Name: 단백질 구조와 통합 구조 질량 분석, 단백질-리간드 단지 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 배우세요 단백질 복합체와 리간드 결합 분석을 위한 네이티브 질량 분석법. 이 방법은 생체 상태에서 단백질 올리고머 상태와 비공유결합 상호작용을 신속하고 민감하게 분석하여 구조 생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 친절 하 게 제공 헤 라 헤 라 NurA 단백질 샘플에 대 한 그리고 그들의 실험 설계에 대 한 칼 피터 Hopfner와 로버트 토마스 번 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 원고의 그의 검토에 대 한 박사 Eamonn 읽기를 감사합니다. 우리는 기꺼이 우리의 자금 시체 인정: Wellcome 신뢰 [109854/Z/15/Z]와 왕 사회 [되 게 RG150216].

관심 없음 충돌 선언.

MS는 산출할, 상호 작용 및 소 단위 단백질 복합물의 건축을 특성화에 점점 중요 한 역할을 재생 됩니다. 메신저-MS 데이터 하위 단위 multicomponent 단지 내에서 위상 배열 정의를 사용할 수 있습니다. 다른 기존의 구조 생물학 방법에 비해, MS는 몇 가지 장점이 있습니다. 네이티브 MS는 신속 하 고 매우 중요 한 기술 이며 이종 단백질 견본을 사용할 수 있습니다. 솔루션 장애 실험 결합, 분리 단백질 어셈블리의 경로 모니터링할 수 있습니다. 크리스탈 구조 또는 상 동 모델, 구조 MS에서 제공 하는 정보는 단백질-리간드 상호작용을 조사 하기 위한 도구를 제공 하 고 근처 기본 모델 및 어셈블리 경로11제공 합니다.
여기, 우리는 통합 MS를 사용 하 여 산출할 및 단백질-리간드 상호작용 하나 이상의 ligands의 구성 분석에 필요한 실험 절차 설명. 이 MS 샘플 준비, 데이터 수집, 데이터 분석 및 계산 도구를 사용 하 여 MS 데이터의 통합이 포함 됩니다. 이렇게 하려면, 우리는 우리의 모델 시스템으로 (DNA, ATP, 그리고 ADP), 3 개의 ligands에 바인딩된 DNA 절제 헤 라-NurA hetero oligomeric 단백질 복잡 한를 사용 합니다. 프로토콜은 데이터 분석 및 프레 젠 테이 션을 돕기 위해 현재 사용할 수 있는 소프트웨어의 사용을 보여준다.
Ligand 바인딩 분석을 위해 중요 하다 고품질 스펙트럼을 취득, 따라서 주의 샘플 준비 단계는 중요 한 단백질 정화, 버퍼 교환, ligand 적정, 등. 한 제한 nESI 네이티브 MS ligand 바인딩 공부를 할 때 비 특정 바인딩입니다. 비 특정 바인딩 물방울 desolvation 분무 과정 전반에 걸쳐 발생합니다. 이 ligand 농도 증가 하 고 따라서 단백질/Ligand 비율29변경. 뉴클레오티드 바인딩 apo와 이온화 효율50,51를 변경 하지 않는 뉴클레오티드 바인딩 단백질 사이의 비교적 작은 질량 차이에 발생 합니다.
우리는 우리의 작업에 대 한 Synapt g 2 시 MS 시스템을 사용 하지만 프로토콜은 다른 상업적으로 사용 가능한 나노-분무 질량 분석기를 사용 하 여 다른 단백질-ligand 복합물의 다른 조사에 대 한 적용. 통합 구조 MS 점점 더 큰 복잡성의 생물학 문제 해결에 중요 한 역할을 재생입니다. 여기서 설명 하 고 워크플로 구조적 결과 이해 하 고 기존의 구조 기법을 사용 하 여 공부 하는 수 없는 복잡 한 단백질 및 단백질-리간드 형성의 메커니즘을 구축에 적합 .

