Name: 후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 배우세요 후기 배아 Drosophila 수컷 고나드의 해부 및 라이브 이미징 기법을 통해 생식소 발생 과정에서 세포 역학을 실시간 관찰하는 방법을 익히세요. 이 프로토콜은 발달생물학 연구에 필수적인 정밀 조직 조작 기술을 제공합니다.

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이 프로토콜의 초기 개발에 상당한 기여를 한 Lindsey W. Plasschaert와 Justin Sui에게 감사드립니다. 저자들은 시약에 대한 관대함에 대한 비행 공동체, 특히 루스 레만과 벤자민 린에게 출판 전에 nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' 라인을 선물한 것에 대해 감사하고 있습니다. Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537)로부터 얻은 주식을 본 연구에 사용하였다. 이 작업은 NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 및 R35GM136270 (S.D)뿐만 아니라 교육 보조금 T32GM007229 (B.W.) 및 F32GM125123 (L.A.)에 의해 지원되었습니다.

1. 전일 해부 준비
<ol><li>생성된 직경이 대략 0.03 mm가 되도록 텅스텐 바늘(24 )을 전해적으로 날카롭게 한다. 공급되는 전압을 약 14V로 조정하고 3.3M NaOH를 사용합니다. 선명하게하는 데는 1 ~ 2 분을 넘지 않아야합니다. 주의: NaOH는 부식성이 강하며 피부에 닿으면 화상을 입을 수 있습니다. 취급하는 동안 장갑과 고글을 착용하고 흄 후드 내부에서 작업하십시오. 참고: 사용 후 NaOH를 폴리프로필렌 팔콘 튜브에 보관하십시오.</li>
	<li>준비된 이미징 미디어를 만듭니다. 15mL 원뿔형 튜브에서 슈나이더 배지 4.25mL를 750μL의 태아 소 혈청(FBS, 최종 농도 15%)과 페니실린-스트렙토마이신 27.5μL(페니실린 0.05U/μL, 최종 농도 0.05μg/μL)와 결합합니다. 이렇게 제조된 이미징 배지를 4°C에서 보관한다.</li>
	<li>헵탄 접착제 용액을 만드십시오. 약 0.5 mL 헵탄을 약 20 cm 양면 테이프로 채워진 20 mL 밀봉가능한 바이알에 첨가한다. 약 한 시간 동안 너트 테이터에 올려 놓거나 물과 글리세롤 사이의 일관성이 달성 될 때까지 피펫 팁으로 저어줍니다. 용해 된 접착제의이 용액은 헵탄이 증발하기 전에 며칠 동안 지속됩니다. 용액을 신선하게하려면 0.5 mL의 헵탄을 추가로 넣고 흔들어줍니다. 참고 : 효과적인 헵탄 접착제 용액은 테이프에 대한 헵탄의 다양한 비율뿐만 아니라 흔들림 / 교반의 다양한 기간을 사용하여 준비 할 수 있습니다. 위의 사양은 그러한 적절한 솔루션 중 하나를 준비하거나 신선하게하기위한 제안 일뿐입니다.</li>
</ol>2. 배아 채취—해부 전 15~17시간
<ol><li>신선한 효모 페이스트를 사과 주스 한천 플레이트(25)에 첨가하십시오. 작은 구멍26으로 천공 된 빈 음식 병에 성인 파리 (10 일 미만)를 추가하여 배아 수집 케이지를 설정하십시오. 효모화된 한천 플레이트를 사용하여 수집 케이지를 캡핑하고, 병에 테이핑하고, 플레이트 측과 함께 케이지를 25°C 어두운 인큐베이터에서 1시간 동안 아래로 놓는다. 참고 : 파리는 생식선을 형광으로 표시하는 이식 유전자를 발현해야합니다 (예 : six4-eGFP : : Moesin20)는 배아의 해부가 입체 형광 현미경으로 발생하기 때문입니다. 생식선을 표시하는 데 사용되는 유전자형 목록은 자료 표를 참조하십시오.</li>
	<li>인큐베이터에서 케이지를 제거하고 첫 번째 컬렉션을 버리십시오. 갓 효모 한천 접시로 교체하고 케이지를 2 시간 동안 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 참고 : 첫 번째 배아 수집은 수정 된 배아의 암컷을 지우고 배아를 발달시키는 데 사용되어 단단히 정해진 두 번째 배아 수집을 달성합니다.</li>
	<li>케이지에서 한천 플레이트를 꺼내 밀봉 가능한 플라스틱 용기 내부의 촉촉한 종이 타월에 효모가 묻은 쪽을 위쪽으로 향하게하십시오. 이 습한 챔버를 25 °C 인큐베이터에 두어 배아를 14.5 시간 동안 숙성시킵니다 (최종 나이, 알을 낳은 후 14.5-16.5 시간). 참고: 2.4단계를 시작하기 직전에 3.1단계와 3.2단계를 완료하십시오.</li>
	<li>인큐베이터에서 한천 플레이트를 제거하고 분출 병을 사용하여 한천 플레이트에 충분한 물을 첨가하여 페인트 브러시로 가볍게 양치하여 효모 페이스트를 용해시킵니다. 배아를 헹구고 효모를 계량 보트 안에 앉아있는 작은 메쉬 스크린 바구니에 녹입니다. 대부분의 효모 페이스트가 메쉬를 통해 여과 될 때까지 물 분출 병으로 바구니를 헹구십시오.</li>
	<li>계량 보트에서 물을 제거하고 바구니를 다시 안에 넣으십시오. 배아를 50 % 표백제 용액에 담그고 분출 병을 사용하여 배아를 Dechorionate하십시오. 표백제 용액의 깊이는 3-5mm이어야합니다. 배아를 표백제에 잠기고 ~ 2 분 동안 가끔 소용돌이치게하십시오. 주의: 표백제는 부식성이 있으며 눈과 호흡기를 자극하거나 손상시킬 수 있습니다. 표백제를 다루는 동안 장갑과 고글을 착용하십시오. 참고: 이 시간 동안 3.3단계를 가능한 한 많이 완료하십시오. 데코리오네이션 진행은 바스켓을 스테레오 현미경 아래에 놓고 등쪽 부속기가 없는지 확인하여 확인할 수 있습니다. 필요한 경우 배아를 표백제 용액에 추가 시간 동안 잠급니다.</li>
	<li>표백제를 버리고 바구니 안의 배아를 분출 병의 물로 철저히 헹구십시오 (~ 3 초 동안 메쉬 바구니를 종이 타월로 얼룩지게하고 2-3 번 반복하십시오).</li>
