Name: 에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화 E. 대장균 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: 배우세요 대장균에서 고처리량 발현 스크리닝을 통해 용해도가 높은 융합 단백질을 정량화하고 정화하는 방법을. 자동화된 액체 처리 로봇을 활용하여 이황화 결합이 풍부한 독 단백질의 생산 조건을 최적화할 수 있습니다.

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이 작품은 VENOMICS 프로젝트, 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 건강 2,011에서 2,015 사이)을 통해 278,346 ° 유럽 프로젝트 보​​조금 N에 의해​​ 지원되었다. VENOMICS 프로젝트는 유럽의 여러 연구 기관과 기업 간의 협력입니다 : AFMB, 엑상 프로방스, 마르세유 대학교 (프랑스), CEA 클레 (프랑스), NZYTech (포르투갈), SistemasGenomicos (스페인), 대학 드 리에 주 (벨기에), VenomeTech (프랑스), Vitamib (프랑스), 뉴질랜드 제약 (덴마크) 이 작품은 통합 구조 생물학 (FRISBI) ANR-10-된 InSb-05-01 프랑스의 인프라에 의해 지원되었다. 저자는 또한 비디오의 촬영을위한 준비를 지원 씨 제레미 Turchetto에게 감사의 말씀을 전합니다.

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<li>Marblestone, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SUMO+fusion+technology+with+traditional+gene+fusion+systems%3A+enhanced+expression+and+solubility+with+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).</li>
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<li>Smith, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+fusions+to+glutathione+S-transferase+for+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies.</a> Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).</li>
<li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32(2007).</li>
<li>Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+reducing+pathways+is+not+essential+for+efficient+disulfide+bond+formation+in+the+cytoplasm+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli.</a> Microb Cell Fact. 9, 67(2010).</li>
<li>de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+contributions+in+the+field+of+the+recombinant+expression+of+disulfide+bonded+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria.</a> Microb Cell Fact. 11, 129(2012).</li>
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<li>Braud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+expression+system+suitable+for+high-throughput+fluorescence-based+screening+and+production+of+soluble+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins.</a> Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).</li>
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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

가용성, 접힘, 기능성 단백질의 발현에 대한 하나의 보편적 인 프로토콜이 없습니다. 비용 및 시간 효율적일 여러 대상 작업 대부분의 실험실 또는 단백질 코어 설비 따라서 표적 대부분 수용성 활성 단백질을 얻기 변수 유용한 &#39;일반적인&#39;조합을 찾기 위해 선별 높은 처리량 단백질 발현을 사용하세요. 우리는 이황화 풍부한 펩타이드 및 단백질 11의 수용성 발현에 일반적으로 적용 융합 파트너 것으로 DsbC을 발견했습니다. DsbC 융합 및 높은 처리량 방법을 사용하여, 주 내에서 여러 대상의 가용성 식 (11)을 관찰 할 수있는 다음과 같은 소개에서 논의 된 것과 같은 추가적인 변수는 더 최적화가 필요한 대상에 대한 후속 라운드에서 상영 할 수있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 이황화 풍부한 단백질과 펩타이드의 발현을 목표로하고 있습니다. 그러나, 사용자의 특급하고자하는높은 처리량 방식으로 RESS 비 그물 단백질은 해당 프로토콜은 이전에 발표 된 다른 곳에서 (22, 24)을 발견 할 수있다. 높은 처리량 설정이 용해 식 또는 동시에 여러 표적 유전자에 대한 (다양한 융합 태그 포함) 식 구조의 많은 수의 검사에 대한 다른 많은 단백질의 심사를 포함하여 응용 프로그램의 수, (이상적입니다 또는 여러 식은 성공률을 향상시키기 위해 단일 ​​대상)에 대한 구성한다. 이 플랫폼은 또한 대상의 많은 수의 새로운 프로토콜의 벤치마킹 및 유효성 검사에 사용할 수 있습니다. 다른 응용 프로그램은 하나의 어려운 대상에 대한 변형 검사, 예를 들어, 모든 orthologs 또는 같은 가족의 구성원, 또는 실험에서 단일 대상의 돌연변이의 패널 생산의 성공을 테스트 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 공동 발현 벡터 (위트와 조합하여 사용되어왔다H의 하나는 아래로 당겨 올바른 복합체 형성과 화학 양론 (33)를 확인하기 위해보다 철저한 생물 물리학 적 분석에 의해 다음에 단백질 - 단백질 복합체의 예비 특성을 허용하는) 유일한 단백질을 태그. 정제 된 단백질의 양은 마이크로 분석법 (기능 시험, 단백질-DNA (34) 또는 단백질 - 단백질 상호 작용 분석) 때로는 적합하다. 높은 처리량 발현 스크리닝 전략 몇 가지 장점이있다 : (ⅰ) 대상의 다수를 테스트 할 수있는 능력 또는 번의 ​​실험에서 많은 변수, (ⅱ) 제한된 배치 별 편차, (ⅲ)는 단순하고 (V) 자동화를위한 잠재력 및 추적 (VI) 단순, 더 큰 규모로 깊은 우물, (IV) 확장 성 및 재현성을 사용하여 작은 규모에서 일하는 개별 튜브 (레테르를 붙이기, 이하 취급하지의 용이성 ) 혼합 개별 튜브의 취급보다 플레이트 형식을 사용하거나 클론의 교환 할 때 도입 실수. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 프로토콜 절에서 논의되지 않지만, 아래에서 간략하게 설명되는 실험의 준비를위한 몇 가지 중요한 고려 사항이있다. 논의에 대한 더 많은 우리의 이전 출판 (24)를 참조하십시오. 최대 효율성을 위해, 그것은 대상의 다수의 하위 복제를 단순화하기 위해, 높은 처리량 복제에 적합한 시스템을 가지고 도움이됩니다. VENOMICS 프로젝트의 초기 단계를 위해, 우리는 일주일에 클론의 수백의 속도로 모든 대상 벡터에 서브 클로닝을 허용하는 다양한 게이트웨이 재조합 시스템 (25)을 사용한다. 게이트웨이 재조합 복제에 대한 프로토콜은 인비 트 로젠의 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다. 높은 처리량 복제에 대한 다른 대안은 37 복제 내고 독립적 인 복제 (LIC) (35, 36)과 제한없는 (RF) 등이 있습니다. 항목 클론 컬렉션에서, 주형 DNA에서 PCR에 의해 포함, 표현의 대상 유전자를 얻기 위해 여러 가지 방법이 있습니다 또는VENOMICS 프로젝트를 위해 선택한 전략 합성 유전자,. 합성 유전자는 유전자 및 유전자 합성의 각 끝에 재결합 사이트로 주문할 수 있습니다 표적 유전자 서열의 쉬운 코돈 최적화 (희귀 대장균 코돈을 제외 할) 수 있습니다. 이 권장되지만 필수되지 않습니다. 희귀 코돈의 높은 숫자, 로제 2 (매우 대장균에서 발현되지 않는 희귀 코돈에 tRNA에 탑재) (DE3) pLysS를을 포함 코돈 최적화하지 않고 대상의 BL21 (DE3) pLysS를보다 더 적합 할 수있다. 세포질의 일반적으로 감소 환경에서 이황화 결합의 감소를 제한하는 것이 가능한 변종이 있지만, 우리 손에 그들은 일반 E.만큼 성공하지 않은 콜라이 11 균주. 분석 규모의 친화력 정화는 수용성 융합 단백질을 복구하고 수율을 정량화하기 위해 테스트 식의 문화에서 수행됩니다. 정량적 데이터는 일에 얻을 수있다문화가 100 ㎎ / L - 0.1의 범위로 표현되는 융합 단백질의 전자 수용성 수율. 대상이 용해되지 않으면 다른 융합 파트너를 추구하기 전에, 다른 표현과 유도 온도, 변형 또는 매체를 테스트 할 수 있습니다. 이황화 풍부한 단백질의 수용성 발현을 위해, 우리는 이전에 세포질 식 11 DsbC&gt; DSBA&gt; GST&gt; MBP&gt; TRX는&gt; HIS 태그로 융합 파트너의 효과를 평가했다. 세포질 표현은 이황화 풍부한 대상의 성공 접는 도움을 수있는 또 다른 가능성이다. 주변 세포질 세포질보다 덜 감소 환경 및 이황화 결합을 지원하기 위해 유용한 산화 환원 보호자를 포함한다. DsbC, DSBA 및 MBP 단백질은 일반적으로 자신의 주변 세포질 신호 서열에 의해 세포질로 지역화됩니다. 이 폴딩을 지원하기 위해 주변 세포질 공간 이황화 풍부한 대상을 지시하는 이러한 태그를 악용 할 수있는 기회를 제공합니다. 난치성 목표 들어, 다음 단계는 P로 될(이것은이 프로토콜의 범위를 벗어난 것으로 여기에 3 구를 논의하지 않을 것이다) 용해 및 접힘, 봉입체에서 불용성 HIS-태그 목표를 urify. 이것은 단지 하나 또는 두 개의 디설파이드 결합을 갖는 대상에 대해 매우 간단하지만, 이황화 결합의 수가 증가함에 따라 점점 더 어려워지고있다. 다른 방법으로, 특히 네 개 이상의 이황화 결합과 단백질 및 펩티드, 그것은 효모, 곤충이나 포유류의 표현으로 복잡한 생산 시스템을 시도 도움이 될 수 있습니다. 소형화 및 자동화의 발전과 함께, HTP의 전기 생리학 실험실 - 온 - 칩 기술 (28)는 의심 할 여지없이 기능 분석을위한 미래의 방법이 될 것입니다. 우리는 (아마도 구조적 연구 제외)이 대규모 배양의 필요성을 부정한다 대부분의 목적을 위해 그것을 직시. 작은 규모의 문화 표현의 조건을 심사하는 데 유용 할뿐만 아니라, SUF를 제공 할 수있을 것뿐만 아니라ficient이 소형화 기능 분석을위한 시료의 양은. 기능적 특성화를 위해 충분한 양으로 평행하게 복수의 타겟을 생산하는 능력이 배양 및 플랫폼의 이러한 종류를 사용하여 비용을 절감하고, 재조합 단백질의 발현 및 특성화 추가 비용 및 시간 효율적인해질 것이다. 프로토콜은 여기에 FP7 유럽 VENOMICS 프로젝트의 초기 단계에서 이황화 풍부한 펩타이드와 단백질의 발현에 적용되었습니다. 독은 종종 흥미로운 약물 가능성이 생리 활성 펩타이드의 훌륭한 소스입니다. 그러나, 그들의 생산 인해 복잡한 이황화 결합 패턴과 작은 크기에 도전합니다. 본원에 기술 된 것과 같은 고 처리량의 플랫폼을 사용하여, 프로젝트 VENOMICS 자연에서 볼 다양성을 재현하기 만 신규 독 펩티드 라이브러리를 생성하는 것을 목표로하고있다. 이 라이브러리는 이황화-R의 특성을 위해 이용 될 것입니다신약 개발을 목표로 잠재적 인 약물이나 치료 응용 프로그램과 무형 문화 유산 펩티드. 이 플랫폼은 현재 VENOMICS의 프로젝트에서 사용하기 위해 새로운 프로토콜을 벤치마킹하고 유효성을 검사하는 데 사용하고있다.

