Name: 이중 색깔 시간 게이트 자극 방출 고갈 (STED) Nanoscopy에 의한 면역 시냅스의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 배우세요 이중 색깔 STED 나노스코피를 이용하여 NK 세포의 세포독성 면역 시냅스를 시각화하는 방법을. 이 기법은 100나노미터 이하의 해상도로 세포골격과 단백질 구조를 정밀하게 관찰할 수 있어 면역 반응 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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1. 항체와 코트 커버 슬립 <ol><li> Prewarm (37 ° C에서) RPMI 10 % FCS 미디어 30 ㎖ 및 BD Cytofix / Cytoperm 1 ㎖를. </li><li> 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 정제 된 항체의 5 ㎍ / ㎖의 용액을 준비합니다. NK92 세포주, 항 CD18의 사용 및 안티 NKP30의 활성화를 위해 좋습니다. <ol><li> PAP 펜을 사용 # 1.5 coverslip에 각 조건에 대한 표시 한 약 한푼 크기의 원. 이중 스테인드 흠,, 두 개의 단일 스테인드 조건 : 듀얼 컬러 실험, 네 가지 조건이 있어야합니다. 각 지역에서 항체 용액 200 μl를 분배하고, 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 부드럽게 실온에서 50 ML 원뿔 튜브에 PBS의 각 50 ㎖에 침지 커버 슬립을 씻으십시오. 세탁 전에 세포 치료가 커버 슬립에 항체 건조를 방지하기 위해주의해야한다의 추가에 즉시 발생한다. </li></ol></li></ol> 2. 커버에 NK 세포를 활성화전표, 수정 및 투과 <ol><li> 조건 당 5 × 5 NK92 세포를 분리. 원심 분리기 및 뜨는 캔트. 단계 1.1에서 10 ㎖ 예비 가온 미디어에 한 번 씻으십시오. 원심 분리기 및 뜨는 캔트. <ol><li> 2.5 × 10 6 / ml의 농도 단계 1.1에서 예비 가온 미디어에 Resuspend 세포. </li><li> 부드럽게 섹션 1.2.1에서 생성 영역의 중심에 200 μl를 가만히 따르다. 5 % CO 2에서 20 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. (참고 :이 시간은 그 생물학적 기능에 따라 확장 또는 감소시킬 수있다 NK 세포 과립 편광를 들어, 20 분은 충분합니다.). </li></ol></li><li> 세포의 배양 후, 부드럽게 50 ML 원뿔 튜브에 실내 온도 PBS 50 ㎖에 각각 침지의 coverslips을 씻어. </li><li> 철저하게 단계 1.1와 소용돌이에서 데워진 수정 / 파마 액 1 ㎖에 트리톤 (Triton) X-100의 1 μl를 추가합니다. 세포에 수정 / 파마 버퍼 (단계 2.3) 200 μl를 추가하여 수정하고 투과. 10m 품다실온에서 어둠 속에서. </li></ol> 3. 얼룩 세포 <ol><li> 버퍼를 염색 준비 인산염은 식염수 (PBS), 1 % BSA, 0.1 % 사포닌을 버퍼. <ol><li> 1 차 항체 솔루션을 준비합니다 200 μL 염색 완충액 (단계 3.1 참조). (주 : 항체를 사용하기 전에 적정해야한다). 코트 커버 슬립 (단계 1.2)를 사용하는 동일한 종에서 발생하는 일차 항체의 사용을 피하십시오. 또한 STED 이미징 Strepatividin - 바이오틴 결합을 피하십시오. </li><li> 2.3.1 다음, 부드럽게 버퍼를 염색 50 ㎖에 커버 슬립을 씻어. 여분의 버퍼를 제거하기 위해 면봉으로 PAP 펜 영역의 가장자리를 가볍게 두 드리십시오. 3.1.1 절에서 만든 항체 솔루션을 적용합니다. 실온에서 어둠 속에서 30 분 알을 품다. (권장 : 습도를 유지하기 위해 축축한 종이 타월로 슬라이드 상자에 커버 슬립을 품어). </li></ol></li><li> 에서 이차 항체의 솔루션을 준비합니다 200 μL 염색버퍼. 추천 형광 알렉사 플 루어 488, 태평양 오렌지 및 V500입니다. 일반적으로, 1:200 희석 STED 영상에 적합합니다. <ol><li> 부드럽게 버퍼를 염색 50 ㎖에 커버 슬립을 씻어. 여분의 버퍼를 제거하기 위해 면봉으로 PAP 펜 영역의 가장자리를 가볍게 두 드리십시오. 차 항체 솔루션을 적용합니다. 