Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

이 원고 luciferase 활동의 측정에 기반 하는 단백질 단백질 상호 작용을 결정 하기 위한 간단 하 고 신속한 실험 절차를 설명 합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 일시적인 발현 시스템에서 단백질-단백질 상호 작용을 정량적으로 검출하는 것입니다. 이 측정은 화학적 또는 환경적 처리 후 단백질 단백질 방향을 정량적으로 모니터링하는 방법과 같은 콴 신호 거래 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 광도계 또는 CCD 카메라를 사용하여 단백질 단백질 방향 강도를 나타내는 명료성 활성을 감지하여 결과를 보다 정확하게 얻을 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 5%의 차아염소산나트륨과 0점 1%의 트리톤 x 100이 들어 있는 용액 1ml를 씨앗이 들어 있는 1점 5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다. 씨앗을 살균하기 위해 용액을 5분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 멸균 물로 씨앗을 5 번 씻으십시오.

씻은 씨앗을 200 마이크로 리터의 멸균 수에 현탁시킵니다. 미세한 팁을 사용하여 도금된 MS 한천 배지의 표면에 개별 씨앗을 조심스럽게 놓습니다. 발아를 동기화하기 위해 플레이트를 섭씨 4도에서 3일 동안 보관하십시오.

그 후, 중간 플레이트를 10일 동안 정상적인 성장 조건에서 유지하십시오. 발아하는 묘목을 흙으로 옮기고 뿌리가 손상되지 않도록 합니다. 습도를 유지하기 위해 밤새 투명 플라스틱 덮개로 트레이를 덮으십시오.

통제된 성장실에서 7주 동안 식물을 키우면 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)가 침투할 준비가 됩니다. 먼저, 150나노그램의 플라스미드를 a-tumefaciens 수용 세포 균주 GV3101에 전달합니다. a-tumefaciens 배양액이 들어있는 튜브를 셰이커에 넣고 4시간 동안 배양합니다.

유리 막대를 사용하여 튜브에서 LB 매체로 배양물을 옮깁니다. 배양 a-tumefaciens 및 LB 한천 배지를 섭씨 28도에서 4일 동안 배양합니다. 다음으로, 각 플레이트의 단일 a-tumefaciens 콜로니를 3ml의 LB 액체 배지가 들어 있는 자체 튜브에 접종할 준비를 합니다.

섭씨 28도에서 280 RBM으로 24시간 동안 흔들어 배양물을 전파합니다. 그런 다음, 75마이크로리터의 박테리아 배양액을 15밀리리터의 카나마이신과 밀리리터당 50마이크로그램의 리팜피신을 포함하는 15밀리리터의 새로운 LB 액체 배지로 옮깁니다. OD600이 0.5 대 1이 될 때까지 섭씨 30도에서 약 8시간 동안 섭씨 220RPM으로 박테리아를 배양합니다.

그런 다음 배양물을 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 중력 4000배, 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리기. 상층액을 버리고 팔레트를 15ml의 변형 용액에 다시 현탁시킵니다.

4000배 중력과 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리기. 그런 다음 현탁액 및 원심분리 단계를 한 번 더 반복합니다. 상층액을 버리고 팔레트를 5ml의 형질전환 용액에 다시 현탁시킵니다.

재부유된 팔레트를 어두운 조건의 실온에서 2시간 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 OD600 is 0.5에 형질전환 용액을 추가하거나 쌍을 이루는 단백질 상호 작용을 테스트하기 위해 동일한 부피의 두 샘플을 결합합니다. 1밀리리터의 주사기 바늘을 사용하여 부유 세포를 네 번째에서 일곱 번째 잎에 침투시킵니다.

그 후, 즉시 12 시간 동안 검은 색 플라스틱 덮개로 식물을 덮으십시오. 첫째, 식물은 성공을 보장하기 위해 매우 건강해야 합니다. 둘째, 침투 과정에서 나뭇잎이 손상되지 않도록 하십시오.

트레이를 12시간 동안 어두운 곳에 두십시오. 그런 다음 루시페라제 활성을 감지하기 전에 2-4일 동안 정상적인 조건에서 식물을 성장시킵니다. 이미징 방법을 시작하려면 침투된 잎을 분리합니다.

전체 전단지를 MS 한천 배지 플레이트에 놓습니다. 50ml 스프레이 병을 사용하여 잎의 인접 쪽에 루시페론 작업 버퍼를 분사합니다. 그런 다음 5분 동안 어두운 곳에 두어 엽록소 자가형광을 끕니다.

저조도 냉각 CCD 상상 장치를 사용하여 섭씨 30도의 음의 온도로 냉각된 장치를 사용하여 50밀리초의 광 충전 노출 시간과 1분의 발광 감지 시간으로 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 N-벤타미아나 잎의 침투 영역에서 잎 조각을 잘라냅니다. 100 마이크로 리터의 탈 이온수에 조각을 96 웰 흰색 플레이트의 우물에 담그십시오.

10마이크로리터의 루시페론 작업 버퍼를 추가합니다. 접시를 5분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 원하는 특정 처리를 수행하여 단백질 상호 작용 역학을 연구하고 상용 광도계로 발광을 직접 측정합니다.

여기에 표시된 것은 COP 1 SPA 1 상호 작용을 나타내는 명료한 활동의 시연입니다. 발광에 의해 감지되는 투명도 활성은 CCD 카메라로 이미지화됩니다. COP 1 SPA 1 상호 작용은 기능적 루시페라아제의 구리 돌연변이를 초래하는 것으로 보입니다.

그런 다음 시간 경과에 따른 Jasmine 8 처리하의 루시페라아제 활성을 측정합니다. 루시페라아제 활성으로 대표되는 COP 1 SPA 1 상호 작용은 어둠 속에서 점차 감소하는 것으로 보입니다. 재스민 8로 치료하면 이러한 상호 작용이 더욱 줄어듭니다.

이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 식물이 준비된 후 1주일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 건강한 식물을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 나뭇잎에 조심스럽게 침투하고 컨트롤을 적절하게 포함하십시오.

개발 후 이 기술은 신호 트랜잭션 분야의 연구자들이 단백질 단백질 상호 작용 역학을 빠르게 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 담배 식물을 재배하는 방법, 담배 잎에 농균을 침투시키는 방법, 맑은 활동을 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.