함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

이 프로시저의 전반적인 목표는 천연 구조 기능 상호작용과 번역 후 수정을 보존하면서 효모 단백질을 추출하는 것입니다. 이는 먼저 세포를 배양하여 목적 단백질의 발현을 유도함으로써 달성됩니다. 그다음, 수확한 효모 세포를 적절한 버퍼 내에서 균질화하여 단백질을 추출합니다.

그런 다음, 친화성 수지를 사용하여 맑게 정제된 전세포 추출물로부터 표적 단백질을 정제합니다. 절차의 마지막 단계는 추가 분석이나 하위 응용 분야를 위해 친화성 수지로부터 정제된 단백질을 용출하는 것입니다. 최종적으로, 웨스턴 블롯 분석을 통해 단백질 정제 변형 및 상호작용을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

실험 절차는 저의 연구실에서 학부 연구원으로 지난 2년 동안 활동한 윌리엄 앤 메리 대학 졸업생인 Eva's Ky가 시연하겠습니다. 기존의 다른 방법들에 비해 비드 비팅(bead beading)의 주요 장점은 단백질의 기능적 상호작용과 번역 후 수정을 보존하는 조건 하에서 다수의 샘플을 신속하게 처리하고 용해할 수 있다는 점입니다. 우선, 갈락토스 유도성 6-His 태그 단백질을 인코딩하는 플라스미드로 gal 양성 효모 균주를 형질전환합니다. 형질전환체를 2% sucrose가 함유된 SD uracil과 같은 5 mL의 적절한 선택 배지에 접종하고, 30 °C에서 회전시키며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 배양한 배양액을 2% sucrose가 포함된 선택 배지로 희석하여 최종 부피를 33 mL로 맞추고, 이때 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)가 0.3이 되도록 합니다. 이후 30 °C, 150 RPM의 진탕 배양기에서 배양합니다.

배양액의 OD 600이 0.8에서 1.5에 도달하면, 6% galactose가 포함된 3X XYEP 17 mL를 첨가하여 최종 농도가 2% galactose가 포함된 1X XYEP가 되도록 하여 목적 단백질의 발현을 유도하고, 30 °C 진탕 배양기에서 5~6시간 동안 추가로 배양합니다. 유도된 배양액의 OD 600을 측정한 후, 약 150~200 OD 600 단위의 세포를 4 °C, 5,000 RPM에서 5분간 원심분리합니다. 그 다음, 1X XPBS 1 mL와 1X protease inhibitor cocktail을 사용하여 세포 펠릿을 재부유시킨 후 2 mL 스크류 캡 튜브로 옮기고, 4 °C, 15,000 RPM에서 1분간 세포를 원심분리합니다. 상층액을 따라낸 후, 세포 펠릿을 액체 질소에 넣어 급속 동결시켜 동결 세포 펠릿을 준비합니다.

산 세척된 유리 구슬 200 µL와 얼음처럼 차가운 용해 버퍼 500 µL를 추가합니다. 튜브를 항상 얼음 위에 둡니다. 끝부분을 잘라낸 파이펫 팁을 사용하여 4 °C에서 짧게 파이펫팅하여 섞어줍니다.

세포가 담긴 튜브를 비드 밀 밸런스 락에 장착하고 제조사의 지침에 따라 5.5 meters per second의 속도로 20초 동안 작동시킵니다. 그 다음 튜브를 슬러시 상태의 얼음 위에 1분 동안 둡니다. 추출된 단백질을 정제하기 위해 이 과정을 총 6회 반복한 후, 4 °C에서 15,000 RPM으로 15분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 웨스턴 블롯용 전세포 추출물(whole cell extract, WCE) 샘플을 준비하기 위해, OD 600 2단위에 해당하는 세포의 WCE를 800 µL의 20% trichloroacetic acid(TCA)에 넣고 볼텍스하여 혼합합니다. 투명한 WCE 샘플을 정제하기 위해, 50 내지 100 µL의 친화성 레진(affinity resin)을 새 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고, 1 mL의 세척 완충액을 추가하여 레진을 세척 및 평형화하며, 레진이 다시 현탁될 때까지 위아래로 뒤집어 섞어줍니다. 4 °C에서 5,000 RPM으로 1분간 원심분리한 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 친화성 정제를 통한 단백질 결합을 위해, 세척된 비드에 100 내지 200 µL의 정제된 용해물을 추가하고 용해 완충액을 사용하여 총 부피를 1 mL로 맞춥니다.

