Name: 서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 배우세요 HEK293 세포를 이용한 과도 형질전환으로 재조합 인간 당단백질을 고수율로 발현하는 방법입니다. 이 기술은 면역학 연구에서 항체 구조와 면역 활성화 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 재정적 보조금 K22AI099165 (AWB)에 의해, P41GM103390 (KWM)와 국립 보건원에서 P01GM107012 (KWM), 아이오와 주립 대학에서 생화학, 생물 물리학 및 분자 생물학의 로이 J. 카버 부서에서 기금에 의해 지원되었다 . 이 작품의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

이 프로토콜 또는 HEK293F 감염된 HEK293S 세포를 사용하여 표현하기에 충분하다. 1. 셀 설립 <ol><li> 문화 접종 참고 : 모든 문화 조작 절차는 BSL-2 시설에서 실시되어야하며, 각 항목은 수용액에서 70 % 에탄올로 분사하여 살균해야하는 바이오 안전성 캐비닛에 가져왔다. <ol><li> 135 rpm으로, 80 % 습도에서 인큐베이터 쉐이커를 운영하고 8.0 % CO 2, 37 ℃에서. 작업에 적어도 1 시간 전에 바이오 안전성 캐비닛의 UV 램프 &quot;의&quot;를 켭니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 물 욕에서 밀봉 된 중간과 중간 B 병 Prewarm. </li><li> 수용액에 70 %의 에탄올로 분무하여 벤트 캡, 피펫, 피펫과 데워진 미디어 병 125 ml의 삼각 플라스크 성장 살균. 바이오 안전성 캐비닛에 이러한 항목을 놓습니다. 참고 : 125 ml의 삼각 문화 플라스크를 덮고 바깥 쪽 플라스틱을 소독하고, 때 나는 만 제거바이오 안전성 캐비닛 내부의. </li><li> 흔들어 혼합 (이후 신선한 배지로 지칭) 부드럽게 30 ㎖ 배양 용 26 중간 ㎖의 중간 B의 3 ㎖ (최종 배양의 10 %)을 회수하고, 125 mL의 삼각 배양 플라스크에 옮기고. </li><li> 얼음에 배양 공간으로 이동 -80 ° C에 냉동 H​​EK293F 세포를 포함하는 세포의 전사 한 바이알. 주 : HEK293F 세포를 1 × 107 세포 / ml의 밀도로 제공된다. </li><li> (이것은 약 1 분 소요되며 세포가 완전히 해동 안) 부분적으로 세포를 해동 37 ℃에서 수조에서 유리 병을 가볍게 가온. 수용액에 70 % 에탄올로 유리 병의 외부를 소독 및 바이오 안전성 캐비닛으로 이동합니다. </li><li> 1 ml의 피펫을 사용하여, 세포 현탁액 (0.7 ml)에 인출하고, 신선한 배지 29 ml를 함유 125 mL의 삼각 플라스크에 옮긴다. 문화 플라스크의 커버를 닫고 배양 흔드는로 이동합니다. </li></oL&gt; </li><li> 셀 유지 보수 : 세포 밀도, 생존 세포 통로를 확인 <ol><li> 아래의 프로토콜에 따라 문화의 해동의 24 시간 후 세포 밀도를 확인합니다. 참고 : 세포가&gt; 80 %의 필수적인 세포의 성장과 생존을 보장하기 위해 해동 후 24 시간 동안 성장하고 있습니다. </li><li> 수용액에 70 % 에탄올과 문화 플라스크를 소독 및 바이오 안전성 캐비닛으로 이동합니다. </li><li> 1 ML의 피펫과 피펫을 사용하여 천천히 멸균 0.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 현탁 배양 및 전송 100 μl를 철회. 닫기 가능한 한 빨리 통에 다시 문화 플라스크를 전송합니다. </li><li> 세포의 7.5 μL와 트리 판 블루 솔루션의 7.5 μl를 섞는다. 