부위별 교차결합을 사용하여 분비된 박테리아 독성 인자의 조립 모니터링

다음 실험의 전반적인 목표는 살아있는 세포 내부의 단백질 단백질 상호 작용의 역학을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 대장균에서 관심 단백질을 발현하고, 아미노산 유사체 벤조일 페닐 알라닌을 특정 위치에서 단백질에 통합하고, 동시에 합성된 단백질 분자의 작은 집단을 태그하기 위해 펄스 추적 무선 라벨링을 수행함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로.

추적 중 다양한 시점에서 수집된 세포의 분취량은 관심 단백질과 상호 작용하는 모든 인자 사이에 공유 결합의 형성을 유발하기 위해 방사선 조사됩니다. 다음 단백질은 특정 항체로 침전되고 SDS 폴리 아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 해결되어 상호 작용 요인을 확인하기 위해, 가교 제품의 전기 영동 이동성의 변화를 기반으로 시간이 지남에 따라 관심 단백질과 기타 세포 내 요인 사이의 상호 작용 변화를 보여주는 결과가 얻어집니다. CO 면역침전 또는 화학적 가교와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 관심 단백질의 특정 잔류물과 다른 분자 사이에서 발생하는 상호 작용에 대한 시간 정보를 생성할 수 있다는 것입니다.

이러한 데이터는 다단계 조립 경로를 통한 단백질의 진행을 연구하고 조립 중간체를 식별할 때 특히 유용합니다. 이 방법은 대장균에 사용하도록 최적화되어 있지만 다른 박테리아, 효모 및 포유류 세포를 포함한 다른 시스템에도 사용할 수 있습니다. 배양 준비에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있습니다.

간단히 0.2%글리세롤을 함유한 5ml의 M nine 배지를 준비하고, 메티오닌과 시스틴을 제외한 모든 엘 아미노산을 항생제와 호박 돌연변이가 있는 관심 단백질을 암호화하는 플라스미드로 형질전환된 대장균을 첨가하여 하룻밤 배양을 시작하고, 호박 억제 시스템을 위해 암호화하는 플라스미드를 섭씨 37도에서 배양합니다. 실험 당일, 50 밀리리터의 M nine 배지 및 항생제가 함유된 250 밀리리터 삼각 플라스크에 하룻밤 배양에서 추출한 적절한 양의 세포를 첨가하여 550 나노미터에서 0.03의 광학 밀도를 얻었습니다. 섭씨 37도의 흔들리는 수조에서 배양물을 배양합니다.

배양액이 로그 초기 단계에서 중간 단계에 도달하면 각 배양액에 1몰 벤조일 페닐알라닌 또는 BPA 50마이크로리터를 추가합니다. 침전을 피하기 위해 플라스크를 휘젓는 동안 BPA를 한 번에 한 방울씩 첨가하십시오. 다음으로, 호박색 돌연변이의 발현을 유도하는 데 필요한 유도 인자를 추가합니다.

30분 유도 기간 동안 추가로 30분 동안 섭씨 37도에서 배양물을 계속 배양합니다. 6개의 일회용 15ml 원심분리기 튜브에 시간 지점과 플러스 UV 또는 마이너스 UV를 표시합니다. 라벨이 붙은 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

얼음으로 채워진 두 번째 얼음 양동이 위에 6개의 우물 조직 배양 플레이트를 놓습니다. 라디오 라벨링 5분 전에 UV 램프를 켭니다. 그런 다음 -UV로 표시된 각 튜브와 다중 웰 플레이트의 두 웰에 약 2ml의 얼음을 추가합니다.

얼음을 튜브와 웰로 직접 공기화하여 각 시점에서 세포 내 반응을 즉시 중지하고 30분 유도 기간이 끝날 때 생화학적 경로에 대한 정확한 스냅샷을 얻는 것이 중요합니다. 배양액 25ml를 예열된 125ml의 일회용 삼각 플라스크에 옮깁니다. 플라스크를 섭씨 37도의 흔들리는 수조에 넣습니다.

펄스 추적 라벨링 및 UV 조사의 단계는 적시에 수행해야 하며 상당한 조직과 사전 준비가 필요합니다. S 35 표지된 메티오닌 및 시스테인을 밀리리터당 30 마이크로 퀴리를 배양액에 첨가하고 빠르게 소용돌이쳐 시간에 혼합합니다. 1분 0초.

250마이크로리터의 비방사성 100밀리몰 메티오닌 시스테인 용액을 넣고 빠르게 휘젓습니다. 얼음 피펫이 들어 있는 냉각된 멀티 웰 플레이트의 웰 중 하나에 배양액 4ml를 즉시 피펫으로 혼합하고, 두 번째 4ml 분취액을 0분에서 UV를 뺀 값으로 표시된 15ml 튜브에 혼합합니다. 2분 0초.