유전체학의 발전과 새로운 단백질의 발견의 빠른 속도에 의해 동기 부여, 높은 처리량의 파이프 라인 검사 및 최적의 단백질 생산 전략의 식별을위한 전통적인 접근 방식을 병렬 처리하기 위해 개발되었습니다. 최적화 될 가능성이 변수는 다른 표정이 대상이 샤페론 14,15 함께 5, 융합 파트너 6-13 공동 발현을 변형, 1,2, 3,4 온도, 미디어 2,3 균주 세포질, 포함 하나 이에 한정되지 않는다 또는 세포질 표현 16-18, 정제 버퍼 구성 요소 3. 배치 별 편차를 제한하면서, 높은 처리 방법, 다양한 변수 또는 여러 표적 높은 수준의 효율성과 병렬로 테스트 할 수있는 구현을 따라. 우리의 경험, 전략은 동일한 문화 (온도, 미디어, 통풍 등), 정제 조건 (같은 집용을 사용하여 규모 확대에 따라 재현성을 제공합니다N, 완충제 등). 여러 높은 처리량 플랫폼, 즉 같은 융합 파트너, 표현의 변종 또는 온도 19 ~ 23 등 다양한 매개 변수를 통해, 수용성 단백질 발현을위한 조건을 식별하기 위해 지난 10 년간 사용되어왔다. 우리는 최근에 용해 이황화 풍부한 단백질 11의 발현에 대한 우리의 높은 처리량 검사 방법을 사용했다. 선택된 단백질은 악의에 찬 소스에서뿐만 아니라이었다, 또한 식물, 돼지, 소와 인간을 포함한 종의 넓은 범위에서 이황화 풍부한 효소 억제제가 포함되어 있습니다. 실험은 12 다른 융합 파트너 및 28 이황화 망상 단백질의 용해도 및 폴딩에 3 개의 다른 발현 균주의 효과를 비교했다. 우리는 스트레인 BL21의 생산을위한 융합 파트너 (DE3)로 DsbC를 사용 pLysS를 크게 outproduced (얻은 수용성 단백질의 수율과 수 모두에서) 긴장과 융합의 다른 조합이 11 테스트 것을 보여 주었다.이 실험의 결과는 이황화 풍부한 표적 발현 더 적합 하나에 (단백질의 넓은 범위의 발현 스크리닝에 사용되었다) 오리지널 일반 높은 처리 파이프 라인 (22, 24)를 적응시키기위한 기초를 형성했다. 동물의 독에서 이황화 풍부한 단백질은 특별한 관심입니다. 독은 약리 및 치료 적으로 잠재적 인 가치로, 생리 활성 펩타이드와 단백질의 복잡한 혼합물이다. 그러나, 이황화 결합을 포함하는 단백질의 발현은 간단하지 않습니다. 이 단백질은 일반적으로 일곱 이황화 결합을 하나 사이에 포함하고 활성화하기 위해 올바른 이황화 결합 패턴과 산화해야합니다. 현재 플랫폼은 FP7 유럽 VENOMICS 프로젝트 (www.venomics.eu)의 일부로 이황화 풍부한 동물 독 많은 단백질의 발현을 심사 및 대상의 수천의 높은 처리량의 표현에 대한 새로운 프로토콜을 벤치마킹하는 데 사용되는 . 여기서, 자동화 된 방법높은 처리량 소규모 발현 검사 및 정화 (그림 1 참조)에 제공된다 이황화 풍부한하는 동물 독 단백질을 적용했다. 이황화 풍부한 펩타이드 및 단백질에 대한 전략은 표적 단백질을 분해 될 HIS-DsbC 융합을 만드는 정화 및 산화 환원 활성 융합 파트너, DsbC위한 HIS 태그를, (그림 2 참조)를 사용합니다. 프로토콜의 초점은 본원 액체 핸들링 로봇과 HTP 전기 영동을 사용하여 자동화 있지만, 이들 방법은 기본 설정과 심지어 연구소 고가의 장비에 대한 전제 조건없이 프로토콜을 활용할 수 있다는 것을 의미 또한 높은 처리량 수동 방식에 적합 . 정제 및 분석 (이황화 풍부한 단백질에 특정하지 않음)로 변환을위한 수동 프로토콜은 다른 곳에서 24 게시 된 여기 반복하지 않는다. 재조합에 의해 생성 된 표현 클론의 수동 절차의 처리량 (,수용성 단백질 수준의 분석에 국가 복제 25) SDS-PAGE 감지) 또는 384 (4 X 96을 사용하여 (96이다 (그림 1 참조)) 주 문화를 점 오점 및 SDS-PAGE (26)를 사용하여. (예 캘리퍼스 GXII LabChip 시스템 (22)과 같이, 액체 핸들링 로봇 (26) 및 도트 블롯 또는 HTP 전기 영동을 사용하여 반자동 방식으로 수행 경우에 증가 될 수있다 여기에 설명 된대로 일주에 병렬로 최대 1,152 (12 × 96) 문화에 대한 결과)의 분석. 일정한 진탕 인큐베이터 충분한 통기 짧은 궤도 고속 진탕 배양기의 사용을 필요로 96 (DW96) 포맷 (진탕 디프 웰에서 성장 배양 달리 사용될 수 있도록 배양은 디프 웰 24 (DW24) 형식으로 수행 800 rpm에서). 자동 유도 매체 (27)의 사용은 또한 수동 유도 단계를 제거 식을 단순화한다. 연구소는 이미 사전 정의 된 표현과 푸리를 사용하는 경우에도문법을 없애는 조건, 이들은 단순히 효율을 향상시키기 위해 본 HTP 시스템으로 직접 전달 될 수있다. 이황화 풍부한 단백질에 대한 높은 처리량 스크리닝 파이프 라인의 상세한 회로도는도 3에 제공된다. 파이프 라인의 파라미터주세요 단백질 생산을위한 가장 유용한 조건을 선택하도록 허용 광범위한 스크리닝 실험 11, 22에 기초하여 선택 하였다. 특성은 샘플의 마이크로 그램 수십 충분한, 또는 민감한 기능 분석 및 결합 분석 (예를 들어, 낮은 볼륨 HTP 패치 클램프 시스템 28)을위한 것입니다 파일럿 연구에서 작은 규모의 표현에서 직접 정제 태그 단백질에서 수행 할 수 있습니다. 동일도 태그와 프로테아제 (역상 HPLC에 의해, 예를 들어) 제거 제공, 벽개 후에 태그가 대상에 수행 될 수있다. 품질 관리도 (예상 크기 및 산화 성을 확인하기 위하여 질량 분석계에 의해 수행 될 수있다ATE) 또는 크로마토 그래피 방법은 () 29 순도 이질성을 확인합니다. 때로는 분열 (특히 난 용성 단백질 30, 31에 대한) 불필요한 또는 바람직하지 않은 태그를, 그래서이 프로토콜의 분열에 선택 사항입니다. 에 관계없이, 모든 구조에 직접 (그림 2 및 토론 참조) 절단 후 기본 단백질을 생산하는 표적 유전자를 이전 TEV 단백질 분해 효소 절단 부위 (ENLYFQ / [G] 32)이있다. 융합 태그의 절단을 원하는 경우, 절단 효율을 분석하기 위해 작은 규모 (용출 분획 또는 &#39;열&#39;) 시험 할 수 있으며, 이후의 스케일 업 실험 수율 신뢰성 추정치를 요구하고 구하는 경우의 조건을 최적화한다. 친 화성 정제시 사용하는 구슬의 볼륨에 대한 두 가지 옵션이 실험의 목적과 기대에 따라이 있습니다. (파일럿 또는 MS 분석을 위해 정제 또는 extrapol 극력 단백질을 포착 할 수있는) 스케일 업 수율 먹은 수지의 200 μL의 최종 볼륨이 시스템의 포화 전에 ~ 100 ㎎ / L 문화의 범위에서 가용성 단백질의 검출을 허용, 사용되어야한다) 제 8.1 (프로토콜 (A 참조) . 실험의 목적은 수용성 단백질의 낮은 양의 검출 된 경우에는, 그 후에 수지의 50 μL의 최종 부피는 (B (프로토콜 참조 0.1-25 ㎎ / L 배양의 범위에서 가용성 단백질의 검출을 가능하게 적합 ) 8.2 절에). 필요한 경우 생산 수용성 발현을 확인 조건을 사용하여 더 구조 및 기능 연구에 정제 대상 밀리그램 수량을 얻기 위해, 확장 할 수 있습니다. AFMB에서 사용 스케일 업 프로토콜의 세부 사항은 다른 곳에서 (22, 24) 논의되었다. 실험 설정, 프로토콜 내에서 중요한 단계에 관련된 더 자세한 사항은, 수정 및 문제 해결 및 기술의 한계는 디스크에 제공된다ussion. 실험을 시작하기 전에 설명을 읽어 보시기 바랍니다. 우리는 각 단계에서 90 %의 성공률을 기대할 프로토콜 걸쳐 (예를 들어, 문화의 적어도 90 %는 임의의 소정 단계에 성장한다). 실험의 모든 단계의 성공율이 90 % 아래로 떨어지면 샘플은 폐기되고, 실험은 구조물의 전체 컬렉션에 대해 반복된다. 이것은 시험 단백질에 매우 의존적 일 것이다 그러나이 성공률 등 수용성 단백질 또는 100 %의 효율로 절단 구조의 비율을 표현하는 구문의 수에 적용 할 수 없다. 로봇의 작업 테이블의 셋업에 대한 특정 세부 사항은 다른 작업대 셋업에 필요한 그러나 그들이 적용 할 수있다, (또한 그림 4 참조) 각 프로토콜에 제공됩니다. 로봇 하드웨어 (테칸)는 96 채널 팔 (MCA96), 로봇 매니퓰레이터 (로마) 및 8 채널 액체 처리 헤드 (구성LIHA). MCA96를 사용하는 모든 단계는 LIHA이 단계 사이에 세척 할 필요가 있기 때문에 그들이 오래 걸릴 것이다 MCA96를 사용할 수없는 경우 LIHA를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 로봇이 기술적으로 무균 환경은 아니지만, 항생제를 포함하는 것이 일반적으로 오염이나 불임에 문제가되지 않도록합니다.