셀 / 트리 판 블루 혼합물의 7.5 μL와 적극적으로 혼합 및 계수 슬라이드로 전송. </li><li> 자동 세포 계수기를 켜고 로딩 챔버로 계산 슬라이드를 배치합니다. 오토 리더가 활성화되어 세포 단위로 자동적으로 카운트mL 및 퍼센트 생존 당 세포의 수 </li><li> 0.3 × 106 살아있는 세포 / ml의 세포 밀도로 신선한 배지로 전송하기 위해 요구되는 도너 문화의 볼륨을 결정한다. 참고 : 보충 자료의 샘플 계산을 참조하십시오. </li><li> 단계를 반복 1.1.2 위의 &quot;1.1 문화 접종&quot;프로토콜의 1.1.3 신선한 배지에 필요한 자료를 준비합니다. </li><li> 신선한 125 ml의 문화 플라스크에 중간 (23 ㎖) 및 중간 (B) (3 ml)에 전송합니다. 바이오 안전성 캐비닛에서 중간과 중간 B의 주식 병을 제거합니다. 주 : 매체 병의 주식 293F HEK 세포와 동시에 바이오 캐비닛에 보관되어서는 안된다. 이것은 스톡 배지 병 오염의 가능성을 제한한다. </li><li> 인큐베이터에서 H​​EK293의 세포 배양액을 제거하고 수용액에 70 %의 에탄올로 분무. (4 ml의 세포의 나누어지는을 철회, 새로운 피펫을 사용하여,이 책은 따라 T를 결정 하였다O의 배양 단계 1.2.6)와 신선한 배지를 함유하는 플라스크에 옮긴다. </li><li> 1.1.1에 따라 설정 인큐베이터 쉐이커에 바이오 안전성 캐비닛에서 문화를 모두 전송합니다. 2-3 × 106 살아있는 세포 / ml의 농도로 세포를 대략적 성장. 주 : 세포의 대략 배가 시간은 32 시간이다. 그것은이 밀도에 도달 3-4 일 소요됩니다. 최초의 형질 전환 이전에 세포의 안정적인 성장 패턴을 가지고 3-4 구절에 대한 세포를 품어. </li></ol></li></ol> 2. 형질에 대한 자료를 준비 <ol><li> HEK293 세포를 준비 (1 일) <ol><li> 형질 감염 전에 새로운 배지 B 24 시간에 1 × 106 세포 / ml의 밀도로 배양 세포는 단계 1.2에있어서. 주 : 형질 전환 배양 부피는 셀의 수에 의존 할 것이다. 큰 형질 볼륨 (&gt; 20 ml)을이 단계에서 문화의 큰 볼륨을 필요로한다. </li></ol></li><li> 세인트 준비재료의 ocks <ol><li> 25 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 150 mM의 염화나트륨 (PH 7.5)를 함유하는 완충액에서 1 mg / ml의 농도로 선형 폴리에틸렌 이민 (PEI)의 스톡 용액을 제조 하였다. 완전히 PEI를 용해; 이 실온에서 30 ~ 60 분 정도 걸릴 수 있습니다. 장시간 사용을 위해 -20 ℃에서 0.22 μM 주사기 필터를 통해 살균 및 저장. </li><li> (2.2.2.1-2.2.2.4 단계에 따라) 멸균 된 플라스미드 DNA를 준비합니다. 플라스미드 건설 절차 (42)는 다른 곳에 설명되어있다. DNA 준비를위한 간단한 절차는 여기에 설명되어 있습니다 : <ol><li> LB 배지 (Tryptone- 10g / L, 추출물을 5g / L 나트륨 클로라이드 - 10g / L 효모)가 보충 된 100 μg의 / 1 L에 pGEn2 벡터로 형질 전환 된 화학적 유능한 대장균 세포의 배양 물을 성장 ㎖의 앰피 실린. E. 대장균은 비 - 습윤, 진탕 배양기에서 37 ℃에서 성장된다. </li><li> 마누 따른 pGEn2 벡터 부호화 대상 플라스미드 DNA를 정제하여의 facturer의 DNA 정제 프로토콜. </li><li> 플라스미드 DNA의 완전한 무균 성을 보장하기 위해, 바이오 캐비닛 내부 DNA 추출 과정의 최종 이소프로판올 침전 단계를 수행 부유. </li><li> 10,000 X에서 용출 된 DNA와 원심 분리기 (플라스미드 준비 키트에 지정) 이소프로판올의 볼륨을 추가 10 분 동안 G. 