 5 % BSA와 표면을 품어 (w / v)의 안티 - BMP-2 항체 (1:100 1 % (W / V를 배양 한 다음 실온에서 1 시간을위한 PBS 용액 RT에서 1 시간 동안) BSA / PBS 용액). PBS와 30 초 동안 초음파 처리로 두 번 표면을 세척 할 것. </li><li> 다음 PBS로 두 번 씻어 RT에서 30 분 동안 HRP - 복합 이차 항체 (1:1,000 1 % (W / V) BSA / PBS 용액)으로 기판을 품어. </li><li> 플레이트 리더로 ​​570 nm에서 HRP의 효소 활성을 측정하기 위해 Ampliflu 레드 분석을 사용합니다. </li></ol> 5. 생물학적 활성 분석 <ol><li> 6 자 PL 잘 당 종자 1 × 10 5 마우스 C2C12의 근육 아세포10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 37 ° C / 5 % CO 2에서 24 시간 동안 배양들을 보충 된 피루브산을 함유하는 하이 글루코스 DMEM 이루어진 증식 배지에서 ATES. </li><li> 고정 된 BMP-2 장식 표면에 파종하기 전에 3-5 시간 동안 혈청이없는 DMEM 세포를 굶어. </li><li> 단기 신호 유도의 조사를 위해, 200 ㎕의 신선한 혈청이없는 DMEM에 의해 매체를 교체하고 세포 위의 고정 된 BMP-2 표면을 배치합니다. 표면이 긁히지 않도록 좋은 팁 핀셋으로 취급되어야한다. </li><li> 부드럽게 표면을 제거하고 피펫 매체를 대기음, PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 세포 반응의 분석을 진행합니다. </li><li> 장기 생물학적 활성, 플레이트 세포의 분석 상 6 일 동안 낮은 혈청 조건 (2 % FBS)에서 37 ° C / 5 % CO 2의 표면과 문화를 그들. </li></ol>

