환자와 인간의 내피 세포에서 파생 된 전립선 순환 종양 세포 사이에 E-셀렉틴 매개 상호 작용을 관찰하는 시험 관내 방법에

이 절차의 전반적인 목표는 마이크로 슬라이드 흐름 어셈블리를 사용하여 희귀 전립선암 세포와 내피 세포를 발현하는 e selectin 간의 상호 작용을 조사하는 것입니다. 이것은 먼저 마이크로 슬라이드를 피브로넥틴으로 코팅하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 인간 제대 정맥 내피 세포 또는 VE를 채널 폭이 작은 마이크로 슬라이드의 동적 흐름 시스템에서 배양

다음으로, 전립선암 세포는 항 전립선 특이막 항원 또는 PSMA 인간화 단클론 항체로 표지되어 내재화됩니다. 마지막 단계는 ve를 발현하는 e selectin에 anti PSMA 표지된 전립선암 세포를 관류하는 것입니다. 궁극적으로 비디오 현미경은 전립선암 세포와 내피 세포 간의 상호 작용을 보여주는 데 사용됩니다.

병렬 플레이트 유동 챔버 및 기타 동적 어셈블리와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 사용하면 동적 흐름 시스템에서 순환 종양 세포와 배양된 내피 세포와 같은 희귀 전립선암 세포 간의 상호 작용을 검사할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 전립선 종양 세포가 혈관 시스템을 통해 어떻게 전이되는지와 같은 전이 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그들은 백혈구가 화되는 동안 사용하는 것과 동일한 메커니즘을 사용합니까?

일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 조직 배양 후드 아래의 관류 하에 좁은 채널에서 내피 세포의 단층을 배양하는 것과 관련이 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 먼저 마이크로 슬라이드를 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 헹굽니다. 그런 다음 1밀리리터 루어 잠금 주사기를 사용하여 밀리리터당 50마이크로그램의 피브로넥틴 200마이크로리터로 마이크로 슬라이드를 부드럽게 코팅합니다.

마이크로 슬라이드를 뚜껑으로 덮고 조직 배양 후드 안에 30분 동안 보관합니다. 다음으로, 200마이크로리터의 따뜻한 qve 성장 배지를 마이크로 슬라이드에 관류하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 마이크로 슬라이드에서 액체를 천천히 분주하면 채널에서 기포 형성을 방지할 수 있습니다.

관류하는 동안 vex를 PBS로 헹구고 실온에서 1-2분 동안 PBS에 0.1% 콜라겐 분해 효소와 0.05% EDTA를 추가하여 vex 현탁액을 준비합니다. 원심분리기는 2밀리리터의 성장 배지에서 180배 G로 5분 동안 사용합니다. 그런 다음 혈세포 분석기를 사용하여 세포 농도를 측정하고 성장 배지 100마이크로리터당 1,000만 개의 세포를 준비합니다.

그런 다음 마이크로 슬라이드의 입구에서 매체를 조심스럽게 제거합니다. 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 마이크로 슬라이드를 눈높이로 가져오고 1밀리리터 루어 잠금 주사기를 사용하여 준비된 벡스 농도 200마이크로리터를 채널로 부드럽게 퍼냅니다. 이 단계에서는 기포가 나타나는 경우 기포 형성을 방지하기 위해 주의가 필요하며, 기포가 배출구 채널로 들어갈 때까지 약간 더 오랜 시간 동안 관류를 유지하십시오.

다음으로, 약 80마이크로리터의 VE 매체를 동일한 부피로 마이크로 슬라이드의 입구와 출구 모두에 피펫으로 주입합니다. 이것은 어느 방향으로든 세포가 흐르는 것을 방지합니다. 슬라이드를 덮고 섭씨 37도의 인큐베이터에 1.5시간 동안 보관합니다.

플로우 챔버 조립을 시작하려면 멸균 20ml 주사기, 암형 및 수형 루어 커넥터, 주사기 펌프 및 튜브를 인큐베이터에 15분 동안 배치하여 데드 볼륨을 최소화합니다. 내경이 0.04인치인 튜브를 사용했습니다. 더 작은 튜빙 직경은 기포 형성을 방지합니다.

다음으로, 20ml 주사기에 12ml의 따뜻한 VE 배지를 채웁니다. 주사기에서 기포를 완전히 제거합니다. 마이크로 슬라이드의 입구를 VE 매체로 채웁니다.

이 어셈블리를 마이크로 슬라이드에 연결합니다. 콘센트 커넥터를 마이크로 슬라이드에 부드럽게 부착합니다. 설정을 인큐베이터로 가져와 주사기 펌프에 연결합니다.

그런 다음 펌프를 분당 10마이크로리터의 전단 속도로 설정한 후 세포를 섭씨 37도의 인큐베이터에서 밤새 방치합니다. 다음날 마이크로 슬라이드의 입구에 부착된 커넥터를 제거하여 설정을 분해합니다. 그런 다음 배출구 커넥터 2를 제거하여 내피 세포에서 e selectin 발현을 상향 조절합니다.

인터루킨 1 베타를 함유하는 신선한 성장 배지를 준비합니다. 10ml 주사기에서 배지를 흡입합니다. 슬라이드 입구에서 남은 매체를 제거한 다음 입구를 완전히 채우는 새 매체를 추가합니다.

