늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색 초파리 조직 제자리에서

이 절차의 전반적인 목표는 초음파 처리 후 형광 현미경을 사용하여 C 2의 조직을 시각화하거나 채우는 것입니다. 이것은 먼저 배아 및 유충 샘플을 수집한 다음 포름알데히드, 헵탄 및 메탄올을 사용하여 고정함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 항체 침투를 허용하기 위해 큐티클을 제거하기 위해 고정 샘플을 초음파 처리하는 것입니다.

다음으로, 샘플은 1차 및 형광 2차 항체를 사용한 면역 염색입니다. 마지막 단계는 글리세롤 기반 Antifa 용액에 샘플을 장착하는 것입니다. 궁극적으로, 컨포칼 또는 에피 형광 현미경은 발달 조직과 단백질 발현 및 국소화를 시각화하는 데 사용됩니다.

조직 해부와 같은 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 다양한 개발 조직을 시각화할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 초음파 처리 단계가 소닉카 프로브의 적절한 위치를 포함하여 최대 효율성을 달성하기 위해 여러 요인에 의존하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 Ashley Fiddler와 Lauren Bole로, 제 연구실의 재능 있는 두 명의 학부생 연구원입니다.

실험을 시작하려면 인산염 완충액 Triton X 100 또는 PBTX 용액을 섞은 작은 페인트 브러시를 사용하여 한천 플레이트에 수집된 배아를 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 샘플이 들어 있는 페인트 브러시를 셀 스트레이너의 내부를 향한 융기에 닦습니다. 셀 스트레이너 아래에 페트리 접시 덮개를 놓습니다.

그런 다음 PBTX가 들어있는 분출 병으로 페인트 브러시와 세포 여과기의 벽을 헹굽니다. 샘플을 스트레이너로 옮긴 후 스트레이너에 충분한 PBTX를 부어 샘플을 메쉬에서 들어 올립니다. 이 단계를 세 번 반복하여 효모와 파리 폐기물을 제거하고 PBTX를 제거합니다.

그런 다음 여과기에 50% 표백제 용액을 붓고 유충을 용액에 5분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 용액을 제거합니다. 그런 다음 PBTX로 샘플을 세척하고 샘플을 용액에 3분 동안 그대로 둡니다.

단계를 5 번 반복하고 세포 여과기의 바닥을 건조시킵니다. 그런 다음 PBTX가 묻은 페인트 브러시를 사용하여 샘플을 1.75ml의 펨이 들어 있는 섬광 바이알로 옮깁니다. 흄 후드에 250마이크로리터의 37% 포름알데히드와 8밀리리터의 시약 등급을 추가합니다.

섬광 바이알에 헵탄을 넣고 200RPM으로 20분 동안 바이알을 흔듭니다. 그런 다음 수성상을 제거하지 않고 섬광 바이알에 10ml의 메탄올을 넣고 500RPM으로 세게 흔듭니다. 흔든 후 즉시 내용물을 액체 폐기물 용기 위의 세포 여과기에 붓습니다.

바이알에 메탄올을 더 넣고 세포 여과기를 통해 내용물을 통과시킵니다. 전체 샘플이 제거되었는지 확인합니다. 실험실 조직으로 세포 여과기의 바닥을 시험해 보십시오.

그런 다음 페인트 브러시를 사용하여 여과기의 샘플을 0.5ml의 메탄올이 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 샘플이 가라앉을 때까지 기다립니다. 그런 다음 피펫으로 메탄올을 제거하고 새로운 0.5ml의 메탄올 분취량으로 교체합니다.

이 단계를 세 번 반복하고 튜브에 최종 0.5ml의 메탄올을 첨가한 후 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 나중에 냉동고에서 저장된 샘플을 꺼내고 피펫으로 메탄올을 제거하십시오. 그런 다음 1ml의 50% 메탄올 인산염 완충액 트윈 또는 PBTW 용액을 튜브에 넣고 튜브를 3분 동안 흔듭니다.

다음으로, PBTW 1ml로 샘플을 두 번 헹구어 샘플이 가라앉도록 한 후 피펫으로 PBTW를 빼낸 후 바이알에 1.0ml의 소 혈청 알부민 인산염 완충 트윈(BBTW)을 넣고 3분 동안 흔듭니다. 샘플이 가라앉고 피펫으로 BBTW를 제거하도록 합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.

