Name: Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 배우세요 루시퍼라스 보완성 이미징을 이용하여 Nicotiana benthamiana 잎에서 단백질 상호작용을 정량적으로 분석하는 방법입니다. 이 기술은 신호전달 연구에서 단백질 역학을 빠르게 탐색하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 자연 과학 재단의 장쑤 성 (BK20140919), 국립 자연 과학 재단의 중국 (31470375), 우선 교육 프로그램 개발의 장쑤 등 교육 기관 및 청 Lan 프로젝트에 의해 지원 되었다.

1. 식물 (8 주)의 준비
<ol><li>5% NaClO 0.1% 트라이 톤 X-100 (V/V) 솔루션 및 두고 씨앗 소독을 5 분의 1 mL를 포함 한 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 50 Nicotiana benthamiana 씨앗을 넣어.</li>
	<li>5 번 살 균 물으로 종자를 헹 굴 하 고 살 균 물 200 µ L에서 씨앗을 일시 중단.</li>
	<li>신중 하 게 장소 개별 씨앗 MS-한 천 매체 (1 l: 重 & Skoog 소금 10 g 자당, pH 5.8 x 1 (코), 1 %agar) 좋은 팁 및 발 아 동기화를 3 일 동안 4 ° C에 게 중간 접시의 표면에. 참고: 미생물 오염을 방지 하려면 클린 벤치에이 단계를 수행 합니다. 살 균 동안 튜브를 흔들 필요는 없습니다.</li>
	<li>10 일 동안, 정상적인 성장 조건 (22 ° C, 80-90 µmolm-2의-1 흰 빛의 강도)에서 중간 접시 놓고 토양으로 세균된 묘를 전송 합니다. 참고: 토양에 모 종 뿌리를 삽입 하 고 뿌리를 손상 하지 마십시오. 투명 한 플라스틱 커버와 하룻밤 습도 유지 하기 위해 트레이 커버.</li>
	<li>16 h/8 h 명암 주기 및 70% 습도에 제어 성장 방에 식물을 성장 한다. 7 주 된 명. benthamiana 식물 Agrobacteriumtumefaciens 침투 (그림 1A)에 대 한 준비가 되었습니다. 참고: 식물을 급수 하 고 식물의 건강을 유지 하는 데 필요한 해충을 제어.</li>
</ol>2. 과도 식 명 Benthamiana 잎 (7-10 일)
<ol><li>플라스 미드의 배달 150 ng (pEGAD-하-뤽 제어 플라스 미드, 빈 벡터 및 국제 협회에 대 한 생성 된 플라스 미드 분석 결과,이 경우에 우리가 사용 pCAMBIA1300 Nluc 및 pCAMBIA1300 Cluc 플라스 미드 건설) A. tumefaciens 유능한 세포로 변형으로 GV3101는 표준 electroporation 방법입니다.</li>
	<li>Luria Bertani (파운드) 한 천 매체 (1 l: 10 g NaCl, 5 g 효 모 추출 물, 10 g tryptone 1.5 %agar) 포함 50 µ g/mL 대와 4 일 동안 28 ° C에서 리 팜 피신의 50 µ g/mL에 문화 A. tumefaciens 참고: 벡터 및 사용 A. tumefaciens 변형에 따라 항생제의 선택 합니다.</li>
	<li>접종 한 파운드 50 µ g/mL 대과 리 팜 피신의 50 µ g/mL를 포함 하는 액체 매체의 3 mL에 각 접시에서 A. tumefaciens 식민지를 단일 및 24 h 셀 문화 전파를 위한 28 ° C에서 220 rpm에 흔들.</li>
	<li>15 mL 신선한 파운드 액체 매체 포함 된 50 µ g/mL 대과 리 팜 피신, 200 배 희석의 50 µ g/mL로 75 µ L 세균성 문화를 전송 합니다. OD600 0.5에서 1.0 사이 때까지 약 8 시간, 30 ° C에서 220 rpm에서 박테리아를 문화.</li>
	<li>A. tumefaciens 액체 문화 15 mL 원심 분리기 튜브에 전송 하 고 4000 x g와 15 분 삭제는 상쾌한 4 ° C 원심 펠 릿을 세척 하 변환 솔루션의 15 mL에 펠 릿을 중단.</li>
	<li>4000 x g와 15 분 동안 4 ° C 튜브를 회전 하 고는 상쾌한 삭제. 다시 한 번 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>변환 솔루션의 5 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 실 온에서 2 h 동안 유지. OD600 의 최종 농도 0.5, 또는 테스트 쌍을 이루는 단백질 상호 작용에 대 한 동등한 양으로 혼합 두 샘플까지 변환 솔루션 A. tumefaciens 펠 릿 셀의 밀도 조정 합니다.</li>
	<li>7 4번째 에 침투 중단 셀일 단풍 1 mL needleless 주사 통 (그림 1B-C). 침투 후 검은색 플라스틱 커버와 함께 즉시 식물을 커버 하 고 12 h에 대 한 어둠 속에서 트레이 놓습니다. 그 후, 평소 뤽 활동을 검출 하기 전에 2 ~ 4 일에 대 한 식물을 성장. 참고: 비슷한 크기의 건강 한 잎을 선택 합니다. 한 잎에 4 개의 다른 영역의 침투는 괜 찮 아 요.</li>
</ol>3. 감지 Luciferase 활동 (1 일)
