Name: 함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-30T22:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 배우세요 신진 효모 단백질 추출 및 정제 방법으로 단백질 상호작용과 번역 후 수정을 보존하여 생화학 및 단백질체 연구에 활용하세요. 이 프로토콜은 웨스턴 블롯 분석을 위한 고품질 시료를 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 그들의 지원을 위해 Kerscher 연구실의 모든 구성원을 감사드립니다. 저희는 효모 균주 MHY3765에 대한 마크 Hochstrasser 감사합니다. 이 작품은 NSF 교부금 1,051,970 (OK)로와 하워드 휴즈 의학 연구소 학부 여행 그랜트 먼로 학자 프로그램 그랜트 (ES를)에 의해 지원되었다.

기본 조건에서 발아 효모 세포에서 발현 6xHIS - 태그 단백질의 정제 1. 단백질 발현의 효모 세포와 유도의 성장 (2에서 수정) 선택 사항 : 관심 대신 아래에 설명 된 갈락토스에 의한 문화의 단백질을 표현 대수 성장 효모 배양을 사용합니다. <ol><li> 플라스미드 인코딩 갈락토오스 유도 선택의 단백질 6xHIS - 태그와 함께 걸 + 효모 균주의 세포를 변환 할 수 있습니다. 예를 들어, 시약 목록을 참조하십시오. </li><li> 2 % 자당을 포함하는 적절한 선택 배지 5 ㎖ (예 : SD-우라실)에 형질 전환을 접종. 30 ° CO / N, 회전을 품다. </li><li> 600 nm에서 광학 밀도가 2 % 자당과 선택 배지 33 ㎖에 0.3 (= 0.3 OD 600)를 측정하므로 O / N 문화를 희석. (Δ150 RPM) 흔들어, 30 ° C에서 성장. </li><li> 문화 OD 600 = 0.8에 도달했을 때-1.5, 2 % 갈 락토 가진 1x YEP의 최종 농도 6 %의 갈락토스 (표 1 레시피)과 배 YEP의 17 ML을 추가하여 원하는 단백질의 발현을 유도. 전체 문화 볼륨 지금은 50 ML이다. 부화, 추가로 5-6 시간 동안 30 ° C에서 떨고. 참고 : 문화 볼륨이 변경 될 수 있습니다. 원하는 최종 볼륨의 3 분의 2로 단계 1.3, 희석을합니다. 단계 1.4에서 배 YEP / 6 % 갈락토스의 3 분의 1의 최종 볼륨을 추가합니다. </li><li> 4 ℃에서 5,000 rpm에서 5 분 동안 유도 문화와 원심 분리기 세포의 Δ150-200 OD 600 단위의 OD 600을 측정 </li><li> 1X 프로테아제 억제제 칵테일 2 ML 나사 캡 튜브로 전송과 1 ML 얼음처럼 차가운 1X PBS로 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 4에서 15,000 rpm에서 1 분간 세포를 원심 분리기 ° C. 가만히 따르다 뜨는을. </li><li> -80에서 즉시 세포 용해 또는 저장 ° C 더 사용할 때까지 다음, 액체 질소에 동결 세포 펠렛을 끼 웁니다. </li></ol><ol><li> 이전 단계에서 냉동 세포 펠렛으로, 산 세척 유리 구슬 200 μL와 얼음처럼 차가운 용해 버퍼 500 μl를 (표 1, 선택의 세포 용해 버퍼를 사용 제조법)을 추가합니다. </li><li> 간단히 피펫 아래. 그것은 완전히 세포 펠렛을 resuspend을 할 필요가 없습니다. 항상 얼음에 튜브를 유지한다. 참고 : 피펫 팁의 끝 부분과 위아래로 pipetting 전에 잘릴 수 있습니다. </li><li> 4 ° C에, 장소 비드 밀, 균형, 잠금, 별, 제조업체의 지침에 따라 컴퓨터를 실행에 세포 튜브 (들). </li><li> 5.5에서 20 초 동안 튜브 (들)을 포함하는 비드 비터 미터 / 초, 후 1 분 동안 녹은 얼음에 배치를 실행합니다. 총 배 반복합니다. </li><li> 4에서 15,000 rpm에서 15 분간 원심 분리하여 추출 된 단백질을 취소 ° C. 선택 사항 : SpinX 필터를 통해 원심 분리하여 작은 입자를 제거합니다. </li><li> 전체 세포 전자의 샘플을 준비서양 얼룩에 의해 관심의 단백질의 존재를 확인하기 위해 (WCE) xtract : <ol><li> 800 ㎕의 20 % 삼염화 초산 (TCA)에 대한 세포의 2 OD 600 단위 (삭제 추출물 등 5 μL 세포의 200 OD 600 단위를 수확 한 경우)와 해당 WCE 추가 할 수 있습니다. 