함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

이 절차의 전반적인 목표는 효모 단백질을 추출하는 동시에 본래 구조 기능 상호 작용 및 번역 후 변형을 보존하는 것입니다. 이는 관심 단백질의 발현을 유도하기 위해 먼저 세포를 성장시킴으로써 달성됩니다. 다음으로, 수확된 효모 세포는 단백질을 추출하기 위해 적절한 완충액에서 균질화됩니다.

그런 다음 관심 단백질은 수지의 친화력을 사용하여 정화된 전체 세포 추출물에서 정제됩니다. 절차의 마지막 단계는 추가 분석 또는 다운스트림 응용 프로그램을 위해 친화성 수지에서 정제된 단백질을 회피하는 것입니다. 궁극적으로 웨스턴 블롯 분석을 기반으로 단백질 정제 변형 및 상호 작용을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 사람은 William and Mary 졸업생인 Eva's Ky로, 지난 몇 년 동안 제 연구실에서 학부 연구원으로 일했습니다. 다른 기존 방법에 비해 bead beading의 주요 장점은 단백질 기능 상호 작용 및 번역 후 변형을 보존하는 조건에서 여러 샘플의 빠른 처리 및 용해입니다. 갈락토스 유도성 6을 암호화하는 플라스미드로 갈 양성 효모 균주의 세포를 형질전환시키기 시작하려면, 그가 선택한 표지된 단백질은 2% 슈크로스를 함유하는 SD 우라실과 같은 적절한 선택적 배지 5밀리리터에 형질전환체를 접종하고 다음날 회전하면서 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 배양하고, 2% 슈크로스로 선택적 배지에서 하룻밤 배양을 33밀리리터의 최종 부피로 희석하여 광학 밀도가 600이 되도록 합니다 나노미터는 0.3을 측정하고 섭씨 30도 및 150RPM의 진탕 인큐베이터에서 자랍니다.

배양액이 0.8 - 1.5의 OD 600에 도달하면, 17ml의 3 XYEP와 6% 갈락토스를 첨가하여 1개의 XYEP와 2%갈락토스를 추가로 5-6시간 동안 섭씨 30도의 진탕 인큐베이터에 넣어 원하는 단백질의 발현을 유도합니다. 유도한 문화 분리기의 OD 600를 5, 섭씨 4도에 000 분당 회전수에 5 분 동안 세포의 대략 150에서 200의 OD 600 단위를 측정한 후에, 세포 입천장을 다시 중단하고 2 밀리리터 나사 모자 관에 그것을 옮기기 위하여 1개의 x 프로테아제 억제물 칵테일을 가진 얼음 차가운 1개의 XPBS의 1 밀리리터를 이용하십시오, 15에 1 분 동안 세포를 원심 분리하십시오, 000 RPM 및 섭씨 4도. 상등액 스냅을 디캔팅한 후 세포 펠릿을 액체 질소에 동결하여 동결된 세포 펠릿에 동결합니다.

200마이크로리터의 산성 세척 유리 구슬과 500마이크로리터의 얼음 저온 용해 완충액을 추가합니다. 튜브를 항상 얼음 위에 두십시오. 끝 부분이 절단된 피펫 팁을 사용하여 섭씨 4도에서 위아래로 잠시 피펫팅합니다.

셀 튜브를 비드 밀 밸런스 잠금 장치에 넣고 초당 20미터에서 5.5초 동안 제조업체의 지침에 따라 기계를 실행합니다. 그런 다음 슬러시 얼음 위에 튜브를 1분 동안 놓습니다. 추출한 단백질 분리기를 15 분 동안 맑게 하기 위하여 6 시간을 반복하십시오, 4 섭씨 온도에 000 분당 회전수.

그런 다음 2 개의 OD 600 단위의 세포에 해당하는 웨스턴 블롯 및 WCE에 대한 전체 세포 추출물 또는 WCE의 샘플을 제조하여 800 마이크로 리터의 20 % 트리클로로 아세트산 또는 TCA 와류를 혼합합니다. 50-100 마이크로리터의 친화성 수지에서 투명한 WCE 샘플을 새로운 마이크로 원심분리 튜브에 정제하려면 1ml의 세척 버퍼를 추가하여 수지를 세척 및 평형화하고 수지가 다시 현탁될 때까지 위에서 아래로 뒤집습니다. 5, 000 분당 회전수 및 4 섭씨 온도에 1 분 동안 회전한 후에, 세척된 구슬에 맑게 한 lysate의 100개에서 200 마이크로리터에 친화력 정화를 위한 결합 단백질을 포인하고 총 부피를 1 milliliter에 가져오기 위하여 lysis 완충액을 이용하십시오.