수용액에 70 % 에탄올로 DNA 용기의 외부 소독 및 바이오 캐비닛 내부에 옮긴다. 펫 및 사용 이소프로판올 뜨는 폐기 DNA 펠렛을 공기 - 건조. 일단 건조, 멸균 10 mM 트리스 완충액, pH가 8.0에서 펠렛을 재현 탁. </li></ol></li><li> 물에 220 밀리미터 발 프로 (VPA) 산의 주식 솔루션을 준비하고 멸균 0.22 μm의 필터를 통과하여 소독. 더 사용할 때까지 -20 ° C에서 솔루션을 저장합니다. </li></ol></li></ol> 3. 과도 형질 구축 <ol><li> 형질 (일 0) <ol><li> 위의 &quot;1.2. 셀 유지 보수&quot;의 1.2.5 단계를 1.2.2에 따라 세포 밀도를 확인합니다. 형질 감염 (생존&gt; 95 %와 2.5-3.0 × 106 살아있는 세포 / ml)에 대한 세포의 양을 결정한다. 보충 자료의 샘플 계산을 참조하십시오. </li><li> 혈청 학적 멸균 피펫을 사용하여 250 mL의 원심 분리 튜브로 이전 단계 (여기에 67 ml)에 계산 된 현탁 배양 세포의 양을 전송. 100 × g으로 5 분간 원심 분리하여 세포를 수집한다. </li><li> 한편, 새로운 형질 전환 배양 배지는 위의 &quot;1.1. 문화 접종&quot;에 따라 단계 1.1.3에 따라 준비합니다. 샘플 계산을위한 보충 자료를 참조하십시오. 또한, 멸균 15 ML 튜브에 신선한 문화 매체의 전송 5ml를 따로 설정합니다. </li><li> 수용액에 70 % 에탄올과 튜브의 외부를 살균 번째 캔트하는 멸균 피펫을 사용 후 바이오 캐비닛으로 세포 펠렛을 함유하는 전열관소비 배지 이루어진 E 상등액. </li><li> 격렬로 pipetting하여 신선한 배지와 형질 신선한 배지와 전사 플라스크에 10 ㎖를 사용하여 아래 펠렛 세포를 재현 탁 (위의 단계 3.1.3에서 제조). 배출 세포 배양 플라스크에 뚜껑을 나사와 진탕 15 분 - 1 시간 동안 (1.1.1에서 설정) 인큐베이터로 플라스크를 이동합니다. </li><li> 이 시간 동안 플라스미드 DNA 및 0.5 μg의 / μL의 최종 농도 (위의 단계 3.1.3에서 인출 5 ml의 부피를 사용하여) 새로운 배지를 이용하여 PEI 축적량 희석. 보충 자료 샘플 계산은 DNA와 PEI의 양을 결정을 참조하십시오. 바이오 안전성 캐비닛에 분산 된 세포 배양 플라스크를 전송합니다. </li><li> 마이크로 피펫을 사용하여 문화 플라스미드 DNA (0.5 μg의 / μL의 300 μL)를 추가하고 부드러운 수동 흔들어 섞는다. PEI 문화 (0.5 μg의 / μL의 900 μL)를 추가, 부드럽게 흔들어 섞는다. 신선한 막힌의 3.8 ML을 추가24 시간 동안 인큐베이터 쉐이커에 위의 단계 3.1.3 및 전송 플라스크에서 진짜야 매체. </li><li> 1.1 단계에 따른 바이오 안전성 캐비닛을 청소합니다. </li></ol></li><li> (50 ㎖ 형질 볼륨) 희석 (1 일) <ol><li> 24 시간 동안 형질 문화를 품어. </li><li> 1ml의 멸균 피펫을 사용하여 혈청학 및 멸균 50 ㎖ 튜브로 전송 (단계 2.2.3에 따라 제조 됨. VPA) 데워진 220 mM의 발 프로 산 1 ㎖를 철회. </li><li> 5.0 데워진 중간 B ㎖의 데워진 중간의 44 mL의 인출 VPA 및 4.4 mM의 최종 농도로 신선한 배지 50 ㎖를 제조 멸균 피펫을 사용하여 혈청학 VPA 용액이 추가. </li><li> 물을 용액에 70 % 에탄올로 플라스크의 외부 살균 후 바이오 캐비닛으로 형질 배양 이동 준비된 희석 매체를 추가 배양 진탕 플라스크로 다시 옮긴다. </li></ol></li><li> 발현 및 수확 (일 2-6) <ol><li> (5-6 일 형질 전환 이후 총) 추가 4~5일에 대한 세포를 품어. </li><li> 단계 1.2.2 다음 배지의 분취 량을 철회. 1.2.5에. SDS-PAGE에 의해 하루에 단백질 발현을 분석 분취 액을 세포 생존 능력을 모니터링하고 저장, 멸균 1 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 위의 &quot;1.2. 