그대로 단백질 그리고 그들의 복합물의 네이티브 대량 spectrometric 분석 실시 하는 이온화 과정1, 동안 분무 및 나노 분무 이온화 (nESI), 단백질 폴딩 유지 및 비-공유 상호 작용을 사용 하 여 2. 네이티브 MS, 단백질 그리고 그들의 복합물의 구조3,4가스 단계에서에서 네이티브에 가까운 상태에 유지 됩니다. 네이티브 MS 검색 여러 청구 단백질 이온 충전 비 (m/z) 단백질 또는 단백질-리간드의 질량을 수 있도록 그들의 질량에 따라 구분 되는 복잡 한 계산. 이 정보는 그대로 단백질의 산출할, 소 단위 구성, ligand 바인딩 및 상호 작용 네트워크3,4,,56의 결정을 수 있습니다. 네이티브 MS는 다른 기술에 비해 몇 가지 장점이 같은 엑스레이 결정학 및 핵 자기 공명 분광학5. 첫째, 네이티브 MS는 신속 하 고 매우 중요 한 기술입니다, 요구 하는 단지 약간 microliters (µ L 2-3) 낮은 µ M 범위6높은 nM에서 상대적으로 낮은 최종 복잡 한 농도에서 샘플의. 둘째, 네이티브 MS 이종 단백질 샘플 여러 단백질과 oligomeric 상태를 동시에 분석 하는 게 가능 하가 사용할 수 있습니다. 셋째, 네이티브 MS는 화학 가교 또는 단백질 라벨 분석 전에 수정할 단백질 견본을 필요 하지 않습니다. 이러한 장점을 구조 MS 단백질 복합물의 구조상 조사 위한 강력한 도구를 만들었습니다.
네이티브 MS 이온 이동성 (IM), 단백질 이온 전기 분야를 통해 여행 하는 데 걸리는 시간을 측정 하는 기술 collisional 횡단면 (CCS) 결정 될 수 있도록 결합할 수 있습니다. CCS는 저해상도 구조 정보를, 토폴로지 및 얻을 수 단백질의 구조적이 정보를 제공 합니다. 또한, 그것은 계산 방법에 의해 생성 된 단백질 구조 모델의 시험이 있습니다.
단백질-기체 안정성 수 조사 충돌 유도 전개 (CIU) 측정을 사용 하 여 IM MS에 의해. CIU 과정 단백질 이온 가속 하 고 질량 분 서 계7,,89내에서 불활성 버퍼 가스로 증가 가속 충돌을 통해 활성화. 이 collisional 활성화 과정 하면 CCS 증가 변환 부분적으로 펼쳐, 단백질. CCS와 단백질을 전개 하는 데 필요한 에너지에이 변경 될 수 있습니다이 이렇게 임 씨를 사용 하 여 측정, ligand 바인딩 단백질 안정성에의 효과 측정된10일 수 있다. Subcomplexes는 단백질 복합물의 기본-같은 토폴로지를 모니터링 하는 유기 용 제의 추가 같은 솔루션에 중단 방법을 사용 하 여 솔루션에서 생성할 수 있습니다. 단백질 복합물의 주로 내부 공유 비 상호 작용의 인 이다. 하위 단지 네이티브 같은 토폴로지를 유지 하 고, MS 검출 시 간 소 단위 연결에 대 한 정보를 공개.
구조 생물학에 통합 접근 결합 구조 단백질과 그들의 단지3,4,,56의 역학을 공부 하 고 다양 한 방법. 네이티브 MS 및 MS 메신저 도전 생물 학적 시스템의 분자 정보를 밝히기 위해 사용 되었습니다. 단백질 어셈블리 경로11,12,13,14, 단백질 단백질 상호 작용 네트워크15 를 공부 하 고 연구를 포함 하 여 응용 프로그램의 몇 가지 예제 되었습니다. , 16 , 17, 막 단백질6,,1819,20,21및 핵 산22,23 같은 단백질-리간드 상호작용 ,24.
그러나, 네이티브 MS는 또한 한계가 있다. 네이티브 MS 측정 종종 일부 단백질의 접힌된 네이티브 상태3,25를 유지 하지 것입니다 수성 염화 아세테이트 등 휘발성 버퍼에서 수행 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 최근 일이이 제한 단백질과 단백질 복잡 한 이온 더 높은 이온 강도 비 휘발성 버퍼에서 직접 형성 될 수 있다 그런 바늘 팁 직경 (0.5 m m 팁) 분사의 최적화에 의해 극복 될 수 있다 보이고 있다 생리 적인 환경을26모방. 또한, 네이티브 MS를 사용 하 여 분무 이온화 솔루션에서 가스 단계; 비 공유 어셈블리를 전송 따라서, 검색 된 단지의 관계 되는 풍부 수 있습니다 전적으로 대표 하지는 솔루션5,27에서. 또한, 솔루션에서에 비해, 가스 단계 소수 성 상호 작용 약한 되 고 정전기 상호 작용 해지고 따라서 선호 하는3,28.
이 문서에서는, 우리 제공 프로토콜, 데이터 분석 및 해석 단백질 식별 및 ligand 바인딩을 사용 하 여 네이티브 MS, 메신저-MS, CIU, 솔루션에서 중단, 그리고 모델링 합니다. 헤 라-NurA, DNA 복구 복잡 한 모델 시스템으로 사용 됩니다. DNA 이중 가닥 틈 (DSBs) 유전 불안정성 및 인 간에 있는 암의 최종 개발 결과로, DNA 손상의 가장 세포 독성과 해로운 형태 중 하나입니다. 동종 재결합 DSBs, ATP 의존 helicase nuclease 복잡 한, 헤 라 NurA22에 의해 조정 하는 과정을 eradicates는 복구 메커니즘입니다.
네이티브 MS와 MS 메신저 기능 분석 실험 결합 및 모델링 허용의 조사: i) 어셈블리, 나 란, 그리고 복잡 한, ii) dsDNA 사이의 복잡 한 상호 작용 및 전체에 미치는 영향의 안정성에서 NurA의 역할 단지, 안정성 및 iii) 산출할와 ATP 바인딩 어셈블리22에 영향. 전반적으로,이 작품은 뉴클레오티드 바인딩과 함께 단백질 복잡 한 구조적 변화와 안정성을 연결 하 여 헤 라 NurA 복합물의 분자 기준의 향상 된 이해를 지도 했다. 이 프로토콜은 하나 또는 여러 개의 ligand(s) 종류와 상호 작용 하는 어떤 단백질 complex(es)에 대 한 일반.

