서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

적절한 번역 후 변형을 통한 진핵 단백질의 실험실 규모 생산은 상당한 장벽을 나타냅니다. 다음은 포유류 발현 시스템을 사용하여 단백질 발현을 위한 신속한 확립 및 전환을 제공하는 강력한 프로토콜입니다. 이 시스템은 선택적 아미노산, 단백질의 선택적 표지 및 글라이칸 조성의 저분자 조절제를 지원합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 재조합 단백질을 ER 및 GOGI 매개 분비 경로에 표적으로 하여 적절한 포유류 당단백질을 발현하는 것입니다. 이 방법은 사양의 역할, 구조의 패턴, 항체 및 항체 단편의 면역 활성화 잠재력과 같은 면역학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 세포를 사용하여 인간 단백질을 발현하여 표적 단백질을 적절하게 접고 수정할 수 있는 적절한 세포 전달을 제공한다는 것입니다.

세포 형성을 위한 incubator shaker는 배양 접종 최소 1시간 전에 135RPM, 습도 80%, 이산화탄소 8%, 섭씨 37도에서 작동해야 합니다. UV 램프를 켜십시오.amp 생물 안전 캐비닛의 밀봉된 매체 A 및 매체 B 병을 섭씨 37도의 수조에서 예열합니다. 자외선을 끄고 70% 에탄올과 수용액으로 생물 안전 캐비닛을 살균합니다.

125ml 삼각 성장 플라스크에 벤트 캡 피펫, 피펫 및 예열 배지 병을 수용액에 70% 에탄올을 분사하여 살균합니다. 이 절차를 통해 이러한 품목을 생물 안전 캐비닛에 넣으십시오. 모든 품목은 생물 안전 캐비닛에 넣기 전에 이러한 방식으로 멸균해야 합니다.

26ml의 배지 A와 3ml의 배지 B를 회수하고 125ml 삼각 플라스크로 옮겨 30ml 배양을 위한 신선한 배양 배지를 준비합니다. 이전에 섭씨 영하 80도에서 동결된 HEK 2 93 F 세포의 바이알을 섭씨 37도의 수조에서 부드럽게 흔들어 따뜻하게 혼합하여 세포를 부분적으로 해동합니다. 이 작업은 약 1분이 소요되며 세포를 완전히 해동해서는 안 됩니다.

다음으로, 물 용액에 70% 에탄올을 함유한 바이알 외부를 살균하고 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 1ml 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 회수하고 29ml의 신선한 배양 배지가 들어 있는 125ml 삼각 플라스크로 옮깁니다. 배양 플라스크의 덮개를 닫고 플라스크를 인큐베이터 셰이커에 24시간 동안 넣습니다.

배양 접종 후 24시간. 세포 밀도를 확인하고 배양 플라스크를 70% 에탄올과 물 용액으로 살균하고 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 1밀리리터 피펫과 피펫터를 사용하여 100마이크로리터의 배양액을 천천히 회수하여 멸균된 0.5밀리리터 아이노르 튜브로 옮깁니다.

배양 플라스크의 덮개를 닫고 가능한 한 빨리 배양 플라스크를 인큐베이터 셰이커에 다시 넣으십시오. 7.5마이크로리터의 트리안 블루 용액과 7.5마이크로리터의 셀을 혼합합니다. 격렬하게 혼합한 다음 혼합물 7.5마이크로리터를 계수 슬라이드로 옮깁니다.

자동 셀 카운터를 켜고 계수 슬라이드를 적재 챔버에 놓습니다. 자동 판독기가 활성화되고 세포가 밀리리터당 세포 수와 생존율 단위로 자동으로 계산됩니다. 밀리리터당 300, 000 살아있는 세포의 세포 밀도를 얻기 위해 신선한 배양 배지로 옮기는 데 필요한 공여자 배양액의 부피를 결정합니다.

23ml의 배지 A와 3ml의 배지 B를 새로운 125ml 배양 플라스크에 옮겨 앞에서 설명한 바와 같이 새로운 배양 배지를 준비합니다. 그런 다음 생물 안전 캐비닛에서 매체 A 및 매체 B의 스톡 병을 제거하여 오염 위험을 줄이십시오. 인큐베이터에서 HEK 2 93 F 세포 배양 플라스크를 회수합니다.

70% 에탄올과 물 용액을 뿌리고 새 피펫을 사용하여 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 배양액에서 세포의 올바른 분취량을 회수하여 신선한 배양액이 들어 있는 플라스크로 옮깁니다. 보통. 두 배양액을 생물 안전 캐비닛에서 인큐베이터 셰이커로 옮깁니다.

transfection 전에 ml리터당 2-300만 개의 살아있는 세포의 대략적인 밀도로 세포를 성장시킵니다. 앞서 설명한 바와 같이 세포 밀도를 확인하고 형질주입을 위한 세포의 양을 측정합니다. 멸균 혈청학 피펫을 사용합니다.

적절한 부피의 세포 현탁액을 250ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 5분 동안 100배 G에서 원심분리하여 세포를 수집합니다. 멸균 후 펠릿화된 세포가 들어 있는 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.