<ol><li>Helm, G., Andersson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Summary+statement%3A+Bone+morphogenetic+proteins%3A+Basic+science%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science.</a> Spine. 27 (16S), S9(2002).</li>
<li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+multifunctional+regulators+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development.</a> Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).</li>
<li>Reddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPs%3A+from+bone+morphogenetic+proteins+to+body+morphogenetic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).</li>
<li>Rengachary, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+basic+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg+Focus%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: basic concepts.</a> Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).</li>
<li>Schlunegger, M., Grütter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+feature+revealed+by+the+crystal+structure+at+2.2+%C3%85%3B+resolution+of+human+transforming+growth+factor-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2.</a> Nature. 358, 430-434 (1992).</li>
<li>Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+bone+morphogenetic+protein-2+at+2.7+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution.</a> J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).</li>
<li>Nimni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polypeptide+growth+factors%3A+targeted+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polypeptide growth factors: targeted delivery systems.</a> Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).</li>
<li>Wozney, J., Rosen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein+and+bone+morphogenetic+protein+gene+family+in+bone+formation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Related+Res%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair.</a> Clin. Orthop. Related Res. 346, 26(1998).</li>
<li>Rosen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+and+BMP+inhibitors+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">BMP and BMP inhibitors in bone.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).</li>
<li>Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+BMP-2-BRIA+ectodomain+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex.</a> Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).</li>
<li>Keller, S., Nickel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recognition+of+BMP-2+and+BMP+receptor+IA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).</li>
<li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+receptor+signaling%3A+transcriptional+targets%2C+regulation+of+signals%2C+and+signaling+cross-talk%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).</li>
<li>Nohe, A., Hassel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+bone+morphogenetic+protein+%28BMP%29+receptor+oligomerization+determines+different+BMP-2+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways.</a> J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).</li>
<li>Sieber, C., Kopf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li>
<li>Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+trials+in+spinal+surgery%3A+emerging+safety+concerns+and+lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned.</a> Spine J. 11, 471-491 (2011).</li>
<li>Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+delivery+of+growth+factors+for+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Localized delivery of growth factors for bone repair.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).</li>
<li>Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+immobilization+of+epidermal+growth+factor+onto+culture+substrates+for+the+selective+expansion+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells.</a> Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).</li>
<li>Gonçalves, R., Martins, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactivity+of+immobilized+EGF+on+self-assembled+monolayers%3A+Optimization+of+the+immobilization+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+A.+94A%22%5BJournal%5D)">Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).</li>
<li>Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+immobilization+of+bone+morphogenetic+protein+2+via+a+self-assembled+monolayer+formation+induces+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation.</a> Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).</li>
<li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li>
<li>Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-2+converts+the+differentiation+pathway+of+C2C12+myoblasts+into+the+osteoblast+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage.</a> J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).</li>
<li>Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+release+from+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Growth factor release from tissue engineering scaffolds.</a> J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).</li>
<li>Uludag, H., D'Augusta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+proteins+with+biomaterial+carriers%3A+a+correlation+between+protein+pharmacokinetics+and+osteoinduction+in+the+rat+ectopic+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model.</a> J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).</li>
<li>Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+BMP-2+for+functionalization+of+titanium+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces.</a> Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).</li>
<li>Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-2+decorated+silk+fibroin+films+induce+osteogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).</li>
<li>Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+systems+for+bone+growth+factors+-+the+new+players+in+skeletal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration.</a> J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).</li>
<li>Masters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+growth+factor+immobilization+strategies+for+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration.</a> Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).</li>
<li>Crouzier, T., Fourel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+of+BMP-2+from+a+soft+biopolymeric+film+unveils+its+activity+on+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration.</a> Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).</li>
<li>Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+morphogenetic+protein+2+contains+a+heparin-binding+site+which+modifies+its+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity.</a> European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).</li>
<li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li>
<li>Kato, K., Sato, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+histidine-tagged+recombinant+proteins+onto+micropatterned+surfaces+for+cell-based+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays.</a> Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).</li>
<li>Martins, M., Curtin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+designed+surfaces+for+blood+deheparinization+using+an+immobilized+heparin-binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide.</a> J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).</li>
<li>Limbut, W., Kanatharana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+capacitive+immunosensors+based+on+self-assembled+monolayers+formed+from+thiourea%2C+thioctic+acid%2C+and+3-+mercaptopropionic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).</li>
<li>Patel, N., Davies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+protein+molecules+onto+homogeneous+and+mixed+carboxylate-terminated+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).</li>
<li>Hu, J., Duppatla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+PEGylation+of+bone+morphogenetic+protein-2+cysteine+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues.</a> Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).</li>
<li>Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGD+modified+polymers%3A+biomaterials+for+stimulated+cell+adhesion+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond.</a> Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).</li>
<li>Cao, T., Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+spacer+length+effect+on+immobilized+Escherichia+coli+pili-antibody+molecular+recognition+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM.</a> Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).</li>
<li>Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+immobilize+bioactive+proteins%2C+including+bone+morphogenetic+protein-4+%28BMP-4%29%2C+on+titanium+alloy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy.</a> Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 프로토콜에서 우리는 생리 활성 rhBMP-2와 기능화 표면의 준비에 대해 설명합니다. ; rhBMP-2 단백질의 2) 공유 고정화 금 표면에 관능 링커의 자기 조립 단분자막 (SAM)의 1) 초기 형성 :이 방법은 두 단계를 포함한다. 이전의 연구에서, 우리는 관능 링커 및 성장 인자의 효과적인 결합을 검증하고, 표면 고정화 rhBMP-2의 생물학적 활성 (19)를 유지 것을 보여 주었다. 고정화 된 형태로 제공 성장 인자의 생리 활성은 단백질의 방출 및 그 이후의 내재화는 세포의 자극 (24, 25)에 필수적되지 않는 것을 나타내는 다른 연구에서 밝혀졌다. 세포막 22,2로 인해 수용체의 다른 유형의 개선 된 점유율의 효과적인 투여 량을 유지하면서 실제로, 성장 인자의 공유 결합 고정화는 표적 세포의 지속적인 자극을 허용3,26-28. 고정화 rhBMP-2,주의를 제시하는 표면의 제조를위한 전체 공정에 걸쳐 표면...