셀 유지 관리&quot;에 설명 (아래, 제 5 장 참조). </li><li> 5 분 1,000 g에서 세포 플러스 매체를 원심 분리하여 5~6일 후 수확 세포. 세포 생존율이 50 % 이하를 (단계를 참조 1.2.2-1.2.5) 떨어지면 또한, 상층 액을 수확. </li><li> 분비 단백질을 포함 할 상층 액을 붓는다. HEK 세포 펠렛에 10 % 표백제의 5 mL를 추가하고 생물 학적으로 폐기하십시오. </li></ol></li></ol> 4. 단백질 정제 <ol><li> 단백질의 세 파로스 5 ㎖로 열을 준비합니다. 버퍼 (3- 20 밀리미터 (5 컬럼 부피와 열 평형 N-모르 폴리 노) 프로판 산 (MOPS)의 pH 7.4, 100 mM의 NAC엘). </li><li> 남아있는 세포 파편을 제거하기 위해 고속 (10 분 14,000g)에서 발현 된 단백질에 수집 된 상층 액을 원심 분리기. 신선한 튜브에 경사에 의해 수집합니다. 생물 학적으로 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 상층 액의 10 μL 나누어지는을 수집하고 추가 SDS-PAGE에 의해 샘플을 분석하는 각각의 단백질 정제 단계에서 작은 샘플을 수집 (5 절에서 설명). 정화 된 상층 액을 넣고 통해 흐름을 수집합니다. </li><li> 버퍼의 3 열 볼륨이 컬럼을 세척하고 100 mM의 글리신, 산도 3.0의 5 열 볼륨과 단백질을 용출. 급속 pH를 중화 1/2 1 M TRIS 완충액 용적, 8.0의 pH를 함유 튜브에 용출 물을 수집한다. </li><li> 나중에 사용하기 위해 버퍼 및 저장의 10 열 볼륨에 열을 씻으십시오. </li><li> 버퍼는 사용 10 kDa의 분자량 컷오프 필터를 원심 버퍼의 적어도 10 배 과량으로 용출 된 단백질을 교환한다. 참고 :에 용출 된 샘플을 집중하지 마십시오매우 낮은 볼륨 용출 버퍼 (&lt;2 ㎖). A. 버퍼로 버퍼 교환 원심 필터를 사용 </li><li> 저장소는 다음에 사용할 때까지 4 ° C에서 단백질을 정제 하였다. 주 : 상등액에서 발현 된 단백질은 단백질의 특성에 기초하여 또는 친 화성 태그의 사용을 선택적 친화 컬럼에 의해 정제 될 수있다. 전형적인 정제 절차, 단백질 열은 폴리 히스티딘 태그로 단백질 발현을 위해 사용될 수의 IgG 또는 니켈 된 Fc 단편 또는 열에 사용될 수있다. 여기서, 단백질의 칼럼을 사용의 IgG1-FC에 대한 정제 단계에 대하여 설명한다. </li></ol> SDS-PAGE에 의해 단백질의 분석 5. <ol><li> 배 로딩 완충액 (0.125 M 트리스, pH가 8.0, 4 % SDS, 10 % β 메르 캅토 에탄올, 20 % 글리세롤, 0.01 % 브로 모 페놀 블루)의 동량 각 샘플의 분취 량 (7.5 μL)를 희석. </li><li> 열 블록 또는 수욕을 사용하여 5 분 동안 90 ℃에서 혼합물을 끓인다. 10,000g FO에서 샘플을 원심 분리기R 1 분. 마커 단백질의 5 μL와 일회용 팁 20 μL 피펫을 사용하여 분석을위한 시료 14 μL와 준비된 젤을로드합니다. </li><li> 60 분 동안 25 밀리 암페어에 한 젤을 실행합니다. 