혼합하는 소용돌이. </li><li> 4 ℃에서 15,000 rpm에서 2.5 분 동안 원심 분리 뜨는을 가만히 따르다하지만, 펠렛을 유지하도록주의해야합니다. </li><li> 4에서 15,000 rpm에서 2.5 분 동안 원심 분리 한 다음 펠렛와 소용돌이 튜브 TCA 2 %의 800 μL, ° C. 추가 뜨는을 가만히 따르다하지만, 펠렛을 유지하도록주의해야합니다. </li><li> TCA 샘플 버퍼 100 μL (표 1 레시피), 펠릿을 용해하는 소용돌이를 추가합니다. 참고 : 샘플 버퍼 펠렛에 추가 한 후 (노란색으로 변) 산성되면, Δ10 μL 트리스베이스의 분주 추가 [1M] 샘플이 다시 파란색까지. </li><li> 2-5 분 동안 100 ° C 열 블록에 품어. </li><li> 소용돌이 AG펠렛의 잔해가 여전히 존재하는 경우 아인 완전히 용해합니다. 이 방법에 의해 제조 펠렛 완전히 용해 악명 어렵습니다. 완전히 알약을 용해 소용돌이로의 Δ10 분 걸릴 수 있습니다. </li><li> -80에서 보관 샘플 ° C 더 사용할 때까지. </li></ol></li><li> 더 이상 사용할 때까지 -80에서 액체 질소와 저장소에 남아있는 삭제 WCE ° C의 분주 동결 웁니다. </li></ol> 3. 효모 세포 균질 액에서 단백질의 일괄 정화 참고 :이 정화 방법은 CO 2 + 금속 친 화성 수지에 6xHIS - 태그 단백질의 정제에 최적화되었다. <ol><li> 수지 평형 <ol><li> 세포의 Δ20-40 OD 600 단위에서 준비 삭제 WCE의 샘플은 microcentrifuge 관에 친 화성 수지의 50-100 μl를 추가합니다. , 원하는 단백질 또는 아밀로오스와 같은 비특이적 수지를 표현하지 않은 세포에서 추출한 단백질은 대조군으로 사용할 수 있습니다특이 바인딩의. </li><li> 세척 버퍼 1 ML과 배 수지를 세척 : 상단에 바닥 반전 수지는 현탁 한 후 4시에 5,000 rpm에서 1 분간 회전 될 때까지 ° C. 뜨는을 대기음. 참고 : 같은 날에 추출 및 정제를 수행하는 경우, 수지 평형을 추출하기 전에 수행 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 친화력 정화를위한 단백질 바인딩 <ol><li> 50-100 μL 세척 구슬로 클리어 해물 100-200 μl를 (Δ20-40 OD 600 단위)를 추가하고 용해 버퍼 1 ML에 총 볼륨을 가져옵니다. </li><li> 2-5 시간 동안 4에서 장동 또는 흔들 ° C로 품어. </li><li> 4 ℃에서 5,000 rpm에서 1 분간 회전 </li><li> 원하는 경우, 언 바운드 단백질의 후속 분석을 위해 남은 상층 액의 샘플을 저장합니다. TCA는 WCE (단계 2.6)에 대한 상기 설명 된대로 침전. </li><li> 5,000 rpm에서 1 분 동안 회전 한 다음 세척 버퍼 1 ML과 함께 배에 바인딩 단백질과 수지를 씻어4 ° C. 세척하는 동안 샘플 차가운 유지하십시오. </li></ol></li><li> 바인딩 단백질의 용출 <ol><li> 4에서 수지 nutate을 150 μL 용출 버퍼를 추가 ° 5 분 C, 4 5,000 rpm에서 1 분간 회전 ° C와 새로운 튜브에 뜨는을 저장합니다. 옵션 : 2X와 풀 elutions를 반복합니다. </li><li> 서양 얼룩에 대한 용출 샘플을 준비 용출 된 단백질의 25 μL에와 25 μL 2X 리튬 도데 실 황산 (LDS) 샘플 버퍼를 추가 2 μL β-메르 캅 토 에탄올 (BME) 2 분 동안 100 ° C 열 블록에 품어.에게 참고 : 표준 2X Laemmli에 샘플 버퍼를 사용할 수도 있습니다. </li><li> 액체 질소에 동결 초과 용출 단백질을 끼 웁니다. 선택 사항 : 65 배 LDS 샘플 버퍼의 동일한 볼륨 수지 스트립 나머지 단백질 ° C 5 분, 새로운 튜브에 LDS-용출 단백질을 제거한 다음이 아닌 수지, 용출 된 단백질에 2 μL BME를 추가합니다. 이 순서는 conjuga 어떤 이온 항체의 제거를 방지하는 것입니다비즈 테드. </li><li> -80 ° C 더 사용할 때까지 매장 샘플. </li></ol></li><li> 적절한 항체와 서양 얼룩 및 프로브 단백질을 시각화합니다. <ol><li> 각 샘플의 20 μl를 (Δ1-3 OD 600 대)과 선택의 SDS-PAGE 젤의 단백질 사다리의 3-10 μl를로드합니다. 