돌연변이가 일어나거나 섭씨 4도에서 2-5시간 동안 몸을 흔들며 배양합니다. 액체 질소를 사용하여 남아 있는 투명한 WCE의 부분 표본을 스냅 동결하고 추가 사용 시까지 섭씨 영하 80도에서 보관하며, 용해물 비트 용액은 얼음 위에서 WCE 웨스턴 블롯 샘플을 위해 배양합니다. 15, 4 섭씨 온도에 000 분당 회전수에 2 분 30 분 동안 회전한 후에, 펠릿을 유지하기 위하여 배려하는 상등액을 decant, 펠릿에 2%TCA의 800 마이크로리터를 추가하고 2 분 30분 회전을 반복하기 전에 관을 와동으로 돌린다.

상등액을 조심스럽게 디캔팅한 후 100마이크로리터의 TCA 샘플 버퍼와 와류를 추가하여 샘플을 배양하기 전에 펠릿을 용해시킵니다. 섭씨 100도의 가열 블록에서 2-5분 동안 펠릿의 잔여물을 완전히 용해하는 데 두 번째 시간이 걸리며, 이는 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 용해하고 보관하기 어려울 수 있습니다. 일단 용해물 구슬 표본이 배양되면, 5, 000 분당 회전수 및 1 분 동안 4 섭씨 온도에 회전시키기 후에, 단백질을 용리하기 위하여 수지를 5 번 세척하기 위하여 세척 완충액을 사용하십시오.

150마이크로리터의 용출 완충액을 섭씨 4도의 수지 뮤테이트에 5분 동안 추가합니다. 5, 000 분당 회전수 및 4 섭씨 온도에 1 분 동안 회전시키고 새로운 관에 있는 상등액을 저장하십시오. 마지막으로, 25마이크로리터의 BME에서 25마이크로리터의 UD 단백질 샘플로 25마이크로리터의 리튬 도칼 설페이트 샘플 버퍼에서 웨스턴 블롯에 대한 샘플을 준비합니다.

이 그림에서 볼 수 있듯이 효모 세포에서 광범위한 단백질을 재현성 있게 추출할 수 있습니다. 다양한 분자량에 걸친 개별 띠는 고품질 단백질 추출물을 나타냅니다. 추출물의 품질은 특정 항원결정기 표지 단백질에 대한 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 확인할 수 있습니다.

다음은 갈락토스가 과발현된 V, 5개의 태그가 붙은 스모 리가세에 대한 대표적인 결과이며, 이는 약 120킬로달톤으로 이동하는 것입니다. 일반적으로 부분적으로 분해된 단백질은 예상 중량 이하의 여러 단편으로 실행되지만 여기서는 전체 길이 단백질만 관찰됩니다. 또한, 주어진 단백질의 높은 분자량 추가는 번역 후 변형을 나타낼 수 있습니다.

예를 들어, 여기에서 표현 된 스모에 대한 유당을 볼 수 있습니다 : S 1, 델타 4, 40 및 전체 길이 SIS 1. 이에서 입증된 바와 같이, 웨스턴 블롯 변형은 또한 내인성으로 발현된 S one에 보존될 수 있습니다. 이 그림은 2개의 핵 농축 단백질 SLX 5 및 CS 1개의 델타 4 40이 당사의 ws에서 성공적으로 정제되었음을 보여줍니다.

특히, 6개의 히스 태그가 지정된 단백질은 네이티브 및 변성 조건 모두에서 W'S로부터 친화성 정제될 수 있습니다. 대조적으로, SLX 5G ST 및 CS one delta four 40 ha에는 6개의 히스 에피토프가 없지만 기본 조건에서는 여전히 올레 민감성 방식으로 금속 친화성 수지와 상호 작용합니다. 우리는 CIS 1 및 SLX five가 금속 배위 고리 도메인을 통해 금속 친화성 수지를 결합할 수 있다고 제안합니다.

우리가 아는 한, 이 특정 현상은 아직 보고되지 않았지만, 콜레 독소 B 소단위가 천연 히스타민 잔기에 의해 매개되는 방식으로 Nicola 친화성 수지를 결합하는 유사한 상황이 설명되었습니다. 이 관찰은 WCER의 단백질이 적어도 부분적으로는 단백질 기능 연구를 위해 본래 접혔다는 것을 시사합니다. 단백질 복합체가 전체 세포 추출물에서 그대로 유지된다는 것을 보여주는 것이 중요합니다.

대표적인 자료에 의하면 WS 시스 1에는 CS 1 delta 4 40 SLX five 및 loading control 역할을 하는 세포질 단백질인 P GK 1이 존재하였다. Delta four 40은 금속 친화성 수지에 결합하는 고유한 능력에 따라 이러한 추출물로부터 정제되었습니다. 또한, SLX 5와 SIS 1이 효모 세포에서 동시 발현되었을 때, EIT에서 SLX 5 수준이 증가하여 SLX 5가 SIS 1과 상호 작용할 수 있는 가능성을 높였습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 네이티브 조건에서 효모 단백질을 추출, 정제 및 시각화하기 위해 효모 세포를 성장시키고 처리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.