전기 영동 단계가 완료되면, 물을 5 분 동안 전자 레인지로 1 L 용기에 겔을 전송. </li><li> 물에 염색 액 (40 % 에탄올, 10 % 아세트산 및 0.1 % 쿠마시 브릴리언트 블루)을 2 시간과 함께 겔 destain 얼룩. </li></ol> 질량 분석 6. 글리 칸 분석 <ol><li> 이전 44 설명 된대로 글리 칸을 분석합니다. 간단히,의 IgG1-FC의 75 μg의 다음 글리 칸 (45)의 석방을 PNGaseF에 의해 처리, 트립신했다. 릴리즈 글리 칸은 메틸화 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 형 질량 분석계 (MALDI-TOFMS)를 사용하여 분석 하였다. </li></ol> 특별 시나리오 7. 프로토콜 조정 <ol><li> 15 N-와 단백질에 레이블(50 ㎖ 형질 볼륨) 아미노산 표지 <ol><li> 단일 멸균 유리 바이알에 각각의 아미노산 5 ㎎을 분배. 물을 멸균 4 ㎖ (완전히리스와의 Phe는 달리, 용해하지 않는 티르 주)로 재현 탁. 15 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브에 의해 살균 용액. 이 솔루션은 50 ~ 60 ℃로 약 식히십시오. </li><li> 50 ㎖ 형질 볼륨은 &quot;3.1 과도 형질 전환 설정&quot;에 따라 단계 3.1.3을 따르십시오. 적당한 볼륨이있는 예를 들어, 보충 자료 섹션을 참조하십시오. </li><li> 형질 감염을 위해, 전술 한 바와 같이 제조 된 표지 아미노산 잔기로 치환 된 신선한 배지를 사용하여 &quot;3. 일시적인 형질 설정&quot;의 단계를 따른다. </li><li> 형질 감염 24 시간 후에, 배양 희석 날에 데워진 매체 B의 5.0 ㎖, 데워진 보통 40 mL 및 아미노산 혼합물 갓 멸균 4 mL를 분취 인출한다 (단계 7.1.1에서와 같이 제조한다. 위) 1 추가VPA ㎖의 4.4 mM의 최종 농도로 희석 신선한 배지 50ml를 제조 VPA 용액 원액 데워진. 멸균 혈청 학적 피펫을 사용하여 형질 문화에이 매체를 추가합니다. </li><li> 물을 용액에 70 % 에탄올로 플라스크의 외부 살균 후 바이오 캐비닛에 형질 배양을 전송 준비된 희석 매체를 추가 배양 진탕 플라스크로 다시 옮긴다. 참고 : 중간는 화학적, 무 혈청 배지이다. 따라서, 다른 제형을 제조 할 수있다. 특정 아미노산이 부족 사용자 지정 중간 준비를 얻기 위해 공급 업체에 문의하십시오. 그것은 그러나, 우리는 완전한 강하 매체 보충 후 삼투압의 조정을 필요로하기 때문에 단지 몇 선택 잔기 부족 배지를 사용하는 것이, 모든 아미노산을 생략하는 것이 가능하다. 우리는 보충 할 수 있고, 삼투압 조절을 필요로하지 않는리스 - 티르 - 프 드롭 아웃 매체를 선택했다. 부rthermore, 중간 자유롭게 매체 성분의 농도를 공유하지 않습니다 공급 업체; 우리는 성공과리스, 티르와 Phe가 100 ㎎ / ℓ 각을 사용했다. 형질과 표현 매체의 볼륨은 추가 아미노산을 고려하여 조정해야합니다. 여기에 동위 원소 표지 위의 프로토콜에 대한 조정은 </li></ol></li><li> 소분자로 형질 보충 <ol><li> 멸균 물을 사용한 2- 데 옥시 -2- 플루오로 -1- 푸 코스의 100 mM의 스톡 용액을 제조하고, 0.22 μM 필터를 사용하여이 용액을 멸균. </li><li> 50ml의 배양, 형질 희석 매체에 푸 코스 아날로그 용액 (250 μM에서) 125 μL를 추가한다. 참고 : 우리는 전체 배양 볼륨 .IT의 0.25 %이 농도 계정에 치환기를 추가하는 당쇄 처리 소분자 억제제를 사용하는 식을 수정하는 것이 가능하기 때문에 더 볼륨 조절을 수행하기 위해 무시. 여기서 우리는 2- 데 옥시 등의 조건을 기술2- 플루오로 -1- 푸 코스, 푸코 실화 글리 칸의 억제제. 우리는 형질 희석 배지에서 250 μM의 농도에서 푸 코스 유사체를 첨가함으로써 푸코 실화에서&gt; 90 % 감소하는 결과. </li></ol></li></ol>