정기적으로이 프로토콜에 사용되는 젤 4-12% 비스 - 트리스 8 % 트리스 - 글리신 있습니다. </li><li> 50 분 동안 200 V에서 젤을 실행합니다. </li><li> 20 ~ 30 분 (표 1의 조리법)를위한 19 V에서 세미 드라이 송금 젤에서 PVDF 막에 단백질을 전송합니다. </li><li> 4 % milk/1x 트리스 블록 막 4 ° C (표 1 레시피)에서 RT 또는 O / N에서 1 시간 동안 식염수 TWEEN (TBST)를 버퍼. </li><li> 4 ° C.에서 RT 또는 O / N에서 1-3 시간 동안 4 % milk/1x의 TBST에 대한 관심의 항원 - 태그 단백질 일차 항체로 막을 배양 </li><li> 5 분 1X TBST로 각각 3 배 막 씻으십시오. </li><li> 적절한로 막을 배양보조 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 (HRP) 복합 RT에서 1-3 시간 동안 항체. </li><li> 1X TBST의 큰 볼륨 15 분 각 배 막 씻으십시오. </li><li> 사란 랩 ECL 기판과 랩으로 막 커버. </li><li> 필름 막 노출하고 단백질을 시각화하기 위해 개발. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li>
<li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li>
<li>Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+and+In+Vitro+Analyses+of+Regulation+of+the+Pheromone-Responsive+prgQ+Promoter+by+the+PrgX+Pheromone+Receptor+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein.</a> J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
<li>Hannich, J. T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li>
<li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li>
<li>Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li>
<li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeutscher%2C+MP+%22Guide+to+protein+purification%22">Guide to protein purification</a>. , (1990).</li>
<li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tandem+Affinity+Purification+%28TAP%29+Method%3A+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li>
<li>Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+125-kd+membrane+glycoprotein+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+attached+to+the+lipid+bilayer+through+an+inositol-containing+phospholipid%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid.</a> EMBO J. 7 (7), 2233(1988).</li>
<li>Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2%2B+ion%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li>
<li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li>
<li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74(2011).</li>
<li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

