Name: 체외 합성에 인간의 세포에서 단백질 발현 유도의 mRNA를 수정의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 학습하세요 체외 합성으로 수정된 mRNA를 제조하여 인간 세포에서 단백질 발현을 유도하는 방법을. 플라스미드 증폭, 전사, DNA 제거, 인산화 효소 처리 단계를 포함하며, 형광 현미경과 유세포 분석으로 결과를 검증합니다.

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이 프로젝트는 바덴 - 뷔 르템 베르크, 독일에 유럽 사회 기금에 의해 투자되었다.

필수 DNA 시퀀스를 코딩 포함하는 플라스미드 1. 확대 술 (CDS) <ol><li> 사전 따뜻한 실온으로 변환 키트에 포함되어 SOC 배지, 37 ° C, 100 ㎍ / ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트. 42 ° C의 물을 욕조를 평형. </li><li> 화학적 구성 요소 E. 중 하나 유리 병을 해동 얼음에 대장균. </li><li> 화학적 성분의 E. 바이알 내로 CDS 함유 플라스미드 1-5 μL (100 ng의 10 페이지)를 첨가 대장균과 부드럽게 섞는다. 피펫 팅하여 세포를 혼합하지 마십시오. 플라스미드를 추가 한 후, 부드럽게 튜브를 눌러 섞는다. </li><li> 30 분 동안 얼음 혼합물을 품어. </li><li> 열 충격 E. 흔들림없이 물을 욕조에 42 ° C에서 30 초 동안 대장균. </li><li> 2 분 동안 얼음에 병을 놓습니다. </li><li> E.에 예열 SOC 매체의 250 μl를 추가 대장균은 세균 배양기에서 37 ° C에서 1 시간 동안 300 rpm에서 수평으로 박테리아를 흔들어. </li><li><html> 100 μL와 미리 예열하는 LB 아가 플레이트에 변환 믹스 150 μl를 확산 판을 반전 하룻밤에 37 ° C를 품어. </li><li> 콜로니가 표시되고 나면, 100 ㎍ / ㎖의 앰피 실린 5 ㎖의 LB 배지를 함유하는 15 ㎖의 배양 관에 각각 플레이트로부터 단일 콜로니를 접종. 문화가 늦게 로그 또는 고정 단계가 될 때까지 300 rpm에서 진탕 37 ° C에서 하룻밤을 품어. </li><li> 형질 전환 된 E.의 장기 저장 용 콜라이, 피펫 cryovial으로 100 % 글리세롤 75 μl를. 세균 배양 (냉동 주식이 25 % 글리세롤을 포함한다)의 225 μl를 추가, 잘 섞는다 및 -80 ° C에서 cryovial를 저장합니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 필요한 CDS를 함유하는 플라스미드를 분리. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 플라스미드 농도를 결정한다. </li><li> 20 μL의 분량을 준비하고 오랜 시간 동안 -20 ° C에 저장합니다. </li></ol>플라스미드 삽입물 _title &quot;&gt; 2. 증폭 및 중합 효소 연쇄 반응에 의해 폴리 T 꼬리의 추가 (PCR) <ol><li> 참고 : PCR을 이용하여 증폭 시험 관내 전사 (IVT), 여기에 관심있는 CDS, eGFP는 대한 DNA 템플릿을 구하십시오. 동시에, 120 티미 딘 (T)의 폴리 T-꼬리는 T (120) 확장자 역 프라이머를 사용하여 삽입에 추가됩니다. 이에 의해, 생성되는 mRNA IVT 후 정의 된 길이의 폴리 A-꼬리를 얻었다. </li><li> 표 1에서 설명하는대로 PCR 혼합물을 준비합니다. </li><li> 완전히 반응 혼합물을 섞는다. NOTE : PCR 생성물은 4-5 IVT 반응에 사용될 수있다. IVT 용 DNA 템플릿 량을 증가시키기 위해, PCR 혼합물의 총 체적이 증가 될 수있다. 몇몇 PCR 튜브 각각 함유하는 100 ㎕의 PCR 혼합물을 PCR 생성물의 충분한 수율을 확보 할 수있다. </li><li> PCR 열 순환기에 튜브를 놓고 PCR 사이클링 프로토콜 (표 2)를 사용하여 PCR을 실행. </li><li> P는 정리20 ㎕의 뉴 클레아 제 -없는 물을 사용하는 DNA는 제조업체의 지침에 따른 용출 및 PCR 정제 키트를 이용하여 CR 반응. </li><li> 분광 광도계를 이용하여 DNA 농도를 측정한다. 참고 : 감지 DNA 농도가 약 300 ㎍ / ㎖의입니다. 따라서, 예상 총량은 ~ 6 μg의이어야한다. 다른 단백질에 대한 DNA의 양은 CDS의 길이에 따라 달라질 수 있으며, 플라스미드의 양은 PCR, 프라이머 어닐링 온도 및 싸이클 횟수에 사용. </li><li> 오랜 시간 동안 -20 ° C에서 DNA 동결 또는 IVT 직접 사용. </li></ol> 3. 조정 단계 : PCR 제품의 품질 <ol><li> DNA 겔 전기 영동에 의해 PCR 산물의 품질을 확인. </li><li> 플라스크에 1 배 TBE와 아가로 오스의 원하는 금액을 섞는다. 1 % 아가 로즈 겔의 경우, 1 배의 TBE 50ml로 오스 0.5 g을 추가한다. </li><li> 아가까지 마이크로 웨이브가 용해된다. 