실온에서 어둠 속에서 30 분 알을 품다. </li></ol></li><li> 그 외 단백질을 세척 및 염색을 반복합니다. Phalloidin의 함께 F-액틴을 검출하는 경우, 이것은 일반적으로 1:200 희석에서, 이차 항체와 함께 포함될 수있다. </li></ol> 4. 슬라이드에 마운트 Coverslips는 <ol><li> 설치 매체를 준비합니다. 참고 : 머리말이나 머리말 금이 바람직하다. 이 STED와 호환되지 않습니다으로 VECTASHIELD은 피해야한다. Phalloidin의가 사용되는 경우 2,2-thiodioethanol은 피해야한다. MOWIOL이 허용됩니다. </li><li> 슬라이드에 장착 매체의 약 10 ~ 20 μl를 놓습니다. 반전의 coverslip (셀 쪽 아래)과에주의하면서 조심스럽게 커버 슬립을 탑재기포의 도입을 피하기. 24 시간 (최대 coverslip에) 이전 이미지에 대한 슬라이드를 품어. </li><li> 매니큐어의 coverslip의 가장자리를 밀봉. </li></ol> 5. 실험 설정 <ol><li> 필요한 레이저와 소프트웨어를 시작합니다. 100 % 전력으로 STED 고갈 레이저를 시작합니다. 상용 시스템의 경우 종종 자동화 된 절차 STED 레이저를 맞 춥니 다. </li><li> 접안 렌즈를 사용하는 현미경에, 하나의 스테인드 컨트롤로 시작, 샘플 초점을 맞 춥니 다. </li></ol> 6. 설정의 최적화 <ol><li> 첫번째 채널을 스캔, 레이저 전력, 여기 빔의 위치 및 검출 범위를 최적화. 가능하면&gt; (100)의 이득을 피하십시오. 설정을 최적화하는 공 초점에서 이미지를 캡처합니다. 라인 및 / 또는 프레임 평균 해상도를 증가 할 것이다. 픽셀의 채도를 확인합니다. 참고 : STED의 응용 프로그램이 방출의 강도를 줄일 수와 같은 일부 채도가 공 초점에서 수락 가능하다. STED를 들어, 최적의 픽셀 크기가 30 나노 미터 이하로하는 방법지금까지 더 나은 해상도가 작은 픽셀 크기를 얻을 수있다. 묘화되는 관심 영역의 사이즈는 화소 사이즈의 하한을 지시 할 것이다. 작은 픽셀 크기는 광표백을 증가시킬 수있다. <ol><li> 50 % 고갈 레이저 파워로 시작하는 STED 고갈 빔과 캡처 이미지를 적용합니다. 해상도의 향상을 볼 수있는 경우, 더 많은 공핍 레이저 전력이 적용될 수있다. 이 단계에서, 그것은 여기 레이저 파워 라인 평균 및 / 또는 게인을 조정해야 할 수도 있습니다. </li><li> 배경 (최소 0.3 NSEC)을 줄이기 위해 시간 게이팅을 적용합니다. 공 촛점 이상 해상도의 개선을 볼 수있을 때까지 설정을 조정합니다. 해상도는 전체 폭의 절반 최대 (FWHM)을 추정하여 근사 할 수있다. 이것은 그 구조를 가로 질러 라인 프로파일을 그려서 만든 가우스 피크의 최대 강도의 절반의 거리를 나타내고, 해상도를 추정 널리 사용되는 방법이다. </li><li> 첫 번째 채널이 만족되면, 그 자체의 두 번째 순서를 시작스캔 미미한. 일반적으로, 먼저 긴 파장의 형광을 검사하는 것이 좋습니다. 제 2 채널에서 6.1 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 모두 스캔 시퀀스를 하나의 스테인드 컨트롤 이미징에 의해 스펙트럼 중첩의 부족을 확인합니다. 마일드 스펙트럼 오버랩 소프트웨어 스펙트럼 않은 믹싱 기능을 이용하여 보정 될 수있다, 그러나 가능한 한 피해야한다. </li></ol> 7. 이미지 획득 <ol><li> 이미지를 수집. 양적 이미징의 경우, 적어도 20 개의 이미지 / 조건을 얻기 위해 권장합니다. 정확한 숫자는, 그러나, 표본의 크기 계산과 같은 통계적 접근과 협력의 실험 질문에 따라 정의되어야한다. 실험을 저장합니다. </li></ol> 8. 컨볼 루션 <ol><li> 디컨 볼 루션 소프트웨어 또는 일괄 처리 프로세서 파일 열기. 소프트웨어를 사용하여 각 채널에 대한 매개 변수를 확인합니다. 각 채널의 여기 및 발광 스펙트럼, STED 고갈 방출, 및 이미징 방향을 확인기 (또는 아래로 이미지가 3 차원 인 경우) 특히. </li><li> 디컨 볼 루션 마법사를 사용하여 Deconvolve. 기본 설정은 그러나 잡음 비율 (SNTR)에 신호를 형광에서 형광으로 다양하고 각 채널을 개별적으로 각각의 실험에 대해 결정해야합니다, 일반적으로 충분하다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 이 문서의 일부 출판 비용은 라이카 마이크로 시스템즈에 의해 defrayed했다