뼈 형태 형성 단백질 2 (BMP-2) 형질 전환 성장 인자 (TGF-β) 가족과 드 노보 골 형성 유도뿐만 아니라 배아 발달과 성인 동안 여러 조직의 조절기 역할을 1-3 항상성의 구성원입니다. 생물학적 활성 homodimeric BMP-2 단백질의 각 단량체는 매우 모든 BMP에 4에 보존되어있는 &quot;시스테인 매듭&quot;모티브가 포함되어 있습니다. 일곱 번째 시스테인이 두 단량체 5,6 사이의 분자간 결합을 형성, 이량에 관여하는 반면, 일곱 시스테인 잔기의 여섯, 각각의 단량체를 안정 분자 내 이황화 결합을 형성한다. 이것은 고도로 보존 된 시스테인 매듭은 BMP-2 단백질의 입체 구조를 정의하고 열, 변성제 및 산성 pH 7-9 대한 저항으로서 독특한 특성을 결정한다. BMP-2함으로써 신호 전달을 유도 세린 / 트레오닌 키나아제 막 관통 수용체 바인딩 <sup&gt; 10-12. 수용체 올리고머의 모드에 따라 서로 다른 신호 전달 경로가 활성화되어 TGF 계통에 의존하는 통로가 Smad의 복잡한 핵 전좌와의 전사 활성에있는 수용체 인산화의 결과에 의해 활성화 된 반면 Smad의 독립적 인 신호 폭포는, P38 신호를 통해 알칼리 포스 파타 아제의 유도로 연결 이러한 분화의 억제 (ID) 12 ~ 14과 같은 특정 표적 유전자. 뼈, BMP-2, 따라서 치료 및 뼈의 드 노보 형성을 자극하는 골아 세포에 중간 엽 줄기 세포의 분화를 유도한다. 현재 재조합 BMP-2가 골절 사이트의 치유를 강화하기 위하여 임상 적으로 적용되는 표현. 뼈 조직 공학의 일반적인 전략은 로컬 배달 시스템에 비해 덜 침습적 주사 성장 인자의 사용이다. 그러나, 생체 내 연구 및 임상 응용 프로그램을 보여 그 짧은 생물학적 반감기, 불특정 LOCalization와 BMP-2의 빠른 현지 통관 여러 지역 자궁외 및 조직 문제 (15)가 발생할 수 있습니다. 따라서, 효과적인 프리젠 테이션, 물질 내에서 또는 상 BMP-2의 함정 수사 또는 고정을 얻으려면 대상 사이트에서 로컬 및 지속적인 전달을 위해 필요합니다. 지속 전달은 물리적 포착, 흡착 또는 이온 착물 (16)과 같은 비공유 결합 고정 방식으로 달성 될 수있다. 그러나, 그것은 알려져있다 분자 (17)의 변성의 표면에 단백질의 비특이적 흡착 할 수있다 결과. 성장 인자의 결합을 공유 결합의 경우, 지지체의 종류가 지난 십 년간 개발되어왔다. 예를 들어 단백질의 아미노 또는 카르복시기를 대상으로 관능 링킹 분자의 사용은 반드시 그 고정화를 달성하는 단백질 수정을 요구하지 않는 방식의 한 유형이다. 사실, 반면 단백질 변형 단백질 배향을 제어 이점을 제공한다인공 도메인, 펩타이드 태그 및 부위 특이 적 쇄의 도입은 성장의 생물학적 활성은 17 요인 변경할 수있다. 따라서, 인해 담체와의 상호 작용에 변성을 회피하는, 표면은 원하는 요소 (18)의 결합에 의해 다음에 링킹 분자의 자기 조립 단분자막 (SAM), 예를 들어, 미리 관능 화 될 수있다. 우리는 그것의 유리 아민의 잔류를 대상으로 공유 표면에 BMP-2를 고정시키기 SAM-기반 접근 방식을 사용하고 고정 된 단백질의 단기 및 장기 생물학적 활성 19 두를 유지하는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜은 세포막에서 발생하고 골 형성 신호에 대한 책임 세포 내 신호를 조절하는 메커니즘에 체외 연구를위한 세포에 BMP-2를 제공하는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>N-하이드록시숙신이미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>130672</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4-(디메틸아미노)피리딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>522805</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>AppliChem</td><td>A2282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>11-메르캅툰데카노산</td><td>시그마-알드리치</td><td>674427</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>디클로로메탄</td><td>머크</td><td>106050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N'-dicyclohexylcarbodiimide</td><td>시그마-알드리치</td><td>D80002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>석유 벤젠</td><td>Merck</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>Carl Roth</td><td>M 875</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>에칠아세테이트</td><td>AppliChem</td><td>A3550</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Carl Roth</td><td>4627</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N-디메틸포름아미드</td><td>Carl Roth</td><td>T921</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R& D Systems</td><td>355-BM</td><td>캐리어 프리; E.coli</td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td>로 표현됨&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>칼 로스</td><td>HN00.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>폴리(디메틸 실록산) (PDMS)</td><td>다우코닝</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-rhBMP-2</td><td>시그마</td><td>B9553</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>염소 안티-마우스 IgG-HRP</td><td>산타크루즈</td><td>sc-2005</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Ampliflu Red assay</td><td>Sigma</td><td>90101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid</td><td>Gibco</td><td>41966</td><td>High glucose</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>멸균 필터링, 세포 배양 테스트</td></tr><tr><td>완료 Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>트립신 0.05%(1x) EDTA 4Na</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>글리신 (0.1 M)</td><td>Riedel-de Ha&euml; 전화</td><td>33226</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (1%)</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>용해 완충액 (ALP 분석)19</td></tr><tr><td>마그네슘 클로라이드 (MgCl2)(1 mM)</td><td>Carl Roth</td><td>HNO3.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>염화 아연 (ZnCl2) (1 mM)</td><td>Carl Roth</td><td>3533.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p-니트로페닐포스페이트(pNPP)</td><td>시그마</td><td>S0942</td><td>포스파타제 기질</td></tr><tr><td>안티-미신 중쇄(MHC)</td><td>개발 연구 하이브리도마 은행, 아이오와 대학교</td><td>MF20</td><td>단클론 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티-마우스 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마</td><td>D9542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), 주파수 35 kHz</td><td>BANDELIN electronic GmbH Co. KG&</td><td></td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>MED 020 스퍼터코팅 시스템</td><td>BAL-TEC AG</td><td></td><td>코팅 조건 Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M200 Plate reader</td><td>Tecan</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

