Name: 환자와 인간의 내피 세포에서 파생 된 전립선 순환 종양 세포 사이에 E-셀렉틴 매개 상호 작용을 관찰하는 시험 관내 방법에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 배우세요 전립선암 순환 종양 세포와 E-셀렉틴 발현 내피 세포 간 상호작용을 마이크로 슬라이드 유동 장치를 이용해 실시간으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 전이 메커니즘 연구와 새로운 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 부서의 방어 전립선 암 연구 프로그램 (W81XWH-12-1-0124)에서 자금에 의해 지원되었다, 국립 암 연구소, 그리고 로버트 McCooey 비뇨 생식기 종양학 연구 기금 U54CA143876. 우리는 HUVEC를 제공을위한 VE-cadherin의 항체를 제공하기 위해 박사 Annarita 로렌조 (병리학 교실)를 감사, 박사 마르코 Seandel (외과학 교실) 것이다.

관측 CTC - 내피 세포 상호 작용에 대한 Microslides 1. 배양 된 HUVEC <ol><li> 조직 문화 후드에서 첫 번째, PBS 1 ㎜의 채널 폭을하는 마이크로 린스. 부드럽게 코트 50 ㎍ / ml의 피브로넥틴 (PBS에 용해 된) 1 ㎖의 루어 로크 시린지를 사용하여 200 μL와 마이크로 슬라이드. </li><li> 뚜껑을하는 마이크로을 덮고 30 분 동안 조직 문화 후드 내부에 보관. 마이크로 슬라이드에있는 액체의 느린 분배 채널에서 거품 형성을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 따뜻한 (37 ° C) HUVEC 성장 배지 200 μl를 Perfuse (M199 미디어, 1M HEPES, 20 % FBS, 5 ㎎ / ㎖ 헤파린, 100 ㎍ / ㎖의 내피 세포 성장 인자, 및 L-글루타민)하는 마이크로 이상과 부화 실온에서 20 분. 관류하는 동안, HUVEC 세포 현탁액을 준비합니다. </li><li> PBS로 된 HUVEC을 씻어 RT에서 1 ~ 2 분 동안 0.05 % 트립신-EDTA를 추가합니다. 5 분 180 XG에 2 ㎖ 성장 매체에 원심 분리기 된 HUVEC. </li><li> neuba를 사용하여 세포 농도를 측정UER의 혈구 및 성장 매체 μL 10 7 HUVEC의 cells/100를 준비합니다. 그런 다음 조심스럽게 200 μL 피펫 팁을 사용하는 마이크로의 입구에서 매체를 제거합니다. </li><li> 눈 높이로하는 마이크로 및 1-ML 루어 잠금 주사기를 사용 가져와 부드럽게 채널로 된 HUVEC의 준비 농도의 200 μl를 perfuse. 주의 기포 형성을 방지하기 위해이 단계에서 필요하다. 거품이 나타날 경우, 거품이 출구 채널을 입력 할 때까지 약간 긴 시간 동안 관류 유지. </li><li> 입구와하는 마이크로의 콘센트에 HUVEC 미디어의 동일한 볼륨 (~ 80 μL)을 넣습니다. 이는 어느 한 방향으로 세포의 유동을 방지한다. </li><li> 슬라이드를 커버하고 1.5 시간 동안 인큐베이터 (37 °의 C)를 유지한다. </li></ol> 하는 마이크로 밤새 HUVEC 문화 흐름 상공 회의소 총회의 2. 준비 <ol><li> 15 마일의 인큐베이터에서 멸균 20 ML 주사기, 여성과 남성 루어 커넥터, 튜브, 주사기 펌프를 배치N. </li><li> 최소한의 죽은 볼륨의 경우, 0.04 인치의 내경 튜브를 사용합니다. 작은 튜브의 직경은 거품 형성을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 따뜻한 (37 ° C) HUVEC 미디어 (12 ㎖) 20 ㎖를 주사기를 채우십시오. 주사기에 커넥터와 튜브를 연결합니다. 거품을 제거합니다. 마이크로 슬라이드에이 어셈블리를 연결합니다. </li><li> 완전히 HUVEC 미디어와 마이크로 슬라이드의 입구를 입력합니다. 다음 마이크로 슬라이드에 커넥터에 연결된 가득 20 ML의 주사기를 가져옵니다. 부드럽게하는 마이크로에 커넥터를 연결합니다. </li><li> 인큐베이터에 셋업을 가지고 있으며 10 μL / 분의 전단 속도로 설정 주사기 펌프에 연결합니다. 37 ℃에서 인큐베이터에있는 세포 O / N를 남겨 </li><li> 다음날, 마이크로 슬라이드의 유입구에 연결된 커넥터를 제거함으로써 셋업을 분해. </li><li> 내장 컴퓨터에 E-selectin의 발현을 상향 조절하려면 4 ML 미디어 / ㎖를 겨 (10)에서 IL-1β를 포함하는 신선한 성장 매체를 준비합니다. 10 ㎖를 주사기에 미디어를 대기음. T를 제거그가하는 마이크로의 입구에서 미디어와 슬라이드에 주사기를 연결합니다. </li><li> 인큐베이터에서 4 시간 10 μL / 분의 전단 속도에서 주사기 펌프를 설정합니다. </li></ol> 3. 안티 PSMA의 준비 (J591-488) 레이블이 전립선 암 세포 <ol><li> 된 HUVEC의 IL-1β의 배양하는 동안, 안티 PSMA의 J591-alexa488 표시 PCA 세포를 준비합니다. 1 분 동안 MDA 세포에 0.05 % 트립신-EDTA를 추가합니다. 이 세포 표면에 존재하는 글리코 펩타이드에 영향을 미칠 수있는 긴 시간 동안 트립신으로 세포를 노출시키지 않는다. 효소 자유로운 세포 해리 시약 대신 트립신 사용될 수있다. 5 분 200 XG에 원심 분리기. </li><li> 1 ㎖의 H / H 버퍼 (행크스 균형 소금 solution/0.1 % HSA/10 mM의 HEPES / 1 ㎜ 염화칼슘)에 MDA 세포 펠렛을 Resuspend. 어두운 곳에서 실온에서 30 분 동안 20 ㎍ / ml로 안티 PSMA의 J591-alexa488 항체를 추가합니다. 