<table><tbody><tr><td>Tecan Freedom EVO 200 액체 취급 로봇</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td></td><td>프로토콜은 플레이트용 진공 매니폴드가 있는 모든 액체 핸들링 로봇에 적용할 수 있습니다. http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8</td></tr><tr><td>96-well PCR(PCR96) 플레이트</td>, <td>Greiner Bio-One</td><td>652270</td><td>http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/</td></tr> <tr><td>LB 매체</td><td></td><td></td>, <td>멸균을 위한 오토클레이브.</td></tr><tr><td>항생제 재고</td><td></td><td></td><td>카나마이신(50mg/ml), 암피실린(100mg/ml), 클로람페니콜(에탄올 중 34mg/ml), 재고 저장 &마이너스; 20 &deg;C. 1:1,000 희석액을 사용합니다.</td></tr><tr><td>2.42ml 용량 용량의 Deep-well 96(DW96) 플레이트</td>: <td>Greiner Bio-One</td><td>780270</td><td>무균을 위한 오토클레이브. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td></tr> <tr><td>Expression vectors</td><td></td><td></td><td>타겟 구조체의 발현을 위해. &마이너스에 저장; 20 &deg;C.</td></tr><tr><td>BL21 (DE3) pLysS 수용 세포</td><td></td><td></td><td>또는 사용자가 선택한 대체 E. coli 발현 균주. &마이너스에 저장; 80 &deg;C.</td></tr><tr><td>Breathseal 통기성 접착 필름</td><td>Greiner Bio-One</td><td>676050</td><td></td></tr><tr><td>PCR 기계, 96웰 플레이트 블록</td><td></td><td></td>, <td>SDS-PAGE/캘리퍼스 샘플의 변형, 열충격 및 끓는용.</td></tr><tr><td>24웰 멸균 조직 배양 플레이트</td>: <td>Greiner Bio-One</td><td>662165</td><td>http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td></tr> <tr><td>LB-한천</td><td></td><td></td>, <td>멸균을 위해 오토클레이브.</td></tr><tr><td>200 &뮤; l 메마른 처분할 수 있는 끝</td><td>Tecan 그룹 주식 회사.</td><td>30 038 617</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Multitron 진탕 인큐베이터, 3mm 투사</td><td>인포스터</td><td>AJ103</td><td>필수는 아니며 일반 진탕 인큐베이터도 사용할 수 있습니다. http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td></tr> <tr><td>Plate 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtiter 플레이트</td><td></td><td></td><td>정제 프로토콜 B를 사용한 글리세롤 스톡 및 용출용.</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td></td><td></td><td>: 글리세롤 스톡의 제조를 위해.</td></tr><tr><td>200 &뮤; l 일회용 팁</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 038 616</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>접착 테이프 패드&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>19570</td><td>http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td></tr><tr><td>Bactinyl</td><td>Orapi 그룹</td><td></td><td>또는 이에 상응하는 미생물 소독제.</td></tr><tr><td>ZYP-5052 매체</td><td></td><td></td><td>구성 요소 레시피는 표 1을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>딥 웰 24 (DW24) 플레이트, 10 ml 용량</td><td>Whatman</td><td>7701-5102</td><td>멸균을 위해 오토클레이브. http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td></tr><tr><td>바닥이 평평한 투명 마이크로타이터 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>흡광도 판독용. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td></tr> <tr><td>플레이트 판독 분광 광도계</td><td></td><td></td><td>선택적. 문화권의 OD600를 측정합니다.</td></tr><tr><td>깊은 우물 플레이트를 위한 로터가 있는 원심분리기&nbsp;</td><td></td><td></td><td>3,800 x g에 적합합니다.</td></tr><tr><td>물에 있는 Lysozyme</td><td></td><td></td><td>50 mg/ml. &마이너스에 저장; 20 &deg;C.</td></tr><tr><td>이미다졸 ACS 등급</td><td>Merck</td><td>IX0005-1</td><td>단백질 수율 계산을 위한 A280 판독값을 방해하지 않도록 고품질 등급의 이미다졸을 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>용해 완충액</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 0.25 mg/ml 라이소자임을 함유하는 10 mM 이미다졸 pH 8 (또는 선호하는 완충액). 매번 재고에서 리조자임을 추가하고 장기간 보관하지 마십시오.</td></tr><tr><td>수조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플레이트 초음파 발생기 (초음파 프로세서 XL, 딥 웰 플레이트에 적합)</td><td>Misonix Inc.</td><td></td><td>필수는 아닙니다. 라이소자임만으로도 일반적으로 거의 완전한 용해에 충분합니다.</td></tr><tr><td>DNase&nbsp;</td><td></td><td></td><td>물에 2 mg/ml 스톡, 살균 필터. 부분 표본을 &-inus에 저장하십시오. 20 &deg;C.</td></tr><tr><td>황산 마그네슘 (MgSO4)</td><td></td><td></td><td>2 M 스톡 (수중), 오토클레이브.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE 또는 캘리퍼 샘플 버퍼&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>결합 완충액</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸 pH 8 (또는 선호하는 완충액). 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>세척 완충액</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM 이미다졸 pH 8 (또는 선호하는 완충액). 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>용리 완충액</td><td></td><td></td><td>50mM Tris, 300mM NaCl, 250mM 이미다졸 pH 8(또는 선호하는 완충액). 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>96-웰 리시버/필터 플레이트 20 &마이크로; m, 1.8 ml 용량</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740686.4</td><td>http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td></tr><tr><td>200 &mu; l 처분할 수 있는 넓은 구멍 끝</td><td>Tecan 그룹 주식 회사.</td><td>30 050 348</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow resin</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-02</td><td>표적 융합 단백질의 정제용. 4°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 세척하고 평형을 유지하십시오. http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td></tr><tr><td>담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제</td><td></td><td></td><td>선택 사항, 절단용. 2mg/ml, 보관 버퍼에 환원제 없음. &마이너스에 저장; 80 &deg;C.</td></tr><tr><td>96-웰 0.22 &마이크로; m 필터 플레이트</td><td>Millipore</td><td>MSGV N22 10</td><td>옵션. 절단 후 용해성 분획을 필터링하려면 http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td></tr><tr><td>SDS-PAGE/dot blot 장비 또는 Caliper Labchip GXII 장비</td><td></td><td></td><td>전기영동 장치 및 겔 유형 선택은 사용자의 몫입니다. 의 재량권.</td></tr><tr><td>분광 광도계 및 큐벳</td><td></td><td></td><td>280nm(A280)에서 흡광도를 측정하여 용해성 단백질의 수율을 계산합니다. 캘리퍼에서 해석이 수행되는 경우에는 필요하지 않습니다.</td></tr><tr><td>ZipTip 피펫 팁</td><td>Millipore</td><td></td><td>옵션. ZipTip의 유형은 사용자의 재량에 따라 다릅니다. C4 수지는 더 큰 단백질에 사용해야 하고 펩타이드에는 C18이 더 좋을 수 있습니다. 추가 품질 관리 전에 샘플을 세척하기 위해 샘플의 탈염을 위한 대체 방법을 사용할 수도 있습니다. http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0</td></tr><tr><td colspan="4">재료는 프로토콜 섹션에서 필요한 순서대로 나열되어 있습니다. 시약은 달리 명시되지 않는 한 실온에서 보관할 수 있습니다. 작성자에 대한 참조 번호' 선호하는 재료 선택이 제공되지만 동등한 제품도 적합할 수 있습니다. 브랜드가 실험 결과에 영향을 미치지 않는 시약의 경우 회사 세부 정보가 생략되었습니다.</td></tr></tbody></table>

