체외 합성에 인간의 세포에서 단백질 발현 유도의 mRNA를 수정의

이 절차의 전반적인 목표는 세포에서 단백질 발현 유도를 위해 변형된 mRNA의 체외 합성입니다. 이는 먼저 플라스미드 삽입물 또는 코딩 DNA 염기서열을 증폭하고 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 120 티미딘의 폴리 T 테일을 추가함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 생성된 DNA를 폴리 아데닌 꼬리를 가진 mRNA로 체외에서 전사하는 것입니다.

다음으로, 주형 DNA는 시험관 내 전사 반응 혼합물의 D'S 처리에 의해 제거됩니다. 마지막 단계는 생산된 mRNA를 남극 인산가수분해효소(Antarctic phosphatase)로 처리하여 5개의 프라임 인산염을 제거하는 것입니다. 궁극적으로 세포는 생성된 mRNA, 지질 복합체에 의해 transfection됩니다.

형광 현미경 검사 및 유세포 분석 분석은 세포에서 향상된 GFP의 합성을 보여주는 데 사용됩니다. 바이러스 transfection과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 숙주 세포 게놈에 통합되지 않아 발암 위험을 방지할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 세포에서 누락되거나 결함이 있는 단백질을 생성하는 데 도움이 될 수 있으며 유전 질환의 예방 접종 치료에 사용할 수 있습니다.

그리고 재생 의학 분야에서는 제 연구실의 대학원생인 steinle이 시연할 것입니다. 이 절차를 시작하기 전에, 필요한 코딩 DNA 서열 또는 CDS를 포함하는 플라스미드를 대장균에서 증폭하고 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 분리했습니다. 이 예에서 관심 CDS는 EGFP의 CDS에 poly detail을 동시에 증폭하고 추가하는 향상된 녹색 형광 단백질 또는 EGFP입니다.

프로토콜 텍스트에 자세히 설명된 대로 PCR 혼합물을 준비합니다. PCR 튜브를 thermocycler에 넣고 프로토콜 텍스트에 설명된 PCR 사이클링 프로토콜을 실행합니다. PCR 반응이 완료되면 시판되는 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 반응을 세척하고 20마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 DNA를 희석합니다.

PCR 산물의 품질을 확인하려면 DNA 겔 전기영동을 수행하고 이미징 시스템에서 DNA 밴드를 시각화합니다. 약 1, 100 염기쌍 길이의 투명한 DNA 띠는 체외 전사 또는 IVT 중에 검출되어야 합니다. 앞서 생성된 DNA는 mRNA로 전사될 것입니다.

여기에 표시된 대로 NTP 캡 아날로그 혼합물을 준비합니다. 와류로 NTP 캡 아날로그 혼합물을 철저히 혼합합니다. 그런 다음 스핀 다운: 이 표에 설명된 대로 IVT 반응 혼합물을 간단히 조립합니다.

위아래로 부드럽게 피펫팅하여 IVT 반응 혼합물을 철저히 혼합합니다. 그런 다음 PCR 튜브를 잠시 원심분리하여 튜브 바닥에 혼합물을 수집합니다. IVT 반응 혼합물을 온도 혼합기에서 3시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.

3시간 후 IVT 반응 혼합물에 1마이크로리터의 DNA를 첨가하여 주형 DNA를 제거합니다. 잘 섞어 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. RNA 정제 키트를 사용하여 반응 혼합물을 정제하고 스핀 컬럼 멤브레인에서 변형된 MR NA를 40마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물로 두 번 희석하고, IVT에 의해 생성된 변형된 mRNA를 포스파타아제로 처리하여 면역 활성화를 유발할 수 있는 5개의 프라임 트리포스페이트를 제거해야 합니다.

이 절차를 시작하려면 9마이크로리터의 10 x 남극 인산가수분해효소 반응 완충액을 79마이크로리터의 정제된 mRNA 용액에 추가합니다. 그런 다음 2마이크로리터의 남극 인산가수분해효소를 넣고 샘플을 부드럽게 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.