참고: luciferase 활동을 모니터링 하는 두 가지 방법이 있다. 하나는 이미징, 기반 그리고 다른 양적 luciferase 활동을 측정 하는 것입니다.
<ol><li>
이미징 방법
	<ol>
<li>침투 잎을 분리 하 고 MS-한 천 매체에 전체 전단지를 넣어.</li>
		<li>스프레이 50 mL 스프레이 용기와 표면에 잎 adaxial 소 작업 버퍼입니다. 엽록소 자동 형광 담금질 하기 위해 5 분 동안 어둠 속에서 자료를 유지.</li>
		<li>이미지 (그림 2)를 (-30 ° C에 냉각) 장치 이미징 낮은 조명 냉각된 CCD를 사용 합니다. 빛에 신청 노출 시간이 50 밀리초 이며 발광 검출 시간은 1 분입니다. 참고: 컴퓨터 매뉴얼에 따라 매개 변수를 조정 합니다. 낮은 온도 이미지 품질을 향상 시키기 위해 신호-잡음 비율을 강화할 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>또는, 상업적인 루미 노와 직접 발광을 측정 합니다.<ol>
<li>조심 스럽게 명. benthamiana 잎의 침투 지역에서 (약 0.25 cm2) 잎 조각을 잘라 고 잎 디스크 100 µ L 96 잘 흰 접시 (그림 3)에서 이온 물에 담가.</li>
		<li>소 작업 버퍼의 10 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 둡니다. 그런 다음 특정 치료 단백질 상호 작용 역학 연구를 수행 합니다. 참고: 특정 치료에서 단백질 단백질 상호 작용의 활동을 나타내는 luciferase 활동 역학을 얻을 다른 시간 지점에서 루미 노와 발광을 감지 합니다. 이 메서드는 동시에 많은 수의 단백질 쌍을 테스트에 대 한 이점이 있다. 서쪽 오 점 여 luciferase 단백질 나타났는데 검사 그 상업 루미 노 하지 않고, 따라서 뤽 활동 quantitively를 참조 하십시오. 빛이 반드시 필요한 경우 단지는 루미 노에 접시를 유지 하 고 다른 시간 지점에서 발광을 측정. 그렇지 않으면 검출 간격 동안 성장 챔버에 접시를 이동 합니다. 적어도 3 개의 생물 복제를 사용 하 여 통계적으로 유의 한 결과 얻을. 루크 활동 다른 침투 영역에서 달라 지기는 하지만 그들의 변화 패턴 일치 하는 정규화 후입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF%28COI1%29+complex+during+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li>
<li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li>
<li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li>
<li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li>
<li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li>
<li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li>
<li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li>
<li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li>
<li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li>
<li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+repression+of+photomorphogenesis%3A+role+switching+of+COP%2FDET%2FFUS+in+light+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li>
<li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li>
<li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li>
<li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 프로토콜은 간단 하 고 vivo에서 단백질-단백질 상호 작용, 공부에 대 한 재현 고 외 인 치료에서 단백질 상호 작용 역동성을 감지 하는 데 특히 적합. 이 분석 결과 주요 단계 명. benthamiana 침투입니다. 성공을 보장 하기 위해 침투, 식물 매우 건강 해야 합니다. 또 다른 중요 한 요인은 침투 후 luciferase 활동을 확인 하는 시기입니다. 이 질문에 대 한 정확한 대답이 있다. 연구원은 다른 일은 luciferase 높은 수준에서 표시 됩니다 때 우리가 관찰 시간8변동 단백질 표정 수준 때문에 판단에 침투 후에 luciferase 활동을 모니터링 하는 것이 좋습니다.
그것은 가능한 아무 발광 실험에서 검색 될 수 있습니다. 적절 한 컨트롤 없이 false 네거티브를 제외할 수 없습니다. 전체 길이 luciferase 제어는 침투와 luciferase 탐지 작동을 증명...