에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화<em&gt; e. 대장균</em

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

대장균 (E. 콜라이)는 구조적 및 기능적 연구에 대한 재조합 단백질의 생산에 널리 이용되는 발현 시스템이다. 많은 단백질이 불용성 형태로 표현하기 때문에, 단백질을 정제하는 것은 때때로 도전이다. 어렵거나 여러 대상으로 작업 할 때 그것은 따라서 신속하게 용해 식의 조건을 식별하기 위해 높은 처리량 (HTP) 작은 규모의 단백질 발현 검사 (1-4 ml의 문화)를 사용하는 것이 좋습니다. 실험실의 다양한 구조 유전체학 프로그램 (재조합 단백질의 0.1 ~ 100 ㎎ / L 문화의 범위 내) 양적 HTP 단백질 발현 검사 프로토콜이 단백질의 수천에 구현하고 검증 된 대처하기. 프로토콜은 액체 핸들링 로봇을 이용하여 자동화 된뿐만 아니라 특수 장비없이 수동으로 수행 될 수있다. 이황화 풍부한 독 단백질 얻고있다치료 약물 리드로 자신의 잠재력에 대한 인식을 증가시킨다. 그들은 매우 유력한 선택이 될 수 있지만, 자신의 복잡한 이황화 결합 네트워크는 생산에 도전합니다. FP7 유럽 Venomics 프로젝트 (의 일원으로서 <a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a> ), 우리의 도전은 기능적인 특성에 대한 새로운 독 단백질의 수천을 생산을 목표로 생산 성공 전략을 개발하는 것입니다. 이황화 결합의 이성화 DsbC의 산화 환원 특성에 힘 입어 우리는 E.의 산화, 기능 독 펩타이드의 발현을위한 우리의 HTP의 제작 파이프 라인을 적용 대장균 세포질. 프로토콜은 또한 다양한 디술 풍부한 단백질의 생산에 적용될 수있다. 여기에서 우리는 우리의 파이프 라인은 동물의 독 단백질의 생산에 적용 보여줍니다. 프로토콜이 여기에 설명으로는 수용성 이황화 풍부한 단백질이 일주일에 한 작은 얻을 수 가능성이 높습니다. 비록 작은 스케일에서 회를 사용할 가능성이있다전자 파일럿 연구에서, 또는 민감한 마이크로 분석을위한 특성화, 질량 분석에 의해 산화 상태의 유효성을 검사하는 단백질을 정제.