공 촛점을 통해 해상도 개선은 제어 할 수없는 요인에 따라 다소 의존한다. 이러한 요인 커버 슬립 두께와 설치 미디어 불일치에 대한 약간의 수차 (가) 있습니다. 그것은 가능한 일관으로서 촬상 방에 온도와 습도를 유지하는 것이 중요하고, STED 빔은 대략 매 60 분을 재편성한다. 절차에서 언급 한 바와 같이이 STED와 호환되지 않습니다으로, VECTASHIELD 설치 매체의 사용은 피해야합니다. 또한 어떤 사람은 항상 # 1.5 커버 전표를 사용하며, 사용 가능한 경우, 특정 두께로 확인 된 그들을를 사용합니다. 여기에 설명 된 방법 중 하나를 수정 STED 빔보다 더 긴 파장에서 방출 형광 물질을 사용하여 공 초점에있는 이미지 추가 채널이다. 이러한 방식으로, 네 개의 채널 (공 초점 두, STED에서는 2 개)까지 1 캔 이미지. 이 접근법을 복용하는 경우, 그러나, 형광체와 함께 채널 ESTED 빔의 응용 프로그램이 이러한 채널에서 광자를 소모하므로 STED 고갈 레이저 위 mitting 먼저 몇 군데해야합니다. 이 기술 장점 중 하나는 수명이 짧은 (34) 광자에서 방출을 제거하여 공 초점의 해상도를 향상시킬 수있는 시간 게이팅의 응용 프로그램입니다. 그 부근의 이미지를 작성할 때 특히, 시간 게이팅, 펄스 여기 STED에 해당하는 방출 검출기의 타이밍의 사용은 반사 오프 coverslip에 유리에서 배경 형광을 감소합니다. 심지어 STED에 적합하지 실험에서, 펄스 여기 소스를 사용하는 경우, 타임 게이팅은 공 초점의 해상도를 향상시키기위한 유용한 도구가 될 수 있습니다. STED에서 해상도를 향상시키기 위해 이용 될 수있는 다양한 변형이있다. 하나이 또한 시료에 도달하는 빛의 양이 감소 되더라도, 표준 1 에어리 부에서 핀 홀의 크기를 감소시키는 것이다. 이는 라스베가스를 증가시킴으로써 보상 될 수있다어 전원 또는 이득. 또 분해능을 향상 각 광자에 대해 수집되는 정보의 양을 증가하는 라인 평균을 증가시키는 것이다. 다시, 그러나, 이것은 샘플의 광표백의 비용에있을 수 있으므로 밸런스 해상도 및 표백 사이 쳤다 될 필요가있을 것이다. 마찬가지로, GFP와 같은 형광 단백질의 사용은 표백을 피하기 위해주의 최적화가 필요합니다. 이것은 필요한 경우 STED 레이저 파워를 감소시킴으로써 달성 될 수있다. 긴 시간의 가볼만한 곳으로는 큰 광자 복구 할 수 및 표백을 줄일 수 있습니다. 광표백에 대한 수정은 라이브 STED를 분석 할 때 고려되어야한다. 물론, STED에서 3 차원 영상도 가능하고, 또한 기존의 공 초점 영상을 통해 개선을 제공 할 것입니다. 치료는 z 축에 여러 개의 평면을 이미징하는 동안 발생하는 편차를 보정하기 위해 이동해야하지만 이것은, 그것이 디컨 볼 루션과 결합 할 경우 더욱 그렇다. 만약 호이겐스 소프트웨어를 사용하여deconvolve,이 보정은 &quot;이미지 안정 &#39;기능을 사용하여 얻을 수있다. 이 방법을 사용하여, Z-축에서의 해상도를 향상시킬 것이다. 이것은 또한 상대적으로 가난한 z 축 해상도가 가난한 축 해상도를 가지고, 심지어 이상 단지 자체를 STED 기존의 공 촛점 이미징, 이상 큰 개선이다. STED 여러 스택을 획득하는 동안, 치료는 샘플의 표백을 피하기 위해 촬영되어야 필요 하나이를 위해 라인 평균화 또는 레이저 전력 강도를 감소시킬 수있는 경우. 다시, STED에 적합하지 않은 다른 형광 물질을 이미징하는 경우, 우선 순차 주사에서 공핍 빔의 응용 프로그램이 채널로부터 방출을 방지 할 수 있음에 유의해야한다. 따라서, 혼합 STED / 공 초점 방식은 (592 나노 미터보다 큰 파장에서 방출 채널에서 공 초점 주사를 사용하는 경우는) 불행하게도 3D에 적합하지 않을 것입니다. 요약하면, 우리로 인해 응용 프로그램의 상대적 용이성 방식으로 STED를 선택했다표준 공 촛점 이미징을 통해 해상도 lication 및 개선. 면역 시냅스 이미징의 경우, 우리는 200 nm의를 통해 해결을 할 수 없습니다 F-액틴 구조의 세부 정보를 볼 수있는 효과적이고 가치있는 기술을 입증했다. 이러한 세부 사항의 많은 미묘한 보이지만, 그들은 NK 세포의 기능에 지대한 영향을 가질 수 있습니다. 따라서, 우리는 인간의 건강을 유지하기위한 중요한 정보를 도출에 최신 나노 이미징 기술을 적용하고있다.

