에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화 E. 대장균

심사 양적, 높은 처리량의 표현과 소규모 대장균 문화의 융합 단백질의 분석 정화하기위한 프로토콜을 설명하고 이황화 풍부한 동물 독의 표적 단백질의 발현에 적용됩니다.

다음 절차의 전반적인 목표는 자동화된 액체 취급 로봇을 사용하여 대장균 내 용해성 단백질 수준을 정량화하기 위해 고처리량 발현 스크리닝 프로토콜을 사용하는 것입니다. 이것은 먼저 접종함으로써 달성됩니다.96. 다음 날 표적 융합 단백질을 인코딩하는 플라스미드로 형질전환된 세포를 사용한 웰 사전 배양, 자동 유도 매체로 채워진 24개의 웰 플레이트에 하룻밤 사전 배양을 접종하여 발현을 생성합니다.

수확 후 배양하고 발현 배양물에서 용해성 단백질을 동결한 후 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피로 정제합니다. 궁극적으로, 각 원형(intact) 표적 융합에 대한 용해도 수준을 측정하여 단백질 생산 및 성공적인 표적 생성을 위한 최적의 발현 조건을 결정할 수 있습니다. 효율성을 높이는 기존 방법의 장점으로부터, 배치 방사선에 대한 제한된 배치와 데이터 처리 및 추적의 단순성은이 방법의 시각적 시연이 중요합니다.

자동화된 단계는 텍스트가 절차의 속도나 단순성을 전달하지 않기 때문에 텍스트 형식만으로는 이해하기 어렵고 어려워 보일 수 있습니다. 박테리아의 변형 후 로봇 그리퍼를 사용하여 첫 번째 24웰 LB 한천 플레이트의 뚜껑을 따로 보관하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 8채널 액체 취급 암을 사용하여 96웰 변환 플레이트에서 50마이크로리터의 변환 혼합물을 혼합한 다음 흡입합니다.

액체 취급 암의 처음 4개 채널 내의 변형 혼합물을 LB 한천 플레이트의 첫 번째 컬럼으로 분주하고 마지막 4개 채널 내의 변형을 LB 한천 플레이트의 두 번째 컬럼으로 분주합니다.분주 후 모든 팁을 철저히 세척한 다음 96 웰 플레이트의 변형 혼합물을 LB 한천 플레이트의 다음 4개 열에 있는 모든 웰로 계속 전달합니다. 그 접시가 완성되었습니다. 첫 번째 플레이트로의 이송이 완료되면 뚜껑을 교체하고 다음 플레이트로의 이송을 시작합니다. 모든 변형이 플레이팅되면 1200RPM에서 1분 동안 모든 플레이트를 흔들어 변형 믹스의 균일한 분포를 생성합니다.

그런 다음 혼합 후 96 멀티채널 암을 사용하여 96 웰 플레이트에서 나머지 변형 혼합물 중 60마이크로리터를 흡입하고 혼합물을 LB 브로스를 포함하는 딥 웰 96 플레이트에 분주합니다. 배양 공기 폭기를 허용하기 위해 통기성 접착 필름으로 깊은 웰 96 사전 배양을 밀봉한 다음 플레이트를 섭씨 37도 쉐이킹 인큐베이터에 하룻밤 동안 최대 속도로 놓습니다. 사전 배양액이 인큐베이터에 들어가면 약 10분 동안 뚜껑을 연 상태로 후드에 LB 한천 플레이트를 밀어 넣습니다.

그런 다음 밤새 섭씨 37도의 플레이트 인큐베이터에서 플레이트를 뒤집습니다. 다음날, 액체 취급 암을 사용하여 하룻밤 전 배양 100 마이크로 리터를 깊은 우물 96 플레이트로 흡인하여 이전과 동일한 방식을 사용하여 1 회 40 번째 희석으로 발현 배양물을 접종하고 사전 배양의 각 열 사이의 세척 스테이션에서 액체 취급 암을 철저히 세척합니다. 접종이 완료되면 표정 배양액을 섭씨 37도의 진탕 인큐베이터에 넣고 통기성 접착제로 밀봉하여 4시간 동안 밀봉합니다.

그런 다음 온도를 섭씨 17도로 낮추어 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 아침 3000 Gs.Disoverakants에서 10 분 동안 깊은 우물 24 플레이트를 원심 분리 항균제가 들어있는 폐기물 용기에 상층액을 버린 다음 흡수성 종이에 플레이트를 거꾸로 두드려 잔류 매체를 제거하여 배양물이 올바르게 성장했는지 확인합니다. 깊은 우물에 펠릿이 있는지 확인하십시오.

다음으로 125마이크로리터의 용해 완충액을 흡입하고 각 웰에 4개의 팁이 있는 딥 웰 24개 플레이트의 각 웰에 버퍼를 두 번 분배합니다. 펠릿을 재현탁하기 위해 1mL의 용해 완충액의 최종 부피에 도달하려면 1200RPM에서 5분 동안 플레이트를 흔듭니다. 로봇에서 셀 현탁액을 딥 웰 96 플레이트의 적절한 웰로 다시 옮기고 플레이트를 섭씨 영하 80도에서 밀봉하여 최소 1시간 동안 보관합니다.

이 시연에서는 표적 융합 단백질의 정제를 위해 50마이크로리터의 니켈 비드와 함께 프로토콜을 사용할 것입니다. 먼저 깊은 우물 96 플레이트를 수조에서 약 15분 동안 해동합니다. 그런 다음 resus는 진탕 인큐베이터에서 세포 용해물을 최대 속도로 10분 더 현탁시키면 배양액이 점성이 되어야 합니다.