배양 중에 세포를 재현 탁. </li><li> 30 분 후, 5 분 동안 800 XG에서 세포 용액을 원심 분리기. ASPI레이트 및 1 ml의 H / H 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 표지 MDA 세포를 세어 1 × 6 세포 / ml로 최종 농도를 가져옵니다. J591-488 라벨 MDA 세포와 5 ML의 주사기를 입력하고 거품을 제거합니다. </li></ol> 4. PCA 환자에서 안티 PSMA (J591-488) 레이블의 CTCs 풍성하게 준비 <ol><li> (구연산 나트륨을 포함하는) 파란 모자 관에서 전립선 암 환자에서 7.5 ml의 혈액을 수집합니다. 부드럽게 0.1 % BSA / 1 ㎜ EDTA / PBS에서 혈액 1:1 희석. </li><li> 5.3 ㎖의 피콜 - paque 플러스 50 ML 원뿔 튜브를 추가합니다. 레이어 피콜 - paque 위에 혈액을 희석. 30 분 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 프리 코트의 모든 튜브 또는 팁은 2 % FBS/RPMI-1640 / 1 ㎜ 염화칼슘 2 / 4 mM의 MgCl2를 표면에의 CTCs 비 특정 바인딩을 방지하기 위해 (R / S 버퍼)과의 CTCs과 접촉. 의 CTCs과 접촉 매체 및 버퍼의 4 ° C 온도를 유지합니다. </li><li> 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를) 분획을 모아서30 ml의 R / S 버퍼를 포함하는 다른 50 ml의 원추형 튜브 인터페이스에서의 CTCs 함유. 8 분 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 펠렛을 재현 탁하고 8 분 400 XG에서 R / S 버퍼에 다시 씻는다. 원심 분리 후, H / H 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 어두운 곳에서 실온에서 30 분 동안 20 ㎍ / ml로 안티 PSMA J591-488 항체를 추가합니다. </li><li> 30 분 후, 5 분 동안 800 XG에서 J591-488 표지의 CTCs 함유 PBMC를 원심 분리. H / H 버퍼를 Resuspend. 샘플 1 ML의 주사기 (R / S 버퍼 사전 코팅)을 입력합니다. </li></ol> 5. 현미경의 준비, 주사기 펌프 및 유량 용기 조립 <ol><li> 거꾸로 현미경을 켜고 10X 목적에 쾰러 조명을 설정합니다. 현미경의 시료 스테이지 같은 수준의 주사기 펌프를 지참 한 DYN / cm이 전단 응력 (~ 10 μL / 분)로 설정. </li><li> 혈구 AxioVision의 소프트웨어를 엽니 다. 컴퓨터 화면에 목표를 선택한다. 새로 만들기소프트웨어의 도구 옵션에서 폴더. </li><li> AxioVision의에서 스마트 실험 옵션을 열고 30 분 동안 짧은 30 초 영상을 기록하는 설정을 조정합니다. </li><li> 실시간 형광 영상의 경우, 영상 옵션-12 밀리 초 노출, 2 × 2 빈 5 게인을 설정합니다. 이러한 매개 변수는 MRM 자이스 카메라와 비디오 프레임 속도 (~ 초당 23 프레임)에 가까운 동영상을 달성하는 데 도움이됩니다. </li><li> 컴퓨터 화면에 10 X의 목적에 유동 채널의 전체 너비를 시각화 C-마운트 어댑터 (0.63 xf/60 mm 인터페이스)를 사용하십시오. </li><li> 수은 램프를 켭니다. </li><li> 주사기 펌프에 주사기와 세포를 포함하는 커넥터를 놓습니다. </li><li> 가져 IL-1β를 인큐베이터에서 H​​UVEC를 자극. 된 HUVEC을 포함하는 마이크로의 작성 유입 채널에 커넥터를 연결합니다. </li><li> 튜브에 부착 된 커넥터와 콘센트 채널을 연결합니다. 을 통해 흐름을 수집하는 접시 15 ML 원뿔 튜브에 튜브를 넣어. </li><li> infusi를 시작합니다10 μL / 분하는 마이크로를 통해서 전달됩니다. 내피 세포 및 표시 MDA 세포 또는 표면 형광 현미경에 488 나노 필터에 따라 환자에서 파생 된 레이블의 CTCs 사이의 상호 작용을 관찰한다. </li><li> 30 초 짧은 영상으로 실험을 녹음을 시작합니다. 재생 분석 중에, 압연 속도를 측정. 회전 속도는 시간이 지남에 따라 셀에 의해 이동 한 거리를 나눔으로써 측정된다. </li></ol> 하는 마이크로의 6. 면역 염색 <ol><li> 10 분 동안 IL-1β 자극 된 HUVEC에 MDA 세포를 관류 한 후하는 마이크로의 입구와 출구에서 용지를 제거합니다. </li><li> 200 ㎕의 팁을 사용하여 5 분 동안하는 마이크로의 입구에 칼슘과 마그네슘을 포함하는 따뜻한 (37 ℃) PBS를 넣어. 벤치에 소품으로의 뚜껑을 사용하는 마이크로를 기울이십시오. 면역 염색 동안 모든 배양을 위해 기울어 진 위치에하는 마이크로 유지. </li><li> 입구에 따뜻한 2 % 포름 알데히드를 관류하여 HUVEC를 수정 </li><l난&gt; RT에서 20 분 동안 품어. 5 분마다 PBS로 두 번 씻어. </li><li> 실온에서 10 분 동안 PBS에서 5 % BSA에 트리톤-X 100 (0.1 %)를 추가합니다. </li><li> 5 분마다 PBS로 두 번 씻어. 30 분 동안 PBS에서 5 % BSA로 차단합니다. </li><li> 차 항체 염소와 부화 방지 VE-cadherin의 (1:100)를 2.5 % BSA의 O / N로 4 ℃에서 </li><li> 다음 날, 5 분마다 PBS로 두 번 세척한다. 45 분 동안 차 당나귀 방지 염소 647 항체를 추가합니다. 5 분마다 PBS로 두 번 씻으십시오. </li><li> 1 시간 동안 인간 답게 J591-alexa488 복합 항체로 실온에서 품어. </li><li> 5 분마다 PBS로 두 번 씻으십시오. 5 분 DAPI를 추가합니다. 5 분 동안 증류수로 세척 할 것. </li><li> PBS를 추가 (또는 장기 저장을 위해 MOWIOL). 공 초점 현미경으로하는 마이크로 시각화. </li></ol>