<table><tbody><tr><td>아데노신 5&프라임;-(3-티오트리포스페이트) 테트라리튬 염</td><td>Merck Millipore</td><td>119120-25MG</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5&프라임;-디포스페이트&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20398-34-9</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 암모늄 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2706</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 바이오 스핀 크로마토그래피 컬럼</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 농축기</td><td>Sartorius</td><td>Z614041-25EA</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Water TraceSelect</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95305</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 모세 혈관</td><td>하버드 장치</td><td>300060</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 구조와 통합 구조 질량 분석, 단백질-리간드 단지 분석

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

단백질은 유전자 발현, catalyzing 신진 대사 반응, DNA 복구 및 복제를 포함 하 여 세포질 기능에 많은 주요 역할을 재생 하는 생물학 고분자의 중요 한 클래스. 이러한 프로세스에 대 한 자세한 이해 방법에 대 한 중요 한 정보를 제공 하는 따라서, 세포 기능. 통합 구조 MS 메서드 구조와 역 동에 단백질 복잡 한 어셈블리, 복잡 한 연결, 소 단위 산출할, 단백질 oligomerization ligand 바인딩 정보를 제공합니다. 통합 구조 MS의 최근 발전은 큰 DNA 묶는 단백질 및 막 단백질을 포함 하 여 어려운 생물 학적 시스템의 특성에 대 한 수 있다. 이 프로토콜에서는 네이티브 MS 및 이온 이동성-질량 분석 (MS 메신저) 분자 동역학 시뮬레이션으로 helicase nuclease DNA에 대 한 통찰력을 얻기 위해 단백질 복잡 한 수리 같은 다양 한 MS 데이터를 통합 하는 방법을 설명 합니다. 결과 접근 중요 한 생물 학적 과정에 관련 된 다른 단백질 복합물에 ligand 바인딩의 상세한 연구에 대 한 프레임 워크를 제공합니다.