대표 결과 VENOMICS 파이프 라인 96 이황화 풍부한 단백질의 발현 검사는 그림 6에 나타나있다. 단백질은 다음 잔류 수를 증가 이황화 결합의 증가로 배치되어있다. 펩티드는 HIS 태그와 DsbC 융합 파트너와 세포질에서 발현되었다. 추천하는 배양 조건을 사용하는 경우, (12)의 OD (600)은 일반적으로 달성된다. 펩티드 니켈 친 화성 수지의 50 μL의 최종 부피로 8.2-프로토콜 B를 사용하여 정제하고, 이렇게 ~ 25 ㎎ / L 융합 단백질의 최대는이 실험에서 검출 될 수있다. 도 6a는 캘리퍼스 LabChip 시스템 (절단 전에 융해를 나타내는) 및 융합 단백질 ㎎ / L 배양에서 수득 외삽에 근거 채점 시스템 (0.1-2 ㎎ / L 문화 수준에서, 2 행에서 전기 영동 결과를 나타낸다 10 ㎎ / L 문화, 10 25 ㎎ / L의 문화와 더<html> T가 검출.) 예상대로 절단 DsbC 태그는 일반적으로 오히려 27 kDa의 것보다 약 32 kDa의에서 실행합니다. 마찬가지로, DsbC 융합은 예상보다 높은 약 5 kDa의를 실행합니다. 대상의 많은 우리는 그대로 융합 (상위 대역)을 참조하십시오뿐만 아니라, 융합 파트너는 혼자 (낮은 대역). 이러한 대상의 일부에 대한 배양 조건을 최적화하는 것은 단독 DsbC 최종 수율 증가를 허용 비교 그대로 융합 (상측 대역)의 비율을 향상시킬 수있다. 스코어링은 그대로 융합 수준에 기초한다. 16 96 중 단백질의 융합 수준에서 감지 할 수 없습니다. 이 83 %의 전반적인 성공의 수준에 해당합니다. 감지 할 수있는 80 단백질이 45 2 ㎎ / L의 문화 (56 %)보다 높은 수준에서 검출되었다. (이 예에서 프로토콜 8.2 B ~ 25 ㎎ / L 융합 단백질의 최대 검출 할 수를 사용하더라도) 타겟과의 융합에 따라, 단백질 수율은 2-100 ㎎ / L 배양의 범위에서 일반적이다. t &quot;&gt; 현재 이황화 결합의 수 (그림 (b) 참조)에 의해 성공의 분석은 가장 낮은 성공 수준이 6 이황을 포함하는 대상에 대해 66 %되는, (1과 7 사이) 테스트 이황화 결합의 모든 숫자에 대한 합리적인 성공을 보여줍니다 채권. 등전점 및 잔기의 수 (도 6c에 도시 됨)에 기초하여 식 성공의 분포의 분석은 모두 성공적으로 표현 대상 및 플롯에 걸쳐 흩어져 검출되지 않았다 대상으로, 그 기술에 대한 특정한 바이어스를 보여주지 않는다. 도 6d는 DTT와 함께 샘플의 환원 전후, 단일 목표에 대한 전기 분무 이온화 질량 분석 (ESI-MS)로부터 얻어지는 질량 분석 결과의 예를 나타낸다. 일반적으로, 이러한 소모적 질량 분광법 분석 그러나 철저한 demonstratio의 목적으로, (a 감소 시료를 분석 할 필요가없는 것)을 수행 할 필요가 없을 것N 우리는 결과를 모두 보여 주었다. 표시 대상은 4 이황화 결합과 5.7 kDa의 이황화 풍부한 독 단백질이다. 왼쪽의 스펙트럼은 추가 개입없이 분열과 탈염 후되면서, 이전의 DTT로 감소 단백질에 대한 결과를 보여줍니다. 우측의 스펙트럼은 어떤 과잉 DTT를 제거하는 탈염 하였다 DTT와 함께 환원 후에 단백질을 나타낸다. 실험 대중에 해당하는 이온이 각 이온의 스펙트럼 지정에 화살표로 표시됩니다은 녹색으로 표시됩니다. 이러한 이온에 대해 계산 된 실험 부모의 대중 (단백질에 대한 이전의 감소 (- DTT)와 감소 (+ DTT) 후) 표에 표시됩니다. 대중 8 다의 질량 차이를 나타낸다 (이전의 감소 및 감소 된 샘플 5717.6 다에 샘플 5709.6 다). 둘 다의 질량의 차이는, 1 산화 이황화 결합의 존재에 대응한다 (예상대로) 따라서 8 다의 질량의 차이는 4 이황화 결합의 존재를 나타내는 소재비 - 환원 샘플. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" /> 설명 반자동 장비 높은 처리량 식 검사 프로토콜의 그림 1. 도식 표현.이 프로토콜을 사용하여, 96-384 조건 수동 방법을 사용하여 한 주에 한 사람에 의해 테스트 할 수 있으며, 최대 1,152 조건. 발현 플라스미드는 수많은 표적 한번에 서브 클로닝 될 수 있도록 재조합 클로닝 기술을 사용하여 구성된다. 일단 수용성 발현 조건이 식별되었으며 수행 단리는, 원하는 경우, 단백질은 산화 및 순도, microassays 및 / 또는 대규모 생산을 확인하는 품질 관리를 진행할 수있다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" wiDTH = &quot;500&quot;/&gt; 그림 2. 보편적 인 재조합 복제에 대한 회로도 및 디자인을 구성합니다. 대상 항목 클론에서 여러 발현 벡터는 높은 처리량 패션 (주에서 최대 6 × 96 항목 클론)에서 하나의 실험에서 하위 복제 할 수 있습니다. 발현 된 단백질은 니켈 친화 정제 HIS 태그를 인코딩합니다. DsbC (세포질 표현의 세포질 신호 순서가 결여) 융합 파트너는 용해도 및 / 또는 원조 폴딩 및 표적 단백질의 정확한 산화를 증가하는 데 사용됩니다. 태그 분해가 필요한 경우 대상 코딩 시퀀스는 N-말단 TEV 단백질 분해 효소 사이트 (ENLYFQ)를 포함해야합니다. 왼쪽 상단 삽입 된 PCR 또는 유전자 합성에 의해 얻을 수있다 도너 벡터와 표적 서열을 사용하여 엔트리 클론의 생성을 보여준다. 항목 클론은 상업 항목 클론 컬렉션에서 얻을 수 있습니다. 