면역 시냅스 단백질 및 세포 골격 성분을 신호의 복잡한 환경이다. 세포 용해 시냅스는 원래 중앙 분비 도메인 1-4을 둘러싼 말라 접착 분자의 반지와 같은 구조 &quot;황소의 눈&quot;을 가진 것으로 설명했다. 그러나, 우리는 지금이 기능 5-11 연속 동적 골격 재구성을 요구하는 활성 신호의 미세한 영역으로 구성되어 있음을 알고있다. 시냅스에 대해 우리가 가지고있는 정보의 대부분은 현미경에서 파생되었으며, 면역 최첨단 이미징 기술의 초기 채택하고있다. 하나는 이러한 새로운 기술은 초 고해상도 현미경입니다. 통상적 인 광 현미경 공간적 약 200 nm에서의 촛점을 포함한 모든 형광 현미경 해상도의 하한을 설정한다 광의 회절 장벽에 의해 제한된다. 최근 몇 년 동안, 몇 가지 기술이 발전한되었습니다해상도 회절 장벽 그 이하 D. 이러한 자극 방출 고갈 현미경 (STED), 구조화 된 조명 현미경 (SIM), 확률 론적으로 해결 현미경 (STORM), 및 광활성 광학 현미경 (PALM) 등이 있습니다. 이 기술은 다른 곳에서 자세히 12-15 리뷰되었지만, 아래에 설명되어 있습니다. Subdiffraction 제한된 해상도는 각 시스템에 고유 한 방법으로 생성됩니다. 초 해상 기술의 선택은, 그러므로, 또한 실험 및 실험 시스템에 의해 결정되어야한다. STED 수퍼 해상도 subdiffraction 제한된 형광 현미경 16-18의 결과, 다음의 여진 또한 각 형광체의 주위에 선택적으로 &quot;침묵&quot;형광 고강도 토로 이달 공핍 빔을 이용하여 달성된다. STED의 장점 중 하나는 이미지 수집이 빠른이며 비교적 작은 후 처리가 필요하다는 것입니다. 염료의 선택은 사양에 의해 결정되는 동안상업적으로 사용 가능한 시스템에서 592 nm에서 위치한 고갈 빔의 TRAL 위치는 여러 가지 상업적으로 이용 가능한 염료는 두 개의 형광 물질의 조합을 가능하게하는 것을 사용할 수 있습니다. 또, GFP 등의 일반적으로 사용되는 형광 리포터 19,20 생균 실험이 가능하게 묘화 될 수있다. 우리는 이전의 탈과립 (21, 22)에 대한 NK 세포에 의해 이용되는 F-액틴 hypodensity의 영역을 식별하고 정량화 STED를 사용했습니다. 우리는 STED 인해 형광체 및 XY 축 해상도가 뛰어난 개선 상대적으로 유연한 가용성 면역 시냅스 이미징을위한 좋은 선택이다 것을 제안한다. 또,이 실험에 이용 시판 STED 시스템에서 고속 (12,000 Hz에서) 공진 스캐너의 사용은 샘플에 대한 피해를 최소화하는 이미지의 신속한 획득을 허용한다. 염료의 선택에 제한 유연성, STED (12)의 단점으로 간주됩니다그러나 이중 색상 STED는 여러 가지 상업적으로 이용 가능한 형광 상대적으로 간단합니다. STED는 두 개의 채널로 제한하는 동안, 추가 구조는 약 200 나노 미터 (E. 메이스, 게시되지 않은 관찰의 해상도 공 촛점 군데 할 수 있도록 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 STED의 통합은 또한, STED와 함께 추가 공 촛점 이미징 수 있습니다 ). 우리는 면역 세포를 묘화 STED의 사용을 설명하지만,이 기술은 신경 세포를 포함한 세포 유형의 다양한 셀 구조의 다양한 23-26 시각화를 위해 적용된다. SIM은 subdiffraction 제한 이미지를 생성하는 다른 방법을 사용합니다. 알려진주기적인 여진 패턴을 시각화함으로써 정보는 수학적 변환 27 다음 연구되고 알려지지 구조에 대해 얻을 수있다. 이것은 ~ 100 nm의 횡 방향 (28, 29)에 해상도의 증가를 얻을 수 있습니다. SIM의 장점은 내가의 모든 표준 공 촛점 염료 및 프로브와 호환 그러나 단점은 이미지를 획득하기가 훨씬 느린 이들은 긴 후 처리 (12)를 필요로한다는 것입니다. 이것은 또한 라이브 셀 이미징에 대한 사용을 제한합니다. 마지막으로, 수퍼 - 해상도 이미지는 형광체의 확률 광 스위칭함으로써 발생 될 수있다. 이 방법은 사진 활성화 현지화 현미경 (PALM)과 확률 적 광학 재건 현미경 (STORM)에 이용된다. 여러 카메라의 프레임을 스캔하고 시간이 지남에 &quot;온&quot;과 &quot;오프&quot;설정되어 무작위로 활성화 분자를 로컬 화하여, 20 ~ 30 nm의 해상도를 가진 이미지는 축적 된 프레임 30-32에서 생성됩니다. 이 해상도에 대한 트레이드 오프는 이미지를 수집하는 데 필요한 시간입니다. 여기에 우리가 자세히 보여, 준비하고 STED 듀얼 컬러 샘플 이미징을위한 프로토콜입니다. 이 시스템에서, 여자는 펄스, 조정 가능한, 흰색 빛의 레이저입니다. 때문에 자연펄스 여기 빔의 검출 시간 게이팅을 가능하게하고 더 해상도는 증가됩니다. 또한, 시스템은 이와 같이 낮은 레이저 전력 요건을 허용 가돌리늄 하이브리드 종래 광전자 증 배관 튜브보다 더 민감하다 (HYD) 검출기가 장착되어있다. STED 대한 공핍 빔 연속적인가되어 두 색상 STED 가능 염료의 선택을 지시 할 것이다 592 nm의,에 동조된다. 일반적으로 사용되는 염료의 조합은 일반적으로 (예 : 알렉사 플 루어 488, 오레곤 녹색, 녹색 DyLights, 또는 Chromeo를 488)을 488 nm의에 의해 흥분 하나 (예 : 태평양 오렌지 또는 호라이즌 V500)을 458 nm의에 의해 흥분 하나 있습니다. 두 염료의 검출이 비슷한 범위에있을 것입니다 (모두가 고갈 레이저에 의해 액세스 할 수있는) 동안 따라서, 여기에서는 서로 다른 파장으로 발생합니다. 조정 가능한 백색광 레이저 조정할 수있는 검출기로, 스펙트럼 중복을 제거하면서 신호를 극대화하는 것은 매우 쉽게 구성되어 있습니다. 따라서, 우리는 combinat 좋은 성공이 있었다이러한 태평양 오렌지와 (여기에 사용) 알렉사 형석 488으로 상업적으로 이용 가능한 염료의 이온. 우리의 프로토콜은 사람들에게 제공하고 그 실험실의 역사 초점을 나타내는 인간 NK 세포의 평가를 설명한다. 즉, 우리는 정기적으로 우리의 실험적인 작업 21,33에 적용한 하나로서 우리는 특히이 예에서 NK92 세포주를 활용하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>#1.5 커버 슬립</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>면 팁 애플리케이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>S450941</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 원심분리기 튜브(50ml)</td><td>VWR</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청(FCS)(500ml)</td><td>Atlantic Biologicals</td><td>S11050</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 Pacific Orange</td><td>Life Technologies</td><td>P31584</td><td></td></tr><tr><td>실험실 조직 와이퍼</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>매니큐어</td><td>VWR</td><td>100491-940</td><td></td></tr><tr><td>NK-92 셀</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Prolongified anti-fade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>Purified anti-CD18</td><td>Biolegend</td><td>301202</td><td></td></tr><tr><td>Purified anti-NKp30</td><td>Biolegend</td><td>325202</td><td></td></tr><tr><td>Purified anti-perforin</td><td>Biolegend</td><td>308102</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium ( 500 ml)</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Quillaja 껍질의 사포닌</td><td>Sigma</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP 펜</td><td>Life Technologies</td><td>008899</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>전자 현미경 과학</td><td>22142</td><td></td></tr><tr><td>Huygens deconvolution 소프트웨어</td><td>SVI</td><td>연락처 회사</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS STED 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>회사에</td><td></td> 문의</tr></tbody></table>