이 프로토콜은 그대로, 네이티브의 준비에 초점을 맞추고, 사후 translationally 다운 스트림 응용 프로그램의 신진 효모 세포에서 단백질을 수정했습니다. 이 프로토콜을 시도하기 전에, 그것은 관심의 단백질이 쉽게 상태에게 12 변성에서 준비 단백질 추출물에서 발견 할 수 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 클론 항체를 사용할 수없는 경우는 융합 단백질은 서양 말에서 감지 할 수 있도록 태그에게 관심의 단백질을 항원 것이 유리할 수 있습니다. 본 프로토콜에서는, 우리는 HA, 6xHIS-V5, 또는 MYC 에피토프 태그 SIZ1 태그이 전략은 우리가 명확 서양 오 (그림 1)에 단백질과 sumoylated 형태를 식별 할 수 있었다. 높은 친화력 안티 GFP 항체가 (데이터가 표시되지 않음)에 얻기 어려운 가능성이 있기 때문에 우리는 GFP - 태그 단백질을 검출 덜 성공을했다. 또 다른 중요한 문제는 관심의 단백질의 발현 수준에 관한 것이다. 개인의 수준...

효모 유전학의 최고 힘은 전설이지만, 신진 효모 인 Saccharomyces cerevisiae의,에서 네이티브 단백질의 준비 및 분석은 종종 문제가 고민입니다. 후자는 상당한 기계적 강도와 효모 세포벽 1의 탄력성 때문이다. 다른 방법은 효소, 화학, 기계, 압력 기반의 전체 세포 단백질 추출물 2-6를 얻기 위해 효모 세포의 파괴에 대해 설명하고있다. 이 기술은 이후의 분석이나 정제 단계에 사용할 수있는 휴대 대표 네이티브 단백질 추출물을 산출하기 위해 효능 널리 다릅니다. 예를 들어, 효모 세포벽은 세포 용해 효소 (예 : zymolyase) 및 결과 spheroblasts으로 제거 할 수는 전단, 세제, 또는 단백질을 해제 삼투 용해에 의해 중단 될 수 있습니다. 이 방법은 성공적으로 많은 세포 내 fractionations의 시작 지점으로 고용하지만 긴에서 incubate을 필요로하고있다일부 단백질 7의 안정성과 호환되지 않습니다. 효모 세포의 단백질의 화학적 추출을위한 독자적인 효모 용해 시약 (예 : 세제)를 상업적으로 사용할 수 있지만이 단백질 추출 시약 및 단백질의 후속 생화학 적 특성에 미치는 영향의 효과는 항상 8 명확하지 않습니다. 자주 프랑스어 프레스로 불리는 고압 균질는 효과적으로 최초의 고압에게 복종하고 압력 셀에있는 작은 구멍을 통해 그들을 압출하여 효모 세포를 휴식. 이 기술은 높은 품질의 추출물을 생산하지만, 장비는 매우 고가이며, 세포 또는 여러 샘플 9 소량 적합하지 않을 수 있습니다. 따라서, 비드 밀 효모 세포의 기계적 장애는 종종 기본 효모 단백질 제제 10에 대한 선택의 방법입니다. 이 기술은 산 워싱턴 주와 효모 세포 벽의 기계적 장애를 포함셰이커, vortexers 또는 비드 공장의 다양한 수행 할 수 유리 구슬을 흘렸다. 특히이 방법은 동시에 여러 작은 샘플 (세포 이하 1 ㎖)을 처리하는 데 사용할 수 있습니다. 많은 다른 구슬 또는 구슬 밀 중단 매트릭스는 이제 2 ㎖ 튜브에 세포 유형의 거의 모든 종류를 방해하는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 다른 기술과 장비를 고려, 비드 밀 단백 분해 효소 및 / 또는 프로 테아 억제제의 적절한 버퍼를 활용하고, 특히 효모 세포의 파괴와 같은 sumoylation로 번역 후 수정 사항을 보존하는 데 도움이 매우 빠르게 발생하는 추가 이점이 있습니다 및 추출물의 온도 제어됩니다. 이 프로토콜은 단백질 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하는 궁극적 인 목표와 부드러운 상태에서 내생 이상 발현 단백질의 빠르고 효과적이며 신뢰할 수있는 추출에 초점을 맞추고 있습니다. 성장 매체, 세포 용해 버퍼조성 및 비드 밀 설정은 단백질 상호 작용과 같은 sumoylation와 ubiquitylation로 번역 후 수정 사항을 유지하기 위해 최적화되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Omni Bead Ruptor 24</td><td></td><td></td> BG1805 <td></td></tr><tr><td>ThermoScientific</td><td>YSC3869</td><td>유도 및 추출에 사용할 수 있는 GAL+ 효모 균주의</td><td>ORF</td></tr><tr><td>균주 pYES2.1 TOPO 벡터</td><td>Life Technologies</td><td>K4150-01</td><td>유도 및 추출에 사용할 수 있는 GAL+ 효모 균주; V5/6xHIS 태그</td></tr><tr><td>포함 Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail ( 100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1860932</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml 스커트 튜브 with Tethered Screw Cap</td><td>BioExpress</td><td>C-3369-3</td><td>튜브가 비드 파열</td></tr><tr><td>유리 비드, 산 세척, 425-600 &micro; m (30-40 US sieve)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X 원심분리기 튜브 필터</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8161</td><td>정화 용해물의 추가 필터링에 사용</td></tr><tr><td>TALON Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>6xHIS 태그 단백질의 정제용</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td>웨스턴 블로팅 이전에 SDS-PAGE에 자주 사용되는 프리캐스트 젤</td></tr><tr><td>Simply Blue</td><td>Life Technologies</td><td>#LC6060</td><td>단백질 겔 염색</td></tr><tr><td>포유류 용해 버퍼</td><td>Promega</td><td>G9381</td><td>대체 상용 용해 버퍼</td></tr><tr><td>Anti-V5 아가로스</td><td>Sigma</td><td>A7345</td><td>면역침전법</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS 겔</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>항-myc 항체</td><td>Covance</td><td>mms-150R</td><td></td></tr><tr><td>2차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab97040</td><td>염소 pAb-마우스 IgG (HRP)</td></tr></tbody></table>