샘플을 잃지 않고 가능한 한 많은 BBTW를 제거하도록 주의하십시오. 그런 다음 튜브에 0.5ml의 BBTW를 넣고 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 초음파 처리를 10 % 최대 진폭으로 설정하고 일정한 이온으로 2 초의 런타임을 설정하고 프로브 팁을 탈 이온수로 채워진 50 밀리리터 원추형 튜브에 넣어 에이터 프로브를 청소하고 초음파 처리를 실행합니다.

그런 다음 초음파 처리 프로브를 실험실 조직으로 건조시킵니다. 프로브를 샘플에서 3-4mm 위의 튜브에 담그고 초음파 처리를 시작합니다. 그런 다음 튜브를 제거하고 30 초 동안 얼음 위에 올려 초음파 처리로 인한 과열을 방지하고 샘플이 튜브 바닥에 가라 앉을 수 있도록합니다.

초음파 처리가 완료된 후 샘플 연령에 따라 필요에 따라 이 단계를 반복합니다. 샘플을 1밀리리터의 BBTW로 두 번 헹굽니다. 헹굴 때마다 BBTW가 건조되기 전에 샘플이 가라앉도록 합니다.피펫으로 바이알에 BBTW 1ml를 넣고 로커에 놓습니다.

3분 후 샘플이 가라앉도록 하고 피펫으로 BBTW를 제거합니다. 그런 다음 이것을 반복하십시오. 두 번 단계로, BBTW에 희석된 0.5% 일반 혈청 0.5ml로 샘플을 튜브에 막고 실온에서 1시간 동안 로커에 샘플을 놓습니다.

다음으로, 0.5ml의 1차 항체 용액을 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 샘플을 흔들어 샘플이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 그런 다음 피펫으로 1차 항체를 제거하고 1ml의 BBTW로 두 번 헹굽니다. 바이알에 BBTW 1ml를 넣은 다음 3분 동안 로커에 올려 놓습니다.

그런 다음 피펫으로 BBTW를 제거하고 이것을 반복합니다. 5 회 단계, 5 % 정상 혈청 BBTW 용액으로 샘플을 막고 30 분 동안 흔듭니다. 그런 다음 용액을 제거하십시오.

5% 일반 혈청 BBTW 용액으로 희석된 2차 항체를 넣고 튜브를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 밤새 샘플을 흔듭니다. 피펫으로 2차 항체를 추출하고 PBTW 1ml로 검체를 두 번 헹굽니다.

다음으로, 바이알에 PBTW 1ml를 넣고 5분 동안 로커에 올려 놓습니다. 그런 다음 샘플이 가라앉을 때까지 기다렸다가 피펫으로 PBTW를 제거합니다. 이 작업을 반복합니다.

세 번 누릅니다. 튜브에 80-100마이크로리터의 DAB co 용액을 넣고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 마지막으로, 샘플을 장착하려면 5-10 마이크로 리터의 bb BCO p lene diamine 또는 PPD anti fade를 사용하십시오.

그런 다음 형광 현미경으로 확인하십시오. 4개의 컨포칼 슬라이스에 대한 이러한 Z 투영은 C의 개별 세포뿐만 아니라 형태학적 특징을 시각화하기 위한 프로토콜의 효능을 보여줍니다: 2개는 초파리 발달의 후기 배아부터 초기 및 중반 L의 3단계 동안입니다. 고환 발달은 고환 성숙이 유충 발달 전반에 걸쳐 역동적이기 때문에 프로토콜 효능을 설명하기에 특히 좋은 시스템입니다.

이 이미지는 빨간색 및 허브 세포의 생식 세포와 중간 L 3 개의 뇌의 녹색 단일 공초점 절편에있는 FU 영역을 강조합니다. 신경절 모세포, 녹색의 미분화 뉴런 및 미성숙 및 1차 뉴런에 대한 면역 염색. 빨간색은 장착 방향에 따라 뇌엽과 복부 신경삭에서 뚜렷한 발현 패턴을 가진 강한 염색을 보여주며, 이미징을 통해 등쪽 표면, 복부 표면 또는 시상 단면에서 뇌 조직을 시각화할 수 있습니다.

이 in situ two 기술을 통해 생물학자들은 보호 큐티클이 항체 침투를 막는 유기체의 조직 형태 형성에서 장기 발달을 탐구할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 C two에서 발달 중인 조직을 시각화하기 위해 후기 단계의 배아 및 유충 식도 샘플을 초음파 처리하고 면역 염색하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 포름알데히드, 헵탄 및 메탄올로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 흄 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치가 필요할 수 있음을 잊지 마십시오.

이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 장갑과 실험복을 착용해야 합니다.