이중 색깔 시간 게이트 자극 방출 고갈 (sted) nanoscopy에 의한 면역 시냅스의 시각화

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

자연 살해 세포는 바이러스 성 감염이나 종양 형성 세포를 용해하기 위해 단단히 규제, 미세 조정 면역 시냅스 (IS)를 형성. 액틴 동적 재구성은 NK 세포의 기능 및 IS의 형성에 중요하다. 시냅스에서 F - 굴지의 영상은 전통적 그러나 빛의 회절 한계는 약 200 nm의, 공 초점을 포함하여, 형광 현미경의 해상도를 제한, 공 초점 현미경을 이용하고있다. 이미징 기술에서의 최근 진보는 subdiffraction 한정 초해 촬상의 개발을 가능하게했다. IS에서 F-액틴 구조를 시각화하기 위해 우리는 유리에 수용체를 활성화에 NK 세포를 부착하여 NK 세포의 세포 독성 시냅스를 요점을 되풀이하다. 우리는 다음 두 가지 색 자극 방출 고갈 현미경 (STED)를 사용하여 그 이미지 단백질. 이 시냅스에서 &lt;80 nm의 해상도가 발생합니다. 여기서 우리는 샘플 준비 및 이중 코르를 사용하여 이미지의 취득 단계를 설명또는 NK에 F-액틴을 시각화하는 STED의 nanoscopy입니다. 우리는 또한 라이카 SP8 소프트웨어 및 시간 게이트 STED를 사용하여 샘​​플 수집의 최적화를 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 이미지의 사후 처리 컨볼 루션에 대한 호이겐스 소프트웨어를 사용합니다.