</ol>3. 해부 당일 준비
<ol><li>30 μL 인슐린 (10 mg/mL)을 1.5 mL 에펜도르프 튜브 (0.2 mg/mL 최종 농도)에서 준비된 이미징 배지 (단계 1.2 참조)에 첨가하십시오. 잘 섞어서 튜브를 벤치 탑에 두어 실온과 평형을 유지하십시오.</li>
	<li>접착제로 코팅 된 커버 슬립 스트립을 준비하십시오.<ol>
<li>다이아몬드 팁이 달린 나이프를 사용하여 22mm x 22mm 커버슬립을 동일한 크기의 네 개의 스트립으로 자릅니다(그림 1A).</li>
		<li>포셉을 사용하여 스트립 하나를 집어 들고 총 약 30μL의 헵탄 접착제 용액을 스트립의 양쪽에 퍼뜨립니다(그림 1B). 접착제 잔류 물의 균일 한 층을 얻으려면 헵탄이 증발하는 동안 스트립을 다양한 각도로 기울이십시오.</li>
		<li>접착제로 덮인 스트립을 커버 슬립 박스의 빈 슬롯에 보관하십시오. 끈적임을 유지하려면 스트립을 기울어지지만 똑바로 세운 위치에 놓고 상자 가장자리에 기대어 상자 표면과의 접촉을 최소화합니다(그림 1C). 공기 중의 미립자가 접착제를 코팅하지 않고 끈적 거림을 줄이도록 상자를 닫으십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>벤치 탑에 다음 품목을 놓습니다 : 6 인치 유리 파스퇴르 피펫, 현미경 슬라이드, 적절한 피펫 팁이있는 P200 및 P1000 피펫만, 링거 용액27 (NaOH로 pH가 7.3으로 조정됨) 및 밝혀지지 않은 Poly-D-Lysine 코팅 35mm 이미징 디쉬.</li>
	<li>메쉬 스크린 바구니에서 배아를 500-750 μL 헵탄으로 채워진 작은 시계 유리로 옮깁니다.<ol>
<li>바구니의 측면과 바닥을 블롯하여 티슈 닦아내기로 말립니다. 헵탄에 페인트 브러시를 적시고 페인트 브러시를 배아에 닿은 다음 (소수성 비텔린 막은 강모에 달라 붙어야합니다), 페인트 브러시를 시계 유리의 헵탄에 다시 담그십시오 (배아는 바닥에 가라 앉아야합니다). 참고 : 배아가 건조되는 것을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 다음 단계를 수행해야합니다. 배아는 20 초 이상 공기에 노출되어서는 안됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>배아를 파스퇴르 피펫을 사용하여 현미경 슬라이드 상으로 옮깁니다(그림 1D). 배아를 피펫에 천천히 넣고 피펫의 좁은 부분으로 제한하십시오. 피펫 배아를 슬라이드에 천천히 올려 놓으면 슬라이드로 흘러 들어가기 전에 피펫 끝 바로 안쪽에 응집됩니다. 조직의 모서리를 닦아내고 미세한 팁으로 닦아내고 슬라이드의 배아에서 헵탄을 떼어냅니다. 그들은 더 작은 영역을 집계하고 덮을 것이므로 다음 단계에서 접착제로 덮인 스트립에서 쉽게 캡처 할 수 있습니다.</li>
	<li>포셉으로 접착제로 덮인 스트립을 집어 들고 배아에 부드럽게 만집니다 (그림 1E). 스트립을 이미징 접시, 배아 사이드 업 및 Poly-D-Lysine 코팅 센터 바로 바깥에 놓습니다. 포셉을 사용하여 접시에 스트립을 눌러 제자리에 고정되도록하십시오. 즉시 접시에 2-3.5 mL 링거의 용액을 넘치게하십시오. 배아가 건조되는 것을 방지하기 위해 배아를 먼저 잠수시킵니다 (그림 1F).</li>
</ol>4. 해부
참고: 이러한 단계는 스테레오 형광 현미경으로 수행해야 합니다.
<ol><li>10-15 개의 배아를 일탈시킵니다. 참고 : 이것은 초보자를위한 두 개의 배아에서 전문가를위한 열 다섯 개의 배아에 이르기까지 다양 할 수 있습니다.<ol>
<li>장 형태학에 따라 16단계 배아를 선택합니다(그림 2). 이 단계에서 배아는 네 개의 누적 된 장 세그먼트를 만드는 세 가지 장 수축을 가지고 있습니다 (그림 2 B, B'). devitellinization을 시작하려면, 텅스텐 바늘로 한쪽 끝, 바람직하게는 앞쪽에 선택된 배아를 관통하십시오. 배아는 비텔린 막에서 튀어 나올 수 있지만, 그렇지 않은 경우 배아에서 막을 벗겨냅니다. 참고: 해부하기에는 너무 어린 배아는 비지역화된 내장을 가지고 있습니다(그림 2C). 17 단계 배아의 해부는이 단계에서 큐티클이 발달하기 시작하기 때문에 16 단계 배아의 해부보다 더 어렵습니다. 초기 단계 17 배아는 서로 상대적으로 이동되는 네 개의 장 세그먼트와 함께 존재합니다 (그림 2 D, D').</li>
		<li>생식선에서 멀리 떨어진 지역의 배아를 통해 바늘을 걸으십시오. 후크 된 배아를 접시의 폴리 라이신 코팅 영역 (여기서부터 단순히 "커버 슬립"이라고 함)으로 옮기고 부착 될 때까지 바닥에 드래그하십시오. 이 단계를 반복하고, 폴리라이신 코팅 커버 슬립(그림 3A)의 상단을 따라 파괴된 배아를 연속적으로 배열하고, 추가 해부를 위해 아래에 충분한 공간을 남겨 둡니다. 참고 : 생식선은 사용 된 특정 마커와 전이유전자 사본 수에 따라 밝게 형광을 띄어야하는 세포의 작은 구형 응집체로 나타납니다. 이 단계에서 생식선은 A5 세그먼트에 측면으로 위치하며 앞쪽에서 배아 길이의 약 70 % -80 %에 위치합니다. 해부 프로토콜 전반에 걸쳐, 조직은 바늘에 달라 붙을 수 있습니다. 파편의 바늘을 제거하려면 링거 용액의 표면 바로 위에 올려 놓습니다. Devitellinization은 적절한 생식선이 가능한 한 적게 방해받는 한 깔끔하지 않을 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>생식선을 배아에서 꺼내 접시 위에 올려 놓습니다 (그림 3C, D).<ol>