이 비등하게하지 마십시오. 아가로 오스 용액에 완전히 있는지 확인합니다. </li><li> 50 ml의 아가 로스 젤에 5 μL 핵산 젤 얼룩을 추가합니다. </li><li> , 아가 로스 젤 상자에 젤을 부어 콤을 설정하고 젤 응고 될 때까지 약 1 시간을 기다립니다. </li><li> 빗을 제거하고 젤 트레이에 젤 상자를 배치합니다. </li><li> 12 μL의 총 부피의 2 μL 6 배 로딩 버퍼 80-10,000 염기쌍의 DNA 사다리의 2 μL (200 NG) 및 PCR 제품의 200 NG를 각각 섞는다. </li><li> 조심스럽게 아가로 오스 겔의 우물에 DNA 샘플을로드합니다. </li><li> 버퍼를 실행으로 1X TBE를 사용하여, 1 시간 동안 100 V에서 아가 로스 젤을 실행합니다. </li><li> 이미징 시스템 (도 2)의 DNA 밴드를 시각화. </li></ol> 4. 시험 관내 전사 (IVT) <ol><li> NOTE는 : PCR 후, 플라스미드 인서트 증폭 및 폴리 T 꼬리 첨가된다. IVT 동안, 유전 정보는 DNA에서 RNA로 전사된다. 생성 된 mRNA의 성적 증명서는 세포에서 단백질을 생산하는 데 사용됩니다. </li><li> 의 RNase D와 작업 영역과 피펫을 청소오염 제거 솔루션입니다. 반응이 RNases와 혼합의 자주 사용하는 PCR 깨끗하고 무균 이중 필터 피펫 팁과 오염을 최소화하기 위해 장갑을 변경합니다. </li><li> 표 3에 기재된 바와 같이 NTP / 캡 아날로그 혼합물을 준비한다. </li><li> 와동에 의해 철저하게 NTP / 캡 아날로그 혼합물을 혼합하고 짧게 스핀 다운. </li><li> 표 4에 기재된 바와 같이 IVT 반응 혼합물을 조립한다. </li><li> 부드럽게 피펫 팅 아래에 의해 철저하게 IVT 반응 혼합물을 섞는다. 이어서 튜브의 하단에 혼합물을 수집 짧게 PCR 튜브를 원심 분리기. </li><li> 써모에서 3 시간 동안 37 ° C에서 품어. 참고 : 최적의 배양 시간이 삽입 주어진 템플릿의 전사 효율의 길이에 따라 달라집니다. 짧은 삽입 (NT &lt;500)의 경우, 더 긴 배양 시간이 유리할 수있다. 경시 실험을 최대 수율을위한 최적의 배양 시간을 결정하기 위해 행해질 수있다. 따라서, exampl를 들어, IVT 반응을 설정즉, 1, 2, 3, 4, 6 시간, 밤새 인큐베이션하고 mRNA의 양을 결정한다. eGFP는 mRNA의 생성에 대한 시험 관내 전사의 동력학은도 3에 도시된다. </li><li> , 주형 DNA를 제거 IVT 반응 혼합물에 DNase의 1 μL (2 U / μL)를 추가하려면, 잘 혼합하고 37 ℃에서 15 분을 품어. </li><li> 제조자의 지시에 따라 RNA 정제 키트를 사용하여 반응 혼합물을 정제 하였다. 40 ㎕의 뉴 클레아 제 무 물로 2 회 스핀 컬럼 막으로부터 수정의 mRNA를 용출. NOTE : 검출 된 RNA의 농도는 약 1500 ㎍ / ml 일. 따라서, 예상 총량은 ~ 120 μg의이어야한다. 다른 단백질 합성의 mRNA 양 CDS의 길이와 IVT 사용되는 PCR 산물의 양에 따라 다를 수있다. </li></ol> 남극 인산 가수 분해 효소 정제 된 mRNA를 5. 치료 <ol><li> 참고 : 생성 된 mRNA의 5를 제거하기 위해 포스 파타 아제로 처리 &#39;트라이면역 활성화에 RIG-I에 의해 인식 이어질 수 있습니다 인산염. 또한, 인산 처리는자가 결찰 반응에 다시 회람을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 정제 된 mRNA의 솔루션의 79 μL에 10 배 남극 포스 파타 아제 반응 버퍼 9 μl를 추가합니다. 그 후, 남극 포스 파타 아제 (5 U / μL)의 2 μL를 추가하고 부드럽게 샘플을 섞는다. 30 분 동안 37 ° C에서 반응 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 제조자의 지시에 따라 RNA 정제 키트를 사용하여 반응 혼합물을 정제 하였다. 50 ㎕의 뉴 클레아 제 무 물로 2 회 스핀 컬럼 막으로부터 수정의 mRNA를 용출. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 변형 된 mRNA의 농도를 측정한다. 260 nm의 체크인 / 280 nm에서의 흡광도의 비율 (A (260) / A (280)) ≥ 1.8 내지 260의 비율 / A (230)의 순도를 나타내는, 인을 2.0이라고. 참고 : 예상 총 생산량은이 sufficie이며, 약 90 μg의해야NT 약 36 mRNA의 형질합니다. </li><li> 클레아없는 물을 첨가하여 100 ng의 / μL로의 mRNA의 농도를 조정. </li><li> -80 ° C에서 형질 및 저장에 필요한 일회용 씩에 수정 된 mRNA의 나누어지는. 여러 동결 및 해동 사이클을 피하십시오. 제대로 준비하고 mRNA를 몇 년 동안 안정 저장됩니다. 작업하는 동안 항상 얼음에 수정 된 mRNA를 유지합니다. </li></ol> 6. 