분명히, 최고 해상도의 영상의 기본 목표는 기존의 공 초점 현미경에 비해 개선 될 것입니다. 그러나 차선의 해결책으로 이어질 수있는 몇 가지 일반적인 함정이 있습니다. 다음은 각 실험을 개별적으로 최적화 할 것을 요구하고 있습니다. 우리의 대표적인 실험에서, 우리는 유리에 결합 된 항체에 의해 활성화 된 NK 세포에 F-액틴 네트워크 이미징된다. 다음과 같이 일반적인 원인 (과에 대한 수정) 공 초점에 STED의 개선 된 해상도의 부족은 다음과 같습니다 : <ol><li> F-액틴 필라멘트의 가난한 해상도로 나타낸 바와 같이에서 샘플링 (그림 1a).이, 입상 및 픽셀 정보의 손실로 이어질 수 있습니다. 증가 라인이나 프레임의 평균은 종종이 문제를 해결 할 수 있습니다. </li><li> 표백 및 / 또는 오버 샘플링 (그림 1b).이 과도한 라인 평균의 결과로 긴 픽셀의 정지 시간으로 인해 발생할 수 있습니다. 또는, 과다 사용으로 포함한 이전 취득 이미지의 오버 스캔의 결과 일 수있다공핍 레이저. 이것은 일반적으로 불투명 또는 뿌연 이미지가 발생합니다. 이렇게 획득 전에 단지 최소한의 관심 분야를 스캔하거나, 가능하다면, 레이저 스캔 속도를 증가시킴으로써 보정 될 수있다. 문제가 계속되면 고갈 레이저 출력이 감소 될 수있다. </li></ol> 올바른 픽셀 드웰 시간의 균형, 여기 레이저 전력 및 공핍 레이저 파워, 향상된 해상도 및 충분한 정보 화상을 달성하여 (도 1C)를 생성 할 수있다. 해상도는 상기 컨볼 루션 (도 1D)의 사용에 의해 개선 될 수있다. 인수가 최적화 될 때, 디컨 볼 루션은 모두 질적 및 양적으로 해상도를 향상하고 하위 100 nm의 해상도는 일상적으로 달성해야한다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1.jpg" /> 수집 및 STED 이미징의 일반적인 함정의 그림 1. 최적화. NK92 세포는, 다음 고정 20 분 동안 안티 CD18 및-NKP30 코팅 유리 활성화 permeabilized 및 Phalloidin의 알렉사 플 루어 488와 F-액틴을 위해 염색 하였다.) 예 때문에 아래의 샘플링. b)에 의한 최적의 조건을 컨볼 루션과 해상도에 큰 개선으로 이어질 표백 / 오버 샘플링 C) 조건에 최적화 된 D)에 해상도의 손실의 예에 영상 정보의 손실. 스케일 바 = 5 μm의.

여기에서 우리는 두 가지 색상 STED의 nanoscopy에 의해 유리에 효과적으로 요약 NK 세포의 세포 독성 면역 시냅스 이미징을위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법을 사용하여 우리는 시냅스 단백질과 세포 골격의 하위 100 nm의 분해능을 얻을 수 있습니다.