<li>먼저, 배아를 파일럿하여 그 내부를 노출시킨다(도 3C). 배아를 중심에서 슬라이스하여 바늘을 후방으로, 생식선 사이로 움직입니다. 외부 큐티클보다 접시에 훨씬 잘 달라 붙을 것이므로 내부 조직을 놀리십시오. 조직의 끈적 거림은 다음 조작이 생식선을 드러내고 커버 슬립에 부착 할 수있게합니다. 참고 : 조직이 접시에 달라 붙지 않으면 코팅 된 커버 슬립의 오염되지 않은 영역에 동축하십시오. 커버 슬립의 외부 영역은 특히 끈적 끈적합니다. 단계 4.1.2에서 언급했듯이, 해부 조작이 생식선이 상처가없는 한 맹글링 된 배아 시체를 초래하는지 여부는 중요하지 않습니다.</li>
		<li>바늘을 사용하여 생식선을 포함한 조직 조각이 나머지 시체에서 분리 될 때까지 생식선 주위를 슬라이스하십시오. 바늘로이 조직을 코팅 된 커버 슬립의 신선한 부위에 당기고 접시에 부착 될 때까지 바닥에 대고 동축하십시오. 참고 : 생식선 자체가 덮여있는 조직을 통한 간접적 인 부착보다는 덮개 슬립에 직접 부착되는 경우에 가장 적합한 이미징이 달성됩니다. 따라서 조직이 시체에서 멀어지면서 생식선이 외부 조직보다는 덮개 슬립을 먼저 만지도록 시도하십시오.</li>
		<li>바늘로 생식선으로부터 부착 조직을 부드럽게 드래그하여 가능한 한 많은 주변 조직을 생식선으로부터 제거한다(그림 3D). 생식선을 직접 만져서 손상되지 않도록 하십시오(그림 4E). 생식선이 접시에 충분히 부착되도록 하려면 바늘을 생식선 주위의 부드러운 원형 운동으로 움직입니다 - 움직이면 바늘을 나머지 부착 조직에 대고 고나드를 끈적 끈적한 덮개 슬립의 신선한 영역으로 향하게하십시오. 생식선의 감지 가능한 움직임이 없을 때까지이 과정을 반복하십시오.</li>
		<li>배아 시체로 돌아가서 두 번째 생식선을 해부하십시오. 가능한 한 많은 배아에서이 과정을 반복하지만 25 분을 초과하지 마십시오. 조직 생존력은 ~ 40-45 분 이상 후에 링거의 솔루션에서 손상 될 것입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>해부가 완료되면 지울 수없는 마커를 사용하여 이미징 접시의 바깥 쪽 테두리에 등록 마크를 추가하여 해부 중 방향을 기록하십시오.</li>
	<li>접시에서 접착제로 코팅 된 스트립을 제거하십시오.<ol>
<li>스트립 아래에 포셉 한 쌍의 바닥 단자를 부드럽게 삽입하고 걸쇠를 천천히 위쪽으로 기울여 링거 용액의 슬로싱을 최대한 줄이면서 접시에서 꺼내어 부착 된 생식선의 방해를 최소화하십시오. 참고 : 스트립은 해부 된 생식선에서 멀리 기울여야합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>링거 용액의 슬로싱을 피하는 방식으로 접시를 이미징 현미경으로 부드럽게 운반하십시오.</li>
</ol>5. 이미징
<ol><li>이미징 접시를 무대 홀더에 놓고 등록 마크를 사용하여 접시를 해부 중과 같이 대략적인 방향으로 놓습니다. 밝은 필드 현미경과 저전력 (~ 10x) 목표를 사용하여 커버 슬립에 부착 된 조직 조각을 식별하고 초점을 맞 춥니 다. 아이피스 설정을 전환하여 형광을 드러내고, 쌍안경 접안 렌즈를 사용하여 접시를 체계적으로 스캔하여 이미징 소프트웨어 내에서 각 생식선의 위치를 표시합니다( 자료 표 참조). 참고: 위치를 표시하기 전에 생식선이 시야각에 집중되어 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>이미징 접시를 홀더에 넣고 전체 스테이지 홀더 어셈블리를 조심스럽게 분리하고 어셈블리를 작업대에 놓습니다.</li>
	<li>링거의 용액을 인슐린을 함유한 준비된 이미징 배지로 교체하십시오 (단계 1.2 및 3.1 참조).<ol>
<li>P1000을 사용하여 이미징 접시의 내부 상단 선반에서 모든 링거 용액을 제거합니다(중앙 커버 슬립 영역에서 링거를 피펫하지 마십시오). 그런 다음 P200으로 전환하고 팁을 중앙 영역의 나머지 링거 표면 바로 아래에 놓습니다. 조심스럽게 링거 50-100 μL를 제거하십시오. 전체 솔루션을 제거하지 마십시오.</li>
		<li>~200μL의 이미징 미디어를 뽑아서 P200 팁을 나머지 링거의 표면 바로 아래에 다시 놓고 천천히 이 이미징 미디어를 추가합니다. 다음으로, 나머지 이미징 매체 (~ 1,300 μL)를 상단 선반의 최외곽 테두리에서 시작하여 접시에 추가하십시오. 피펫팅하는 동안 유체의 중앙 돔쪽으로 이동하고 결국 두 가지를 가로 질러 피펫 팁을 브러시하여 두 가지를 병합합니다. 뚜껑을 접시에 올려 놓습니다. 참고: 이미징 미디어는 증발을 방지하기 위해 접시의 전체 내부 직경(약 2mm 깊이)을 덮어야 합니다(그림 4D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>현미경을 더 높은 동력 목표 (63x, 1.2 NA)로 전환하고 사용 된 목표 (목표에 필요한 침지 유체 유형 및 굴절률)에 따라 적절한 침지 유체를 적용한 다음 스테이지 홀더 어셈블리를 교체하십시오. 밝은 필드 현미경을 사용하여 이미징 접시의 바닥에 부착 된 조직에 초점을 맞 춥니 다. 참고 : 무대가 움직이지 않았다면, 목표가 집중되면 마지막 생식선이 보입니다.</li>
	<li>표시된 각 생식선 위치를 단계별로 실행하고 필요에 따라 해당 위치를 조정하십시오. 이미지 선명도, 생식선 섹스 등을 기반으로 이미지 할 생식선을 선택하십시오. 이미징 설정(다중 채널, 노출 시간, 레이저 강도, Z 시리즈 증분, 적절한 간격의 타임랩스 등)을 사용자 지정합니다. 이미징을 시작합니다. 참고 : 남성 생식선은 틈새 시장과 생식선의 반대쪽 끝, 남성 특이적 체세포 생식선 전구체 (msSGPs)라고 불리는 작고 매우 원형의 체세포 클러스터의 존재로 식별 할 수 있습니다. six4-eGFP::moesin 형광 마커가 사용되는 경우, 틈새 세포는 생식선에서 두 번째로 밝은 세포이며, 가장 밝은 것은 msSGP입니다. 이 단계에서 여성 생식선에는 틈새 시장이나 msSGP가 없습니다.</li>
</ol>