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

구슬을 쳐서 균질화 방해 악명 어려운 신진 효모 세포에서 DNA, RNA, 단백질 및 대사 산물을 해제하는 빠르고 효율적인 방법입니다. 여기에서 우리는 기능, 상호 작용과 단백질의 번역 후 수정 사항을 유지하기 위해 최적화 된 버퍼로 단백질의 추출을위한 비드 밀 균질의 사용을 설명합니다. 관심의 단백질을 발현 대수 성장 세포 선택 액상 성장 미디어에서 재배된다. 성장 매체를 유도 프로모터 (예 : 갈락토스)에서 단백질 발현을 유도하는 약으로 보충 할 수 있습니다 (예 : nocodazole) 세포주기 단계를 동기화하거나 (예 : MG132) 프로 테아 기능을 억제. 세포는 침전 및 분해 효소 및 / 또는 인산 가수 분해 효소 억제제를 포함하는 적절한 버퍼에 재현 탁하고도 즉시 처리 또는 나중에 사용하기 위해 액체 질소에 냉동. 균질화은 20 초 BEA의 여섯 사이클에 의해 수행됩니다D-구타 (5.5 m / 초), 얼음의 한 분 배양 한 다음 각. 결과 균질는 원심 분리에 의해 제거되고 작은 입자는 여과에 의해 제거 할 수 있습니다. 결과 삭제 전체 세포 추출물 (WCE)은 웨스턴 블롯 다음 SDS-PAGE로 전체 단백질의 직접적인 분석을 위해 TCA 20 %를 사용하여 침전된다. 추출물은 특정 단백질의 친화력 정화, 번역 후 수정 또는 공동 정화 단백질의 분석의 검출에 적합하다. 대부분의 단백질 정화 프로토콜의 경우와 같은 일부 효소와 단백질은 정제 및 다른 사람을위한 유일한 조건이나 버퍼 조성물에 명시된 조건을 불안정하거나 용해 할 수 필요할 수 있습니다. 후자의 경우, 제시된 프로토콜은 경험적으로 단백질 추출 및 정제를위한 가장 비드를 제패 전략을 결정하는 데 유용한 출발점을 제공 할 수 있습니다. 우리는 에피토프 태그가 SUMO E3 리가, Siz1, 세포주기의 추출 및 정제를 보여Slx5, sumoylated 및 인산화뿐만 아니라, SUMO-대상 유비퀴틴 리가 소단위 모두되어 단백질을 규제.

우리의 대표적인 결과를 설명 비드 구타와 단백질 추출 프로토콜 스트림 응용 프로그램 (표 2에 요약)의 다양한 단백질의 재현성 준비에 유용 밝히지. WCEs의 쿠마시 염색 이어 SDS-PAGE 단백질 (~ 12&gt; 250 kDa의)의 넓은 범위 재현성 효모 세포 (그림 1A)에서 추출 할 수 있음을 보여줍니다. 분자량의 범위 이산 밴드는 양질의 단백질 추출물의 지표입니다. 추출물의 품질은 서양 특정 에피토프 태그가 단백질 블롯으로 확인 할 수 있습니다. 그림은 Δ120kDa (그림 1B)에서 마이그레이션 갈락토오스 과발현, V5 태그가 SUMO ligase의 Siz1에 대한 대표적인 결과입니다. 일반적으로, 부분적으로 분해 단백질은 예상 무게 아래에 여러 조각으로 실행됩니다, 그러나 여기에만 전체 길이 단백질이 관찰된다. 주어진 단백질 또한, 고 분자량의 부가 물번역 후 수정을 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 갈락토오스 과발현 su...

