환자와 인간의 내피 세포에서 파생 된 전립선 순환 종양 세포 사이에 E-셀렉틴 매개 상호 작용을 관찰하는 시험 관내 방법에

본 절차의 전체적인 목표는 마이크로 슬라이드 유동 장치를 사용하여 희귀 전립선암 세포와 E-selectin을 발현하는 혈관 내피 세포 간의 상호작용을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 마이크로 슬라이드를 피브로넥틴으로 코팅함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 채널 폭이 좁은 마이크로 슬라이드 상의 동적 유동 시스템에서 인간 제대정맥 내피 세포(HUVEC 또는 VE)를 배양하는 것입니다.

다음으로, 전립선암 세포를 전립선 특이 막 항원 또는 PSMA 인간화 단클론 항체로 표지하며, 이는 세포 내부로 유입됩니다. 마지막 단계는 anti PSMA로 표지된 전립선암 세포를 e-selectin이 발현되는 혈관 내피세포(VE) 위로 관류시키는 것입니다. 최종적으로, 비디오 현미경을 사용하여 전립선암 세포와 내피세포 간의 상호작용을 관찰합니다.

평행판 유동 챔버(parallel plate flow chamber) 및 기타 동적 조립 장치와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 동적 유동 시스템 내에서 순환 종양 세포와 같은 희귀 전립선암 세포와 배양된 내피 세포 사이의 상호작용을 조사할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 전립선 종양 세포가 혈관 시스템을 통해 어떻게 전이되는가? 이들이 백혈구가 이동하는 동안 사용하는 것과 동일한 메커니즘을 사용하는가? 와 같은 전이 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

일반적으로 이 기술에 익숙하지 않은 연구자들은 조직 배양 후드 아래에서 관류 상태의 좁은 채널 내에 내피세포 단층을 배양해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 먼저, 마이크로 슬라이드를 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹굽니다. 그런 다음 1 mL 루어 락 주사기를 사용하여 50 µg/mL 피브로넥틴 200 µL를 마이크로 슬라이드에 부드럽게 코팅합니다.

마이크로 슬라이드를 덮개로 덮고 조직 배양 후드 내에 30분 동안 보관하십시오. 다음으로, 따뜻한 qve 성장 배지 200 µL를 마이크로 슬라이드 위에 관류시키고 상온에서 20분 동안 배양하십시오. 액체를 마이크로 슬라이드에 천천히 분주하면 채널 내의 기포 형성을 방지할 수 있습니다.

관류 중에 vex를 PBS로 헹구고 0.1% collagenase와 0.05% EDTA가 포함된 PBS를 첨가하여 실온에서 1~2분 동안 처리함으로써 vex 현탁액을 준비합니다. hve를 2 mL의 성장 배지에서 180 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 헤모사이토미터를 사용하여 세포 농도를 측정하고, 성장 배지 100 µL당 10 million cells가 되도록 준비합니다.

다음으로, 마이크로 슬라이드의 입구에서 배지를 조심스럽게 제거합니다. 200 µL 피펫 팁을 사용하여 마이크로 슬라이드를 눈높이로 맞춘 다음, 1 mL 루어락 주입기를 사용하여 준비된 농도의 vex 200 µL를 채널 내로 부드럽게 관류합니다. 이 단계에서는 기포 형성을 방지하기 위해 주의가 필요하며, 만약 기포가 나타나면 기포가 배출 채널로 나갈 때까지 조금 더 오래 관류하십시오.

다음으로 약 80 µL의 동일한 부피의 VE 배지를 마이크로 슬라이드의 입구와 출구 양쪽에 각각 피펫팅합니다. 이는 세포가 어느 방향으로든 흐르는 것을 방지합니다. 슬라이드를 덮고 37 °C 인큐베이터에서 1.5시간 동안 보관합니다.

유동 챔버 조립을 시작하려면, 데드 볼륨을 최소화하기 위해 멸균된 20 milliliter 주사기, 암수 루어 커넥터, 주사기 펌프 및 튜빙을 인큐베이터에 15분 동안 둡니다. 내경이 0.04 inches인 튜빙을 사용하십시오. 튜빙 직경이 작을수록 기포 형성을 방지할 수 있습니다.

다음으로, 20 milliliter 주사기에 따뜻한 VE 배지 12 milliliters를 채웁니다. 주사기 내의 기포를 완전히 제거합니다. 마이크로 슬라이드의 입구에 VE 배지를 채웁니다.

이 어셈블리를 마이크로 슬라이드에 연결하십시오. 배출구 커넥터를 마이크로 슬라이드에 조심스럽게 부착하십시오. 설비를 인큐베이터로 옮겨 시린지 펌프에 연결하십시오.

그 다음, 펌프의 전단 속도를 10 µL/min으로 설정하고 세포를 37 °C 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 마이크로 슬라이드의 입구에 연결된 커넥터를 제거하여 장치를 분해합니다. 그 후, 혈관 내피 세포의 E-selectin 발현을 상향 조절하기 위해 출구 커넥터를 제거합니다.

interleukin one beta가 포함된 신선한 배양액을 준비합니다. 10 milliliter 시린지에 배양액을 흡입합니다. 슬라이드 입구에 남아있는 배양액을 제거한 후, 입구가 완전히 채워지도록 신선한 배양액을 추가합니다.