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생식선 형성 동안, 배아 생식선, 특히 남성 생식선(15) 내의 줄기 세포 틈새는 급속한 형태 학적 변화를 겪습니다. 이러한 역동적 인 변화의 기초가되는 발달 메커니즘은 라이브 이미징 기술을 통해 가장 잘 이해됩니다. 그러나, 배아 단계 17에서, 생식선의 생체내 영상화는 대규모 근육 수축(17)의 시작에 의해 불가능하게 된다. 이 프로토콜을 통해 우리는 성공적인 대안을 제공합니다 : 생식선을 생체 외 라이브 이미징을위한 이미징 접시에 직접 해부합니다. 이 프로토콜은 후기 단계 배아 생식선의 라이브 이미징을 달성하는 데 사용할 수있는 유일한 방법을 제시합니다.
프로토콜의 중요한 단계는 손재주와 타이밍에 중점을두고 실행되어야합니다. 해부 전에, 배아의 신속한 부착은 배아가 탈수되지 않고 건강하고 turgid를 유지하도록하는 것이 가장 중요하며, 이는 탈종 및 해부를...

Drosophila melanogaster 고환은 많은 역동적 인 세포 과정에 대한 우리의 이해를위한 패러다임으로 사용되었습니다. 이 모델에 대한 연구는 줄기 세포 분열 조절 1,2,3, 생식 세포 발달4,5, piRNA 생물학 6,7,8 및 틈새 줄기 세포 신호 전달 사건9,10,11,12,13에 대해 밝혀 냈습니다. 이 모델은 유전적으로 견인성이 있고 14,15 이고 자연 환경3,16,17,18에서 줄기 세포를 생생하게 볼 수 있는 몇 안되는 곳 중 하나이기 때문에 유리하다. 그러나이 모델의 라이브 이미징은 성인 조직과 초기 배아 단계로 제한되어 틈새 시장이 처음 형성되고 기능하기 시작하는 정확한 단계 인 후기 배아의 생식선 역학에 대한 지식에 틈을 남겼습니다.
후기 단계의 배아 생식선은 구형으로, 전방의 체세포 틈새 세포와 더 많은 후부 영역에 걸쳐 체세포 생식선 세포에 의해 경화 된 생식 세포(19)로 구성됩니다. 이러한 장기는 초기 배아 단계 1717,20,21까지 생체내에서 생포상화될 수 있다. 추가 이미징은 대규모 근육 수축의 시작으로 인해 예방됩니다. 이러한 수축은 너무 심해서 이미징 프레임에서 생식선을 밀어 내며 이미징 소프트웨어로는 이러한 움직임을 수정할 수 없습니다. 우리 실험실은 라이브 이미징을위한이 애매한 기간 동안 발생하는 틈새 형성의 메커니즘을 공개하는 데 관심이 있습니다. 따라서, 우리는 배아 단계 16에서 시작하는 생식선을 살아있는 이미지화하기 위한 생체외 접근법을 생성하여, 생식선 발달의 이 중요한 기간 동안 세포 역학에 대한 연구를 용이하게 하였다. 우리 실험실의 이전 연구는이 생체 외 영상이 생체 내 생식선 발달17을 충실하게 되풀이한다는 것을 보여줍니다. 이 기술은 초파리 배아 생식선에 대한 최초이자 유일한 종류입니다.
여기에서, 우리는 후기 배아 단계 동안 생식선의 생체외 생생 영상화에 필요한 해부 프로토콜을 제시한다. 이러한 프로토콜은 약리학적 치료, 또는 생식선 내 특정 세포 계보의 형질전환 조작과 조합될 수 있다. 이 기술을 사용하여, 우리는 줄기 세포 틈새 형성17의 단계를 성공적으로 이미지화했습니다. 따라서이 이미징 접근법은 자연 환경15,17 내에서 실시간으로 틈새 형성의 초기 단계를 시각화 할 수 있기 때문에 줄기 세포 생물학 분야에 도움이됩니다. 이 방법은 줄기 세포 생물학 분야에 유익하지만, 세포 재배열 22, 세포 부착2,12,23 및 세포 이동 23을 포함하여이 발달 시점 동안 생식선에서 발생하는 임의의 동적 과정을 시각화하는 데 추가로 적용 가능합니다. 따라서 이 해부 프로토콜은 많은 근본적인 세포 생물학적 과정에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것이다.