4°C에서 2~5시간 동안 반응시키거나 흔들어 섞어줍니다. 용해물 비드 용액이 WCE Western blot 샘플을 위해 얼음 위에서 반응하는 동안, 남은 투명한 WCE 분주액을 액체 질소로 급속 냉동하여 추후 사용 시까지 -80°C에서 보관하십시오. 4°C에서 15,000 RPM으로 2분 30초 동안 원심분리한 후, 펠렛이 손실되지 않도록 주의하며 상층액을 따라내고, 펠렛에 2% TCA 800 µL를 추가한 후 튜브를 볼텍싱하고 다시 2분 30초 동안 원심분리합니다.

상청액을 조심스럽게 따라낸 후, TCA 샘플 버퍼 100 µL를 첨가하고 볼텍싱하여 펠렛을 녹인 다음 샘플을 인큐베이션합니다. 100 °C 히팅 블록에서 2~5분간 두 번 더 처리하여 녹이기 어려운 펠렛의 잔여물을 완전히 용해시키고, 사용 전까지 -80 °C에서 보관합니다. 라이세이트 비드 샘플의 인큐베이션이 끝나면, 5,000 RPM, 4 °C에서 1분간 원심분리한 후 세척 버퍼를 사용하여 레진을 5회 세척하여 단백질을 용출합니다.

4°C에서 5분 동안 레진에 150 µL의 용출 버퍼를 첨가합니다. 4°C, 5,000 RPM에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 새 튜브에 저장합니다. 마지막으로, 웨스턴 블롯 샘플을 준비하기 위해 25 µL의 UD 단백질 샘플에 2 µL의 BME가 포함된 25 µL의 2x SDS 샘플 버퍼를 첨가합니다.

이 그림에서 보는 바와 같이, 광범위한 단백질을 효모 세포로부터 재현성 있게 추출할 수 있습니다. 다양한 분자량 범위에 걸쳐 나타나는 뚜렷한 밴드들은 단백질 추출물의 품질이 높음을 나타냅니다. 추출물의 품질은 특정 에피토프 태그 단백질에 대한 웨스턴 블로팅을 통해 확인할 수 있습니다.

갈락토스 과발현 V five 태그 Sumo Ligase의 대표적인 결과는 약 120 kilodaltons에서 이동하는 밴드입니다. 일반적으로 부분적으로 분해된 단백질은 예상 분자량보다 낮은 위치에서 여러 단편으로 나타나지만, 여기서는 전체 길이의 단백질만 관찰됩니다. 또한, 특정 단백질의 고분자량 부가물은 번역 후 변형을 나타낼 수 있습니다.

예를 들어, 여기서는 락토스(lactose)로 과발현된 sumo related S one delta four 40과 전장 SIS one을 확인할 수 있습니다. 이 Western blot에서 입증된 바와 같이, 수정(modifications)은 내인성으로 발현된 S one에서도 보존될 수 있습니다. 이 그림은 핵 농축 단백질인 SLX five와 CS one delta four 40이 우리의 ws로부터 성공적으로 정제되었음을 보여줍니다.

특히, 6xHis 태그가 붙은 단백질은 천연 및 변성 조건 모두에서 W'S로부터 친화성 정제가 가능합니다. 이와 대조적으로, SLX 5G ST 및 CS one delta four 40 ha는 6xHis 에피토프가 없지만, 천연 조건에서 여전히 금속 친화성 수지와 올레 민감성 방식으로 상호작용합니다. 우리는 CIS one과, 그보다는 덜하지만 SLX five가 금속 배위 링 도메인을 통해 금속 친화성 수지에 결합할 수 있다고 제안합니다.

우리가 알고 있는 바로는 이 특정 현상이 아직 보고되지 않았으나, 콜레라 독소 B 서브유닛이 천연 히스티딘 잔기에 의해 매개되는 방식으로 니켈 친화성 레진에 결합하는 유사한 상황이 설명된 바 있습니다. 이러한 관찰 결과는 WCER 내의 단백질들이 적어도 부분적으로는 단백질 기능 연구를 위해 천연 상태로 접혀 있음을 시사합니다. 단백질 복합체가 전세포 추출물 내에서 온전하게 유지된다는 것을 보여주는 것이 중요합니다.

대표 데이터 분석 결과, WS cis one 내에 CS one delta four 40, SLX five, 그리고 로딩 컨트롤로 사용되는 세포질 단백질인 P GK one이 존재하는 것으로 나타났습니다. Delta four 40은 금속 친화성 수지에 결합하는 고유 특성을 이용하여 이들 추출물로부터 정제되었습니다. 또한, yeast 세포에서 SLX five와 SIS one을 공동 발현시켰을 때, EIT 내의 SLX five 수준이 증가하였으며, 이는 SLX five가 SIS one과 상호작용할 가능성이 있음을 시사합니다.

이 영상을 시청한 후에는 천연 조건에서 효모 단백질을 추출, 정제 및 시각화하기 위해 효모 세포를 배양하고 처리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.