조정 단계 : 종합 된 수정 된 mRNA의 품질 <ol><li> RNA 겔 전기 영동에 의해 수정의 mRNA의 품질을 확인합니다. </li><li> 플라스크에 1 배 TBE와 아가로 오스의 원하는 금액을 섞는다. 1 % 아가 로즈 겔의 경우, 1 배의 TBE 50ml로 오스 0.5 g을 추가한다. </li><li> 아가까지 마이크로 웨이브가 용해된다. 이 비등하게하지 마십시오. 아가로 오스 용액에 완전히 있는지 확인합니다. </li><li> 50 ml의 아가 로스 젤에 5 μL 핵산 젤 얼룩을 추가합니다. </li><li> , 아가 로스 겔 상자에 겔을 붓고 빗 설정하고 겔 솔리 때까지 약 1 시간을 기다려dified. </li><li> 빗을 제거하고 젤 트레이에 젤 상자를 배치합니다. </li><li> 0.5 ~ 10 KB의 RNA 사다리의 3 μL (3 μg의)와 mRNA의 10 μL의 총 부피의 7 μL 로딩 버퍼 각각 수정하여 합성 200 NG를 섞는다. 로딩 완충액의 조성은 표 5에 기재되어있다. </li><li> 10 분 동안 70 ° C에서 사다리와 mRNA의 샘플을 변성시킨다. </li><li> 조심스럽게 사다리와 1 % 아가 로스 젤에서 mRNA의 샘플을로드합니다. </li><li> 버퍼를 실행으로 1X TBE를 사용하여 1 시간 동안 100 V에서 전기 영동을 수행합니다. </li><li> 젤 문서 시스템 (그림 4)를 사용하여 자외선 transilluminator가와 사진에 사다리와 mRNA의 밴드를 시각화. </li></ol> 7. 형질에 대한 세포의 준비 <ol><li> 12 웰 플레이트 잘 당 판 (2) X10 5 세포 (HEK293 세포). </li><li> 세포 배양기에서 37 ° C에서 밤새 세포를 부화. 참고 : 형질의 날에, 세포가 REAC해야한다80-90 %를을 hed. </li></ol> 8. 세포의 mRNA 트랜 수행 <ol><li> 수정 된 mRNA를 해동. </li><li> 형질 전환에 대한 리포 플렉스를 생성합니다. </li><li> 수정 mRNA의 25 μL (2.5 μg의) 내가 12 웰 플레이트 잘 하나의 형질 전환을위한 형질 전환 혼합물을 생성하는 혈청 배지를 감소 473 μL 옵티-MEM (최소 필수 중간)에 양이온 성 지질 형질 전환 시약의 2 μL를 추가합니다. 형질 전환되는 우물의 수에 따라 볼륨을 확장 할 수 있습니다. 음성 대조군으로, mRNA를하지 않고 형질 전환 혼합물을 제조. </li><li> 부드럽게 피펫 팅하여 컴포넌트를 섞는다. 형질 감염을위한 리포 플렉스를 생성하기 위해 20 분 동안 실온에서 형질 전환 혼합물을 인큐베이션. 참고 : 형질 전환 혼합물이 항생제가 포함되어 있지 않습니다. 따라서, 세포를 처리하는 동안 불임을 보장하기 위해주의를 기울입니다. </li><li> 500 μL의 DPBS와 세포를 씻으 / 웰. </li><li> 12도 괞 찮아 잘 하나에 형질 전환 혼합물 μL 500 추가테. </li><li> 37 ° C에서 4 시간, 5 % CO 2 세포를 부화. </li><li> 형질 전환 혼합물을 대기음 세포에 1 ml의에게 완전한 세포 배양 배지를 추가한다. </li><li> 세포 배양기에서 24 시간 동안 세포를 품어. </li><li> 형광 현미경을 수행하면 형광 현미경 (도 5)를 사용하여 분석한다. NOTE는 : eGFP는 이외의 mRNA는 mRNA의 코딩에 의해 생성되는 형질 전환 세포에서 다른 단백질의 발현을 조사하기 위해서, 세포는 커버 슬립에서 배양 될 수있다. 이어서 형질 감염이 수행 될 수 있고, 세포를 적절한 항체로 염색하고 형광 현미경으로 분석 될 수있다. </li></ol> 세포의 eGFP는 표현의 9 유세포 분석 <ol><li> 웰로부터 세포 배양 배지를 제거하고 (칼슘 및 마그네슘없이) 1 ㎖의 DPBS로 각 웰을 세척 하였다. 세포 배양 플레이트의 표면으로부터 세포를 분리하는 웰 당 500 ㎕를 트립신 / EDTA를 추가한다. 계속해서, (500)을 추가μL TNS 당 잘 트립신을 비활성화합니다. </li><li> 실온에서 300 XG에서 5 분 동안 분리 된 세포를 원심 분리기. 만 펠렛을 떠나 뜨는을 제거합니다. 150 ㎕의 세포 고정액에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 유세포 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> eGFP는 발현 세포의 비율 및 평균 지오 (형광 강도의 기하 평균) (도 6)를 사용하여 형광 강도를 분석. </li></ol> 시간 이상 단백질 발현 10. 측정 <ol><li> 또한 단계 8에 기재된 바와 같이, 12- 웰 플레이트의 웰 (3)의 셀의 mRNA 트랜 수행 mRNA를 첨가하지 않은 형질 전환 혼합물로 HEK293 세포를 웰 3을 배양한다. </li><li> eGFP는 1, 2의 발현을 측정, 3 일 후 형질 전환 단백질 발현 (도 7)의 지속 기간을 평가. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