높은 품질의 효모 세포 추출물의 준비를 개별 단백질 또는 전체 프로테옴의 분석에 필요한 첫 번째 단계입니다. 여기에서 우리는 단백질의 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하기 위해 최적화 된 신진 효모 세포에 대한 빠르고, 효율적이며 신뢰성있는 균질화 프로토콜을 설명합니다.

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

이 프로시저의 전반적인 목표는 천연 구조 기능 상호작용과 번역 후 수정을 보존하면서 효모 단백질을 추출하는 것입니다. 이는 먼저 세포를 배양하여 목적 단백질의 발현을 유도함으로써 달성됩니다. 그다음, 수확한 효모 세포를 적절한 버퍼 내에서 균질화하여 단백질을 추출합니다.그런 다음, 친화성 수지를 사용하여 맑게 정제된 전세포 추출물로부터 표적 단백질을 정제합니다. 절차의 마지막 단계는 추가 분석이나 하위 응용 분야를 위해 친화성 수지로부터 정제된 단백질을 용출하는 것입니다. 최종적으로, 웨스턴 블롯 분석을 통해 단백질 정제 변형 및 상호작용을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.실험 절차는 저의 연구실에서 학부 연구원으로 지난 2년 동안 활동한 윌리엄 앤 메리 대학 졸업생인 Eva's Ky가 시연하겠습니다. 기존의 다른 방법들에 비해 비드 비팅(bead beading)의 주요 장점은 단백질의 기능적 상호작용과 번역 후 수정을 보존하는 조건 하에서 다수의 샘플을 신속하게 처리하고 용해할 수 있다는 점입니다. 우선, 갈락토스 유도성 6-His 태그 단백질을 인코딩하는 플라스미드로 gal 양성 효모 균주를 형질전환합니다. 형질전환체를 2% sucrose가 함유된 SD uracil과 같은 5 mL의 적절한 선택 배지에 접종하고, 30 °C에서 회전시키며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 배양한 배양액을 2% sucrose가 포함된 선택 배지로 희석하여 최종 부피를 33 mL로 맞추고, 이때 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)가 0.3이 되도록 합니다. 이후 30 °C, 150 RPM의 진탕 배양기에서 배양합니다.배양액의 OD 600이 0.8에서 1.5에 도달하면, 6% galactose가 포함된 3X XYEP 17 mL를 첨가하여 최종 농도가 2% galactose가 포함된 1X XYEP가 되도록 하여 목적 단백질의 발현을 유도하고, 30 °C 진탕 배양기에서 5~6시간 동안 추가로 배양합니다. 유도된 배양액의 OD 600을 측정한 후, 약 150~200 OD 600 단위의 세포를 4 °C, 5,000 RPM에서 5분간 원심분리합니다. 그 다음, 1X XPBS 1 mL와 1X protease inhibitor cocktail을 사용하여 세포 펠릿을 재부유시킨 후 2 mL 스크류 캡 튜브로 옮기고, 4 °C, 15,000 RPM에서 1분간 세포를 원심분리합니다. 상층액을 따라낸 후, 세포 펠릿을 액체 질소에 넣어 급속 동결시켜 동결 세포 펠릿을 준비합니다.산 세척된 유리 구슬 200 µL와 얼음처럼 차가운 용해 버퍼 500 µL를 추가합니다. 튜브를 항상 얼음 위에 둡니다. 끝부분을 잘라낸 파이펫 팁을 사용하여 4 °C에서 짧게 파이펫팅하여 섞어줍니다.세포가 담긴 튜브를 비드 밀 밸런스 락에 장착하고 제조사의 지침에 따라 5.5 meters per second의 속도로 20초 동안 작동시킵니다. 그 다음 튜브를 슬러시 상태의 얼음 위에 1분 동안 둡니다. 추출된 단백질을 정제하기 위해 이 과정을 총 6회 반복한 후, 4 °C에서 15,000 RPM으로 15분 동안 원심분리합니다.그런 다음 웨스턴 블롯용 전세포 추출물(whole cell extract, WCE) 샘플을 준비하기 위해, OD 600 2단위에 해당하는 세포의 WCE를 800 µL의 20% trichloroacetic acid(TCA)에 넣고 볼텍스하여 혼합합니다. 투명한 WCE 샘플을 정제하기 위해, 50 내지 100 µL의 친화성 레진(affinity resin)을 새 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고, 1 mL의 세척 완충액을 추가하여 레진을 세척 및 평형화하며, 레진이 다시 현탁될 때까지 위아래로 뒤집어 섞어줍니다. 