네이티브 MS 결과 밝혀 oligomeric 상태, 구성 및 토폴로지 헤 라 NurA 단지 (그림 1). 비 공유 상호 작용 가스 단계에서 보존, ATP-γ-S 및 ADP titrations 실험의 기본 MS 없음을 뉴클레오티드 바인딩 헤 라-NurA (그림 2)을 결정 하 고 ATP-γ-S 농도 증가 비례하여 증가 hexameric 헤 라 (그림 3)의 강도. 구조에 관한 소 단위 상호 작용 다음 네이티브 MS 솔루션에 중단에서 가져온와 함께 동의 했다 정보와 이론 대 중 (그림 4 및 표 1).
단백질 그리고 그들의 복합물의 실험적인 CCS 값 메신저 MS 실험 (그림 5)에서 파생 되었다. 이러한 값은 회전 평균된 기체 분자 도형의 단면 계산 고 단백질의 차원 상태를 기술 한다. 엑스레이 결정학에서 이론적인 측정 CCS 값을 비교 하 고 좋은 계약 유추에 기본 도형 (표 1)가스 단계에서에서 유지. 이 단백질 어셈블리48의 저해상도 모델을 구축 하기 위한 CCS 값을 사용 하 여 확인 합니다.
각 충전 상태 이온에 대 한 실험적인 CCSs는 계산할 수 있습니다. 네이티브-처럼 단백질 conformer 유사한 CCS 값으로 상태 이온 충전을 야기할 수 있습니다. 그러나, 더 높은 충전 상태 이온 coulombic repulsions 단백질 가스 단계 전개 및 큰 CCS 값 이론적인 CCSs에 비해 이어질 수 증가. 이온은 따라서 일반적으로 낮은 충전 상태에 대 한 CCS 값49사용. 헤 라-NurA에 대 한 솔루션에서 중단 실험 헤 라 헤 라 NurA에 DNA 없이 메시지가 어셈블리 경로 단위체로 시작 후 전체 hexameric HerA (헤 라6) 형성의 세대-dimeric NurA (NurA2) 복잡 한 DNA (그림 6).
Apo (ligand 무료)와 ligand 바인딩 CIU 전개 플롯에 차이 ligand 바인딩 시 복잡 한 안정성에 변화를 정의 합니다. 더 높은 CV50 또는 애COM 값 가스 단계에서 더 안정된 이온을 의미합니다. CIU와 애COM 분석 DNA 바인딩 헤 라-NurA DNA 무료 복잡 한 (그림 7좋아) 보다 더 안정입니다 밝혔다. CIU MS 각각 ATP 바인딩 상태 분석에서 4-ATP-γ-S 바인딩된 상태 가스 단계에 점유는 어디 모든 사이트는 6-ATP-γ-S 바인딩된 상태 감소 복잡 한 안정성은 가장 안정 (그림 7Bii). 네이티브 MS 개별 뉴클레오티드 바인딩 헤 라;의 상태를 계시 할 수 있다 그러나, 그것은 수 없습니다 구별 어떤 헤 라 소 단위 ATP를 바인딩하는이 바인딩이 수행. 이 정보는 hexameric 헤 라 헤 라-NurA 요약된 워크플로 (그림 8) 다음에 명시적 용 MD 시뮬레이션에서 파생 될 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig1.jpg"> 그림 1. Oligomeric 상태, 구성 및 토폴로지 헤 라 NurA 비 공유 복잡 한 질문. (헤 라, 헤 라 NurA 및 헤 라-NurA DNA (15.4 kDa 25 bp 이중 가닥 DNA) 존재의 스펙 하 트 A) 대량 라 헤 라 서브 복잡 한 hexamer와는 heptamer로 존재합니다. NurA 이합체 바인딩합니다 및 헤 라 hexamer oligomeric 변환 부과 하. DNA 형성된 된 헤 라-NurA 복잡 한 (Z. Ahdash 그 외 여러분, 201722에서 적응 결과)에 바인딩합니다. (확인 된 종 B) 상대 농도 UniDec32를 사용 하 여 계산 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig2.jpg"> 그림 2. 네이티브 ESI-MS의 헤 라 NurA에 뉴클레오티드 바인딩 메커니즘을 보여준다. 질량 스펙트럼 (A) 헤 라 NurA 및 (B) 헤 라 NurA DNA ATP-γ-S 및 (ii) ADP (i)의 농도 증가 함께. 측정 된 질량 이론적인 대 중 및 ATP-γ-S의 금액에 비해 또는 ADP 바인딩된 결정 됩니다. 측정 된 질량 및 바인딩된 뉴클레오티드의 수는 스펙트럼에 표시 됩니다. ATP-γ-S와 ADP titrations 실험 결정 헤 라-NurA 혼자 하 고 인덱스도 뉴클레오티드 바인딩 때 복잡 한 순환 반응 메커니즘 (Z. Ahdash 그 외 여러분, 201722에서 적응 결과)을 나타내는 dna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig3.jpg"> 그림 3. 