다음으로, 수동 8채널 피펫을 사용하여 DNA와 황산마그네슘 혼합물을 딥 웰 96 플레이트의 각 웰에 각각 10마이크로그램 및 20밀리몰의 최종 농도로 분배합니다. 밀봉된 플레이트를 15분 더 흔들면 배양액이 점성이 없어져야 합니다. 정제 중 필터 플레이트가 막히지 않도록 하려면 용해물이 더 이상 점성이 없는지 육안으로 주의 깊게 확인하는 것이 중요합니다.

액체 취급 로봇에서 200마이크로리터의 넓은 보어 팁을 사용하여 수지 슬러리를 완전히 혼합한 후 200마이크로리터의 슬러리를 용해물이 포함된 딥 웰 96 플레이트로 옮깁니다. 딥 웰 96 플레이트를 1400RPM과 실온에서 10분 동안 흔들어 결합을 허용한 다음 넓은 보어 팁을 사용하여 혼합한 다음 200마이크로리터 분취액에 있는 1200마이크로리터의 수지 용해물 슬러리 전체를 필터 플레이트로 옮깁니다. 이제 약 30초 동안 진공 청소기를 켜서 플레이트를 통해 용해물을 여과하고 깊은 우물에서 흐름을 수집합니다.

유동을 포함하는 깊은 우물 아래(96)의 96은 여과판 아래로부터 제거되고 실험이 종료될 때까지 랙에 저장된다. 그런 다음 두 번째 세척 후 매번 800마이크로리터의 결합 버퍼로 수지를 두 번 세척하고 로봇 그리퍼를 사용하여 필터 플레이트 아래에 신선하고 깊은 웰 96 플레이트를 배치하여 50밀리몰 I midaz 세척을 수집합니다. 필터 플레이트에 150마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 버퍼가 포함된 깊은 우물 96을 통과할 때까지 진공 청소기를 다시 적용합니다.

세척액은 여과판 아래에서 제거되어 실험이 끝날 때까지 랙에 보관됩니다. 그런 다음 바인딩 버퍼에 대해 입증된 대로 800마이크로리터의 세척 버퍼로 두 번 더 세척한 후 로봇 그리퍼를 사용하여 마이크로플레이트를 작업대에 옮기고 SPE 블록과 필터 플레이트를 마이크로플레이트 위에 다시 올려 엘루시안을 수집했습니다. 그런 다음 190마이크로리터의 Elucian 완충액을 필터 플레이트의 수지에 추가합니다.

3분 후 1분 동안 진공 청소기를 적용하여 모든 버퍼가 통과할 수 있도록 합니다. Ellucian 볼륨이 올바른지 빠르게 육안으로 확인합니다. 마지막으로, Ellucian 세척 및 플레이트를 통한 흐름의 블록 샘플을 용해성 발현 수준의 정량화에 사용합니다.

먼저 엘루시안 플레이트를 분석하고 필요한 경우에만 관련 세척 및 유동 분획을 확인합니다. 이 데이터는 캘리퍼 실험실 칩 시스템의 전기영동 결과를 보여줍니다. 온전한 절단된 융합 단백질은 위쪽 띠로 표시되며 절단된 단백질 단편은 아래쪽 띠로 표시됩니다.

각 표적 단백질에 대한 융합 수율은 리터 배양 수준당 0.1 - 2, 2 - 10 및 10 - 25 마이크로그램 범위 내에 속하는 것으로 결정되었으며, 일부 경우에는 검출되지 않았습니다. 각 융합 단백질 단편 내에 존재하는 디스 황화물 결합의 수로 단백질 발현의 성공을 평가하면 6개의 이황화 결합을 포함하는 표적에 대해 가장 낮은 성공 수준이 66%인 모든 이황화 결합 수에 대해 합리적인 성공을 보여줍니다. 등전점과 잔류물 수를 기반으로 한 발현 성공의 분포를 분석한 결과, 성공적으로 발현된 표적과 검출되지 않은 표적이 모두 플롯 전체에 흩어져 있는 기술에 대해 특별한 편향이 없음을 나타냅니다.

일단 융해가 검출되고 쪼개지면, 순화된 표적은 electrospray 이온화, 질량 분석법에 의하여 품질 관리를 치룹니다. 여기에 표시된 대표적인 표적은 4개의 이황화 결합을 가진 5.7 킬로달톤 황화가 풍부한 독 단백질입니다. 이 스펙트럼은 추가 개입 없이 절단 및 탈염 후와 마찬가지로 DTT로 환원하기 전의 단백질에 대한 결과를 보여줍니다.

이 스펙트럼은 DTT로 환원한 후 과도한 DTT를 제거하기 위해 탈염으로 단백질을 환원한 후 단백질을 보여줍니다. 화살표는 실험 질량에 해당하는 이온을 나타내며 각 이온에 대한 지정은 녹색으로 표시됩니다. 이러한 이온에 대해 계산된 실험 상위 질량은 표에 나와 있으며 4개의 산화된 다이 설파이드 결합에 해당하는 8개의 Dalton의 질량 차이에 해당합니다.

설정하면 일주일 이내에 1,000개 이상의 배양에서 전체 프로토콜을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 소규모 대장균 배양을 사용하여 고처리량 방법을 사용하여 용해성 단백질 생산에 필요한 성공적인 조건을 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.