공유 결합은 자기 조립 단분자막의 접근 방식을 사용하여 표면에 bmp-2의 결합

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

뼈 형태 형성 단백질 2 (BMP-2) 뼈 조직의 세포 외 매트릭스에 포함 된 성장 인자이다. 따라서 치유와 드 노보 골 형성을 자극하는 조골 세포에 중간 엽 세포 분화의 트리거로 BMP-2의 역할. 비계와 함께 재조합 인간 BMP-2 (rhBMP-2)의 임상 프레 젠 테이션의 형태에 따라, 최근의 논쟁을 제기하고 양이 전달 될 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 세포에 대한 생체 외 연구에 BMP-2를 제공하는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다. 우리는 이종 링커 이루어진 자기 조립 단분자막을 형성하는 방법을 설명하고, rhBMP-2의 공유 고정화를 구하는 후속 결합 단계를 나타낸다. 이 방법으로는 단백질의 생물학적 활성을 유지하면서, BMP-2의 지속적인 프레젠테이션을 달성하는 것이 가능하다. 사실, BMP-2의 표면 고정화는 불특정 광고를 방지하여 타겟 조사를 허용orption, 성장 인자의 양을 줄임과 동시에, 특히, 표면에서 제어되지 않는 방출을 방해. 세포가 공유 고정 된 rhBMP-2를 제시 표면에 노출되었을 때 BMP-2에 의해 트리거 모두 단기 및 장기의 신호 이벤트는 BMP-2 자극에 대한 세포 반응에 체외 연구를위한이 방법이 적합하다 일어나고있다.

그것은 생물학적으로 불특정 화학적으로 조정할 수있는 시스템을 제공하기 때문에 우리의 설정에서, 금은 부형제로 선정되었습니다. 또한, 자기 조립 단분자막의 응용 프로그램이 많은 이점을 수반한다 : 자신의 기능 최종 그룹이 추가로 수정 될 수있는 반면 SAM에 자발적으로, 금속 및 결함이 거의 형태의 단일 층에 자신의 "머리 그룹"을 통해 흡착. 따라서 그들은 통제 아직 높은 적응력 방법 (20)에 인터페이스의 속성을 조정할 수있는 플랫폼을 제공합니다. 금 - 코팅 된 표면에 BMP-2의 고정화를 위해, 우리는 두 단계 접근법을 사용 : 1) 2))도 1을 참조 (단백질 링커를 반응 후 금 층으로 MU-NHS 링커를 바인딩하고. rhBMP-2의 바인딩을 증명하기 위해, 우리는 효소 면역 측정법을 사용했다. 이 분석에서, rhBMP-2는 BMP-2 특이 항체와 HRP가 결합 이차 항체와 배양 고정 제시 표면. 후자의 바인딩 ㄹ 수A...