환경과 성장 조정 하려면 식물 감각, transduce, 신호 신호에 응답 하는 우아한 신호 경로 진화해왔다. 릴레이 경주에서 주자 처럼 단백질은 식물 신호 변환에 필요한 선수. 그것은 널리 인정 되었습니다 단백질 단백질 상호 작용 (PPI) 셀룰러 통신에 대 한 주요 역할을 한다. 단백질 인 산화, acetylation, 및 저하 모두 대상 단백질 및 그것의 수정 효소 간의 실제 상호 작용에 따라 달라 집니다. 예를 들어 Jasmonate ZIM 도메인 단백질 (JAZ) 가족 단백질 녹음 방송 요인 MYC2와 상호 작용 하 고는 transcriptional 활동1,2를 억제. PPI의 중요성을 감안할 때 대규모 단백질 interactomes 식물에 되었습니다 탐험 최근3,,45. 이러한 위하여 결과 더 다양 한 세포 기능을 조정 하는 복잡 한 규제 네트워크 공개.
PPI를 모니터링 하기 위한 몇 가지 설립된 접근이 있다. 효 모 2 잡종 (Y2H) 분석 결과 PPI 탐지에 대 한 가장 널리 사용 되는 방법입니다. Y2H를 수행 하기 쉽고 단백질 상호 작용을 검사 하는 빠른 테스트를 위해 적당 한 이다. Y2H는 관심의 특정 단백질에 대 한 알 수 없는 상호 파트너 심사 또한 널리 이용 된다. 그러나, Y2H은 효 모에 전적으로 실시 하기 때문에 그것은 수 없습니다 반영 공장에서 실제 시나리오 세포 높은 거짓 긍정적인 요금을 가져온다. 또 다른 유사한 전략은 풀 다운 분석 결과 이다. 일반적으로, 두 단백질은 표현 및 대장균 세포에서 정화와 혼합 그리고 단백질 상호 작용 검출을 위한 움직일 수 있습니다. 이 방법은 시간이 오래 걸릴 하지 않습니다, 비록 그것은 얻을 수 없습니다 vivo에서 상호 작용 결과 중 하나. 목적을 위해 비보에 상호 작용, 공동-immunoprecipitation (공동-IP) 고품질 immunoprecipitate 관심의 단백질에 항 체를 요구 하 고 간접 PPIs의 가능성을 제외 수는 가장 인기 있는 분석 결과 이다. 또한, 공동-IP에 복잡 한 실험 절차 때문 결과 일반적으로 개별 전문성을 갖춘 다.
기자 기반으로 재구성 분석 실험은 크게 vivo에서 PPI의 탐지 사전. 이러한 방법에는 형광 공명 에너지 전달 (무서 워)6, 분자 형광 보완성 (BiFC)7및 이미징 (협회) 분석 결과8반딧불 luciferase 보완성 포함 됩니다. 있지만 이러한 세 가지 방법 공동 IP 보다는 직접 vivo에 맞게 PPI, 무서 워, BiFC 특정 현미경 형광 신호 필요와 쉽게 상호 작용 강도 정할 수 없습니다. 반면, 협회의 기판 소 반응 후 놀 것 이다 반딧불 luciferase의 활용. 더 중요 한 것은, PPI 강도 luciferase 활동의 값에서 확인할 수 있습니다. 따라서, 협회는 뿐만 아니라 두 단백질 상호 작용, 하지만 또한 치료 시 상호 작용 역동성에 정보를 제공 합니다 여부를 나타냅니다. 비록 몇 가지 설정된 방법이 상호 역학 (표면 플라스몬 공명 또는 온도 안정성 교대 기준)9,10, 모니터링을 위한 섬세 한 악기 또는 특정 라벨이 방법 필요 합니다. 반면, 협회 수행 하 고 검색 하기가 쉽습니다.
국제 협회에 대 한 원리는 아미노 터미널과 carboxyl 터미널 반쪽 luciferase (라는 N-뤽 또는 C-뤽, 각각)의 A와 B, 단백질과 단백질 식물 세포에 동시에 표현 했다이 두 퓨전으로 융합 했다. 단백질 A, 단백질 B와 상호 작용 하는 경우 다음 luciferase의 두 반쪽 됩니다 수 재구성 된다 될 활성 luciferase 효소. 루미 노 또는 CCD 카메라 luciferase 활동을 감지할 수 있습니다. 그것은 협회;에 대 한 안정 된 transformants를 얻을 필요가 없습니다. 과도 식 고급 상호 작용 결과 얻기에 충분 하다.
링 타입 E3 유비퀴틴 리가 제정 photomorphogenic 1 (COP1) 녹음 방송 요인의 무수 한와 상호 작용 하 고 26S 프로테아좀11그들의 저하를 촉진 합니다. 이러한 COP1 대상 녹음 방송 요인 중 일부는 photomorphogenesis에 대 한 긍정적인 레 귤 레이 터입니다. 어둠 속에서 COP1 phytochrome A-105 1 (SPA1), COP1 E3 활동8향상의 억압으로 작용 합니다. 빛의 지 각, 후 대뇌 COP1 활동을 억제 하 고 COP1 기판12,,1314다음 안정화 COP1-SPA1 상호 작용을 파기 됩니다. 이 예제에서는 PPI를 공부 하 고 PPI 역학 생물 학적 의미를 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td><강한>변환 솔루션</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM 모르폴린에탄술폰산</td><td>VETEC</td><td>V900336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27.8 mM 포도</td>당 <td>VETEC</td><td>V900392</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl2&times; 6H2O</td><td>VETEC</td><td>V900020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>150 &뮤; M 아세토시링곤</td><td>알드리치</td><td>D134406&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pH 5.7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luciferin 작동 완충액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM Luciferin 칼륨 염</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>0.025% Triton X-100</td><td>VETEC</td><td>V900502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>H2O to 10 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