mRNA의 치료는 재생 의학, 질병 및 예방 접종의 치료 분야에서 엄청난 잠재력을 가지고있다. 이 비디오는, 세포에서 단백질 발현의 유도를위한 안정화 된 변형의 mRNA의 생성을 보여준다. 이 프로토콜을 이용하여, 다른 원하는 mRNA를 생성 할 수있다. 변형 된 mRNA를 시험 관내 합성은 표적 단백질의 발현을 유도하는 것이 바람직 mRNA를 함께 세포의 형질 감염을 허용한다. 외생 전달 mRNA를 완전히 분해 될 때까지 이에 의해, 목적 단백질은 생리 학적 조건에서 일시적으로 발현된다. 이 비디오에서는, eGFP는의 발현은 eGFP는 mRNA의와 HEK293 세포의 단일 형질 전환 후 3 일 동안 증명되었다. 다른 단백질을 코딩하는 mRNA의 분자는 짧은 단백질 발현 기간을 초래할 수있다. 단백질의 발현으로 인해 외생 전달의 mRNA의 분해를 감소시킨다. 솜에 대한이 기술의 따라서, 제한전자 응용 프로그램은 단백질 발현의 과도 유도 될 수 있습니다. 따라서...

세포에서, 전령 RNA의 전사 (mRNA의) 원하는 단백질 내로의 mRNA의 번역은 다음 셀의 적절한 기능을 보장한다. 유전 또는 획득 한 유전 질환 단백질의 부족과 장애 합성으로 이어질 심각한 질병을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 결함이 없거나 단백질의 생산을 유도하는 새로운 치료 방법은 세포 내로의 mRNA 합성의 개질 외인성 전달, 목적 단백질을 코딩이다. 이에 따라, 세포가 정상적으로 생성되지 않거나 자연적으로 필요하지 않을 기능 단백질을 합성하는 트리거됩니다. 이 방법을 사용하여, 유전 질환의 mRNA의 도입에 의해 보정 될 수없는 결함이 있거나 한 단백질을 코딩. mRNA의 치료는 또한 종양 세포 또는 병원체에 의해 발현 된 단백질 항원을 접종 synthetize하기 위해 사용될 수있다. 이에, 숙주 면역 시스템은 효과적으로 종양 세포를 제거하거나 infe을 방지하기 위해 활성화 될 수있다ctions 2,3. 또한, 최근에는 mRNA를 성공적으로 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 생성하기 위해 사용되었다. 이러한 목적을 위해, 섬유 아세포 리 프로그래밍의 발현이 4-6 인자 유도 및 재생 의학에 막대한 잠재력 iPSCs으로 변환하는 mRNA를 함께 형질 감염시켰다. 이전에, 종래의 mRNA의 사용은 낮은 안정성과 강한 면역 원성 연관되었다. 따라서, 기존의 mRNA의 임상 적용은 제한되었다. 그러나 Kariko과 동료의 mRNA 분자 내에 5 메틸 시티와 pseudouridine로 시티 딘과 딘의 교체는 생물학적 유체 안정의 mRNA 분자를 렌더링 극적으로 지금 수정의 mRNA의 임상 적용을 허용 면역 활성화 7-10 감소. 합성으로 생산 된 수정의 mRNA를 사용하여, 원하는 유전자 성적표는 일시적으로 생체 (11)에 전달 될 ​​수또는 시험관 내에서 단백질 발현을 유도한다. 도입의 mRNA는 세포 번역 기계에 의해 생리 학적 조건에서 변환됩니다. 인해 바이러스 유전자 치료 벡터에 비해 숙주 세포 게놈 내로 통합의 부족으로, 종양의 위험도 12,13 방지된다. 따라서, 수정 합성의 mRNA를 사용하여 치료 이후에보다 좋은 임상 승인을 얻을 것이다. 여기에, 우리는 수정 된 mRNA를 생산 (그림 1)의 mRNA와 세포와 형질 전환 된 세포에서 단백질 발현의 평가, 형질 전환에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">세포 배양</td></tr><tr><td>DMEM, 고혈당</td><td>PAA</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신&nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-글루타민&nbsp;</td><td>PAA</td><td>M11-004</td> 칼슘과 마그네슘 없는 <td>200 mM</td></tr><tr><td>DPBS&nbsp;</td><td>PAA</td><td>E15-002</td><td></td></tr><tr><td>0.04% 트립신 / 0.03% EDTA&nbsp;</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td></td></tr><tr><td>TNS</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td>트립신 중화 용액, 0.1% BSA HEK-293 세포에 0.05% 트립신 억제제</td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Consumables</td></tr><tr><td>Tissue culture plates, 12-well&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크 (75 cm2)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>DNase-및 RNase-free 1.5 ml 멸균 마이크로 원심분리 튜브&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.589</td><td>Safe-Lock, Biopur</td></tr><tr><td>15 ml 원뿔형 튜브&nbsp;</td><td>greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>PCR 깨끗하고 멸균된 epT.I.P.S. 이중 필터 피펫 팁&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>10 &마이크로; 엘: 022491202; 100 &마이크로; 엘 : 022491237; 1,000 &마이크로; l: 022491253</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>greiner bio-one</td><td>122279-128</td><td>Cryo.s&nbsp;</td></tr><tr><td>세균 배양을 위한 14ml 폴리프로필렌 라운드 바닥 튜브&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">플라스미드 증폭 및 정제</td></tr><tr><td>pcDNA 3.3_eGFP 플라스미드&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>26822</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Top10 화학 성분 Escherichia coli&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>멸균수(Ampuwa)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1636071</td><td></td></tr><tr><td>LB 미디엄(Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td>25 g L-1 를 멸균수에 녹입니다.</td></tr><tr><td>LB 한천 (루리아/밀러)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td>40 g L-1 를 멸균수에 녹입니다.</td></tr><tr><td>암피실린 레디 메이드 솔루션</td><td>시그마 알드리치</td><td>A5354</td><td>100 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 알드리치</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep 스핀 미니프렙 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">mRNA 생산</td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity 중합효소 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 키트&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>5-메틸시티딘-5&급성;-트리포스페이트&nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1014</td><td>5-메틸-CTP</td></tr><tr><td>슈도우리딘-5&급성;-트리포스페이트&nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1019</td><td>Pseudo-UTP</td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5&acute;)PPP(5&급성;)G RNA 캡 구조 아날로그&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase 억제제</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 U/&micro; 엘&nbsp;</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>2 U/&마이크로; l (MEGAscript T7 Kit에서)</td></tr><tr><td>남극 인산가수분해효소&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>MO289S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 미니 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap 솔루션&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Transfection</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection 시약&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>양이온성 지질 형질주입 시약</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 환원된 혈청 매체&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td>개선된 최소 필수 매체(MEM)는 Fetal Bovine Serum (FBS) 보충제를 줄일 수 있게 해줍니다&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Gel 전기영동</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>겔레드 핵산 젤 Stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>10,000x in water&nbsp;</td></tr><tr><td>peqGOLD 레인지 믹스 DNA-래더&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>25-2210</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">유세포 분석 분석</td></tr><tr><td>CellFIX (1x)</td><td>BD Biosciences</td><td>340181</td><td>10x concentrate&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">삽입 증폭 및 폴리 (T) 테일 PCR용 프라이머</td></tr><tr><td>Forward 프라이머 (HPLC 등급) 10 &micro; M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&급성;-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3&급성;</td></tr><tr><td>리버스 프라이머 (HPLC 등급) 10 &마이크로; M</td><td>엘라 바이오텍</td><td></td><td>5&acute;- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3&acute;</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Cell incubator</td><td>Binder</td><td></td><td>CO2 (5%) 및 O2 (20%)&nbsp;</td></tr><tr><td>CASY 셀 카운터&nbsp;</td><td>슈 &auml; RFE 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 작업대&nbsp;</td><td>BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>박테리아 인큐베이터&nbsp;</td><td>Incutec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanDrop 분광 광도계&nbsp;</td><td>분석 Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 열순환기&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>peqlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel apparatus for electrophoresis&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel 문서화 시스템&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACScan 시스템&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>위상차 현미경&nbsp;</td><td>자이스</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

