바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

DNA, RNA 및 단백질에 대한 다중 면역형광 세포 기반 검출 접근 방식을 통해 단일 세포 내에서 다양한 유형과 가닥성의 단백질과 핵산을 동시에 시각화할 수 있습니다. 파종하기 전에 에탄올에서 커버 슬립을 5분 동안 배양한 다음 PBS에서 2분 동안 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 실온에서 30분 동안 폴리-D-라이신 밀리리터당 20마이크로그램에 커버 슬립을 완전히 담그십시오.

배양이 끝나면 PBS에서 2회 세척하여 초과 매트릭스 용액을 제거하고 관심 세포를 1 x 10에서 커버 슬립 농도당 PBS 50마이크로리터당 6번째 세포로 희석합니다. 그런 다음 관심 세포 50마이크로리터를 각 poly-D-lysine 코팅 커버 슬립에 시딩하여 실온에서 30분 배양합니다. 배양이 끝나면 PBS에서 세포를 세 번 세척한 후 4% 파라포름알데히드에 30분 동안 고정합니다.

배양이 끝나면 PBS에서 세포를 두 번 세척한 후 실온에서 10분 동안 PBS에서 0.1%Tween 20의 500마이크로리터로 세포를 투과시킵니다. 배양이 끝나면 세척 당 500 마이크로 리터의 신선한 PBS로 각 커버 슬립을 두 번 세척하십시오. 커버 슬립을 유리 슬라이드에 고정하려면 멸균된 유리 슬라이드에 투명 매니큐어 한 방울을 떨어뜨리고 커버 슬립의 셀이 없는 면의 한쪽 가장자리를 매니큐어 한 방울 위에 놓고 커버 슬립을 슬라이드 셀 면이 위를 향하도록 내립니다.

세포가 탈수되는 것을 방지하기 위해 고정된 커버 슬립에 PBS 몇 방울을 추가하고 소수성 차단 펜을 사용하여 커버 슬립 바깥쪽에 원을 그립니다. 장벽이 그려지면 PBS를 100마이크로리터의 프로테아제 III로 교체하고 슬라이드를 섭씨 40도의 인큐베이터에 15분 동안 넣습니다. 배양이 끝나면 신선한 PBS로 슬라이드를 두 번 씻고 흔들면서 씻을 때마다 2 분 동안 씻습니다.

두 번째 세척 후 관심 프로브를 섭씨 67도에서 200마이크로리터의 혼성화 완충액에 10분 동안 희석합니다. 배양이 끝나면 각 커버 슬립에 50마이크로리터의 프로브 용액을 추가하고 슬라이드를 가습된 섭씨 40도 오븐에 2시간 동안 넣습니다. 배양이 끝나면 새 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척하고 세척당 2분 동안 흔듭니다.

두 번째 세척 후 슬라이드를 두드려 초과 버퍼를 제거하고 형광 채널 1, 2 및 3용 증폭기 한 방울로 커버 슬립을 순차적으로 처리하여 30분, 증폭기당 섭씨 40도 배양 및 처리 사이에 세척당 흔들림이 있는 새 세척 버퍼에서 2분 동안 두 번 세척합니다. 마지막 세척 후 섭씨 4도 오븐에서 15분 동안 배양하기 위해 커버 슬립에 형광 채널 4 증폭기 한 방울을 추가하고 그림과 같이 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번, PBS로 한 번 세척합니다. 관심 단백질의 면역 염색을 위해 마지막 세척 후 각 커버 슬립을 200마이크로리터의 차단 버퍼로 처리하여 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 종료 시 블로킹 완충액을 디캔팅하고 PBS에 희석된 1차 관심 항체 200마이크로리터와 1% 소 혈청 알부민이 보충된 Tween 20을 추가합니다. 실온에서 1시간 배양 후 새 PBS로 10분 2회 세척하고 세척당 Tween 20을 흔들어 슬라이드를 세척한 후 실온에서 1시간 동안 적절한 2차 항체로 샘플을 라벨링합니다. 배양이 끝나면 새 PBS와 Tween 20으로 슬라이드를 두 번 세척하고 세척할 때마다 흔들면서 10분 동안

두 번째 세척 후 실온에서 1분 동안 적절한 핵 염료로 핵을 카운터 염색한 다음 실온에서 10분 동안 PBS를 2회 세척하여 진탕합니다. 이미징을 위해 샘플을 장착하려면 샘플당 하나의 새로운 멸균 유리 슬라이드에 페이드 방지 용액 한 방울을 떨어뜨리고 커버 슬립 크기와 비슷한 영역을 덮도록 용액을 펴 놓습니다. 슬라이드에서 커버 슬립을 분리하고 커버 슬립을 PBS에 담그십시오.

집게를 사용하여 남아 있는 매니큐어를 제거하고 실험실 물티슈로 커버 슬립 뒷면을 말리십시오. 그런 다음 각 커버 슬립 샘플 면을 페이드 방지 용액에 부드럽게 놓고 샘플을 밤새 건조시킵니다. 이 절차의 개념 증명으로 HIV-1 DNA, RNA 및 단백질을 동시에 라벨링하고 단일 세포 수준에서 현미경으로 시각화했습니다.

이 예에서는 두 개의 HIV-1, DNA 게놈이 바이러스 RNA를 활발하게 전사하기 때문에 단일 세포 내에서 시각화할 수 있습니다. 바이러스 RNA는 핵공 복합체를 통해 내보내졌고 바이러스 단백질은 세포질에서 합성되었습니다. 관찰된 바와 같이, 프로브 교차 반응 가능성이 있는 두 개의 레트로바이러스로 표지되었음에도 불구하고 두 바이러스에 걸친 프로브 세트 간에 교차 반응이 거의 또는 전혀 관찰되지 않습니다.

또한 시료 전처리 중에 세포를 RNase로 처리하면 바이러스 RNA 염색을 제거할 수 있습니다. 그런 다음 각 이미지에서 세포당 항체 신호의 평균 통합 형광 강도를 정량화할 수 있습니다. 관찰된 바와 같이, HBV 전유전체 RNA와 총 HBV RNA의 양은 HBV 감염이 진행됨에 따라 증가합니다.

HCV 감염 이미징은 관심 형광단을 검출하기 위해 60X 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하는 컨포칼 현미경을 통해 수행할 수도 있습니다. 이 매우 특이적인 접근 방식을 통해 높은 공간적 시간 해상도로 바이러스 또는 세포 과정을 추적할 수도 있습니다. 또한 이 기술은 여러 바이러스 및 기타 병원체를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.