<table><tbody><tr><td>Alfa Aesar 텅스텐 와이어</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA10408G6</td><td>0.25mm(0.01인치) 직경, 99.95%(금속 기준)</td></tr><tr><td>D. melanogaster: His2Av::mRFP1</td><td>블루밍턴 초파리 재고 센터(BDSC)</td><td>FBtp0056035</td><td>Schuh, Lehner 및 Heidmann, Current Biology, 2007</td></tr><tr><td>D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato</td><td>Ruth Lehmann Lab</td><td></td><td>Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'</td></tr><tr><td>D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin</td><td></td><td>FBtp0083398</td><td>Sano et al., PLoS One, 2012</td></tr><tr><td>Diamond-tipped knife</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>Scotch</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>이미징 접시</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td></td><td>MetaMorph 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어 v7.8.4.0</td></tr><tr><td>인슐린, 소</td><td>시그마</td><td>l0516</td> 4°C<td>에 부분 표본 저장; C</td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-955</td><td></td></tr><tr><td>Nytex 바구니</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>링거 용액</td><td></td><td></td><td>2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM 설탕, 5mM Hepe' s 버퍼; pH 7.3에 도달할 때까지 NaOH로 조정</td></tr><tr><td>Schneider's Insect Media</td><td>GIBCO</td><td>21720-024</td><td></td></tr></tbody></table>