여러 재조합 복제 시스템을 사용할 수 있습니다,하지만 우리는 게이트웨이 Syste의에게 사용m, 회로도와 같이. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" /> 여러 이황화 풍부한 대상에 대해 그림 3. 높은 처리량 검사 파이프 라인. 대상은 처음 BL21 (DE3) pLysS를 E.의 세포질에있는 HIS-DsbC 융합으로 표현된다 자동 유도 매체 (ZYP-5052)를 사용하여 17분의 37 ° C에서 대장균. 정화는 HTP 전기 (또는 점 오점 / SDS-PAGE로)에 의해 용해 구조의 검출 다음 니켈 수지에서 수행됩니다. 식 검사의 첫 번째 라운드가 실패하면 다른 배양 조건이 시도됩니다. 구문이 충분히 높은 수율, microassays 및 품질 관리에 가용성 단백질을 생산하는 경우 수행 될 수 있고 필요한 경우, 대규모 생산은 추구 될 수있다. 수용성 수익률이 충분히 높지 않다 대상의 표현 검사는 다른 스트라를 계속할 수 있습니다인 다음 온도 다른 융합 파트너 및 주변 세포질 식입니다. 선택 단계가 점선 상자로 표시됩니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" /> HTP 플랫폼에 대한 그림 4. 로봇 작업대 설치. 다른 작업 테이블도 사용할 수 있지만 우리의 액체 처리 로봇 작업대의 배치가 표시됩니다 가능한 동등한 사이트가 제공했다. 설정은 (8 - 채널 액체 처리 헤드 (LIHA)), 4 개의 위치를​​ 가진 두 개의 마이크로 캐리어 각 (MP4, 1-4과 5-8를 배치), 2 위치와 진공 스테이션 세척 스테이션 (WS)로 구성 캐리어에게 (테 - 셰이커 14-15과 16-17을 배치) 2 위치를 가진 두 개의 플레이트 뜨는 각각 3 위치와 마이크로 캐리어 (MP3가, 11 ~ 13를 배치), (테 - 진공 청소기, 9, 10 배치) 및 3 위치를 가진 처분 할 수있는 팁 (DITI, 18 ~ 20를 배치). 또다시 두 호텔 깊은 웰 플레이트에 대한 사업자와 (도시하지 않음) 마이크로 플레이트에 대한 하나입니다. 액체 처리 로봇에 설치되어있는 하드웨어는 처분 할 수있는 끝, 주변에 접시 / 장비를 이동 고정 팁 8 채널 액체 처리 헤드 (LIHA)와 로봇 매니퓰레이터 (로마)와 함께 사용하기위한 96 채널 팔 (MCA96)입니다 작업대. 위치의 번호는 프로토콜에 걸쳐이라고합니다. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" /> 그림 5. 4 개의 24 웰 플레이트에 하나 96 - 웰 플레이트에서 전송하기위한 개략도. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" /> 그림 6. 대표 결과는 96 이황화 풍부한 독 프로의 발현 화면에 표시됩니다teins. 단백질이 세포질에있는 HIS-DsbC 융합으로 표현하고 니켈 수지의 50 μL (프로토콜 8.2-B)를 사용하여 정제 하였다. A) 식 심사 결과, 가상 젤을 보여주는 식 수율 득점. 가상 젤의 대비가 매우 희미하거나 강렬한 밴드를 보상하기 위해 차선에 차선 조정되었습니다. 어떤 대상에 대해 두 밴드가 상위 대역에서 이황화 결합의 수와 비교). B 형 융합 태그에 대응하는 본래 융합 단백질 및 하부 대역으로 각각의 발현 수준에서 발현 된 단백질의 비율을 대응하는 볼 수 있습니다 단백질. 각 그룹에있는 단백질의 실제 개수는 그래프. C)에 오버레이되는 등전점 (PI) 및 잔기의 수에 기초하여 발현 량의 분포. D) 5.7 kDa의 이황화 풍부한 독이 질량 분석 결과의 예 4 이황화 결합과 단백질. 의 스펙트럼좌측은 종래 DTT와 함께 감소하고 우측의 스펙트럼 단백질 DTT로 환원 한 후 탈염 단백질 정보을 나타낸다. 실험 대중에 해당하는 이온은 화살표로 표시되어 자신의 할당은 녹색으로 표시됩니다. 이전의 감소 및 감소 후 표와 환원제를 첨가하기 전에 산화 단백질의 존재에 해당하는 8 다의 질량 차이를 전시하는 단백질에 대한 실험 대중. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 조리법 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> ZY </td><td> ~ 928 ㎖의 10g 트립 톤 5g 효모 추출물 925 ㎖의 물 </td><td> 혼합 후 소독 압력솥. </td></TR&gt; <tr><td> 2 M 망초 </td><td> 100 ML 49.3 g 망초 · 7H 2 O ~ 60 ml의 물 </td><td> 용해 될 때까지 교반 한 후 소독 압력솥. </td></tr><tr><td> 50X 5052 </td><td> 1 L 250g의 글리세롤 730 ㎖의 물 25g의 포도당 100g α-유당 </td><td> 순서대로 추가 모두 용해 될 때까지 불로 저어 후 소독 압력솥. </td></tr><tr><td> 20 배 NPS </td><td> 1 L 900 ㎖의 물 66g (NH 4) 2 SO 4 136g의 KH 2 PO 4 142g 나 2 HPO 4 </td><td> 순서대로 추가하고 모든 용해 후 소독 압력솥 때까지 저어. </td></tr></tbody></table> ZYP-5052 배지의 성분 표 1. 레시피.

심사 양적, 높은 처리량의 표현과 소규모 대장균 문화의 융합 단백질의 분석 정화하기위한 프로토콜을 설명하고 이황화 풍부한 동물 독의 표적 단백질의 발현에 적용됩니다.