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</ol>

박사 Bander도이 문서에서 사용되는 J591 항체에 대한 코넬 연구 재단 ( &quot;CRF&quot;)에 할당 된 특허의 발명자이다. 박사 Bander도 컨설턴트와 BZL 생물 의약품의 특허가 추가 연구 및 개발을위한 CRF에 의해 허가 된 것으로 회사의 주식을 소유하고 있습니다.

인해 혈액 세포들 사이의 CTCs 낮은 숫자로, 그것은 세포의 순수로의 CTCs 모집단을 분리하는 것이 곤란하다. CTC / EC의 상호 작용을 연구하기 위해,의 CTCs 희귀하고 불순한 인구는 두 가지 주요 도전 포즈 : 혈액 세포들 사이의 CTCs) 확인을; B) CTC / EC의 상호 작용을 관찰. 혈액 세포들 전립선의 CTCs 식별 첫번째 한계를 극복하기 위해, 우리는 사실상 모든 전립선 종양 세포 PSMA 6 표현한다는 사실을 이용 하였다. 단일 클론 항체 J591-488은 PCA의 CTCs는 생체 레이블 및 CTC / EC의 상호 작용 (13)에 대해 연구 할 수있는 제안 바인딩 세포 표면을 따라 내면된다. 항체 및 최대 면역 최적의 국제화를 위해, 우리는 30 분 또는 1 시간도 4 ° C에서 37 ° C 하나에 항체와 MDA 세포를 배양 하였다. 우리는 최대...