luciferase 보완성 이미징 분석 결과 nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

단백질 단백질 상호 작용은 릴레이 신호 변환 가장 세포질 과정;에 대 한 기본 메커니즘 그러므로, 소설 단백질-단백질 상호 작용 쌍 및 단백질 상호 작용 역동성을 모니터링 드러내는 식물 환경 요인 및 발달 신호에 응답 하는 방법에 대 한 특별 한 관심의 이다. 접근의 과다 단백질 단백질 상호 작용, 체 외에서 또는 vivo에서검토 개발 되었습니다. 그 중 최근에 설립 된 luciferase 보완성 (협회) 이미징 분석 결과가 이다 vivo에서 단백질-단백질 상호 작용 위한 간단 하 고 빠른 방법. 이 분석 결과에서 단백질 또는 단백질 B는 융합 luciferase의 아미노 맨끝 또는 carboxyl 터미널 반 각각. 단백질 단백질 B로 할 때, luciferase의 두 반쪽 기능과 활성 luciferase 효소를 형성 하는 재구성 된다 것입니다. 루미 노 또는 CCD 카메라 luciferase 활동을 기록할 수 있습니다. 다른 방식에 비해, 질적 및 양적 협회 분석 결과 단백질 단백질 상호 작용을 보여줍니다. Nicotiana benthamiana 잎에서 Agrobacterium 침투 과도 단백질 표정에 대 한 널리 사용된 시스템입니다. 협회 및 과도 식의 조합으로, 이러한 접근 COP1와 SPA1 간의 실제 상호 작용 jasmonate 치료 후 서서히 감소 되었다 보여줍니다.