에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화<em&gt; E. 대장균</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

다음 절차의 전반적인 목표는 자동화된 액체 취급 로봇을 사용하여 대장균 내 용해성 단백질 수준을 정량화하기 위해 고처리량 발현 스크리닝 프로토콜을 사용하는 것입니다. 이것은 먼저 접종함으로써 달성됩니다.96. 다음 날 표적 융합 단백질을 인코딩하는 플라스미드로 형질전환된 세포를 사용한 웰 사전 배양, 자동 유도 매체로 채워진 24개의 웰 플레이트에 하룻밤 사전 배양을 접종하여 발현을 생성합니다.수확 후 배양하고 발현 배양물에서 용해성 단백질을 동결한 후 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피로 정제합니다. 궁극적으로, 각 원형(intact) 표적 융합에 대한 용해도 수준을 측정하여 단백질 생산 및 성공적인 표적 생성을 위한 최적의 발현 조건을 결정할 수 있습니다. 효율성을 높이는 기존 방법의 장점으로부터, 배치 방사선에 대한 제한된 배치와 데이터 처리 및 추적의 단순성은이 방법의 시각적 시연이 중요합니다.자동화된 단계는 텍스트가 절차의 속도나 단순성을 전달하지 않기 때문에 텍스트 형식만으로는 이해하기 어렵고 어려워 보일 수 있습니다. 박테리아의 변형 후 로봇 그리퍼를 사용하여 첫 번째 24웰 LB 한천 플레이트의 뚜껑을 따로 보관하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 8채널 액체 취급 암을 사용하여 96웰 변환 플레이트에서 50마이크로리터의 변환 혼합물을 혼합한 다음 흡입합니다.액체 취급 암의 처음 4개 채널 내의 변형 혼합물을 LB 한천 플레이트의 첫 번째 컬럼으로 분주하고 마지막 4개 채널 내의 변형을 LB 한천 플레이트의 두 번째 컬럼으로 분주합니다.분주 후 모든 팁을 철저히 세척한 다음 96 웰 플레이트의 변형 혼합물을 LB 한천 플레이트의 다음 4개 열에 있는 모든 웰로 계속 전달합니다. 그 접시가 완성되었습니다. 첫 번째 플레이트로의 이송이 완료되면 뚜껑을 교체하고 다음 플레이트로의 이송을 시작합니다. 모든 변형이 플레이팅되면 1200RPM에서 1분 동안 모든 플레이트를 흔들어 변형 믹스의 균일한 분포를 생성합니다.그런 다음 혼합 후 96 멀티채널 암을 사용하여 96 웰 플레이트에서 나머지 변형 혼합물 중 60마이크로리터를 흡입하고 혼합물을 LB 브로스를 포함하는 딥 웰 96 플레이트에 분주합니다. 배양 공기 폭기를 허용하기 위해 통기성 접착 필름으로 깊은 웰 96 사전 배양을 밀봉한 다음 플레이트를 섭씨 37도 쉐이킹 인큐베이터에 하룻밤 동안 최대 속도로 놓습니다. 사전 배양액이 인큐베이터에 들어가면 약 10분 동안 뚜껑을 연 상태로 후드에 LB 한천 플레이트를 밀어 넣습니다.그런 다음 밤새 섭씨 37도의 플레이트 인큐베이터에서 플레이트를 뒤집습니다. 다음날, 액체 취급 암을 사용하여 하룻밤 전 배양 100 마이크로 리터를 깊은 우물 96 플레이트로 흡인하여 이전과 동일한 방식을 사용하여 1 회 40 번째 희석으로 발현 배양물을 접종하고 사전 배양의 각 열 사이의 세척 스테이션에서 액체 취급 암을 철저히 세척합니다. 접종이 완료되면 표정 배양액을 섭씨 37도의 진탕 인큐베이터에 넣고 통기성 접착제로 밀봉하여 4시간 동안 밀봉합니다.그런 다음 온도를 섭씨 17도로 낮추어 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 아침 3000 Gs.Disoverakants에서 10 분 동안 깊은 우물 24 플레이트를 원심 분리 항균제가 들어있는 폐기물 용기에 상층액을 버린 다음 흡수성 종이에 플레이트를 거꾸로 두드려 잔류 매체를 제거하여 배양물이 올바르게 성장했는지 확인합니다. 깊은 우물에 펠릿이 있는지 확인하십시오.다음으로 125마이크로리터의 용해 완충액을 흡입하고 각 웰에 4개의 팁이 있는 딥 웰 24개 플레이트의 각 웰에 버퍼를 두 번 분배합니다. 펠릿을 재현탁하기 위해 1mL의 용해 완충액의 최종 부피에 도달하려면 1200RPM에서 5분 동안 플레이트를 흔듭니다. 로봇에서 셀 현탁액을 딥 웰 96 플레이트의 적절한 웰로 다시 옮기고 플레이트를 섭씨 영하 80도에서 밀봉하여 최소 1시간 동안 보관합니다.이 시연에서는 표적 융합 단백질의 정제를 위해 50마이크로리터의 니켈 비드와 함께 프로토콜을 사용할 것입니다. 먼저 깊은 우물 96 플레이트를 수조에서 약 15분 동안 해동합니다. 그런 다음 resus는 진탕 인큐베이터에서 세포 용해물을 최대 속도로 10분 더 현탁시키면 배양액이 점성이 되어야 합니다.다음으로, 수동 8채널 피펫을 사용하여 DNA와 황산마그네슘 혼합물을 딥 웰 96 플레이트의 각 웰에 각각 10마이크로그램 및 20밀리몰의 최종 농도로 분배합니다. 밀봉된 플레이트를 15분 더 흔들면 배양액이 점성이 없어져야 합니다. 정제 중 필터 플레이트가 막히지 않도록 하려면 용해물이 더 이상 점성이 없는지 육안으로 주의 깊게 확인하는 것이 중요합니다.액체 취급 로봇에서 200마이크로리터의 넓은 보어 팁을 사용하여 수지 슬러리를 완전히 혼합한 후 200마이크로리터의 슬러리를 용해물이 포함된 딥 웰 96 플레이트로 옮깁니다. 딥 웰 96 플레이트를 1400RPM과 실온에서 10분 동안 흔들어 결합을 허용한 다음 넓은 보어 팁을 사용하여 혼합한 다음 200마이크로리터 분취액에 있는 1200마이크로리터의 수지 용해물 슬러리 전체를 필터 플레이트로 옮깁니다. 이제 약 30초 동안 진공 청소기를 켜서 플레이트를 통해 용해물을 여과하고 깊은 우물에서 흐름을 수집합니다.유동을 포함하는 깊은 우물 아래(96)의 96은 여과판 아래로부터 제거되고 실험이 종료될 때까지 랙에 저장된다. 그런 다음 두 번째 세척 후 매번 800마이크로리터의 결합 버퍼로 수지를 두 번 세척하고 로봇 그리퍼를 사용하여 필터 플레이트 아래에 신선하고 깊은 웰 96 플레이트를 배치하여 50밀리몰 I midaz 세척을 수집합니다. 필터 플레이트에 150마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 버퍼가 포함된 깊은 우물 96을 통과할 때까지 진공 청소기를 다시 적용합니다.세척액은 여과판 아래에서 제거되어 실험이 끝날 때까지 랙에 보관됩니다. 그런 다음 바인딩 버퍼에 대해 입증된 대로 800마이크로리터의 세척 버퍼로 두 번 더 세척한 후 로봇 그리퍼를 사용하여 마이크로플레이트를 작업대에 옮기고 SPE 블록과 필터 플레이트를 마이크로플레이트 위에 다시 올려 엘루시안을 수집했습니다. 그런 다음 190마이크로리터의 Elucian 완충액을 필터 플레이트의 수지에 추가합니다.3분 후 1분 동안 진공 청소기를 적용하여 모든 버퍼가 통과할 수 있도록 합니다. Ellucian 볼륨이 올바른지 빠르게 육안으로 확인합니다. 마지막으로, Ellucian 세척 및 플레이트를 통한 흐름의 블록 샘플을 용해성 발현 수준의 정량화에 사용합니다.먼저 엘루시안 플레이트를 분석하고 필요한 경우에만 관련 세척 및 유동 분획을 확인합니다. 이 데이터는 캘리퍼 실험실 칩 시스템의 전기영동 결과를 보여줍니다. 온전한 절단된 융합 단백질은 위쪽 띠로 표시되며 절단된 단백질 단편은 아래쪽 띠로 표시됩니다.각 표적 단백질에 대한 융합 수율은 리터 배양 수준당 0.1 - 2, 2 - 10 및 10 - 25 마이크로그램 범위 내에 속하는 것으로 결정되었으며, 일부 경우에는 검출되지 않았습니다. 각 융합 단백질 단편 내에 존재하는 디스 황화물 결합의 수로 단백질 발현의 성공을 평가하면 6개의 이황화 결합을 포함하는 표적에 대해 가장 낮은 성공 수준이 66%인 모든 이황화 결합 수에 대해 합리적인 성공을 보여줍니다. 등전점과 잔류물 수를 기반으로 한 발현 성공의 분포를 분석한 결과, 성공적으로 발현된 표적과 검출되지 않은 표적이 모두 플롯 전체에 흩어져 있는 기술에 대해 특별한 편향이 없음을 나타냅니다.일단 융해가 검출되고 쪼개지면, 순화된 표적은 electrospray 이온화, 질량 분석법에 의하여 품질 관리를 치룹니다. 여기에 표시된 대표적인 표적은 4개의 이황화 결합을 가진 5.7 킬로달톤 황화가 풍부한 독 단백질입니다. 이 스펙트럼은 추가 개입 없이 절단 및 탈염 후와 마찬가지로 DTT로 환원하기 전의 단백질에 대한 결과를 보여줍니다.이 스펙트럼은 DTT로 환원한 후 과도한 DTT를 제거하기 위해 탈염으로 단백질을 환원한 후 단백질을 보여줍니다. 화살표는 실험 질량에 해당하는 이온을 나타내며 각 이온에 대한 지정은 녹색으로 표시됩니다. 이러한 이온에 대해 계산된 실험 상위 질량은 표에 나와 있으며 4개의 산화된 다이 설파이드 결합에 해당하는 8개의 Dalton의 질량 차이에 해당합니다.설정하면 일주일 이내에 1,000개 이상의 배양에서 전체 프로토콜을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 소규모 대장균 배양을 사용하여 고처리량 방법을 사용하여 용해성 단백질 생산에 필요한 성공적인 조건을 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이후 인간 게놈 시대에 원시 conformations에서 재조합 단백질의 가용성은 구조적 기능적 및 치료 연구와 개발에 매우​​ 중요합니다. 여기서는 테스트 및 재조합 단백질의 다양한 생산하는 데 사용할 수있는 인간의 배아 신장 293T 세포에 대규모 단백질 발현 시스템을 설명합니다.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