전이가 제대로 이해 남아있는 복잡한 여러 단계의 프로세스입니다. E-selectin/selectin 리간드 축은 혈관 내피 세포와 암세포 간의 1,2 차 접착제 상호 작용을 촉진함으로써 종양 전이에 중요한 역할을하는 것으로 밝혀졌다. 다른 E-셀렉틴 리간드 (들) 종양 세포 (3)에 의해 표현되는 반면 내피 (E)-셀렉틴은 활성화 된 내피 세포에 의해 발현 막 횡단 단백질이다. 다수의 체외 방법이 성공적으로 종양 세포와 내피 세포 사이의 E-selectin/selectin 리간드 상호 작용되는 EC (1) 모델로 사용되어왔다. 이러한 상호 작용을 연구하기 위해, 다른 흐름 챔버 시스템은 혈액 혈관 시스템을 시뮬레이션하기 위해 사용하고있다. 유량 용기 어셈블리 중, 내피와 함께 병렬 플레이트 흐름 챔버 (PPFC)는 정기적으로 생체 전단 응력 조건에서 시뮬레이션 체외 모델로 사용됩니다. 이에방법, 내피는 35 mm 접시에 성장하고 단일 층을 달성 한 후, 내피는 PPFC에 부착하고 전단 응력을 기준으로 실험이 수행된다. 그러나 PPFC과 다른 현재의 시스템은 환자와 내피에서 파생 된 종양 세포 (의 CTCs)를 순환 사이의 접착제의 상호 작용을 연구하는 많은 제약을 제시 주로의 CTCs는 혈액 세포의 수백만의 사이에 순환, 기본 종양에서 흘려 세포의 희소 한 인구 때문에 (1 CTC 9 혈구 열마다) 4. 따라서, 배양 세포 라인의 무제한 공급과 달리 낮은 CTC 수는 재생 분석을위한 상호 작용을 기록하는 적절한 흐름의 채널 폭을 필요로하는, 매우 적은 희귀 CTC / EC의 상호 작용을지도한다. 환자 유래의 CTCs가 불순한 인구 때문에 또한, 따라서 식별 마커는 특정의 CTCs를 추적해야합니다. 이 문제를 해결하기 위해서, 우리는 (PCA) CT 전립선 암을 확인하는 새로운 방법을 개발CS 거의 모든 이들의 CTCs가 자신의 세포 표면 5,6에 전립선 특이 막 항원 (PSMA)을 표현한다는 사실을 활용하여. 이 보고서에서, 우리는 결국 전이의 메커니즘을 이해하기 위해, 내피로 전립선 CTC 상호 작용을 연구하기위한 새로운 시스템의 잠재적 인 유틸리티를 보여, 전립선 암 세포주 MDA PCa2b (MDA)를 사용했다. 우리의 방법은 생체 내 혈관 시스템 7-9에서 시뮬레이션 각종 전단을 기준으로 실험에 적용 할 수 있습니다. PCA CTC / EC 상호 작용을 조사 외에, 전류 흐름 챔버 시스템은 쉽게 말초 혈액 단핵 세포를 분석하거나 내피와 종양 세포의 상호 작용을 위해 구성 될 수있다. 분해 및 유량 용기의 재 조립의 용이성,하는 마이크로는 III (0.1) (이하 마이크로 슬라이드로 함), 관류 및 홍보를 유도하는 다른 사이토 카인과 내피를 자극에서 배양되는 EC 수 있습니다식을 otein. 또한, 배양 된 내피 같은 E-셀렉틴 및 P-재조합 단백질은 종양 세포와 상호 작용하는 마이크로 슬라이드 상에 코팅 할 수는 층류 조건 (10)으로 관찰 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Microslide</td><td>Ibidi</td><td>80331</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 튜브</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-96115-08</td><td></td></tr><tr><td>남성 Luer 어댑터</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>여성 Luer 어댑터</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Chemyx Inc</td><td>Fusion 100</td><td></td></tr><tr><td>루어락 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>M199 medium</td><td>Sigma</td><td>M7653</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Mitogen</td><td>Biomedical Technologies</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSMA J591-488</td><td>Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interleukin-1 beta</td><td>Peprotech</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Millipore</td><td>SM-2002-C</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H-3149</td><td></td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Weill Cornell Medical College-Department of Surgery</td><td></td><td>provided by Marco Seandel</td></tr><tr><td>VE-Cadherin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5648</td><td></td></tr><tr><td>10x</td><td>objective Zeiss Plan Neofluar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>효소가 없는 세포 해리 시약</td><td>Millipore</td><td>S-004-C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Lonza</td><td>12-702-F</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-paque plus</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr></tbody></table>