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Drosophila melanogaster male embryonic gonad는 생식 세포 발달, piRNA 생물학 및 틈새 형성을 포함하되 이에 국한되지 않는 발달 생물학의 다양한 측면을 연구하는 데 유리한 모델입니다. 여기에서, 우리는 생체 내 라이브 이미징이 매우 비효율적 인 기간 동안 생식선 ex vivo 영상을 생중계하는 해부 기술을 제시한다. 이 프로토콜은 배아를 이미징 접시로 옮기고, 적절하게 준비된 수컷 배아를 선택하고, 구조적 무결성을 유지하면서 주변 조직에서 생식선을 해부하는 방법을 설명합니다. 해부 후, 생식선은 공초점 현미경을 사용하여 이미징되어 동적 세포 과정을 시각화 할 수 있습니다. 해부 절차는 정확한 타이밍과 손재주가 필요하지만 일반적인 실수를 예방하는 방법과 이러한 문제를 극복하는 방법에 대한 통찰력을 제공합니다. 우리가 아는 한, 이것은 초파리 배아 생식선에 대한 첫 번째 해부 프로토콜이며, 그렇지 않으면 접근 할 수없는 시간 동안 라이브 이미징을 허용합니다. 이 기술은 약리학적 또는 세포형 특이적 트랜스제닉 조작과 결합하여 그들의 자연적인 생식선 환경에서 세포 내 또는 세포 사이에서 발생하는 임의의 동적 과정을 연구할 수 있다.

우리는 "해부 준비의 날"에 설명 된 바와 같이 그림 1의 이미징 접시의 준비를 보여줍니다. 이러한 방법은 궁극적으로 덮개 슬립 스트립에 잘 수화 된 배아를 발생시켜야하며, 이는 일시적으로 접시의 바닥에 고정되고 링거 용액에 잠겨 있습니다 (그림 1F). 다이아몬드 팁 나이프를 사용하면 22mm x 22mm 커버 슬립을 서너 개의 작은 스트립으로 깨끗하게 슬라이스할 수 있습니다(그림 1A). 이러한 스트립을 포셉으로 처리하는 동안 피펫을 사용하여 이러한 스트립을 코팅하기에 충분한 헵탄 접착제를 전달하여 접착제와 질감이 있는 표면을 제공합니다(그림 1B). 코팅된 스트립은 빈 커버 슬립 박스에 쉽게 보관하여 접착제 표면을 최대 2시간 동안 깨끗하게 유지합니다(그림 1C</strong...

여기서, 우리는 후기 배아 초파리 남성 생식선을 생생하게 이미지화하는 데 필요한 해부 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 정상적인 조건 하에서 또는 트랜스제닉 또는 약리학적 조작 후에 동적 세포 과정의 관찰을 허용할 것이다.

