이중 색깔 시간 게이트 자극 방출 고갈 (STED) Nanoscopy에 의한 면역 시냅스의 시각화

이 절차의 전반적인 목표는 TED 현미경을 사용하여 NK 세포 용해 시냅스에서 F 액틴과 같은 구조를 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 활성화 항체를 사용하여 유리에 시냅스를 다시 요약함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 perme을 고정하고 관심 구조를 위해 세포를 염색하는 것입니다.

다음으로, 슬라이드는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 이미지화한 다음 이미지 해상도를 높이기 위해 stead depletion을 적용합니다. 마지막 단계는 디콘볼루션 알고리즘을 사용하여 이미지를 처리하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 이중 색상 스테드와 내시경 덕분에 세포 구조의 100나노미터 미만의 해상도를 보여줄 수 있습니다.

이 방법은 세포골격(cytoskeleton)과 외세포작용(exocytosis) 사이의 관계와 같은 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리의 경우, 우리는 자연 살해 세포에 의한 용해 과립이라고 불리는 특수 리소좀의 분비에 관심이 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 TED 고갈 레이저의 적용에서 조정할 수 있는 여러 변수가 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

공핍 빔을 부적절하게 적용하면 해상도가 개선되는 대신 악화될 수 있습니다.준비 시 30ml의 RPMI 매체를 10%FCS로 따로 가열합니다. 1 밀리리터의 BD CY는 섭씨 37도까지 사이옵 펌에 영향을 미칩니다. 그런 다음 커버 슬립을 항체로 코팅하는 과정을 시작하십시오.

번호 1.5 커버 슬립을 잡고 PAP 펜을 사용합니다. 커버 슬립에 동전 크기의 사각형을 만드십시오. 테스트된 각 조건에 대해 하나의 정사각형을 준비합니다.

각 서클에 PBS에서 밀리리터당 5마이크로그램의 항체 200마이크로리터를 로드합니다. NK 92 세포 활성화를 위해서는 항 CD 18 및 항 NK P 30 항체를 사용합니다. 적재한 덮개 미끄러짐을 30분 동안 37 섭씨 온도에 배양하고, 그 후에 실내 온도 PBS에 있는 복각으로 그(것)들을 씻어내십시오, 각 시험한 조건을 위한 세포 추가로 즉각 진행하십시오, 500의 000의 세포는 사용하기 위하여 준비되어 있어야 합니다.

10ml의 예열 매체로 세포를 세척한 다음 동일한 예열 매체에 다시 현탁시킵니다. 세포가 완전히 현탁된 상태에서 밀리리터당 250만 개의 세포에서 커버 슬립의 각 항체 사각형에 200마이크로리터를 디캔팅합니다. 이 경우 5%CO2로 섭씨 37도의 세포와 함께 커버 슬립을 배양합니다. 20분은 배양 세척 후 NK 세포의 과립을 분극하기에 충분한 시간이며, 실온에서 PBS에서 덮개가 부드럽게 미끄러집니다.

100 마이크로리터의 TRITTON X 100을 1밀리리터의 따뜻한 BD CY 효과 사이토 펌 용액에 첨가하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 소용돌이. 이 용액 200마이크로리터를 커버 슬립의 각 조건 사각형에 적용합니다.

그런 다음 세포를 실온의 어두운 곳에 놓고 10분 동안 기다립니다. 배양이 완료되면 염색 완충액에서 커버 슬립을 부드럽게 씻어냅니다. 그런 다음 면봉으로 주변 영역의 가장자리를 말리십시오.

다음으로, 염색 완충액에 있는 1차 항체 200마이크로리터를 주변 부위에 첨가하고 커버 슬립을 30분 동안 어둠 속에서 배양합니다. 스테드 이미징을 위한 좋은 2차 항체로는 Alexa floor 4, 88 Pacific orange 및 Horizon V 500이 있습니다. 이들 각각은 1에서 200까지의 희석에서 잘 작동합니다.

배양 세척 후 덮개가 얼룩을 묻히고 완충하고 두드려 건조시킵니다. 이전과 마찬가지로 200마이크로리터의 2차 항체를 각 조건 사각형에 적용합니다. 그런 다음 30분 동안 더 어둠 속에 앉아 두십시오.

이 시점에서 추가 세척 후 추가 항체를 추가할 수 있습니다. 예를 들어, Phin을 1에서 200까지 적용하여 f actin을 검출할 수 있습니다. 장착 매체의 경우 stead와 호환되지 않는 prolong over vector shield를 선택합니다.