환자와 인간의 내피 세포에서 파생 된 전립선 순환 종양 세포 사이에 e-셀렉틴 매개 상호 작용을 관찰하는 시험 관내 방법에

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

전이는 종양 세포가 차 틈새 시장을 extravasate 및 양식에 대한 액세스를 확보함으로써, 기본 종양 intravasate 혈액 혈관과 림프 시스템에서 창고하는 과정이다. 혈액 혈관 시스템에서 종양 세포의 혈관 외 유출은 다양한 세포주에서 얻은 내피 세포 (EC에) 및 종양 세포를 이용하여 연구 될 수있다. 초기 연구는 정적 조건을 사용하여 실시되었다하지만 그것은 잘되는 EC 생리 흐름 조건에서 다르게 행동하는 것이 설명되어 있습니다. 따라서, 다른 유동 챔버 조립체는 현재의 EC와 암세포 간의 상호 작용을 연구하는 데 사용되고있다. 현재 유량 용기 어셈블리는 다른 전단 응력 조건에서 서로 다른 세포주 또는 유체를 사용하여 재현 가능한 결과를 제공합니다. 그러나, 관찰하고 종양 세포 (의 CTCs)를 순환하는 희귀 세포와의 상호 작용을 연구하기 위해, 특정 변경 내용은 기존의 유량 용기의 조립을 할 필요합니다. 의 CTCs혈액 세포의 수백만 사이 희소 세포 집단이다. 결과적으로,의 CTCs 순수 인구를 얻기 어렵다. 정상적으로 순환에서 발견 세포의 다른 유형의 CTCs 오염은 본 농축 또는 공핍 기술을 사용 불가피하다. 본 보고서에서, 우리는 형광 라벨 순환하는 전립선 암 세포에 고유 한 방법을 설명하고 자기 조립 흐름 챔버 시스템에서의 EC와의 상호 작용을 연구한다. 이 기술은 또한 전립선의 CTCs 및 또한 어떤 단백질 사이의 상호 작용을 관찰하기 위해 적용될 수있다.

그림 1은 마이크로 슬라이드에 내장 컴퓨터의 단일 층의 O / N 문화를 보여줍니다. 그림 1A에 스케일링은하는 마이크로의 100 %는 70 %가 10 배 목표 (그림 1B)를 사용하여 표시되는 동안 5 배 목표를 사용하여 볼 수 있음을 보여줍니다. E-셀렉틴 매개되는 상호 작용의 경우, 가장자리에서 롤링 균체 영상 기록 재생 분석을위한 마이크로 슬라이드의 70 % 이상이 가능하게하는 것으로 간주되지 않는다. 우리의 경험에서, 처음에이 세트 업 어셈블리 문화에 전단 응력에서의 EC의 단일 층을 연습을 필요로한다. 마이크로 슬라이드에 EC 성장을 확립 한 후에, 우리는, 전립선 암 세포 MDA 레이블. J591-488 항-PSMA 항체의 특이성은 건강한 공여자의 혈액에서 아군 및 항-PSMA J591-488 단일 클론 항체에 표지 된 형광 물질로 표지 MDA 세포를 사용하여 시험 하였다. 제공된 PSMA 면역 염색은 PBMC를 (데이터 미...

우리의 보고서는 생리 학적 유동 조건 하에서 전립선 암의 CTC / EC의 상호 작용을 시각화하고 분석 할 수있는 독특한 방법을 설명합니다.