30분 후, RNA 정제 키트를 사용하여 반응 혼합물을 정제하고 스핀 컬럼 멤브레인에서 변형된 mRNA를 50마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물로 두 번 희석합니다. 변형된 mRNA의 농도를 측정한 후 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 농도를 마이크로리터당 100나노그램으로 조정합니다. RNA 겔 전기영동에 의해 합성된 변형된 mRNA의 품질을 확인하고 UV 트랜스 일루미네이터에서 래더 및 mRNA 금지를 시각화합니다.

길이가 약 1, 100 염기쌍인 투명한 mRNA 띠를 검출해야 합니다. 합성된 변형된 mRNA를 2회 도금하여 형질주입을 위해 HEC 2 9 3 세포를 준비합니다. 12웰 플레이트의 웰당 5개의 세포를 중앙에 배치하고 세포 배양기에서 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다. 다음 날 세포는 80-90%의 합류점에 도달해야 합니다.

transfection을 위한 lipo plexus를 생성합니다. 12 well plate의 각 well에 transfection할 수 있는 충분한 transfection 혼합물을 준비하려면 modified mRNA 2.5 μg, lipid transfection 시약 2 μl, opt one 473 μl가 필요합니다. 세럼 매체를 줄입니다.

음성 대조군으로 피펫팅하여 성분을 부드럽게 혼합합니다. Mr.NA 없이 transfection 혼합물을 준비하고, 실온에서 20분 동안 transfection 혼합물을 배양하여 lipo plex를 생성합니다. 형질주입용.

500마이크로리터의 DPBS로 세포를 세척합니다. 웰 500마이크로리터를 12웰 플레이트의 각 웰에 주입 혼합물 500마이크로리터를 추가하고, 섭씨 37도에서 4시간 동안 세포를 배양하고, 4시간 후 5%의 이산화탄소를 배양하고, 트랜스펙션 혼합물을 흡인하고, 완전한 세포 배양 1ml를 추가합니다. 각 우물에 있는 세포에 매체.

세포 배양기에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 세포의 형광 현미경 분석을 수행하여 유세포 분석을 위해 세포를 준비합니다. 웰에서 세포 배양 배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS 중 하나로 각 웰을 세척합니다.

웰당 500마이크로리터의 TRIPSIN EDTA를 추가하여 세포 배양 플레이트의 표면에서 세포를 분리합니다. 그 후, 웰당 500마이크로리터의 트립신 중화 용액을 첨가하여 분리된 세포를 300배의 실온에서 5분 동안 tryin 원심분리를 비활성화합니다. supinate Reese를 제거한 후 150마이크로리터의 세포 고정 용액에 세포 구개를 현탁시키고 세포 현탁액을 유세포 분석 튜브로 옮깁니다.

EGFP 발현 세포의 비율과 형광 강도는 형광 강도의 기하 평균을 사용하여 분석합니다. 시간 경과에 따른 단백질 발현은 또한 프로토콜 텍스트에 설명된 바와 같이 형질주입 후 1일, 2일 및 3일에 EGFP 발현 세포의 유세포 분석 분석에 의해 평가되며, 생성된 EGFP mRNA의 기능은 HEC 2 9 3 세포의 형질주입에 의해 테스트되었습니다. 세포에서 EGFP의 생성은 형광 현미경을 사용하여 transfection 24시간 후에 검출되었습니다.

여기서, 세포의 얼굴 대비 이미지는 세포의 형광 이미지 옆에 표시됩니다. 세포에서의 EGFP 발현은 또한 transfection 24시간 후에 유세포 분석에 의해 검출되었습니다. 분홍색 선은 mRNA, transfection이 없는 세포를 나타내고 파란색 선은 EGFP 양성 세포를 나타냅니다.

EGFP mRNA 형질주입 후 측정된 모든 세포의 93.91%가 양성이었고 형광 강도의 기하 평균은 720.16이었습니다. HC2 93 세포에서의 단백질 발현 기간은 mRNA 후 1일, 2일 및 3일 후 EGFP 발현을 측정하여 평가하였다. Transfection 단백질 발현은 Transfection 후 24시간 후에 세포에서 가장 높았습니다.

그 양은 다음 날마다 1.6배씩 감소했지만, 3일 후에도 세포에는 EGFP가 포함되어 있습니다. 이 기술은 제대로 수행되면 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 세포에서 원하는 단백질 발현을 유도하기 위해 안정화된 변형 mRNA를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.