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

세포 역학은 라이브 이미징을 통해 가장 쉽게 이해할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이전에는 시각화에 액세스할 수 없었던 성선 형성의 발달 단계에 대한 실시간 이미징을 가능하게 합니다. 생식선을 분리하는 데 필요한 미세 해부는 고배율에서 섬세하고 정밀한 조작이 필요합니다.시각적 데모만이 각 단계를 실행하는 방법을 전달할 수 있습니다. 이 기술을 처음 접하는 사람은 특정 단계에서 필요한 빠른 타이밍과 섬세한 조직 조작에 어려움을 겪을 수 있습니다. 학습하는 동안 이 프로토콜의 섹션을 개별적으로 연습하는 것이 좋습니다.먼저 다이아몬드 끝이 있는 칼을 사용하여 22 x 22mm 커버 슬립을 동일한 크기의 4개의 스트립으로 자릅니다. 겸자를 사용하여 하나의 스트립을 집고 스트립의 양쪽에 30마이크로리터의 헵탄 접착제 용액을 펴 바릅니다. 헵탄이 증발할 때 균일한 접착제 잔류물 층을 얻기 위해 스트립을 다양한 각도로 기울이십시오.스트립을 빈 덮개 슬립 박스에 보관하십시오. 비스듬하지만 똑바로 세운 위치를 설정하여 상자와의 접촉을 최소화하고 끈적임을 유지하십시오. 그런 다음 상자를 닫습니다.노화된 탈혈 배아를 500-750마이크로리터의 헵탄으로 채워진 작은 시계 유리로 옮깁니다. 배아를 마이크로 피펫의 좁은 부분으로 끌어당겨 피펫의 안쪽 끝 부분에 천천히 응집시킨 후 슬라이드에 부드럽게 피펫팅합니다. 티슈 물티슈의 모서리를 미세한 끝으로 비틀고 슬라이드의 배아에서 헵탄을 빨아서 접착제로 덮인 스트립에 더 쉽게 캡처할 수 있습니다.집게를 사용하여 접착제로 덮인 스트립을 집어 배아에 부드럽게 만집니다. 배아 면이 위로 향하게 하여 Poly-D-Lysine 코팅 중앙 바로 바깥쪽에 있는 이미징 접시에 스트립을 놓습니다. 접시에 묶인 스트립을 눌러 제자리에 고정되었는지 확인합니다.즉시 접시에 2-3.5ml의 Ringer's 용액을 가득 채워 배아를 담그고 건조를 방지합니다. 해부하는 동안 조직 파편이 해부 바늘에 달라붙을 수 있습니다. 이 파편을 제거하려면 Ringer 용액 표면 바로 위에 바늘을 주기적으로 올리십시오.4개의 겹쳐진 장 분절을 생성하는 3개의 장 수축이 있는 16기 배아를 선택합니다. devitellinization을 시작하려면 텅스텐 바늘로 선택한 배아를 앞쪽 끝에서 뚫고 배아에서 vitelline 막을 벗겨냅니다. 생식선에서 멀리 떨어진 부위의 배아를 통해 바늘을 걸고 배아를 커버 슬립의 폴리리신 코팅 영역으로 옮깁니다.붙을 때까지 아래쪽으로 드래그하십시오. 마찬가지로, 모든 devitellinized 배아를 커버 슬립의 상단을 따라 일렬로 배열하고 아래에 충분한 공간을 남겨 둡니다. 배아를 필레팅하여 내부를 노출시키고 생식선 사이에서 바늘을 후방으로 움직여 배아를 중심에서 잘라냅니다.생식선을 드러내고 커버 슬립에 부착되도록 내부 조직을 조여냅니다. 바늘을 사용하여 생식선을 포함한 조직 조각을 잘라 남은 사체와 분리합니다. 그런 다음 이 조직을 코팅된 커버 슬립의 새 부분으로 당겨 접시에 부착합니다.생식선에서 주변 조직을 가능한 한 많이 제거하여 외부 조직을 조심스럽게 안내하고 생식선을 접시의 신선하고 끈적한 부분에 부착합니다. 덩어리가 손상되지 않도록 직접 만지지 마십시오. 해부 후에는 해부 접시 외부에 등록 표시를 추가하여 나중에 컨포칼 현미경에서 생식선을 찾는 데 도움이 됩니다.스트립 아래에 한 쌍의 집게의 바닥 단자를 부드럽게 삽입하고 집게를 잡은 다음 스트립을 위쪽으로 기울여 접시에서 분리하여 부착된 생식선의 방해를 최소화하여 접시에서 접착제 코팅된 스트립을 제거합니다. 이미징 접시를 무대 홀더에 놓습니다.tage 등록 표시를 사용하여 접시를 해부 중과 동일한 대략적인 방향으로 접시를 놓습니다. 명시야 현미경 검사와 저전력 대물렌즈를 사용하여 커버 슬립에 부착된 모든 조직 조각을 식별하고 초점을 맞춥니다.IP 설정을 전환하여 형광을 표시하고 양안 안안렌즈를 사용하여 접시를 체계적으로 스캔하고 이미징 소프트웨어 내에서 각 생식선의 위치를 표시합니다. 이미징 접시가 홀더에 있는 상태에서 전체 스테이지 홀더 어셈블리를 부드럽게 제거하고 어셈블리를 작업대에 놓습니다. 이미징 접시의 내부 상단 선반에서 P1000 마이크로피펫을 사용하여 Ringer 용액의 일부를 제거합니다.그런 다음 P50 마이크로피펫을 사용하여 표면 아래에서 약 100-200마이크로리터의 용액을 제거하고 모든 용액을 제거하지 않도록 합니다. 인슐린이 포함된 약 200마이크로리터의 이미징 배지를 나머지 Ringer's 용액의 표면 아래에 추가합니다. 나머지 이미징 미디어를 상단 선반의 가장 바깥쪽 가장자리에서 시작하여 접시에 추가합니다.파이펫팅하는 동안 유체의 중앙 돔 쪽으로 이동하고 파이펫 팁을 양쪽에 브러시로 씹어 튜브를 병합합니다. 현미경을 더 높은 출력의 대물렌즈로 전환하고 적절한 침지 유체를 적용합니다. 그런 다음 스테이지 홀더 어셈블리를 교체하십시오.표시된 생식선 위치로 초점을 조정하고 이미징을 시작합니다. 컨포칼 현미경에서 분리된 생식선의 명시야 시각화는 이미징 중에 생식선의 무결성을 유지하는 세포 외 기질인 생식선 주변을 둘러싼 어두운 그림자를 보여줍니다. 표지된 체세포 및 체세포 및 히스톤 마커를 발현하는 건강하고 잘 배양된 생식선의 예가 여기에 나와 있습니다.이미징 중에 생식선에 충분한 수분이 공급되지 않으면 조직이 쪼그라듭니다. 해부 중에 세포외 기질이 손상된 생식선은 경계가 손상되었으며, 이는 생식선의 경계 밖에 생식선 특이적 세포가 존재한다는 점에서 분명합니다. 압축 전, X-VIVO 배양 생식선에서 형성되는 줄기세포 틈새는 처음에는 생식선 전방에서 체세포의 느슨한 응집체로 나타납니다.틈새 세포는 생식세포 줄기 세포로 둘러싸여 있습니다. 틈새 집합체는 처음에 불규칙한 경계를 나타냅니다. 이미징 과정 전반에 걸쳐 개별 틈새 세포는 틈새 응집체가 더 부드러운 경계를 획득하도록 위치를 재배열하여 틈새 영역이 감소합니다.이 프로토콜을 시도할 때는 배아를 코팅된 접시로 옮길 때 신속하게 작업하고 생식선을 주변 조직에서 멀리 해부할 때 섬세하게 하는 것이 중요합니다. X-VIVO 배양은 유전적 및 약리학적 조작과 결합할 수 있으며, 이를 통해 남성 또는 여성의 생식선 형성 중에 발생하는 사건을 조사하기 위한 다각적인 접근 방식을 사용할 수 있습니다. 이 기술을 통해 줄기세포 틈새가 최종 구조를 획득하는 방법을 시각화할 수 있었습니다.결과적으로, 우리는 이제 세포 형성을 주도하는 기저 세포 역학에 대한 가설을 형성하고 테스트할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기 GFP 태그 glial 세포와 결합하여 라이브 미세 분석을 사용하여 개발 Drosophila의 눈을 glial 세포의 마이 그 레이션을 검사하기 위해 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