환자와 인간의 내피 세포에서 파생 된 전립선 순환 종양 세포 사이에 E-셀렉틴 매개 상호 작용을 관찰하는 시험 관내 방법에

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

본 절차의 전체적인 목표는 마이크로 슬라이드 유동 장치를 사용하여 희귀 전립선암 세포와 E-selectin을 발현하는 혈관 내피 세포 간의 상호작용을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 마이크로 슬라이드를 피브로넥틴으로 코팅함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 채널 폭이 좁은 마이크로 슬라이드 상의 동적 유동 시스템에서 인간 제대정맥 내피 세포(HUVEC 또는 VE)를 배양하는 것입니다.다음으로, 전립선암 세포를 전립선 특이 막 항원 또는 PSMA 인간화 단클론 항체로 표지하며, 이는 세포 내부로 유입됩니다. 마지막 단계는 anti PSMA로 표지된 전립선암 세포를 e-selectin이 발현되는 혈관 내피세포(VE) 위로 관류시키는 것입니다. 최종적으로, 비디오 현미경을 사용하여 전립선암 세포와 내피세포 간의 상호작용을 관찰합니다.평행판 유동 챔버(parallel plate flow chamber) 및 기타 동적 조립 장치와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 동적 유동 시스템 내에서 순환 종양 세포와 같은 희귀 전립선암 세포와 배양된 내피 세포 사이의 상호작용을 조사할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 전립선 종양 세포가 혈관 시스템을 통해 어떻게 전이되는가? 이들이 백혈구가 이동하는 동안 사용하는 것과 동일한 메커니즘을 사용하는가? 와 같은 전이 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.일반적으로 이 기술에 익숙하지 않은 연구자들은 조직 배양 후드 아래에서 관류 상태의 좁은 채널 내에 내피세포 단층을 배양해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 먼저, 마이크로 슬라이드를 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹굽니다. 그런 다음 1 mL 루어 락 주사기를 사용하여 50 µg/mL 피브로넥틴 200 µL를 마이크로 슬라이드에 부드럽게 코팅합니다.마이크로 슬라이드를 덮개로 덮고 조직 배양 후드 내에 30분 동안 보관하십시오. 다음으로, 따뜻한 qve 성장 배지 200 µL를 마이크로 슬라이드 위에 관류시키고 상온에서 20분 동안 배양하십시오. 액체를 마이크로 슬라이드에 천천히 분주하면 채널 내의 기포 형성을 방지할 수 있습니다.관류 중에 vex를 PBS로 헹구고 0.1% collagenase와 0.05% EDTA가 포함된 PBS를 첨가하여 실온에서 1~2분 동안 처리함으로써 vex 현탁액을 준비합니다. hve를 2 mL의 성장 배지에서 180 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 헤모사이토미터를 사용하여 세포 농도를 측정하고, 성장 배지 100 µL당 10 million cells가 되도록 준비합니다.다음으로, 마이크로 슬라이드의 입구에서 배지를 조심스럽게 제거합니다. 200 µL 피펫 팁을 사용하여 마이크로 슬라이드를 눈높이로 맞춘 다음, 1 mL 루어락 주입기를 사용하여 준비된 농도의 vex 200 µL를 채널 내로 부드럽게 관류합니다. 이 단계에서는 기포 형성을 방지하기 위해 주의가 필요하며, 만약 기포가 나타나면 기포가 배출 채널로 나갈 때까지 조금 더 오래 관류하십시오.다음으로 약 80 µL의 동일한 부피의 VE 배지를 마이크로 슬라이드의 입구와 출구 양쪽에 각각 피펫팅합니다. 이는 세포가 어느 방향으로든 흐르는 것을 방지합니다. 슬라이드를 덮고 37 °C 인큐베이터에서 1.5시간 동안 보관합니다.유동 챔버 조립을 시작하려면, 데드 볼륨을 최소화하기 위해 멸균된 20 milliliter 주사기, 암수 루어 커넥터, 주사기 펌프 및 튜빙을 인큐베이터에 15분 동안 둡니다. 내경이 0.04 inches인 튜빙을 사용하십시오. 튜빙 직경이 작을수록 기포 형성을 방지할 수 있습니다.다음으로, 20 milliliter 주사기에 따뜻한 VE 배지 12 milliliters를 채웁니다. 주사기 내의 기포를 완전히 제거합니다. 마이크로 슬라이드의 입구에 VE 배지를 채웁니다.이 어셈블리를 마이크로 슬라이드에 연결하십시오. 배출구 커넥터를 마이크로 슬라이드에 조심스럽게 부착하십시오. 설비를 인큐베이터로 옮겨 시린지 펌프에 연결하십시오.그 다음, 펌프의 전단 속도를 10 µL/min으로 설정하고 세포를 37 °C 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 마이크로 슬라이드의 입구에 연결된 커넥터를 제거하여 장치를 분해합니다. 그 후, 혈관 내피 세포의 E-selectin 발현을 상향 조절하기 위해 출구 커넥터를 제거합니다.interleukin one beta가 포함된 신선한 배양액을 준비합니다. 10 milliliter 시린지에 배양액을 흡입합니다. 슬라이드 입구에 남아있는 배양액을 제거한 후, 입구가 완전히 채워지도록 신선한 배양액을 추가합니다.주사기를 슬라이드에 연결합니다. 