서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

본 절차의 전반적인 목표는 재조합 단백질을 소포체(ER) 및 GOGI 매개 분비 경로로 타겟팅함으로써 적절한 포유류 당쇄화가 이루어진 포유류 당단백질을 발현시키는 것입니다. 이 방법은 특정 단백질의 역할, 항체 및 항체 단편의 구조적 패턴 및 면역 활성화 잠재력과 같은 면역학의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 세포를 사용하여 인간 단백질을 발현시킨다는 점이며, 이는 타겟 단백질이 적절하게 접히고 수정될 수 있도록 적합한 세포 환경을 제공합니다.

세포 배양을 위한 인큐베이터 쉐이커는 배양 접종 최소 1시간 전에 135 RPM, 80% 습도, 8% 이산화탄소, 37 °C로 작동시켜야 합니다. 생물안전작업대의 UV 램프를 켜고, 밀봉된 배지 A와 배지 B 병을 37 °C 항온수조에서 예열하십시오. UV 램프를 끄고 70% 에탄올 수용액으로 생물안전작업대를 멸균하십시오.

70% 에탄올 수용액을 분사하여 125 mL 삼각 플라스크, 통기성 캡, 피펫, 피펫팅 도구 및 미리 데워둔 배지 병을 멸균합니다. 이 항목들을 실험 과정 전반에 걸쳐 생물안전작업대 내에 배치하십시오. 모든 품목은 생물안전작업대로 반입하기 전에 반드시 이 방식으로 멸균해야 합니다.

배지 A 26 mL와 배지 B 3 mL를 취해 125 mL 삼각 플라스크에 옮겨 30 mL 배양을 위한 신선한 배양 배지를 준비합니다. 부드럽게 흔들어 섞어줍니다. -80 °C에서 냉동 보관했던 HEK 2 93 F 세포 바이알을 37 °C 항온 수조에서 가온하여 세포를 부분적으로 해동합니다. 이 과정은 약 1분 정도 소요되며, 세포가 완전히 해동되지 않도록 주의해야 합니다.

다음으로, 바이알 외부를 70% 에탄올 수용액으로 소독한 후 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내부로 옮깁니다. 1 mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 취해 29 mL의 신선한 배지가 들어 있는 125 mL 삼각플라스크에 옮깁니다. 배양 플라스크의 뚜껑을 닫고 인큐베이터 쉐이커에 넣어 24시간 동안 배양합니다.

배양 접종 24시간 후, 세포 밀도를 확인하고 배양 플라스크를 70% ethanol 및 증류수 용액으로 소독한 후 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내부로 이동시킵니다. 1mL 피펫과 피펫터를 사용하여 배양액 100µL를 천천히 흡입하여 멸균된 0.5mL einor 튜브로 옮깁니다.

배양 플라스크의 덮개를 닫고 가능한 한 빨리 배양 플라스크를 인큐베이터 셰이커로 되돌립니다. 7.5 µL의 트라이판 블루 용액과 7.5 µL의 세포를 혼합합니다. 격렬하게 혼합한 후, 혼합액 7.5 µL를 계수 슬라이드로 옮깁니다.

자동 세포 계수기를 켜고 카운팅 슬라이드를 로딩 챔버에 넣습니다. 자동 판독기가 활성화되면 mL당 세포 수와 생존율(%) 단위로 세포가 자동으로 계수됩니다. 신선한 배양액으로 옮겨 mL당 300,000개의 생존 세포 밀도를 얻기 위해 필요한 공여 배양액의 부피를 결정합니다.

이전에 설명한 대로 배지 A 23 milliliters와 배지 B 3 milliliters를 새 125 milliliter 배양 플라스크로 옮겨 신선한 배양 배지를 준비합니다. 그 후, 오염 위험을 줄이기 위해 배지 A와 배지 B의 스톡 병을 생물안전작업대에서 꺼냅니다. 인큐베이터에서 HEK 2 93 F 세포 배양 플라스크를 꺼냅니다.

70% 에탄올 수용액으로 분무한 후 생물안전작업대 내에 배치합니다. 새로운 피펫을 사용하여, 배양물에서 정확한 양의 세포 분주액을 취해 신선한 배지가 담긴 플라스크로 옮깁니다. 두 배양물 모두 생물안전작업대에서 인큐베이터 셰이커로 옮깁니다.

트랜스펙션을 수행하기 전, 세포를 mL당 약 200만에서 300만 개의 생존 세포 밀도로 배양합니다. 이전에 설명한 방법에 따라 세포 밀도를 확인하고 트랜스펙션에 사용할 세포 양을 결정합니다. 멸균된 세롤로지컬 피펫을 사용하십시오.

적절한 부피의 세포 현탁액을 250 milliliter 원심분리 튜브에 옮깁니다. 100 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다. 멸균 후, 세포 펠릿이 포함된 튜브를 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮깁니다.