핀 염색을 사용하는 경우 2 개의 2 티오 에탄올을 사용하지 마십시오. 그러나 괜찮은 경우 10-20 마이크로 리터의 장착 매체를 슬라이드에 적용하십시오. 커버 슬립을 거꾸로 한 상태에서 기포를 피하면서 매체로 부드럽게 내립니다. 그런 다음 24시간 동안 슬라이드를 배양합니다.

커버를 사용하면 다음날 슬립을 끼우고 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하고 이미징을 진행합니다. 레이저와 소프트웨어를 시작합니다. stead depletion 레이저는 100% 전력으로 예열되고 정렬되어야 합니다.

접안경을 사용하여 샘플에 초점을 맞춘 다음 소프트웨어로 전환합니다. 파장이 가장 긴 첫 번째 채널을 스캔합니다. 4층, 레이저의 출력, 여기 빔 위치 및 검출기 범위를 최적화합니다.

100 이상으로 설정하지 마십시오. 다음으로 컨포칼 이미지를 캡처하고 픽셀을 확인합니다. 채도, 선 및 프레임 평균화는 모두 픽셀 해상도를 향상시킵니다.

목표는 픽셀당 30나노미터 미만이 되는 것입니다. stead에는 약간의 채도가 허용됩니다. 다음으로, 50% 전력으로 stead depletion beam을 적용하고 이미지를 캡처합니다.

해상도가 향상되면 더 많은 전력을 적용할 수 있습니다. 또한, 여기 레이저 출력 또는 라인 평균 또는 이득을 조정하면 분해능도 향상될 수 있습니다. 배경을 줄이려면 0.3나노초의 타임 게이팅을 적용하고 위쪽으로 조정합니다.

새 해상도는 전체 절반 너비 최대 계산을 사용하여 추정해야 합니다. 만족스러우면 모든 채널이 조정될 때 두 번째 채널에 대해 이 단계를 반복합니다. 모든 스캔 시퀀스와 함께 단일 염색 대조군을 이미징하여 스펙트럼 중복을 확인합니다.

가벼운 겹침은 소프트웨어에 의한 스펙트럼 불혼화로 수정할 수 있지만 피하거나 최소한으로 유지하는 것이 가장 좋습니다. 이제 정량적 이미징을 위한 이미지를 획득합니다. 실험 조건에 따라 조건당 최소 20개의 이미지를 얻습니다.

저장된 이미지를 삭제하려면 해당 소프트웨어에서 파일을 엽니다. 각 채널의 파라미터, 특히 excitation 및 admission spectra, stead depletion emission, 이미징 방향을 확인합니다. 그런 다음 소프트웨어의 디콘볼루션 계산을 적용합니다.

일반적으로 기본 설정으로 충분하지만 노이즈 대 신호는 바닥 힘에 따라 다르므로 실험을 위해 매개변수를 수동으로 설정해야 합니다. stead를 사용할 때 최적이 아닌 해상도로 이어질 수 있는 몇 가지 일반적인 함정이 있습니다. 하나는 샘플링 중입니다.

이것은 입자와 이러한 f 액틴 필라멘트와 같은 픽셀 정보의 손실로 이어집니다. 라인 또는 프레임 평균을 늘리면 종종 이 문제가 해결됩니다. 또 다른 문제는 긴 픽셀로 인한 표백 또는 오버샘플링입니다.

일반적으로 이미지 획득 전에 스캔에 대한 과도한 라인 평균화로 인한 체류 시간도 원인일 수 있으며 이미지를 획득하기 전에 더 작은 스캔을 사용하거나 더 높은 스캔 속도를 사용하여 수정할 수 있습니다. 레이저 출력을 줄이면 모든 것이 작동하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이미지가 크게 향상됩니다.

디콘볼루션은 이미지를 더욱 향상시킬 것입니다. 양적으로나 질적으로나 말입니다. 이 절차를 시도하는 동안 100나노미터 미만의 분해능을 일상적으로 얻어야 합니다.

각 실험 전에 stead beam alignment를 수행하고 그 후 이 절차에 따라 약 한 시간에 한 번 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 정량 분석과 같은 다른 방법은 공동 국소화(colocalization), 세포 내 국소화(subcellular localization) 및 분자 상호 작용에 관한 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다.