인터루킨 1베타(interleukin one beta)를 vex에 배양하는 동안, 배양기 내에서 주사기 펌프를 10 µL/min의 전단 속도로 4시간 동안 설정하여 anti PSMA Alexa 488 항체로 표지된 전립선암 세포를 준비합니다. 먼저, MDA 전립선암 세포에 0.05% trypsin EDTA를 넣고 1분 동안 둡니다.세포 표면에 존재하는 당펩타이드에 영향을 줄 수 있으므로 세포를 트립신에 너무 오래 노출시키지 마십시오. 세포를 200 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 다음으로, MDA 세포 펠렛을 1 mL의 Hank's Buffer에 재부유시킨 후 anti PSMA 항체를 첨가하고, 배양 과정 중 세포를 재부유시키면서 암실의 상온에서 30분 동안 배양합니다.30분 후, 세포 용액을 800 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 흡입하고 펠렛을 1 mL의 Hank's buffer에 재현탁합니다. 표지된 MDA 세포 수를 측정하고 최종 농도를 1 million cells/mL로 맞춥니다.5 mL 시린지에 라벨이 부착된 MDA 세포를 채우고 기포를 제거합니다. 도립 현미경의 전원을 켜고 10배 대물렌즈에서 조명을 설정합니다. 시린지 펌프를 현미경의 시료 스테이지와 동일한 높이로 맞추고, 전단 응력을 1 dime/cm²로 설정합니다.다음으로, Zeiss Axio vision 소프트웨어를 엽니다. 컴퓨터 화면에서 대물렌즈를 선택합니다. 소프트웨어의 tools 옵션 아래에 새 폴더를 생성합니다.Axio vision의 smart experiments 옵션을 열고 30분 동안 32초의 짧은 비디오를 기록하도록 설정을 조정하십시오. 실시간 형광 비디오의 경우, 이미지 옵션을 설정하십시오. 이러한 파라미터는 Zeiss MRM 카메라를 사용하여 비디오 프레임 속도에 가까운 영상을 얻는 데 도움이 됩니다. 컴퓨터 화면에서 10x 대물렌즈로 유로의 전체 너비를 시각화하려면 CM 마운트 어댑터를 사용하십시오. 시린지와 세포가 포함된 커넥터를 시린지 펌프에 배치하기 전에 수은 램프를 켜십시오. 다음으로, interleukin one beta로 자극된 ax가 포함된 마이크로 슬라이드의 채워진 입구 채널에 커넥터를 연결하십시오.배출 채널을 튜브에 연결된 커넥터와 연결합니다. 유출액을 수집하기 위해 튜브를 디쉬나 15 milliliter 원심분리 튜브에 넣습니다. 10 microliters per minute의 속도로 마이크로 슬라이드를 통해 주입을 시작합니다.488 nm 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 혈관 내피세포와 표지된 MDA 세포 또는 환자 유래 표지된 CTC 간의 상호작용을 관찰하십시오. 실험 과정을 32개의 짧은 영상으로 녹화하십시오.재생 분석 중에 롤링 속도를 측정합니다. 롤링 속도는 세포가 이동한 거리를 시간으로 나누어 측정합니다. 여기에는 내피세포 단층의 하룻밤 배양 상태가 나타나 있습니다.마이크로 슬라이드 상의 모습입니다. 배율 표시를 통해 5x 대물렌즈 사용 시 마이크로 슬라이드의 100%가 보이며, 10x 대물렌즈 사용 시 70%가 보임을 알 수 있습니다. 선택된 매개 상호작용의 경우, 가장자리에서 롤링하는 세포들은 고려하지 않았으며, 이에 따라 마이크로 슬라이드의 70% 이상을 비디오 녹화 및 재생 분석에 사용할 수 있습니다. 박스 플롯은 서로 다른 전단 응력 조건에서 interleukin one beta로 자극된 혈관 내피 세포 상의 표지되지 않은 MDA 세포와 anti PSMA가 표지된 MDA 세포의 롤링 속도 분포를 보여줍니다.10 dyn/cm²의 높은 전단 응력에서 1 dyn/cm²와 5 dyn/cm²의 롤링 속도는 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다. 표지되지 않은 MDA 세포와 anti-PSMA 표지 MDA 세포의 롤링 속도 사이에는 통계적으로 유의미한 차이가 관찰되었습니다. 전립선암 환자의 혈액을 사용하여 촬영한 타임랩스 영상은 표지된 전립선 CTC와 렉틴 발현 내피세포 간의 세 가지 상호작용 유형을 보여줍니다. 이는 CTC가 부착되었다가 다시 떨어지는 테더링(tethering), 30초 후에도 CTC가 떨어지지 않는 안정적 부착(stable adhesion), 그리고 상호작용하지 않는 CTC가 시야에 들어오는 무상호작용(no interactions)으로 구분됩니다. 마이크로 슬라이드는 쉽게 면역 염색 및 형광 이미징이 가능하며, 이를 통해 anti-PSMA 표지 MDA 세포의 강한 부착을 확인할 수 있습니다.interleukin one beta로 자극된 혈관 내피 세포에 주입한 후의 모습을 여기에서 확인할 수 있습니다. 이 영상을 시청하신 후에는, 본 절차에 따라 순환 전립선 종양 세포와 같은 희귀 세포와 S selectin을 발현하는 혈관 내피 세포 간의 상호작용을 검사하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. s selectin 리간드의 존재 여부와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 면역형광법과 같은 다른 방법들도 수행될 수 있습니다.이러한 기술들은 연구자들이 전이 과정에 관여하는 다양한 단계들을 이해하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