멸균 피펫을 사용하여 소비된 것으로 구성된 상등액을 디캔팅합니다. 배양 배지는 10ml의 신선한 배양 배지를 사용하여 위아래로 피펫팅하여 펠릿화된 세포를 격렬하게 재전송하고 신선한 transfection 배양을 포함하는 준비된 플라스크로 옮깁니다. 보통. 벤트된 세포 배양 플라스크의 캡을 조이고 세포가 배양하는 동안 15분에서 1시간 동안 인큐베이터 셰이커에서 플라스크를 배양합니다.

신선한 배양 배지를 사용하여 혈장 DNA와 폴리에테르아민 또는 PEI 스톡을 마이크로리터당 0.5마이크로그램의 최종 농도로 희석합니다. 인큐베이터 쉐이커에서 분산된 세포가 있는 배양 플라스크를 제거하고 마이크로 피펫과 300마이크로리터의 혈장 DNA를 사용하여 생물 안전 캐비닛으로 가져간 후 900마이크로리터의 PEI에서 배양액에 부드럽게 수동 흔든 후 배양물에 혼합하고 다시 혼합합니다. 그런 다음 3.8 밀리리터의 신선한 배양 배지.

플라스크를 인큐베이터 셰이커에 24시간 동안 옮깁니다.형질 주입 후 24시간이 지나면 세포 배양을 희석해야 합니다. 희석 매체를 먼저 준비하려면 멸균 1ml 혈청학 피펫을 사용하여 1ml의 PREWARM 220 millimolar valproic acid 또는 VPA를 빼내어 멸균 50ml 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 5ml의 예열 배지 B와 44ml의 예열 배지 A를 VPA 용액에 추가합니다. 그 결과 최종 농도는 4.4 millimolar의 VPA와 함께 50 ml의 신선한 배양 배지가 생성됩니다. 인큐베이터에서 형질주입된 배양액을 검색합니다.

플라스크 외부를 살균하고 플라스크를 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 제조된 희석 배지를 배양액에 첨가합니다. transfection 후 추가로 4-5일 동안 플라스크를 incubator shaker로 다시 옮깁니다.

앞에서 설명한 절차를 통해 매일 세포 생존력을 모니터링합니다. 또한 형질주입 후 5-6일 후 또는 세포 생존율이 50% 미만으로 떨어지면 5분 동안 1000배 G에서 세포와 배지를 원심분리하여 세포 발현 분석을 위해 매일 분취량을 저장해야 합니다. 분비된 단백질을 5ml의 10% 표백제 용액으로 함유할 상등액을 HEK 세포 펠릿에 모아 생물학적 위험으로

그 후, 단백질은 수집된 상층액에서 정제됩니다. 이 발현 시스템은 HK 2 93 F 세포의 일시적인 형질주입 후 IgG one fc의 이러한 전형적인 발현 패턴에 의해 설명되는 높은 수율의 당화 단백질을 생성했습니다. IgG용 단백질 컬럼, FC 1개 또는 FC 감마 수용체 3A가 있는 GFP 태그가 지정된 히스타민용 니켈 컬럼을 사용한 친화성 정제는 고순도 단백질을 생성했습니다.

이 시스템은 수소 핵의 공명 주파수와 직접 결합된 아미드 질소의 상관 관계를 나타내는 이 2차원 NMR 스펙트럼에서 동위원소가 풍부한 IgG one FC를 효율적으로 표현했습니다. 15개의 원자, 잘 분산된 신호가 관찰되었습니다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량 분석 분석에 의해 나타난 바와 같이 상이한 배양 조건 하에서 HEK 2 93 F 및 HEK 2 93 s 세포로 상이한 글리코 형태를 생산하였다.

HEK 2 93 s 세포로부터 발현된 IgG 1 FC 및 HEK 2 93 F 발현 물질로부터 FU 글루코스 글리칸을 함유하지 않은 5개의 아노와 2개의 N 아세틸 글루코사민 잔기를 가진 형태의 글리칸은 코어 FU 글루코스를 갖는 복합형 bi 여정 형태였으며 대부분 말단 N 아세틸 글루코사민 또는 소량의 모노 또는 확장 형태를 가졌다. HEK 2 93 F 세포를 사용하여 수행된 발현에 글리칸 생성 억제제를 첨가하면 fuco 혼입이 90% 이상 감소하는 것으로 나타났으며, 일단 마스터되면 일시적 형질주입을 확립하는 것은 1일차에 1.5시간, 2일차에 15분 내에 완료될 수 있습니다. 4일에서 6일의 발현 기간 후, 단백질을 함유한 용액을 15분 안에 수확할 수 있습니다.

마지막으로, 이 절차를 시도하는 동안 단백질을 정제하는 데 약 1.5시간이 소요되며, 활발하게 성장하는 세포를 transfection하고 PEI를 추가하기 전에 DNA를 추가하기 전에 안정적인 배양을 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따릅니다. 발현된 당단백질의 발달 후 구조와 기능을 조사하기 위해 다양한 생물물리학 기술을 사용하여 단백질 기능 특성화와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 IgG와 당화(glycosylation)의 구조, 활성, 관계, in vitro 및 in vivo를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 K 2 93 F 세포와 PZ N 2 벡터의 조합을 사용하여 당단백질을 준비하고 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.