체외 합성에 인간의 세포에서 단백질 발현 유도의 mrna를 수정의

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

원하는 세포에서 단백질 합성의 유도 합성 메신저 RNA (mRNA의)를 코딩의 외생 배달 재생 의학, 기본적인 세포 생물학, 질병의 치료, 세포의 재 프로그래밍 분야에서 엄청난 잠재력을 가지고있다. 여기서 우리는 유동 세포 계측법에 의해 유도 된 단백질 발현의 감소 면역 활성화의 가능성과 안정성이 향상, 생산의 mRNA의 품질 관리, 세포의 형질의 mRNA와 검증과 수정의 mRNA의 생성 단계 프로토콜에 의해 단계를 설명합니다. eGFP는 mRNA의 단일 형질 전환 후 3 일까지, 형질 전환 된 HEK293 세포 eGFP는을 생산하고 있습니다. 이 비디오 문서에서, eGFP는 mRNA의 합성을 예로 들어 설명한다. 그러나, 절차는 다른 원하는 mRNA를 생산에 적용될 수있다. mRNA의 변성 합성을 사용하여, 세포를 일시적들이 정상적으로 발현하지 것이다 원하는 단백질을 발현하도록 유도 될 수있다.

eGFP는의 CDS를 포함하여 pcDNA 3.3 플라스미드를 사용하여, 수정 된 eGFP는 mRNA를 합성 (도 1)를 구축했다. PCR에 의한 삽입 증폭 및 폴리 T-미행 한 후, 약 1,100 bp의 길이의 명확한 밴드 (그림 2)을 검출한다. mRNA의 (그림 3)의 수율은 IVT 시간을 증강 증가. IVT 후, 약 1100 bp의 길이의 명확한 mRNA의 밴드가 생성 될 eGFP는 mRNA의 길이 (도 4)에 대응하는 검출되었다. eGFP는 mRNA의 생성의 기능은 HEK293 세포의 형질 감염에 의해 시험 하였다. 이러한 목적을 위해, 형질 감염 복합체 (리포 플렉스)는 양이온 성 지질 형질 감염 시약을 이용하여 생성 하였다. 형질 12- 웰 플레이트의 웰 당 2 × 105 세포로 수행 하였다. eGFP는 세포의 제조는 <str...

이 비디오 문서에서는, 우리는 세포에서 단백질 발현의 유도에 대한 수정의 mRNA의 체외 합성을 설명합니다.