헤 라 oligomeric 상태에 ATP-γ-S 농도 증가의 효과 측정. (ATP-γ-미의 농도 증가에 헤 라의 A) 질량 스펙트럼 (B) UniDec deconvolution 소프트웨어32를 사용 하 여 계산 하는 기본 MS에서 다른 종족의 상대 농도 보여주는 그래프. ATP-γ-S 농도 증가, hexameric 헤 라의 상대 강도 또한 증가 합니다. 바인딩된 ATP-γ-S 분자의 수는 스펙트럼 (Z. Ahdash 그 외 여러분, 201722에서 적응 결과)에 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig4.jpg"> 그림 4. 질량 스펙트럼 및 헤 라 (A)와 (B) 헤 라-NurA (i)의 하위 복잡 한 분리 제품 혼자 및 (ii) DNA 다음 솔루션에 장애의 존재. 솔루션에서 중단 실험 이기의 10-40%를 사용 하 여 수행 했다 메탄올 (MeOH) 또는 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 및 다양 한 subcomplexes의 대형 귀착되 었 다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig5.jpg"> 그림 5. 이온 이동성 도착 시간 분포는 생성 된 하위 단지 및 단지에 대 한 CCS 축에 표시 된. 그림 4에서 스펙트럼에 주석이 그 각 하위 복잡 한 상관에 대 한 아이콘입니다. 실험 및 계산 대 중 및 하위 단지의 CCS 값 모두 보여주었다 (여행 파 이온의 해결책에서 일반적인 불확실성을 고려한 후 실험 및 계산 된 값 사이의 계약 표 1 에 나열 된 이동성 질량 분석의37% ± 5-8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig6.jpg"> 그림 6. 헤 라-NurA 복잡 한 솔루션에서 중단 네이티브 MS, 임 양 색 동그라미 표시 각 하위 복잡 한 관찰 되었다 조건에서에서 생성 된 어셈블리 경로: 기본 (녹색, 중단 하기 전에), 메탄올 (노란색), DMSO (자주색) 또는 이기 (레드)입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig7.jpg"> 그림 7. 헤 라-NurA에 헤 라-NurA-dna (B) ATP 바인딩 (A) DNA의 안정화 효과 조사. (i) 가스 단계 CIU MS 음모 그리고 (ii) 질량의 중심 충돌 에너지 (KEcom) 계산 쇼 dsDNA의 존재 헤 라 NurA 복잡 한 안정화 하 고 6 개의 ATP-γ-S 상태 바인딩된 가장 안정적입니다. 다른 충전 상태에 대 한 안정화 표시 됩니다. 플롯은 펄서 33를 사용 하 여 생성 했다. Z. Ahdash 그 외 여러분, 201722에서 적응 (A)에서 결과. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig8.jpg"> 그림 8. 차동 분자 동역학 시뮬레이션 모델링 절차에 대 한 워크플로. (A) 기존 하는 소 단위 및 누락 된 잔류물 재건에서 토폴로지를 구축 하 여 복잡 한 조사를 생성 합니다. (B)와 ligand 없이 복잡 한 단백질에서 분자 동역학 시뮬레이션을 실행 하기 위한 워크플로. 분자 동역학 시뮬레이션은 단백질에 대 한 실행만 기준으로 작동 하 고 있는 단백질 ligand의 시뮬레이션에서 뺍니다. 이것은 시뮬레이션 사이의 차동 제곱 평균 변동 (RMSF)를 계산 하 고 ligand 바인딩의 효과 결정 옵니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>복잡 한/하위 복잡 한</td>
			<td>이론적인 질량 (kDa)</td>
			<td>실험 집단 (kDa)</td>
			<td>이론적인 CCS (Å2)</td>
			<td>실험적 CCS (Å2) [충전]</td>
			<td>조건 HN</td>
		</tr>
<tr>
<td>헤 라6-NurA2
</td>
			<td>416.22</td>
			<td>417.85</td>
			<td>14531</td>
			<td>14577 [42 +] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45 +]</td>
			<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr></tbody></table>