이중 색깔 시간 게이트 자극 방출 고갈 (STED) Nanoscopy에 의한 면역 시냅스의 시각화

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

본 절차의 전체적인 목표는 TED 현미경을 사용하여 NK 세포 용해 시냅스(lytic synapse) 내의 F actin과 같은 구조를 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 활성화 항체를 사용하여 유리 위에서 시냅스를 재현함으로써 수행됩니다. 본 절차의 두 번째 단계는 관심 구조를 관찰하기 위해 세포를 고정, 투과화 및 염색하는 것입니다.다음으로, 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 슬라이드를 촬영한 후, 이미지 해상도를 높이기 위해 STED 고갈법을 적용합니다. 마지막 단계는 디컨볼루션 알고리즘을 사용하여 이미지를 처리하는 것입니다. 결과적으로 이색 STED 및 내시경 기술 덕분에 세포 구조의 100 nanometer 미만 해상도를 구현할 수 있습니다.이 방법은 세포골격과 엑소사이토시스(exocytosis) 사이의 관계와 같이 세포 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 본 연구에서는 자연 살해 세포(natural killer cells)에 의해 분비되는 용해 과립(lytic granules)이라 불리는 특수 리소좀의 분비에 주목하였습니다. 일반적으로 이 방법이 생소한 사용자의 경우, TED 고갈 레이저 적용 시 조정 가능한 변수가 많기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.고갈 빔(depletion beam)을 부적절하게 적용하면 해상도가 개선되지 않고 오히려 저하될 수 있습니다. 준비 과정으로, 10% FCS가 포함된 RPMI 배지 30 mL와 BD CytoPerm 1 mL를 각각 37 °C로 가온하십시오. 그다음 커버슬립에 항체를 코팅하는 과정을 시작합니다.1.5번 커버슬립을 준비하고 PAP 펜을 사용하여 커버슬립 위에 동전 크기의 정사각형을 그립니다. 테스트할 각 조건당 하나의 정사각형을 준비합니다.각 원형 구역에 PBS에 녹인 5 µg/mL 농도의 항체 200 µL를 분주합니다. NK 92 세포 활성화를 위해서는 anti CD 18 및 anti NK P 30 항체를 사용하십시오. 항체가 분주된 커버슬립을 37 °C에서 30분 동안 배양한 다음, 상온의 PBS에 담가 세척합니다. 즉시 각 테스트 조건에 맞게 세포를 첨가하며, 이때 500,000 cells가 준비되어 있어야 합니다.미리 데워둔 배지 10 milliliters로 세포를 세척한 후, 동일한 가온 배지에 세포를 다시 현탁합니다. 세포가 완전히 현탁된 상태에서 1 mL당 250만 개의 세포 농도가 되도록 하여, 커버슬립의 각 항체 구역에 200 microliters씩 분주합니다. 세포가 부착된 커버슬립을 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 이 경우 NK 세포 내의 과립을 극성화하는 데 20분이면 충분합니다. 배양 후, 실온에서 PBS로 커버슬립을 부드럽게 세척합니다.따뜻한 BD CY effects cyto perm 용액 1 mL에 TRITTON X 100 1 µL를 첨가하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 볼텍싱합니다. 이 용액 200 µL를 커버슬립의 각 조건 구역에 도포합니다.그 다음 세포를 실온의 어두운 곳에 두고 10분 동안 기다립니다. 배양이 끝나면 커버슬립을 염색 완충액으로 부드럽게 세척합니다. 그런 다음 면봉을 사용하여 둘러싸인 영역의 가장자리를 말립니다.다음으로, 염색 완충액에 희석한 1차 항체 200 µL를 주변 영역에 첨가하고, 커버슬립을 암소에서 30분 동안 반응시킵니다. STEAD 이미징에 적합한 2차 항체로는 Alexa Fluor 488, Pacific Orange 및 Horizon V 500이 있습니다. 이들 항체는 각각 1:200 희석 비율에서 효과적으로 작동합니다.배양 후 세척을 마친 뒤, 커버슬립을 염색 완충액으로 세척하고 가볍게 닦아 건조시킵니다. 이전과 마찬가지로 각 조건 구역에 2차 항체 200 µL를 처리합니다. 그 후 암실에서 30분 동안 더 둡니다.이 시점에서 추가 세척 후 추가 항체를 첨가할 수 있습니다. 예를 들어, f actin을 검출하기 위해 Phin을 1:200 비율로 적용할 수 있습니다. 마운팅 용매의 경우, stead와 호환되지 않는 vector shield 대신 prolong를 선택하십시오.phin 염색을 사용하는 경우, 2-mercaptoethanol의 사용은 피하십시오. 하지만 슬라이드에 10-20 µL의 마운팅 용액을 도포하는 것은 괜찮습니다. 커버 슬립을 뒤집은 상태에서 기포가 생기지 않도록 용액 위로 천천히 내립니다. 그런 다음 슬라이드를 24시간 동안 배양하십시오.다음 날 커버글라스를 덮고, 매니큐어로 커버글라스를 밀봉한 후 이미징을 진행합니다. 레이저와 소프트웨어를 실행합니다. STED 고갈 레이저는 100% 출력으로 예열하고 정렬해야 합니다.접안렌즈를 사용하여 샘플에 초점을 맞춘 다음, 소프트웨어 화면으로 전환하십시오. 파장이 가장 긴 첫 번째 채널을 스캔하십시오. 네 번째 단계에서 레이저 출력, 여기 빔 위치 및 검출기 범위를 최적화하십시오.100 이상으로 설정하지 마십시오. 다음으로, 공초점 이미지를 캡처하고 픽셀을 확인합니다. 포화도, 라인 및 프레임 평균화를 통해 픽셀 해상도를 모두 높일 수 있습니다.목표는 픽셀당 30 nanometers 미만으로 유지하는 것입니다. stead를 위해 어느 정도의 포화는 허용됩니다. 다음으로, 50% power로 stead 고갈 빔을 조사하고 이미지를 캡처하십시오.해상도가 개선되면 더 높은 출력을 적용할 수 있습니다. 또한, 여기 레이저 출력, 라인 평균(line average) 또는 게인을 조정하여 해상도를 추가로 개선할 수 있습니다. 배경 신호를 줄이려면 0.3 nanoseconds의 타임 게이팅(time gating)을 적용하고 값을 상향 조정하십시오.새로운 분해능은 전체 반치폭(full half width maximum) 계산을 통해 추정해야 합니다. 결과가 만족스러우면 모든 채널의 미세 조정이 완료될 때까지 두 번째 채널에 대해 이 단계들을 반복하십시오. 모든 스캔 시퀀스로 단일 염색 대조군을 이미징하여 스펙트럼 중첩 여부를 확인하십시오.약한 중첩은 소프트웨어의 스펙트럼 언믹싱(spectral unmixing)으로 교정할 수 있으나, 가급적 피하거나 최소화하는 것이 가장 좋습니다. 이제 정량적 이미징을 위한 영상을 획득하십시오. 실험 조건에 따라 조건당 최소 20장의 영상을 얻으십시오.저장된 이미지를 디컨볼루션(deconvolution)하려면 적절한 소프트웨어에서 파일을 엽니다. 각 채널의 파라미터, 특히 들뜸 및 방출 스펙트럼, 정지 소멸 방출(stead depletion emission) 및 이미징 방향을 확인하십시오. 그런 다음 소프트웨어의 디컨볼루션 계산을 적용하십시오.일반적으로 기본 설정으로 충분하지만, 신호 대 잡음비는 바닥 힘에 따라 달라지므로 해당 매개변수는 실험에 맞춰 수동으로 설정해야 합니다. stead를 사용할 때 최적의 해상도를 얻지 못하게 만드는 몇 가지 흔한 실수 중 하나는 샘플링 부족입니다.이는 이러한 f actin 필라멘트에서와 같이 입자감이 나타나고 픽셀 정보가 손실되는 결과로 이어집니다. 라인 또는 프레임 평균값을 높이면 종종 이 문제를 해결할 수 있습니다. 또 다른 문제는 장시간의 픽셀 노출로 인해 발생하는 광퇴색 또는 과표본 추출입니다.이미지 획득 전 스캐닝 과정에서 과도한 라인 평균화(line averaging)로 인해 발생하는 체류 시간(dwell time)이 원인일 수 있으며, 이는 이미지 획득 전 스캔 횟수를 줄이거나 더 빠른 스캔 속도를 사용하여 해결할 수 있습니다. 레이저 출력을 낮추는 것도 전반적인 작동 상태를 개선하는 데 도움이 됩니다. 이렇게 하면 이미지 품질이 획기적으로 향상될 것입니다.디컨볼루션(Deconvolution)을 통해 정량적 및 정성적 측면 모두에서 이미지 품질을 더욱 향상시킬 수 있습니다. 이 절차를 수행하면 통상적으로 100 nm 미만의 해상도를 얻을 수 있어야 합니다.각 실험 전과 그 이후 약 한 시간마다 본 절차에 따라 스테디 빔 정렬(stead beam alignment)을 수행하는 것이 중요합니다. 공국소화(colocalization), 세포 내 국소화 및 분자 상호작용에 관한 추가적인 의문을 해결하기 위해 정량 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