우리는 표면에 BMP-2를 효율적으로 고정화를 달성하기위한 방법을 설명합니다. 우리의 접근은 유리 아민 잔기를 통해 BMP-2 공유 결합을 달성하기 위해 자기 조립 단분자막의 형성에 기초한다. 이 방법은 세포막에서 신호를 연구 할 수있는 유용한 도구입니다.

공유 결합은 자기 조립 단분자막의 접근 방식을 사용하여 표면에 BMP-2의 결합

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

이 절차의 전반적인 목표는 BMP 두 분자를 생체 활성을 잃지 않고 표면에 공유 결합하는 것입니다. 이것은 먼저 물리적 기상 증착에 의해 기판에 금 층을 형성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 mu NHSA 이중 기능 NHS Thiol 링커의 자체 조립 단층을 만드는 것입니다.다음으로, RH BMP 2는 링커에 공유 결합됩니다. 마지막 단계는 초음파 처리에 의해 비 결합 BMP 2를 제거하는 것입니다. 궁극적으로, 항체 결합 분석법은 BMP 2가 표면에 성공적으로 결합하는 것을 보여주기 위해 사용되며, SMA 1 5 8 인산화를 분석하여 세포 내에서 표면 결합 BMP 2의 생물학적 활성을 측정합니다.이 방법은 세포 표면의 수용체에 대한 성장 인자의 초기 결합이 신호 반응을 유발하기에 충분한지와 같은 성장 인자 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 두 구성원인 Teresa Paul과 Elizabeth Schwab입니다. 이 절차를 시작하려면 정밀 와이프로 유리 커버 슬립을 청소하고 에틸 아세테이트와 메탄올의 일대일 혼합물에서 5분 동안 초음파 처리합니다.초음파 처리 후, 기판을 메탄올로 헹구고 질소 흐름으로 건조시킵니다. 깨끗한 기판을 스퍼터 코팅 장치에 넣고 챔버를 비우십시오. 60초 동안 스퍼터링하여 크롬 타겟에서 가장 위쪽의 크롬 산화물 층을 제거합니다.그런 다음 기판을 10나노미터 크롬 층으로 코팅한 다음 40나노미터 금 층으로 코팅합니다. 완료되면 챔버에서 금 기판을 제거하고 따로 보관하십시오. 금 기질을 2 넥 둥근 바닥 플라스크로 옮기고 질소 분위기에서 4 시간 동안 실온의 DMF에서 1 밀리 몰 M-U-N-H-S로 배양합니다.배양 후 DMF에서 기질을 2분 동안 초음파 처리합니다. DMF와 메탄올로 헹구고 질소 흐름에서 건조시킵니다. RHB MP 2 원액을 PBS에 1몰 염화나트륨으로 희석하여 최종 농도가 밀리리터당 3.5마이크로그램이 되도록 합니다.사용 직전에 이 작업 용액을 멸균 8.5밀리몰 수산화칼륨으로 pH 10로 조정하십시오. 샘플 위에 A-P-D-M-S 링을 놓습니다. 기판을 6웰 플레이트로 옮겨 기판 표면만 배양 용액에 노출되도록 합니다.그런 다음 기능화된 M-U-N-H-S 기판을 섭씨 4도에서 RHB MP 2 작업 솔루션으로 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 상층액을 제거한 후 PBS에 1 몰 염화나트륨을 첨가하고 2 분

covalent-binding-bmp-2-on-surfaces-using-self-assembled-monolayer

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

여기 우리는 뼈 Morphogenetic의 단백질 (BMP) 고정 세포에 신호를 시각화하는 항체의 조합과 근접 내고 분석 (괞찮아)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 우리가 BMP4 자극을 아래에 효과기 - 단지를 활성화 내생 BMP의 핵 축적에 따라 자신의 수준 시간이 지남에를 정할 수있었습니다.