배양액 4ml를 얼음이 들어 있는 냉각된 다중 웰 플레이트의 두 번째 웰에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 약 2ml의 얼음에서 5분 시점 직전에 1분 빼기 UV라고 표시된 15ml 튜브에 또 다른 4ml 분취액을 피펫으로 넣어 6분 0초에 걸쳐 멀티 웰 플레이트의 세 번째 웰로 피펫합니다. 얼음 파이프가 들어있는 냉각 멀티 웰 플레이트의 세 번째 웰에 배양액 4 밀리리터를 피펫팅합니다.

5분 마이너스 UV라고 표시된 15밀리리터 튜브에 또 다른 4밀리리터 분취액을 넣었습니다. 예열된 UV 램프 아래에 멀티 웰 플레이트가 있는 얼음 양동이를 놓고 각 샘플을 개별적으로 4분 동안 조사합니다. 세포를 0분과 UV, 1분과 UV 등으로 표시된 냉각된 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 2, 500배 G에서 세포를 원심분리합니다. 각 샘플을 300마이크로리터의 M 9 배지 또는 PBS와 33마이크로리터의 100% 콜드 트리클로로아세트산 또는 TCA에 재현탁하여 단백질을 침전시키고 TCA를 10분 동안 최고 속도로 마이크로 퓨지에서 침전시킵니다. 세이트를 제거하기 전에 각 샘플에 50마이크로리터의 가용화 완충액을 추가하고 섭씨 95도에서 5분 동안 교반하여 가열하여 침전된 단백질을 가용화합니다.

1ml의 방사성 면역침전 분석 버퍼를 첨가한 후, 완충액은 각 시료의 1/5에서 1/2을 사용하여 표준 면역 침전을 수행합니다. 나트륨 ESAL 황산염, 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 SDS 페이지로 면역 침전 단백질을 분해합니다. 마지막으로, 염색 및 건조된 겔을 phospho 스크린에 하룻밤 동안 노출시키고 phospho imager로 가교 결합 제품을 포함한 방사성 단백질을 검출합니다.-특이적 사진 교차 결합은 외막으로 이동하는 동안 ESPP와 상호 작용하는 단백질을 식별하는 데 사용되었습니다.

이 실험을 위해 ESPP 베타 도메인의 잔기 1113 및 1214에서 pH 알라닌 코돈을 호박색 코돈으로 대체했습니다. ESPP 베타 영역의 결정 구조는 두 잔류물이 모두 베타 배럴의 주위 플라즈마 측에 있으며 약 120도 떨어져 있음을 보여줍니다. 두 개의 상이한 폴리펩티드를 C 말단 항 ESPP 및 혈청에 의해 조사된 세포와 대조 세포 모두에서 면역 침전시켰다.

초기에는 공유 결합 된 승객 도메인과 베타 도메인을 포함하는 단백질의 약 135 킬로달톤 전구체 형태가 나중 시점에서 우세했습니다. PRO ESPP의 수준은 감소하고 자유 베타 도메인이 우세해지기 시작했는데, 이는 passenger domain이 외막을 가로질러 trans 위치에 있고 단백질 분해 분열에 의해 beta domain과 분리되었기 때문입니다. 그러나 UV I 방사 샘플은 대조군 샘플에 존재하지 않는 더 높은 분자량 대역을 분명히 가지고 있었습니다.

이러한 밴드는 이러한 폴리펩티드의 이동성을 기반으로 PRO ESPP와 상호 작용하는 단백질의 가교 결합으로 인해 발생하며, 상호 작용하는 단백질의 크기는 알려진 외막 단백질 조립 인자에 해당할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 추정되었습니다. 추정되는 상호작용 파트너에 대해 생성된 항세라(anti-cera)를 사용한 추가적인 면역 침전을 수행하였다. BPA가 잔기 1113 및 1214 모두에 통합되었을 때 관찰된 약 150 킬로달톤 폴리펩티드는 17 킬로달톤 페리 플라즈믹 샤프론 스킵에 대한 항혈청으로 면역 침전될 수 있습니다.

또한, BPA가 두 위치 중 하나에서만 통합되었을 때 관찰된 더 큰 폴리펩티드는 BAM 복합체 소단위체인 BAM B 및 BAM D에 대해 각각 항세라로 면역 침전될 수 있음을 발견했습니다. 이 절차를 수행한 후 가교 생성물을 정제할 수 있으며 질량 분석법을 포함한 다른 방법을 수행하여 관심 단백질과 상호 작용하는 인자를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 비디오로 시청한 후에는 펄스 추적 라벨링과 부위별 사진 교차 연결을 성공적으로 결합하여 살아있는 세포 내부의 다른 분자와 관심 있는 단백질의 상호 작용 역학을 연구하는 방법을 잘 이해해야 합니다.