질량 분석 (MS)는 구조 조사와 고분자 어셈블리의 역학에 대 한 중요 한 도구로 떠오르고 있다. 여기, 우리는 단백질 복잡 한 형성과 ligand 바인딩이 MS 기반 접근을 통합 합니다.

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

요즘 질량 분석은 구조 생물학에서 중요한 역할을합니다. 이 방법은 그들의 모국상태에서 중요한 생물학 거대 분자, 특히 단백질 및 단백질 복합체에 관하여 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 네이티브 질량 분광법은 다단백 및 핵산 시스템을 포함한 다양한 생체 분자 어셈블리에 널리 적용됩니다.이 기술의 주요 장점은 빠르고 매우 민감하다는 것입니다. 이질적인 단백질 샘플을 심문하는 데 사용할 수 있으며, 올리고머 상태에서 여러 단백질을 동시에 분석할 수 있게 한다. 절차를 시연하는 것은 내 그룹의 박사 과정 학생 인 앤디 라우 (Andy Lau)가 될 것입니다.이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 나노 전기 스프레이에 대한 사내 모세혈관을 준비합니다. 버퍼가 각각 암모늄 아세테이트로 교환될 때 각 실행에 대한 제어로 리간드 프리 샘플을 준비합니다. 다음으로 감도, 양수 이온 획득 및 이동성 TOF 모드를 선택합니다.트랩, API 및 IMS 가스를 켭니다. IM 분리의 경우 여기에 표시된 질소 및 아르곤 시작 점을 사용하고 필요에 따라 조정합니다. 적절한 m/z 획득 범위를 설정합니다.알 수 없는 단백질의 경우 초기 최적화 단계는 넓은 범위를 사용해야 합니다. 금코팅 모세관을 모세관 홀더에 삽입합니다. 그런 다음 모세관에 관심있는 단백질 복합 용액의 2 ~3 마이크로 리터 사이에 적재합니다.모세관을 부드럽게 조이고 전기 스프레이 소스 스테이지에 놓습니다. 스테이지를 위치로 밀어 데이터 수집을 시작합니다. 모세관 끝에 낙하가 형성될 때까지 낮은 나노 유량 가스 압력을 적용합니다.원뿔에 대하여 모세관을 이동하고 이온 전류를 모니터링하여 안정적인 이온 전류를 달성한다. 0.9~1.6킬로볼트 범위의 모세관 전압을 적용합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플링 콘, 소스 오프셋, 소스 온도 및 원뿔 가스 흐름을 설정합니다.잘 해결된 질량 스펙트럼을 획득하고 이온 전송을 최대화하려면 MS 매개 변수를 조정하고 스펙트럼의 결과로 발생하는 변화를 모니터링합니다. 트랩 충돌 에너지를 10~50볼트 사이의 초기 시작점으로 설정합니다. 전압 오프셋이 충분하지 않은 경우 트랩 충돌 에너지를 조정합니다.전압을 통해 트랩을 20~45볼트 사이의 초기 시작점으로 설정합니다. 이 전압을 최적화하여 해독을 개선합니다. 그 후 텍스트에 설명된 대로 웨이브 속도와 웨이브 높이를 최적화하여 최상의 이동성 분리를 달성합니다.HerA와 NurA와 관련된 연구에는 초당 40미터의 파도 속도와 550~650볼트 사이의 파도 높이를 사용합니다. DNA 결합 분석을 위해 단백질과 DNA를 단백질 DNA 복합 체형 형성을 허용하는 어금니 비율로 혼합합니다. 다음 중 5'O-3-티오 트리호스페이트, 테트라리튬 소금 또는 ADP의 양을 증가시추가합니다.적절한 소프트웨어를 사용하여 생성된 종의 질량을 측정하고 ATP 및 ADP 결합 및 올리고메릭 상태와 같은 리간 드바인딩을 식별합니다. 그런 다음 원시 ESI MS 스펙트럼에서 관찰된 이온 강도를 사용하여 해당 상대적인 종의 풍부를 정량화한다. 