체외 합성에 인간의 세포에서 단백질 발현 유도의 mRNA를 수정의

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

이 절차의 전반적인 목표는 세포에서 단백질 발현 유도를 위해 변형된 mRNA의 체외 합성입니다. 이는 먼저 플라스미드 삽입물 또는 코딩 DNA 염기서열을 증폭하고 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 120 티미딘의 폴리 T 테일을 추가함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 생성된 DNA를 폴리 아데닌 꼬리를 가진 mRNA로 체외에서 전사하는 것입니다.다음으로, 주형 DNA는 시험관 내 전사 반응 혼합물의 D'S 처리에 의해 제거됩니다. 마지막 단계는 생산된 mRNA를 남극 인산가수분해효소(Antarctic phosphatase)로 처리하여 5개의 프라임 인산염을 제거하는 것입니다. 궁극적으로 세포는 생성된 mRNA, 지질 복합체에 의해 transfection됩니다.형광 현미경 검사 및 유세포 분석 분석은 세포에서 향상된 GFP의 합성을 보여주는 데 사용됩니다. 바이러스 transfection과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 숙주 세포 게놈에 통합되지 않아 발암 위험을 방지할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 세포에서 누락되거나 결함이 있는 단백질을 생성하는 데 도움이 될 수 있으며 유전 질환의 예방 접종 치료에 사용할 수 있습니다.그리고 재생 의학 분야에서는 제 연구실의 대학원생인 steinle이 시연할 것입니다. 이 절차를 시작하기 전에, 필요한 코딩 DNA 서열 또는 CDS를 포함하는 플라스미드를 대장균에서 증폭하고 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 분리했습니다. 이 예에서 관심 CDS는 EGFP의 CDS에 poly detail을 동시에 증폭하고 추가하는 향상된 녹색 형광 단백질 또는 EGFP입니다.프로토콜 텍스트에 자세히 설명된 대로 PCR 혼합물을 준비합니다. PCR 튜브를 thermocycler에 넣고 프로토콜 텍스트에 설명된 PCR 사이클링 프로토콜을 실행합니다. PCR 반응이 완료되면 시판되는 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 반응을 세척하고 20마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 DNA를 희석합니다.PCR 산물의 품질을 확인하려면 DNA 겔 전기영동을 수행하고 이미징 시스템에서 DNA 밴드를 시각화합니다. 약 1, 100 염기쌍 길이의 투명한 DNA 띠는 체외 전사 또는 IVT 중에 검출되어야 합니다. 앞서 생성된 DNA는 mRNA로 전사될 것입니다.여기에 표시된 대로 NTP 캡 아날로그 혼합물을 준비합니다. 와류로 NTP 캡 아날로그 혼합물을 철저히 혼합합니다. 그런 다음 스핀 다운: 이 표에 설명된 대로 IVT 반응 혼합물을 간단히 조립합니다.위아래로 부드럽게 피펫팅하여 IVT 반응 혼합물을 철저히 혼합합니다. 그런 다음 PCR 튜브를 잠시 원심분리하여 튜브 바닥에 혼합물을 수집합니다. IVT 반응 혼합물을 온도 혼합기에서 3시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.3시간 후 IVT 반응 혼합물에 1마이크로리터의 DNA를 첨가하여 주형 DNA를 제거합니다. 잘 섞어 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. RNA 정제 키트를 사용하여 반응 혼합물을 정제하고 스핀 컬럼 멤브레인에서 변형된 MR NA를 40마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물로 두 번 희석하고, IVT에 의해 생성된 변형된 mRNA를 포스파타아제로 처리하여 면역 활성화를 유발할 수 있는 5개의 프라임 트리포스페이트를 제거해야 합니다.이 절차를 시작하려면 9마이크로리터의 10 x 남극 인산가수분해효소 반응 완충액을 79마이크로리터의 정제된 mRNA 용액에 추가합니다. 그런 다음 2마이크로리터의 남극 인산가수분해효소를 넣고 샘플을 부드럽게 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.30분 후, RNA 정제 키트를 사용하여 반응 혼합물을 정제하고 스핀 컬럼 멤브레인에서 변형된 mRNA를 50마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물로 두 번 희석합니다. 