4 °C에서 5,000 RPM으로 1분간 원심분리한 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 친화성 정제를 통한 단백질 결합을 위해, 세척된 비드에 100 내지 200 µL의 정제된 용해물을 추가하고 용해 완충액을 사용하여 총 부피를 1 mL로 맞춥니다.4°C에서 2~5시간 동안 반응시키거나 흔들어 섞어줍니다. 용해물 비드 용액이 WCE Western blot 샘플을 위해 얼음 위에서 반응하는 동안, 남은 투명한 WCE 분주액을 액체 질소로 급속 냉동하여 추후 사용 시까지 -80°C에서 보관하십시오. 4°C에서 15,000 RPM으로 2분 30초 동안 원심분리한 후, 펠렛이 손실되지 않도록 주의하며 상층액을 따라내고, 펠렛에 2% TCA 800 µL를 추가한 후 튜브를 볼텍싱하고 다시 2분 30초 동안 원심분리합니다.상청액을 조심스럽게 따라낸 후, TCA 샘플 버퍼 100 µL를 첨가하고 볼텍싱하여 펠렛을 녹인 다음 샘플을 인큐베이션합니다. 100 °C 히팅 블록에서 2~5분간 두 번 더 처리하여 녹이기 어려운 펠렛의 잔여물을 완전히 용해시키고, 사용 전까지 -80 °C에서 보관합니다. 라이세이트 비드 샘플의 인큐베이션이 끝나면, 5,000 RPM, 4 °C에서 1분간 원심분리한 후 세척 버퍼를 사용하여 레진을 5회 세척하여 단백질을 용출합니다.4°C에서 5분 동안 레진에 150 µL의 용출 버퍼를 첨가합니다. 4°C, 5,000 RPM에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 새 튜브에 저장합니다. 마지막으로, 웨스턴 블롯 샘플을 준비하기 위해 25 µL의 UD 단백질 샘플에 2 µL의 BME가 포함된 25 µL의 2x SDS 샘플 버퍼를 첨가합니다.이 그림에서 보는 바와 같이, 광범위한 단백질을 효모 세포로부터 재현성 있게 추출할 수 있습니다. 다양한 분자량 범위에 걸쳐 나타나는 뚜렷한 밴드들은 단백질 추출물의 품질이 높음을 나타냅니다. 추출물의 품질은 특정 에피토프 태그 단백질에 대한 웨스턴 블로팅을 통해 확인할 수 있습니다.갈락토스 과발현 V five 태그 Sumo Ligase의 대표적인 결과는 약 120 kilodaltons에서 이동하는 밴드입니다. 일반적으로 부분적으로 분해된 단백질은 예상 분자량보다 낮은 위치에서 여러 단편으로 나타나지만, 여기서는 전체 길이의 단백질만 관찰됩니다. 또한, 특정 단백질의 고분자량 부가물은 번역 후 변형을 나타낼 수 있습니다.예를 들어, 여기서는 락토스(lactose)로 과발현된 sumo related S one delta four 40과 전장 SIS one을 확인할 수 있습니다. 이 Western blot에서 입증된 바와 같이, 수정(modifications)은 내인성으로 발현된 S one에서도 보존될 수 있습니다. 이 그림은 핵 농축 단백질인 SLX five와 CS one delta four 40이 우리의 ws로부터 성공적으로 정제되었음을 보여줍니다.특히, 6xHis 태그가 붙은 단백질은 천연 및 변성 조건 모두에서 W'S로부터 친화성 정제가 가능합니다. 이와 대조적으로, SLX 5G ST 및 CS one delta four 40 ha는 6xHis 에피토프가 없지만, 천연 조건에서 여전히 금속 친화성 수지와 올레 민감성 방식으로 상호작용합니다. 우리는 CIS one과, 그보다는 덜하지만 SLX five가 금속 배위 링 도메인을 통해 금속 친화성 수지에 결합할 수 있다고 제안합니다.우리가 알고 있는 바로는 이 특정 현상이 아직 보고되지 않았으나, 콜레라 독소 B 서브유닛이 천연 히스티딘 잔기에 의해 매개되는 방식으로 니켈 친화성 레진에 결합하는 유사한 상황이 설명된 바 있습니다. 이러한 관찰 결과는 WCER 내의 단백질들이 적어도 부분적으로는 단백질 기능 연구를 위해 천연 상태로 접혀 있음을 시사합니다. 단백질 복합체가 전세포 추출물 내에서 온전하게 유지된다는 것을 보여주는 것이 중요합니다.대표 데이터 분석 결과, WS cis one 내에 CS one delta four 40, SLX five, 그리고 로딩 컨트롤로 사용되는 세포질 단백질인 P GK one이 존재하는 것으로 나타났습니다. Delta four 40은 금속 친화성 수지에 결합하는 고유 특성을 이용하여 이들 추출물로부터 정제되었습니다. 또한, yeast 세포에서 SLX five와 SIS one을 공동 발현시켰을 때, EIT 내의 SLX five 수준이 증가하였으며, 이는 SLX five가 SIS one과 상호작용할 가능성이 있음을 시사합니다.이 영상을 시청한 후에는 천연 조건에서 효모 단백질을 추출, 정제 및 시각화하기 위해 효모 세포를 배양하고 처리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