visualization-immunological-synapse-dual-color-time-gated-stimulated

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Neisseria meningitidis (NM), g 부정적인 인간 특정 호흡기 병원체가 인간 α - actinin에 바인딩할 수 있습니다. 여기 우리는 인간의 뇌 microvascular 내피 세포 (HBMECs)에 세균 입국 후 α - actinin 세포와 세균의 colocalisation의 시각화를위한 프로토콜을 제시한다.

의 세포 상호 작용 Visualisation 및 부량 Neisseria meningitidis</em공촛점 이미징에 의해 α - actinin>과 인간

이 프로토콜은 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 계량하는 방법 세부 사항. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다.

Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이

이 비디오는 지원되는 지질 이중층(SLB)에서 자연살해(NK) 세포의 면역학적 시냅스 형성을 시각화하는 기술을 보여줍니다. SLB는 먼저 형광단 표지된 NK 세포 활성화 수용체 리간드로 표지된 다음 NK 세포로 배양합니다. 그 후, 세포는 중합된 액틴 및 퍼포린 양성 용해 과립을 위해 염색됩니다. 이 접근 방식을 사용하면 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경을 사용하여 시냅스 형성을 시각화할 수 있습니다.

지원되는 지질 이중층에서 NK 세포 면역학적 시냅스 형성의 초고해상도 이미징

이 비디오는 T 림프구와 형광 항원을 운반하는 상피 세포 간의 상호 작용을 조사하여 면역학적 시냅스 토폴로지의 라이브 셀 이미징을 보여줍니다. 형광 현미경 검사는 내피 세포에서 적색 세포질 변위와 노란색 막 고리를 보여주어 면역학적 시냅스의 형성을 나타냅니다.

Live-Cell Imaging을 통한 면역학적 Synapse 토폴로지 평가

사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

여기에서는 면역학적 시냅스를 형성하는 유리 지지 지질 이중층 기술과 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경의 초고해상도 이미징 기술의 조합을 설명합니다. 이 프로토콜의 목표는 이러한 두 가지 기술을 성공적으로 수행하는 데 필요한 지침을 사용자에게 제공하는 것입니다.

유리 - 지원 평면 지질 이중층에 자연 살해 세포 면역 시냅스의 슈퍼 해상도 이미징

적응 면역은 T 세포와 항원 제시 세포 사이에 형성된 역동적인 '면역학적 시냅스'에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜은 연구가 부족한 생리학적 APC이자 새로운 유형의 '평면 세포 APC 모델'로서 내피 세포를 조사하는 방법을 설명합니다.

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

Coverslips B 세포 수용 체에 항 체, 초기 단계에 대 한 모델 코팅에 확산 하는 B 세포에서 동시에 이미지 걸 구조, microtubules, 및 microtubule 플러스-엔드 바인딩 단백질에 호텔 위치 현미경 검사 법을 사용 하기 위한 프로토콜 소개 면역 시 냅 스 형성.

말라와 자극된 방출 소모 (호텔 위치) 현미경을 사용 하 여 B 세포 면역 냅에 Microtubule Cytoskeletons 시각화

이 방법론의 전반적인 목표는 게 최적의 실험 조건 샘플 준비에서 이미지 수집 및 재건 고정 셀에서 microtubules 및 중간 필 라 멘 트의 2D 듀얼 컬러 dSTORM 이미지를 수행...

중간 필 라 멘 트와 2 차원 직접 확률적 광학 재건 현미경으로 Microtubules 이미징

이러한 프로토콜은 면역학적 시냅스 형성및 면역학적 시냅스를 향한 후속 편광 분비 트래픽을 모두 이미지화한다. 세포 접합체는 초항원 펄스 라지 세포 (항원 제시 세포역할을 함)와 Jurkat 클론 (이펙터 도우미 T 림프구로 작용)사이에 형성되었습니다.

인간 면역학적 시냅스 이미징

이 프로토콜은 SMA 및 ColQ 관련 CMS의 마우스 모델에서 병리학 적 변화를 정량화하는 데 사용되는 컨 포칼 및 STED 현미경을 결합하여 신경근 접합부의 형태 측정 분석 방법을 설명합니다.

결합된 공초점 및 초분해능 현미경에 의한 마우스의 신경근 접합부 특성 분석

배우세요 이중 색깔 STED 나노스코피를 이용하여 NK 세포의 세포독성 면역 시냅스를 시각화하는 방법을. 이 기법은 100나노미터 이하의 해상도로 세포골격과 단백질 구조를 정밀하게 관찰할 수 있어 면역 반응 메커니즘 연구에 필수적입니다.

이중 색깔 시간 게이트 자극 방출 고갈 (STED) Nanoscopy에 의한 면역 시냅스의 시각화

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