변형된 mRNA의 농도를 측정한 후 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 농도를 마이크로리터당 100나노그램으로 조정합니다. RNA 겔 전기영동에 의해 합성된 변형된 mRNA의 품질을 확인하고 UV 트랜스 일루미네이터에서 래더 및 mRNA 금지를 시각화합니다.길이가 약 1, 100 염기쌍인 투명한 mRNA 띠를 검출해야 합니다. 합성된 변형된 mRNA를 2회 도금하여 형질주입을 위해 HEC 2 9 3 세포를 준비합니다. 12웰 플레이트의 웰당 5개의 세포를 중앙에 배치하고 세포 배양기에서 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다. 다음 날 세포는 80-90%의 합류점에 도달해야 합니다.transfection을 위한 lipo plexus를 생성합니다. 12 well plate의 각 well에 transfection할 수 있는 충분한 transfection 혼합물을 준비하려면 modified mRNA 2.5 μg, lipid transfection 시약 2 μl, opt one 473 μl가 필요합니다. 세럼 매체를 줄입니다.음성 대조군으로 피펫팅하여 성분을 부드럽게 혼합합니다. Mr.NA 없이 transfection 혼합물을 준비하고, 실온에서 20분 동안 transfection 혼합물을 배양하여 lipo plex를 생성합니다. 형질주입용.500마이크로리터의 DPBS로 세포를 세척합니다. 웰 500마이크로리터를 12웰 플레이트의 각 웰에 주입 혼합물 500마이크로리터를 추가하고, 섭씨 37도에서 4시간 동안 세포를 배양하고, 4시간 후 5%의 이산화탄소를 배양하고, 트랜스펙션 혼합물을 흡인하고, 완전한 세포 배양 1ml를 추가합니다. 각 우물에 있는 세포에 매체.세포 배양기에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 세포의 형광 현미경 분석을 수행하여 유세포 분석을 위해 세포를 준비합니다. 웰에서 세포 배양 배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS 중 하나로 각 웰을 세척합니다.웰당 500마이크로리터의 TRIPSIN EDTA를 추가하여 세포 배양 플레이트의 표면에서 세포를 분리합니다. 그 후, 웰당 500마이크로리터의 트립신 중화 용액을 첨가하여 분리된 세포를 300배의 실온에서 5분 동안 tryin 원심분리를 비활성화합니다. supinate Reese를 제거한 후 150마이크로리터의 세포 고정 용액에 세포 구개를 현탁시키고 세포 현탁액을 유세포 분석 튜브로 옮깁니다.EGFP 발현 세포의 비율과 형광 강도는 형광 강도의 기하 평균을 사용하여 분석합니다. 시간 경과에 따른 단백질 발현은 또한 프로토콜 텍스트에 설명된 바와 같이 형질주입 후 1일, 2일 및 3일에 EGFP 발현 세포의 유세포 분석 분석에 의해 평가되며, 생성된 EGFP mRNA의 기능은 HEC 2 9 3 세포의 형질주입에 의해 테스트되었습니다. 세포에서 EGFP의 생성은 형광 현미경을 사용하여 transfection 24시간 후에 검출되었습니다.여기서, 세포의 얼굴 대비 이미지는 세포의 형광 이미지 옆에 표시됩니다. 세포에서의 EGFP 발현은 또한 transfection 24시간 후에 유세포 분석에 의해 검출되었습니다. 분홍색 선은 mRNA, transfection이 없는 세포를 나타내고 파란색 선은 EGFP 양성 세포를 나타냅니다.EGFP mRNA 형질주입 후 측정된 모든 세포의 93.91%가 양성이었고 형광 강도의 기하 평균은 720.16이었습니다. HC2 93 세포에서의 단백질 발현 기간은 mRNA 후 1일, 2일 및 3일 후 EGFP 발현을 측정하여 평가하였다. Transfection 단백질 발현은 Transfection 후 24시간 후에 세포에서 가장 높았습니다.그 양은 다음 날마다 1.6배씩 감소했지만, 3일 후에도 세포에는 EGFP가 포함되어 있습니다. 이 기술은 제대로 수행되면 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 세포에서 원하는 단백질 발현을 유도하기 위해 안정화된 변형 mRNA를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이후 인간 게놈 시대에 원시 conformations에서 재조합 단백질의 가용성은 구조적 기능적 및 치료 연구와 개발에 매우​​ 중요합니다. 여기서는 테스트 및 재조합 단백질의 다양한 생산하는 데 사용할 수있는 인간의 배아 신장 293T 세포에 대규모 단백질 발현 시스템을 설명합니다.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