안정적인 변속기를 위해 계측기 조건을 최적화한 후, 충돌 에너지를 줄이고 원뿔을 가능한 한 낮게 샘플링하면서도 양호한 스펙트럼 품질을 유지합니다.이전에 결정된 최적화된 웨이브 속도와 웨이브 높이를 사용하여 IM MS를 획득합니다. 동일한 파도 높이를 유지하면서 세 가지 다른 파도 속도로 이온 드리프트 시간을 측정합니다. 단백질 이온 CCS를 결정하기 위하여 는 4개의 단백질 교정을 측정하기 위하여, 2개는 조사 중인 단백질 위에 질량을, 및 2개의 아래 질량을, 동일 계측 조건을 사용하여 측정합니다. 먼저, 단백질 샘플을 준비하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 암모늄 아세테이트로 교환하는 버퍼를 준비한다.원하는 양에 도달할 때까지 용매를 10% 증분에 추가합니다. 1 시간 동안 얼음에 배양. 이 후 각 샘플에 대해 IM-MS 스펙트럼을 획득합니다.SUMMIT 소프트웨어를 사용하여 단백질 하위 복합체를 할당하고 단백질 상호 작용 네트워크를 생성합니다. 또는, 수동으로 예상 된 종에 대 한 이론질량의 목록을 생성. 단백질 복합 적 안정성을 조사하기 시작하려면 IM-MS 데이터를 기록하면서 트랩 가속 전압을 10 볼트에서 200 볼트로 증가시켜 단백질과 가스 상으로 점진적으로 전개됩니다.적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 각 충전 상태에 대한 각 가속 전압에서 정규화된 CCS 분포강도를 적층하여 2차원 전개 플롯을 생성합니다. 네이티브 MS 결과는 HerA 및 NurA 복합체의 올리고메릭 상태, 조성 및 토폴로지의 상태를 나타낸다. 비동적 상호 작용이 가스 상에서 보존됨에 따라 ATP 감마 S 및 ADP 적정 실험의 기본 MS는 HerA 및 NurA에서 쌍-현명한 뉴클레오티드 결합을 결정하는 데 사용됩니다.HerA 올리고메릭 상태의 질량 스펙트럼은 ATP 감마 S 농도를 증가시켜 hexameric HerA의 상대적 강도를 증가시킨다는 것을 밝힙습니다. 단백질과 그 복합체에 대한 실험적인 CCS 값은 IM-MS 실험에서 유래됩니다. 이러한 값은 단백질 어셈블리의 저해상도 모델을 구축하기 위해 CCS 값을 사용하여 유효성을 검사하는 x 선 결정학의 이론적 측정과 좋은 관련이 있는 것으로 보입니다.CIU와 KEcom 분석에 따르면 HERA-NurA에 묶인 DNA는 DNA가 없는 복합체보다 더 안정적이라는 것을 알 수 있습니다. CIU MS 분석 및 각각ATP 결합 상태는 4개의 ATP 감마 S 바운드 상태가 가스 상에서 복잡한 안정성을 감소시킨다는 것을 보여줍니다. 그러나 모든 사이트가 점유되는 ATP 감마 S 바운드 상태 6개는 가장 안정적인 것으로 보입니다.그대로 복합체의 분자 질량을 정확하게 측정하면 생체 분자 특성화에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 우리는 복잡한 조립 경로, 단백질 올리고머화 및 리간드 결합에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 이 모든 정보를 결합하면 기능성 생물학적 어셈블리의 상세한 모델을 생성할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

질량 분석계는 큰 단백질 단지를 분석하는 데 유용한 도구로 입증되었습니다. 이 방법은 멀티 - subunit 어셈블리의 구성, stoichiometry 및 전반적인 아키텍처에 대한 통찰력을 수 있습니다. 여기, 우리가 설명하는, 단계 단계의 구조 질량 분광법 분석을 수행하고, macromolecular 구조를 특성화하는 방법.