주사기를 슬라이드에 연결합니다. 인터루킨 1베타(interleukin one beta)를 vex에 배양하는 동안, 배양기 내에서 주사기 펌프를 10 µL/min의 전단 속도로 4시간 동안 설정하여 anti PSMA Alexa 488 항체로 표지된 전립선암 세포를 준비합니다. 먼저, MDA 전립선암 세포에 0.05% trypsin EDTA를 넣고 1분 동안 둡니다.

세포 표면에 존재하는 당펩타이드에 영향을 줄 수 있으므로 세포를 트립신에 너무 오래 노출시키지 마십시오. 세포를 200 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 다음으로, MDA 세포 펠렛을 1 mL의 Hank's Buffer에 재부유시킨 후 anti PSMA 항체를 첨가하고, 배양 과정 중 세포를 재부유시키면서 암실의 상온에서 30분 동안 배양합니다.

30분 후, 세포 용액을 800 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 흡입하고 펠렛을 1 mL의 Hank's buffer에 재현탁합니다. 표지된 MDA 세포 수를 측정하고 최종 농도를 1 million cells/mL로 맞춥니다.

5 mL 시린지에 라벨이 부착된 MDA 세포를 채우고 기포를 제거합니다. 도립 현미경의 전원을 켜고 10배 대물렌즈에서 조명을 설정합니다. 시린지 펌프를 현미경의 시료 스테이지와 동일한 높이로 맞추고, 전단 응력을 1 dime/cm²로 설정합니다.

다음으로, Zeiss Axio vision 소프트웨어를 엽니다. 컴퓨터 화면에서 대물렌즈를 선택합니다. 소프트웨어의 tools 옵션 아래에 새 폴더를 생성합니다.

Axio vision의 smart experiments 옵션을 열고 30분 동안 32초의 짧은 비디오를 기록하도록 설정을 조정하십시오. 실시간 형광 비디오의 경우, 이미지 옵션을 설정하십시오. 이러한 파라미터는 Zeiss MRM 카메라를 사용하여 비디오 프레임 속도에 가까운 영상을 얻는 데 도움이 됩니다. 컴퓨터 화면에서 10x 대물렌즈로 유로의 전체 너비를 시각화하려면 CM 마운트 어댑터를 사용하십시오. 시린지와 세포가 포함된 커넥터를 시린지 펌프에 배치하기 전에 수은 램프를 켜십시오. 다음으로, interleukin one beta로 자극된 ax가 포함된 마이크로 슬라이드의 채워진 입구 채널에 커넥터를 연결하십시오.

배출 채널을 튜브에 연결된 커넥터와 연결합니다. 유출액을 수집하기 위해 튜브를 디쉬나 15 milliliter 원심분리 튜브에 넣습니다. 10 microliters per minute의 속도로 마이크로 슬라이드를 통해 주입을 시작합니다.

488 nm 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 혈관 내피세포와 표지된 MDA 세포 또는 환자 유래 표지된 CTC 간의 상호작용을 관찰하십시오. 실험 과정을 32개의 짧은 영상으로 녹화하십시오.

재생 분석 중에 롤링 속도를 측정합니다. 롤링 속도는 세포가 이동한 거리를 시간으로 나누어 측정합니다. 여기에는 내피세포 단층의 하룻밤 배양 상태가 나타나 있습니다.

마이크로 슬라이드 상의 모습입니다. 배율 표시를 통해 5x 대물렌즈 사용 시 마이크로 슬라이드의 100%가 보이며, 10x 대물렌즈 사용 시 70%가 보임을 알 수 있습니다. 선택된 매개 상호작용의 경우, 가장자리에서 롤링하는 세포들은 고려하지 않았으며, 이에 따라 마이크로 슬라이드의 70% 이상을 비디오 녹화 및 재생 분석에 사용할 수 있습니다. 박스 플롯은 서로 다른 전단 응력 조건에서 interleukin one beta로 자극된 혈관 내피 세포 상의 표지되지 않은 MDA 세포와 anti PSMA가 표지된 MDA 세포의 롤링 속도 분포를 보여줍니다.

10 dyn/cm²의 높은 전단 응력에서 1 dyn/cm²와 5 dyn/cm²의 롤링 속도는 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다. 표지되지 않은 MDA 세포와 anti-PSMA 표지 MDA 세포의 롤링 속도 사이에는 통계적으로 유의미한 차이가 관찰되었습니다. 전립선암 환자의 혈액을 사용하여 촬영한 타임랩스 영상은 표지된 전립선 CTC와 렉틴 발현 내피세포 간의 세 가지 상호작용 유형을 보여줍니다. 이는 CTC가 부착되었다가 다시 떨어지는 테더링(tethering), 30초 후에도 CTC가 떨어지지 않는 안정적 부착(stable adhesion), 그리고 상호작용하지 않는 CTC가 시야에 들어오는 무상호작용(no interactions)으로 구분됩니다. 마이크로 슬라이드는 쉽게 면역 염색 및 형광 이미징이 가능하며, 이를 통해 anti-PSMA 표지 MDA 세포의 강한 부착을 확인할 수 있습니다.

interleukin one beta로 자극된 혈관 내피 세포에 주입한 후의 모습을 여기에서 확인할 수 있습니다. 이 영상을 시청하신 후에는, 본 절차에 따라 순환 전립선 종양 세포와 같은 희귀 세포와 S selectin을 발현하는 혈관 내피 세포 간의 상호작용을 검사하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. s selectin 리간드의 존재 여부와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 면역형광법과 같은 다른 방법들도 수행될 수 있습니다.

이러한 기술들은 연구자들이 전이 과정에 관여하는 다양한 단계들을 이해하는 데 도움을 줄 수 있습니다.