포유류 시스템에 의한 재조합 단백질의 발현은 구조 생물학을 위한 단백질 복합체를 생산하는 매력적인 방법이 되고 있습니다. 여기에서 우리는 구조 연구를 위해 단백질 복합체를 정제하기 위해 현탁액 성장 포유류 세포를 사용하는 간단하면서도 매우 효율적인 발현 시스템을 제시합니다.

소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

적절한 번역 후 변형을 통한 진핵 단백질의 실험실 규모 생산은 상당한 장벽을 나타냅니다. 다음은 포유류 발현 시스템을 사용하여 단백질 발현을 위한 신속한 확립 및 전환을 제공하는 강력한 프로토콜입니다. 이 시스템은 선택적 아미노산, 단백질의 선택적 표지 및 글라이칸 조성의 저분자 조절제를 지원합니다.

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

여기 우리가 드라이 필름 방식에 기반 하 고 안전에 대 한 사용할 수 있습니다 양이온 nanoliposomes의 생성에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 효율적인 전달 체 외에 문자 메신저 RNA.

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

여기 우리 재활 요인 인코딩 수정된 mRNAs를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 인간의 기본 섬유 아 세포를 재 설 정할 임상 관련, 높은 효율, 피더 무료 메서드를 설명 하 고 성숙한 예측에 관한-367/302 모방. 또한는 재활 효율성을 평가 하는 방법 클론 iPSC 식민지 확장 및 pluripotency 마커 TRA-1-60의 식을 확인 있습니다.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

둘 다 생체 외에서 그리고 세포에서 선택적 2'-히 드 록 acylation 뇌관 연장 (모양) 실험 사전 mRNA 시퀀스는 RNA를 대상으로 작은 분자의 존재의 2 차 구조를 결정 하 여 분석에 대 한 자세한 프로토콜은 이 문서에서 제시 하는.

작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도

대식세포, 특히 1차 대식세포는 비자기 기원의 분자를 검출하는 것을 전문으로 하기 때문에 트랜스펙트에 도전하고 있습니다. 우리는 플라스미드와 같은 DNA 템플릿에서 생성된 mRNA를 가진 1 차적인 대식세포의 고도로 능률적인 형질혈을 허용하는 프로토콜을 기술합니다.

체외 전사 mRNA를 가진 1 차적인 대식세포의 고효율 형질감염

이 프로토콜은 RNA 및 단백질 생산 합성 세포의 상향식 준비를 위한 방법, 물질, 장비 및 단계를 설명합니다. 합성 세포의 내부 수성 구획은 지질 이중층(즉, 안정한 리포솜) 내에 캡슐화된 S30 세균 용해물을 함유하고, 수중 오일 에멀젼 전달 방법을 사용하였다.

세포가 없는 세균 추출물, 리포좀 및 에멀젼 전달을 사용하여 합성 세포를 생산하는 단백질 을 준비합니다.

자체 조립된 펩타이드-폴록사민 나노입자(PP-sNp)는 미세유체 혼합 장치를 사용하여 개발 되어 시험관 내 전사된 메신저 RNA를 캡슐화하고 전달합니다. 기술된 mRNA/PP-sNip는 배양된 세포를 시험관내에서 효율적으로 형질감염시킬 수 있었다.

펩티드-폴록사민 나노입자를 사용하여 배양된 세포에서 시험관내 트랜스크립션된 mRNA의 효율적인 형질감염

이 프로토콜은 합성 세포를 구성하는 데 사용되는 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 설명합니다. 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 대표적인 결과를 제공하는 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 합성 세포 커뮤니티의 다양한 실험실에 대한 모범 사례를 수립하여 합성 세포 개발의 진전을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

합성 세포 구축을 위한 Cell-Free 단백질 합성 시스템

학습하세요 체외 합성으로 수정된 mRNA를 제조하여 인간 세포에서 단백질 발현을 유도하는 방법을. 플라스미드 증폭, 전사, DNA 제거, 인산화 효소 처리 단계를 포함하며, 형광 현미경과 유세포 분석으로 결과를 검증합니다.

체외 합성에 인간의 세포에서 단백질 발현 유도의 mRNA를 수정의

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