세 가지 주요 단계 단백질 단백질 상호 작용에서 vivo에서, 식물 성장, luciferase 분석 결과, 담배 침투 등 공부에 대 한이 luciferase 보완성 프로토콜에 점찍어 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 액체 A. tumefaciens 명. benthamiana 잎 (그림 1)에 침투 하는 것은.
여기에 jasmonate COP1-SPA1 상호 작용을 감소를 확인 하는이 기술의 유용의 예가입니다. Luciferase 아미노 터미널과 carboxyl 터미널 반 COP1 융합 했다 (COP1-NLuc) 또는 SPA1 (CLuc-SPA1), 각각. COP1-SPA1 상호 작용 기능 luciferase 보완성에 결과. Luciferase ...

이 원고 luciferase 활동의 측정에 기반 하는 단백질 단백질 상호 작용을 결정 하기 위한 간단 하 고 신속한 실험 절차를 설명 합니다.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

이 절차의 전반적인 목표는 일시적인 발현 시스템에서 단백질-단백질 상호 작용을 정량적으로 검출하는 것입니다. 이 측정은 화학적 또는 환경적 처리 후 단백질 단백질 방향을 정량적으로 모니터링하는 방법과 같은 콴 신호 거래 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 광도계 또는 CCD 카메라를 사용하여 단백질 단백질 방향 강도를 나타내는 명료성 활성을 감지하여 결과를 보다 정확하게 얻을 수 있다는 것입니다.이 절차를 시작하려면 5%의 차아염소산나트륨과 0점 1%의 트리톤 x 100이 들어 있는 용액 1ml를 씨앗이 들어 있는 1점 5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다. 씨앗을 살균하기 위해 용액을 5분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 멸균 물로 씨앗을 5 번 씻으십시오.씻은 씨앗을 200 마이크로 리터의 멸균 수에 현탁시킵니다. 미세한 팁을 사용하여 도금된 MS 한천 배지의 표면에 개별 씨앗을 조심스럽게 놓습니다. 발아를 동기화하기 위해 플레이트를 섭씨 4도에서 3일 동안 보관하십시오.그 후, 중간 플레이트를 10일 동안 정상적인 성장 조건에서 유지하십시오. 발아하는 묘목을 흙으로 옮기고 뿌리가 손상되지 않도록 합니다. 습도를 유지하기 위해 밤새 투명 플라스틱 덮개로 트레이를 덮으십시오.통제된 성장실에서 7주 동안 식물을 키우면 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)가 침투할 준비가 됩니다. 먼저, 150나노그램의 플라스미드를 a-tumefaciens 수용 세포 균주 GV3101에 전달합니다. a-tumefaciens 배양액이 들어있는 튜브를 셰이커에 넣고 4시간 동안 배양합니다.유리 막대를 사용하여 튜브에서 LB 매체로 배양물을 옮깁니다. 배양 a-tumefaciens 및 LB 한천 배지를 섭씨 28도에서 4일 동안 배양합니다. 다음으로, 각 플레이트의 단일 a-tumefaciens 콜로니를 3ml의 LB 액체 배지가 들어 있는 자체 튜브에 접종할 준비를 합니다.섭씨 28도에서 280 RBM으로 24시간 동안 흔들어 배양물을 전파합니다. 그런 다음, 75마이크로리터의 박테리아 배양액을 15밀리리터의 카나마이신과 밀리리터당 50마이크로그램의 리팜피신을 포함하는 15밀리리터의 새로운 LB 액체 배지로 옮깁니다. OD600이 0.5 대 1이 될 때까지 섭씨 30도에서 약 8시간 동안 섭씨 220RPM으로 박테리아를 배양합니다.그런 다음 배양물을 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 중력 4000배, 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리기. 상층액을 버리고 팔레트를 15ml의 변형 용액에 다시 현탁시킵니다.4000배 중력과 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리기. 