암 세포에 의해 내피 세포 단층의 침략을 측정하는 실시간 전기 임피던스 기반 기술

순환 종양 세포는 세포 손상을 보면서 겁에 질리게하지 않고 암 환자의 혈액으로부터 격리됩니다. 종양 세포의 분리는 상피 마커에 대한 항체 이외에 E-selectin의 bimolecular 표면을 사용하여 수행됩니다. 나노튜브 코팅은 특별히 높은 캡처 purities 결과 암 세포 접착을 촉진합니다.

환자의 혈액 샘플에서 가능한 순환 종양 세포의 신속한 분리

테스트 시스템으로 인간의 3D 종양 조직을 만들 수있는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 decellularized 생물 혈관을 비계 (BioVaSc), 인간의 기본 세포와 흐름 생물 반응기의 동적 조건에서뿐만 아니라 정적에서 배양 할 수있는 종양 세포 라인을 기반으로합니다.

인간의 3 차원의 조직 공학<em&gt; 시험관</em&gt; 종양 테스트 시스템

감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에...

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

인간의 혈관 혈액 상호 작용을 조사하기 위한 신뢰할 수 있는 모델의 접근성이 부족합니다. 우리는 혈액(ELISA)과 혈관 구획(현미경) 모두에서 세포 상호 작용을 조사하기 위해 인간 전혈과 결합된 배양된 1차 인간 내피 세포의 체외 모델을 제시합니다.

소설 시험관 인간의 전체 혈액과 내피 세포 사이의 상호 작용 유학을위한 모델

우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 원발성 종양 특이적 내피 세포를 분리하고 배양하는 신뢰할 수 있는 방법을 보고합니다.

종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

이 원고는 순환 종양 세포(CTC)에서 전립선암 환자 유래 이종이식편(PDX)을 생성하는 데 사용되는 방법을 자세히 설명합니다. CTC에서 PDX 모델을 생성하면 전립선암을 연구하기 위한 대체 실험 모델을 제공합니다. 가장 흔하게 진단되는 종양이며 남성의 암으로 인한 사망 원인이 빈번합니다.

전립선 암 환자의 발생은 종양 세포를 순환에서 이종 이식 모델을 파생

우리는 매트릭스 겔 플러그 혈관 분석의 변형을 사용하여 마우스에서의 인간 내피 주연 세포의 상호 작용을 연구하는 프로토콜을 제시한다.

마우스의 매트릭스 젤 플러그 분석을 사용하여 인간의 내피 - 주연 세포 상호 작용의 생체 내 연구에

이 프로토콜의 목표 후속 거세와 전립선 암 세포의 내부 전립선 주사를 설명 하는 것입니다. 안 드로 겐 의존 및 거세 저항 전립선 암의 Orthotopic 전 임상 모델은 임상 관련 종양 microenvironment 및 immunocompetent 호스트의 컨텍스트에서 질병 연구에 중요 한.

발광 및 형광 Orthotopic Syngeneic Murine 모델 Androgen 종속 및 거세 내성 전립선 암

이 분석은 3D 콜라겐 젤에서 배양된 배아체로 분화된 마우스 배아 줄기 세포를 활용하여 시험관 내에서 발아 혈관신생을 제어하는 생물학적 과정을 분석합니다. 이 기술은 약물 테스트, 질병 모델링 및 배아적으로 치명적인 결실의 맥락에서 특정 유전자를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석

매우 정확한 체외 고처리량 분석 시스템은 암 조직과 유사하지만 96웰 및 384웰 플레이트를 가진 체외 고처리량 분석 시스템에 적합하지 않은 환자 유래 종양 오르가노이드(PdOs)를 사용하여 항암제를 평가하기 위해 개발되었다.

환자 유래 종양 오르가노이드를 사용하여 시험관 분석에서 높은 처리량

배우세요 전립선암 순환 종양 세포와 E-셀렉틴 발현 내피 세포 간 상호작용을 마이크로 슬라이드 유동 장치를 이용해 실시간으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 전이 메커니즘 연구와 새로운 치료 전략 개발에 활용됩니다.

환자와 인간의 내피 세포에서 파생 된 전립선 순환 종양 세포 사이에 E-셀렉틴 매개 상호 작용을 관찰하는 시험 관내 방법에

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