주사기를 슬라이드에 연결합니다. vex의 인터루킨 1 베타 배양 중 인큐베이터에서 4 시간 동안 주사기 펌프를 분당 10 마이크로 리터의 전단 속도로 설정하고 항 PSMA Alexa 4 88 항체 표지 전립선 암 세포를 준비합니다. 먼저 MDA 전립선암 세포에 0.05%트립신 EDTA를 1분 동안 첨가합니다.

세포를 트립신에 장기간 노출시키면 세포 표면에 존재하는 글리코펩타이드에 영향을 줄 수 있으므로 사용하지 마십시오. 200배 G로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 다음으로, Hank's Buffer 1ml에 MDA 세포 구개를 재현탁시키고 항 PSMA 항체를 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 부유하여 배양 중 세포를 현탁시킵니다.

30분 후, 세포 용액을 800배 G로 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 흡인하고 Hank's buffer의 1ml에 재현탁합니다. 라벨링된 MDA 세포를 계수하고 최종 농도를 밀리리터당 100만 개의 세포로 가져옵니다.

5ml 주사기에 라벨이 붙은 MDA 세포를 채우고 기포를 제거합니다. 도립 현미경을 켜고 curler 조명을 10 x 대물렌즈로 설정합니다. 현미경의 샘플 단계와 동일한 높이의 주사기 펌프를 가져와 1센트당 1센트 제곱 전단 응력으로 설정합니다.

그런 다음 Zeiss Axio 비전 소프트웨어를 엽니다. 컴퓨터 화면에서 목표를 선택합니다. 소프트웨어의 도구 옵션 아래에 새 폴더를 만듭니다.

Axio vision에서 스마트 실험 옵션을 열고 30분 동안 짧은 32번째 비디오를 녹화하도록 설정을 조정합니다. 라이브 형광 비디오의 경우 이미지 옵션을 설정합니다. 이러한 매개변수는 Zeiss MRM 카메라로 비디오 프레임 속도에 가까운 비디오를 얻는 데 도움이 되며, 컴퓨터 화면에서 10 x 대물렌즈에서 흐름 채널의 전체 너비를 시각화하고, 주사기와 세포가 포함된 커넥터를 주사기 펌프에 배치하기 전에 수은 램프의 CM 마운트 어댑터 스위치를 사용합니다. 다음으로, 인터루킨 1 베타 자극 축을 포함하는 마이크로 슬라이드의 채워진 입구 채널에 커넥터를 부착합니다.

튜브에 부착된 커넥터와 콘센트 채널을 연결합니다. 튜브를 접시나 15ml 원추형 튜브에 넣어 흐름을 수집합니다. 분당 10마이크로리터의 속도로 마이크로 슬라이드를 통해 주입을 시작합니다.

내피 세포와 488나노미터 미만의 환자에서 유래한 표지된 MDA 세포 또는 표지된 CTC 간의 상호 작용을 관찰합니다. epi 형광 현미경을 필터링합니다. 실험을 32번째 짧은 동영상으로 녹화하기 시작합니다.

재생 해석 중에 롤링 속도를 측정합니다. 롤링 속도는 시간이 지남에 따라 셀이 이동한 거리를 나누어 측정합니다. 여기에 표시된 것은 내피 세포의 단층을 하룻밤 동안 배양한 것입니다.

마이크로 슬라이드에서. 스케일링은 마이크로 슬라이드의 100%가 5x 대물렌즈를 사용하여 보이는 반면, 70%는 선택된 매개 상호 작용에 대해 10 x 대물렌즈를 사용하여 표시되며, 가장자리에서 롤링되는 세포는 고려되지 않으며, 이는 마이크로 슬라이드의 70% 이상을 비디오 녹화 및 재생 분석에 사용할 수 있도록 합니다. 상자 플롯은 서로 다른 전단 응력 조건에서 인터루킨 1 베타 자극 내피 세포에 대한 라벨링되지 않은 PSMA와 anti PSMA, 라벨링된 MDA 세포의 롤링 속도 분포를 보여줍니다.

1 및 5 딘 센티미터 제곱의 롤링 속도에서 센티미터 제곱 당 10 다임의 높은 순파 응력에서 큰 차이는 관찰되지 않았습니다. 표지되지 않은 PSMA와 표지된 MDA 세포의 롤링 속도 사이에 통계적으로 유의미한 차이가 관찰되었으며, 전립선암 환자의 혈액을 사용하여 촬영한 시간 스티칭 비디오는 표지된 전립선 CTC와 렉틴 발현 내피 세포 사이의 세 가지 유형의 상호 작용을 보여주며, CTC가 부착 및 재부착되는 내피 세포 테더링, 30초 후에도 CTC가 분리되지 않고 비상호 작용 CTC가 시야에 들어올 때 상호 작용이 없는 안정적인 접착력을 보여줍니다. 마이크로 슬라이드는 쉽게 면역 염색 할 수 있으며 MDA 세포로 표지 된 안티 PSMA의 확고한 접착력을 형광 이미지화할 수 있습니다.

인터루킨이 많이 투여된 후 하나의 베타 자극 내피 세포를 여기에서 볼 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 순환 전립선 종양 세포와 같은 희귀 세포와 내피 세포를 발현하는 S 셀렉트인 사이의 상호 작용을 검사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. s selectin의 존재와 같은 추가 질문에 답하기 위해 면역형광과 같은 다른 방법도 수행할 수 있습니다. 리간드.

이와 같은 기술은 연구자들이 전이와 관련된 다양한 단계를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.