효과기 - 단지에게 사용 BMP4의 다운 스트림 신호의 감지 현장에서 괞찮아, 근접 내고 분석

다양한 단일 분자를 AFM 팁에 공유 결합하는 프로토콜이 제시됩니다. 고체 지지체 및 생체 계면에서 이러한 분자의 접착력과 자유 에너지를 결정하기 위한 절차와 예가 제공됩니다.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

우리는 나노 구조 기질과 고정화된 단백질 및 압타머와 인터페이스하는 나노 생물학적 시스템의 제조 및 특성화를 설명합니다. 나노 구조 기판의 리소그래피 제작, 생체 기능화 및 표면 강화 라만 분광법(SERS) 특성화와 관련된 관련 실험 단계가 보고됩니다. 표면 고정 단백질의 SERS 검출 및 단백질-리간드 및 압타머-리간드 결합의 프로빙이 입증되었습니다.

표면 EBL 날조 된 나노 구조 기판을 사용하여 생체 분자의 라만 분광학 감지 강화

우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

생체 재료 뼈 Morphogenetic 단백질 2 (BMP2) 실수로 비-연합 뼈 골절을 치유 하 새로운 치료 전략으로 사용 되었습니다. 요인의 통제 자료에서 발생 하는 부작용을 극복 하기 위해 제안 하는 사이트를 새로운 전략-직접 따라서 향상 된 osteogenic 기능으로 자료를 만드는 요소를 고정.

뼈 Morphogenetic 단백질의 2 고체 표면에 화학 클릭 하 여 사이트 감독 동원 정지

이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

원자력 현미경 검사법 (AFM) 캔틸레버 팁에 프로브 분자의 공유 부착은 물리적 특성의 조사를위한 필수적인 기술입니다. 이를 통해 높은 재현성을 가진 AFM 기반 단일 분자 힘 분광학을 통해 연신력, 탈착력 및 폴리머 길이를 결정할 수 있습니다.

AFM 기반 힘 분광학을 위한 단일 분자의 공유 부착

생체멤브레인 힘 프로브(BFP)는 시투 동적 힘 분광법(DFS) 기술이다. BFP는 살아있는 세포에 분자 상호 작용의 봄 상수를 측정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 BFP에 의해 검출된 분자 결합에 대한 스프링 상수 분석을 제시합니다.

생체멤브레인 포스 프로브 분광법에 의한 분자 스프링 상수 분석

성장 인자 ß 를 변형할 때 가족 전구체 단백질은 제노푸스 라예비스 배아에서 ectopically 발현될 때, 그들은 분화하고, 갈라지고, 초기 가스트루라 단계로 늦은 블라술라에서 시작되는 blastocoele로 분비됩니다. 우리는 면역 blot 분석을 위한 blastocoele 캐비티에서 분열 제품을 심는 방법을 설명합니다.

제노푸스 라레비스 배아의 블라스코클로로 분비된 성장 인자 변형 분석 가족 분열 제품

골수 혈관 틈새의 시험관 내 모델은 중간엽 및 내피 세포를 프리캐스트 3D PEG 하이드로겔에 파종하여 설정됩니다. 틈새의 내피 네트워크, ECM 성분 및 ALP 활성은 사용된 성장 인자에 따라 다릅니다. 이 플랫폼은 진행된 암 모델에 사용할 수 있습니다.

이미징 마이크로플레이트에서 프리캐스트 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 하이드로겔을 사용하여 혈관화된 골수 틈새의 간단한 설정

자체 조립된 금속-유기 프레임워크 단층의 합성 및 특성화를 위한 프로토콜은 고분자 접목, 금속-유기 프레임워크(MOF) 결정을 사용하여 제공됩니다. 이 절차는 고분자 접목된 MOF 입자가 주사 전자 현미경 이미징으로 입증된 바와 같이 잘 형성된 독립적인 단층 구조를 생성하여 공기-물 계면에서 자체 조립될 수 있음을 보여줍니다.

Synthesis and Characterization of Self-Assembled Metal-Organic Framework Monolayers Using Polymer-coated Particles(고분자 코팅 입자를 사용한 자체 조립된 금속-유기 프레임워크 단층의 합성 및 특성 분석)

배우세요 자기 조립 단분자막을 이용한 BMP-2의 공유 결합 표면 고정화 방법을 통해 생물학적 활성을 유지하면서 성장 인자 신호 전달을 연구하는 기술입니다.

공유 결합은 자기 조립 단분자막의 접근 방식을 사용하여 표면에 BMP-2의 결합

더 많은 동영상 탐색