budding-yeast-protein-extraction-purification-for-study-function

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

유전자 삭제 및 단백질 overexpression은 단백질의 기능을 연구하는 일반적인 방법입니다. 이 문서에서는, 우리는 인구의 단백질 농도의 기능 및 단일 세포 수준으로 표현형 개발의 분석을 위해 프로토콜을...

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

공동 정화 nucleases와 프로 테아제에 의해 전통적인 방법으로 정화 진핵세포 리보솜의 준비 오염 부정 스트림 생화학 및 구조 분석에 영향을 미칩니다. 신속하고 간단한 색층 정화 방법은 모델 시스템으로 효모 변이를 사용하여이 문제를 해결하는 데 사용됩니다.

높은 활성 효모 변이의 색층 정화

이 기사는 단백질 분해에 대한 유전적 요구 사항을 결정하기 위한 효모 성장 기반 분석에 대해 설명합니다. 또한 효모 단백질을 신속하게 추출하는 방법을 보여주며, 이는 분해 요구 사항을 생화학적으로 확인하기 위한 웨스턴 블로팅(western blotting)에 적합합니다. 이러한 기술은 다양한 단백질의 분해를 모니터링하도록 조정할 수 있습니다.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

이 원고는 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에, sumoylation 및 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80의 유비퀴틴의 검출에 대해 설명합니다.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

변환 규칙 단백질 풍부의 제어에서 중요 한 역할을 한다. 여기, 우리는 높은 처리량 방법 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 번역의 정량 분석에 대 한 설명.

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

여기 우리가 제시 익스프레스, solubilize, 누 룩을 사용 하 여 SLC4 운송업 자 가족에 상 동으로 여러 진 핵 borate 전송기를 정화 하는 프로토콜. 우리는 또한 multimeric 어셈블리에 대 한 정화 homomeric 단백질을 평가 하기 위해 화학 가교 분석 결과 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 다른 도전 막 단백질에 대 한 적용할 수 있습니다.

표현, 가용 화, 그리고 진 핵 Borate 전송기의 정화

여기서, 우리는 효모에서 SNX-BAR 헤테로디머의 발현, 정제 및 리포좀 결합에 대한 워크플로우를 제시한다.

신진 효모 SNX-BAR 헤테로디머의 발현, 정화 및 리포솜 결합

최근 진행에도 불구하고 많은 효모 미토콘드리아 단백질은 여전히 완전히 알려지지 않은 기능으로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 분자 기능의 해명에 대한 기본이었던 단백질의 제출국국화를 결정하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

이 프로토콜은 효모 세포 주기 정지 및 선택적 방출의 두 가지 방법을 자세히 설명하고 S. cerevisiae에서 세포 주기 의존적 과정을 연구하기 위한 형광 현미경의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

발아 효모의 세포 주기 의존적 과정의 조작 및 분석

배우세요 신진 효모 단백질 추출 및 정제 방법으로 단백질 상호작용과 번역 후 수정을 보존하여 생화학 및 단백질체 연구에 활용하세요. 이 프로토콜은 웨스턴 블롯 분석을 위한 고품질 시료를 제공합니다.

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

더 많은 동영상 탐색