구조 질량 분광법에 의해 큰 단백질 단지 분석

이온 이동성 - 질량 분광법는 충돌 단면 및 질량에 따라 이온을 분리 신흥 가스 상 기술입니다. 방법은 단백질 단지의 전체 토폴로지와 모양에 대한 입체적인 정보를 제공합니다. 여기, 우리는 악기 설정 및 최적화, 드리프트 시대의 교정 및 데이터 해석을위한 기본 절차를 설명합니다.

T - 파 이온 모빌리티 분석법 - 질량 : 단백질 복잡한 분석을위한 기본 실험 절차

정확한 질량 측정이 단백질의 조사 기간 동안 중요한 단계를 나타냅니다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 질량 분석 (MS)은 이러한 결정을 위해 사용될 수 있고, 그것의 주요 장점은 염, 세제 및 오염물에 대한 내성이다. 여기에서 우리는 MALDI-MS 100 kDa의보다 큰 단백질의 분석을위한 접근 방법을 보여줍니다.

비행의 레이저 탈착 / 이온화 시간 본래대로 단백질의 (MALDI-TOF) 질량 분광 분석 매트릭스를 이용한 큰 100 kDa의

여기에서는 고체 분말 내 단백질에 대한 고체 상태 아미드 수소/중수소 교환 질량 분석법(ssHDX-MS) 및 고체 상태 광분해 라벨링 질량 분석법(ssPL-MS)에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 비정질 고체 상태의 단백질 형태 및 상호 작용에 대한 고분해능 정보를 제공하며, 이는 제형 설계에 유용할 수 있습니다.

질량 분석은 동결 건조 분말에서 단백질의 구조와 상호 작용을 연구하는 접근

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

단백질 복합물의 건축은 그들의 기능을 위해 필수적입니다. 다양 한 대량 spectrometric 기법을 결합 하 여 그들의 어셈블리를 공부 하는 강력한 입증. 우리 화학 cross-linking 및 네이티브 질량 분석에 대 한 프로토콜을 제공 하 고 어떻게 이러한 상호 보완적인 기술을 다 소 단위 단백질 어셈블리의 구조를 명료 하 게 도움이 보여.

화학 Cross-linking 및 여러 소 단위 단백질 어셈블리의 건축을 그대로 단백질 복합물의 질량 분석

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

표적 가교 질량 분광법은 최대 세 가지 다른 수집 프로토콜을 사용하여 획득한 질량 분광법 데이터를 사용하여 사차 단백질 구조 모델을 생성합니다. Cheetah-MS 웹 서버에서 간소화된 워크플로로 실행되면 결과가 Jupyter 노트북에 보고됩니다. 여기서는 Jupyter 노트북을 보다 심층적인 분석을 위해 확장할 수 있는 방법에 대한 기술적 측면을 보여 줍니다.

화학 가교 질량 분광법을 통한 사차 구조 모델링: TX-MS Jupyter 보고서 확장

기재된 단백질 은 관심 있는 주어진 단백질및 무표지 질량 분석법의 면역친화성 농축을 사용하여 핵 세포 분획으로부터 단백질 상호작용 파트너를 식별하기 위한 프로테오믹스 워크플로우이다. 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 필터 보조 시료 준비, 오프라인 정리, 질량 분석 법 및 다운스트림 생물 정보학 파이프라인이 포함됩니다.

대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

질량 분광 검출을 가진 영양 절이로카보네이트 기지를 둔 공유 라벨을 수행하기 위한 실험 절차가 설명됩니다. Diethylpyrocarbonate는 단순히 관심있는 단백질 또는 단백질 복합체와 혼합되어 용매접근 가능한 아미노산 잔류물의 변형으로 이어집니다. 상기 변형된 잔류물은 프로테오리스틱 소화 및 액체 크로마토그래피/질량 분석 후 확인할 수 있다.

질량 분광법에 의한 단백질 고차 구조를 연구하기 위한 디틸피로카보네이트와 공유 라벨링

배우세요 단백질 복합체와 리간드 결합 분석을 위한 네이티브 질량 분석법. 이 방법은 생체 상태에서 단백질 올리고머 상태와 비공유결합 상호작용을 신속하고 민감하게 분석하여 구조 생물학 연구에 활용됩니다.

단백질 구조와 통합 구조 질량 분석, 단백질-리간드 단지 분석

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