멸균 피펫을 사용하여 소모된 배양 배지로 구성된 상청액을 따라냅니다. 10 milliliters의 신선한 배양 배지를 사용하여 피펫팅을 반복함으로써 펠릿 형태의 세포를 격렬하게 재현탁하고, 신선한 형질전환 배양이 들어 있는 준비된 플라스크로 옮깁니다. 통기성 세포 배양 플라스크의 캡을 돌려 닫고, 세포가 배양되는 동안 인큐베이터 셰이커에서 15분에서 1시간 동안 배양합니다.

신선한 배양 배지를 사용하여 플라스마 DNA와 POLYETHERAMINE 또는 PEI 스톡을 최종 농도 0.5 µg/µL가 되도록 희석합니다. 세포가 분산된 배양 플라스크를 인큐베이터 쉐이커에서 꺼내 바이오안전 작업대로 옮깁니다. 마이크로 피펫을 사용하여 300 µL의 플라스마 DNA를 배양액에 첨가하고 부드럽게 수동으로 흔들어 섞어준 뒤, 900 µL의 PEI를 배양액에 첨가하고 다시 섞습니다. 그 후 3.8 mL의 신선한 배양 배지를 첨가합니다.

플라스크를 인큐베이터 셰이커로 옮겨 24시간 동안 배양합니다. 형질전환 24시간 후, 세포 배양액을 희석해야 합니다. 희석 배지를 먼저 준비하려면, 멸균된 1mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 미리 데워둔 220mM valproic acid(VPA) 1mL를 취해 멸균된 50mL 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 멸균된 혈청분주기(serological pipette)를 사용하여 미리 데워둔 배지 B 5 mL와 미리 데워둔 배지 A 44 mL를 VPA 용액에 첨가합니다. 이렇게 하면 VPA의 최종 농도가 4.4 mM인 신선한 배양액 50 mL가 만들어집니다. 인큐베이터에서 형질전환된 배양물을 꺼냅니다.

플라스크 외부를 멸균한 후 생물안전작업대(biosafety cabinet) 안에 놓습니다. 준비된 희석 배지를 배양액에 첨가합니다. 형질전환 후 4~5일 동안 플라스크를 다시 진탕 배양기에 넣어 배양합니다.

앞서 설명한 절차에 따라 매일 세포 생존력을 모니터링하십시오. 단백질 발현 분석을 위해 transfection 후 5~6일이 지났거나 세포 생존력이 50% 미만으로 떨어진 경우, 매일 aliquot를 보관해야 합니다. 세포와 배지를 1000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수확하십시오. 분비 단백질이 포함된 상층액을 수집하고, HEK 세포 펠릿에 10% 표백제 용액 5 mL를 가한 후 생물학적 위험물로 폐기하십시오.

그 후, 수집된 상층액으로부터 단백질을 정제합니다. 이 발현 시스템은 HK 2 93 F 세포의 일시적 형질전환 후 IgG 1 fc의 전형적인 발현 패턴에서 알 수 있듯이, 높은 수율의 당화 단백질을 생성했습니다. IgG 1 FC용 단백질 컬럼 또는 FC gamma receptor III A가 포함된 히스티딘 태그 GFP용 니켈 컬럼을 이용한 친화성 정제를 통해 고순도의 단백질을 얻었습니다.

이 시스템은 수소 핵과 직접 결합된 아미드 질소의 공명 주파수를 상관시키는 이 2차원 NMR 스펙트럼에서 동위원소 농축 IgG one FC를 효율적으로 발현했습니다. 15개 원자의 신호가 잘 분산되어 관찰되었습니다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 전리 질량 분석법(MALDI-MS) 분석 결과에서 알 수 있듯이, 서로 다른 배양 조건 하의 HEK 2 93 F 및 HEK 2 93 s 세포를 통해 서로 다른 당쇄 형태가 생성되었습니다.

HEK 293S 세포에서 발현된 IgG1 FC는 5개의 mannose와 2개의 N-acetylglucosamine 잔기로 구성되며 fucose를 포함하지 않는 형태의 glycans를 보유하고 있었습니다. HEK 293F 발현 물질에서 유래한 glycans는 core fucose를 포함하는 complex type biantennary 형태로, 대부분 terminal N-acetylglucosamine을 가지거나 소량의 mono- 또는 di-fucosylated 형태로 나타났습니다. HEK 293F 세포를 이용한 발현 과정에 glycan 저해제를 첨가한 결과, fucose 통합이 90% 이상 감소하는 것으로 나타났습니다. 숙련된 경우, 일시적 형질전환(transient transfection) 수립은 1일 차에 1.5시간, 2일 차에 15분 내로 완료할 수 있습니다. 4~6일의 발현 기간 후, 단백질이 포함된 용액을 15분 만에 수확할 수 있습니다.

마지막으로, 단백질 정제에는 약 1.5시간이 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때, transfection 전까지 안정적인 배양 상태를 유지하고, 활발하게 성장하는 세포에 transfection을 진행하며, PEI를 첨가하기 전에 DNA를 먼저 첨가해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에, 발현된 당단백질의 구조와 기능을 조사하기 위해 다양한 생물리학적 기법을 이용한 단백질 기능 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 IgG와 당화의 구조-활성 관계를 in vitro 및 in vivo에서 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 K 2 93 F 세포와 PZ N two 벡터의 조합을 사용하여 당단백질을 준비하고 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.