우리는 액체 처리 로봇을 사용하여 재조합 단백질의 친 화성 태그 정화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 일반적으로 높은 처리량 형식에 용해 그의 태그 단백질의 작은 규모의 정화에 적용됩니다.

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

포유류 시스템에 의한 재조합 단백질의 발현은 구조 생물학을 위한 단백질 복합체를 생산하는 매력적인 방법이 되고 있습니다. 여기에서 우리는 구조 연구를 위해 단백질 복합체를 정제하기 위해 현탁액 성장 포유류 세포를 사용하는 간단하면서도 매우 효율적인 발현 시스템을 제시합니다.

소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

녹색 형광 단백질에 융합을 기반으로 대장균에서 재조합 막 단백질의 발현에 대한 심사에 대한 효율적인 접근 방법이 제시된다.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

징크 핑거 도메인은 본질적으로 세포 투과성 및 포유 동물 세포 유형 내로 다양한 단백질 전달을 매개 할 수있다. 여기서, 단백질의 세포 내 전달을위한 아연 핑거 기술을 구현하기위한 상세한 단계별 프로토콜이 제시된다.

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달<sub&gt; 2</sub&gt; - 그의<sub&gt; 2</sub&gt; 아연 손가락 도메인

소각 X 선 산란 (SAXS)에 의한 단백질의 용액 구조의 결정은 단 분산 샘플을 필요로한다. 여기에서는, 샘플 준비 및 데이터 수집 간의 최소 지연을 보장하기 위해 두 가지 가능성을 제시 : 온라인 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC) 및 온라인 이온 교환 크로마토 그래피 (IEC).

SAXS 빔라인에 온라인 크기 배제 및 이온 교환 크로마토 그래피

이 원고는 미생물 배양 미디어의 맞춤형 디자인에 대 한 일반적인 접근 방식을 설명합니다. Kriging 기반 실험 설계 및 microbioreactor 기술을 결합 충분 한 재배 처리량, 안정성 및 액체 미디어 처리 속도 높이기 위해 연구소 로봇에 의해 지원 되는 워크플로 반복 하 여 사용이 준비입니다.

자동화 된 Microbioreactor 기술을 사용 하 여 분리 단백질 생산의 최적화를 위한 일반 프로토콜

본 프로토콜은 세포외 막 결합 소포 내부에 포장된 전형적으로 불용성 또는 이황화 결합 함유 단백질을 포함하는 재조합 단백질의 박테리아 생산을 위한 상세한 방법을 설명합니다. 이것은 응용 생명 공학 및 의학을 포함한 과학 연구의 다양한 영역에 적용될 가능성이 있습니다.

E. coli의 재조합 단백질 충전 소포의 최적화된 생산 및 분석

인간 막 수송체의 구조 및 생화학적 연구에는 밀리그램 단위의 안정적이고 온전하며 균질한 단백질이 필요합니다. 여기서는 코돈 최적화 유전자를 사용하여 인간 용질 운반체 수송체를 스크리닝, 발현 및 정제하는 확장 가능한 방법을 설명합니다.

구조 및 생화학 연구를 위한 Human Solute Carriers의 High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies(구조 및 생화학 연구를 위한 인간 용질 담체의 고처리량 발현 및 정제)

이 기사에서는 C41(DE3) 발현 시스템에서 독성 뉴클레아제인 재조합 Nsp15를 과발현한 다음 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피를 활용하여 태그가 지정된 단백질을 정제하는 방법론에 대해 설명합니다. 이러한 프로토콜은 다른 까다로운 독성 단백질에 적용될 수 있습니다.

대장균에서 독성 뉴클레아제를 과발현 및 정제

이 프로토콜은 재조합 인간 SLFN14 리보뉴클레아제의 생성과 질량 광도계를 통한 화학양론 분석을 설명합니다.<br...

재조합 인간 SLFN14 리보뉴클레아제의 신속 생성 및 질량 광도계를 통한 화학양론 분석

배우세요 대장균에서 고처리량 발현 스크리닝을 통해 용해도가 높은 융합 단백질을 정량화하고 정화하는 방법을. 자동화된 액체 처리 로봇을 활용하여 이황화 결합이 풍부한 독 단백질의 생산 조건을 최적화할 수 있습니다.

에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화

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