Mesoscopic 형광 tomography는 조직 sectioning 형광 현미경의 침투 제한없는 운영하고 있습니다. 이 기술은 다중 투영 조명 및 광자 수송 설명을 기반으로합니다. 우리의 morphogenesis의 인 - 생체내 전체 - 몸 3D 시각화 GFP - 표현에 날개 imaginal 디스크를...

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내</em개발> 이미징 Drosophila</em

우리는 특정 genotypes의 Drosophila의 배아의 "등심"준비 창출을위한 능률적인 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 화면의 다양한 효율적인 실행을 허용합니다. 또한 후반 배아의 구조 우수 시각화 수 있습니다.

라이브 해부 Drosophila 태아 : 항체 스테 이닝에 의해 돌연변이 컬렉션을 검사 늘씬한 방법

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

여기 스테인드에 대한 마운트 프로토콜을...

의 입식 이미징 Drosophila 태아

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

이 프로토콜은 과일 파리가 변형을 겪으면서 Drosophila 복부 상피에서 세포 배향 및 조직 성장의 역학을 이미징 및 분석하기 위해 설계되었습니다. 여기에서 기술된 방법론은 Drosophila 또는 그밖 모형 유기체에 있는 다른 발달 단계, 조직 및 subcellular 구조물의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

여기에서는 초파리 난소 틈새 시장에서 생식세포 줄기세포(GSC)의 비대칭 분열에 대한 실시간 이미징을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 분광 단백질 Par-1의 녹색 형광 단백질(GFP) 융합을 유비쿼터스하게 발현하는 형질전환 라인을 사용합니다.

여성 Drosophila melanogaster 생식세포 줄기세포 틈새의 확장된 라이브 이미징

배우세요 후기 배아 Drosophila 수컷 고나드의 해부 및 라이브 이미징 기법을 통해 생식소 발생 과정에서 세포 역학을 실시간 관찰하는 방법을 익히세요. 이 프로토콜은 발달생물학 연구에 필수적인 정밀 조직 조작 기술을 제공합니다.

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

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