그런 다음 현탁액 및 원심분리 단계를 한 번 더 반복합니다. 상층액을 버리고 팔레트를 5ml의 형질전환 용액에 다시 현탁시킵니다.재부유된 팔레트를 어두운 조건의 실온에서 2시간 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 OD600 is 0.5에 형질전환 용액을 추가하거나 쌍을 이루는 단백질 상호 작용을 테스트하기 위해 동일한 부피의 두 샘플을 결합합니다. 1밀리리터의 주사기 바늘을 사용하여 부유 세포를 네 번째에서 일곱 번째 잎에 침투시킵니다.그 후, 즉시 12 시간 동안 검은 색 플라스틱 덮개로 식물을 덮으십시오. 첫째, 식물은 성공을 보장하기 위해 매우 건강해야 합니다. 둘째, 침투 과정에서 나뭇잎이 손상되지 않도록 하십시오.트레이를 12시간 동안 어두운 곳에 두십시오. 그런 다음 루시페라제 활성을 감지하기 전에 2-4일 동안 정상적인 조건에서 식물을 성장시킵니다. 이미징 방법을 시작하려면 침투된 잎을 분리합니다.전체 전단지를 MS 한천 배지 플레이트에 놓습니다. 50ml 스프레이 병을 사용하여 잎의 인접 쪽에 루시페론 작업 버퍼를 분사합니다. 그런 다음 5분 동안 어두운 곳에 두어 엽록소 자가형광을 끕니다.저조도 냉각 CCD 상상 장치를 사용하여 섭씨 30도의 음의 온도로 냉각된 장치를 사용하여 50밀리초의 광 충전 노출 시간과 1분의 발광 감지 시간으로 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 N-벤타미아나 잎의 침투 영역에서 잎 조각을 잘라냅니다. 100 마이크로 리터의 탈 이온수에 조각을 96 웰 흰색 플레이트의 우물에 담그십시오.10마이크로리터의 루시페론 작업 버퍼를 추가합니다. 접시를 5분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 원하는 특정 처리를 수행하여 단백질 상호 작용 역학을 연구하고 상용 광도계로 발광을 직접 측정합니다.여기에 표시된 것은 COP 1 SPA 1 상호 작용을 나타내는 명료한 활동의 시연입니다. 발광에 의해 감지되는 투명도 활성은 CCD 카메라로 이미지화됩니다. COP 1 SPA 1 상호 작용은 기능적 루시페라아제의 구리 돌연변이를 초래하는 것으로 보입니다.그런 다음 시간 경과에 따른 Jasmine 8 처리하의 루시페라아제 활성을 측정합니다. 루시페라아제 활성으로 대표되는 COP 1 SPA 1 상호 작용은 어둠 속에서 점차 감소하는 것으로 보입니다. 재스민 8로 치료하면 이러한 상호 작용이 더욱 줄어듭니다.이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 식물이 준비된 후 1주일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 건강한 식물을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 나뭇잎에 조심스럽게 침투하고 컨트롤을 적절하게 포함하십시오.개발 후 이 기술은 신호 트랜잭션 분야의 연구자들이 단백질 단백질 상호 작용 역학을 빠르게 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 담배 식물을 재배하는 방법, 담배 잎에 농균을 침투시키는 방법, 맑은 활동을 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

luciferase-complementation-imaging-assay-nicotiana-benthamiana-leaves

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서는 제대로 BioRad는 양파 표피 세포에 플라스미드 DNA을 소개하는 진 건 헬리 우스 및 Bimolecular 형광 Complementation의 원칙 (BiFC)를 기반으로 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 테스트를 사용하는 방법을...

헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이

우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

이 동영상은 단백질-단백질 상호 작용을 검출하기 위한 분할 루시페라제 보체 분석을 보여줍니다. 이 분석법에서 관심 단백질은 루시페라아제 효소의 작은 단편과 큰 단편에 태그가 지정됩니다. 단백질이 상호 작용할 때 큰 조각과 작은 조각이 결합하여 활성 효소 복합체를 형성하며, 특정 기질이 존재할 때 측정할 수 있는 밝은 발광을 방출합니다.

특정 단백질-단백질 상호작용을 식별하기 위한 Split Luciferase Complementation Assay

아그로 박테리아는 (담배 모자이크 바이러스 계는) 백신 항원과 치료 단백질을 생산하기 위해 신속하고 경제적 인 방식 발사 벡터를 들고있는 진공 침투에 근거 된 담배 식물에서 과도 단백질 생산. 우리는 절차를 간소화하고, 세균의 배양 조건을 최적화 호스트 종을 선택하고 RNA 침묵 억제를 공동 도입하여 대상 축적을 개선.

최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

세포 이하 수준에서 신호 이벤트는 발달 및 환경 단서에 의해 동적으로 조절됩니다. 여기에서는 담배 일시적 발현 시스템을 사용하여 동적 단백질-단백질 상호 작용을 모니터링하고 식물 세포에서 신호 전달의 공간적 조직을 공개하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

여기에 제시된 프로토콜은 분할 루시퍼라제 보체 분석의 가장 최근의 변이체를 사용하여 살아있는 포유동물 세포에서 세포질적으로 노출된 N- 및/또는 C-테르미니와 골지-상주 III형 막 단백질 사이의 이종 상호작용의 발생을 입증하기 위한 것이다.

스플릿 루시퍼라아제 보체 분석을 사용하여 골지-레지던트 타입 III 막 단백질에 의해 형성된 이종 복합체의 시연

우리는 니코티아나 벤타미안에서GFP에 융합된 재조합 인간 IgG의 발현, 추출 및 정제를 위한 간단한 방법을 여기에서 설명한다. 이 프로토콜은 열 크로마토그래피를 활용하는 수많은 단백질의 정제 및 시각화로 확장될 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 직접 및 가상 대학 교육 실험실에 적용되어 프로젝트 기반 탐사를 제공합니다.

니코티아나 벤타미안나에서 과도하게 표현된 IgG 융합 단백질의 생산

여기서 우리는 BiFC 기반 FRET-FLIM 분석법에 의한 형광 태그 단백질을 사용하여 3개의 단백질 파트너 간의 삼차 복합 형성을 시각화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 생체 내에서단백질 단백질 상호 작용 복합체를 연구하는 데 유용합니다.

BIFC-FRET-FLIM 분석체에 의한 MADS 박스 전사 계수의 두 단백제와 칼슘 센서 단백질 간의 삼자 상호 작용 결정

형광 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 감지하기 위한 이미징 기술입니다. 여기에서는 식물 조직에서 유전자 발현의 후성유전학적 조절을 위해 히스톤 변형 효소와 전사 인자를 모집하는 전사 인자의 연관성을 연구하기 위해 FRET 프로토콜이 제시됩니다.

형광 공명 에너지 전달에 의한 생체 내 히스톤 변형 효소와 전사 인자 간의 상호 작용 조사

이 프로토콜은 바이러스-플라스모데스마타 상호 작용 또는 플라스모데스마 수송 중 플라스모데스마타를 표적으로 하는 단백질의 컨포칼 현미경 기반 분석을 위한 최적의 플라스모데스마 마커 선택에 대해 설명합니다.

Nicotiana benthamiana에서 Plasmodesmata에 대한 단백질 분류의 컨포칼 현미경 분석

배우세요 루시퍼라스 보완성 이미징을 이용하여 Nicotiana benthamiana 잎에서 단백질 상호작용을 정량적으로 분석하는 방법입니다. 이 기술은 신호전달 연구에서 단백질 역학을 빠르게 탐색하는 데 활용됩니다.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

더 많은 동영상 탐색