모든 저자는 이 원고에 대해 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜은 S 또는 HEK293F 세포의 일시적인 형질 감염을 통해 단백질 발현을 도시한다. 바브와 Moremen 실험실 설립 형질 최적 조건은 고효율 형질 감염을 달성 셀 밀도 및 시약 농도의 중요한 조합을 채용한다. 이 프로토콜을 구현하는 중요한 고려 사항은 다음과 같습니다 (일관된 문화는 시간을 두 배로 포함) 형질 전환 이전에 안정적인 문화를 유지하는 단계; 95 % 이상 세포 생존 능력 (1 × 106 세포 / ㎖ 24 시간 이전에 형질 전환에에 희석 세포에 의해 달성) 적극적으로 성장하는 세포의 형질; 형질 세포의 밀도가 90 % 중간 10 % 중간 B를 함유하는 배양에서 생존&gt; 95 % (형질 밀도) 6 10 × 2.5-3.0 사이 살아있는 세포 / ml이어야한다; 그리고, ml의 3 μg의 / 각각 31 9 μg의 / ㎖에서 PEI 추가하기 전에 DNA를 첨가하는 단계; 중간 접점에 1 : 24 시간 후 형질의 문화 1을 희석ining 4.4 m...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

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Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

구조와 기능에 대한 자세한 분석을 위해 적절하게 접혀 및 번역 후 변형 된 인간 단백질의 높은 수율을 생산하는 것은 중요한 과제로 남아. 발현 시스템의 많은 수의 네이티브와 같은 기능과 행동 재조합 단백질을 생산하는 사용할 수 있습니다. 효모, 식물, 곤충 및 포유 동물 시스템은도 1 ~ 4를 설명하지만 세균 발현 시스템, 주로 대장균 균주 인해 이들 발현 시스템의 단순성, 연구 분야에 가장 접근하고 일반적으로 사용되는 도구를 나타낸다. 그러나, 이들 시스템들의 대부분은 표적 단백질의 적절한 번역 후 변형 불가능하다. 바브와 Moremen 실험실의 근본적인 관심은 적절한 당질과 진핵 생물의 단백질을 생산하고있다. 대부분의 인간 단백질 (5) 적절한 기능에 적합한 글리코 실화를 필요로한다. 진핵글리코 실화가 광범위한 기계 모두 아스파라긴 (N)를 포함 변형의 다양한 범위를 제조 할 수있다 - 세린 / 트레오닌 (O)는 복합 글리 칸 6 -linked. 이것은 인간 단백질의&gt; 50 % 7 N 글리코 실화가있는 것으로 추정된다. 글리 칸은 몇 가지 이름 인자 IX 같은 치료 단일 클론 항체, 에리트로 포이 에틴, 혈액 응고 인자 등 많은 단백질의 필수 구성 요소입니다. 여러 방법이 적절 N-당화 단백질을 준비하기 위해 존재하고 8-10 순수 합성에 이르기까지 다양하지만, 가장 강력한를 할 놀랍게도, 인간의 발현 시스템은 지금까지 입증되지 설계 재조합 시스템 15-20에서 11-14 또는 복구를 화학 효소합니다 인간 단백질을 생성하기위한 방법. 많은 인간 치료 용 당 단백질은 포유 동물 세포를 사용하여 재조합 시스템에서 생산된다. 주 시스템 중국 햄스터 난소 (CHO), 마우스 골수종 (NS0), 아기 햄스터 Kidne이다Y (BHK), 인간 배아 신장 (HEK-293) 및 단백질 생산 4,21,22에 대한 접착 또는 현탁 배양에 사용되는 인간의 망막 세포 라인. 그러나, 포유 동물 단백질의 발현 시스템은 안정 세포주 고가 성장 배지 및 형질 보조 기판 (23)의 시저 발생을 요구했다. 포유 동물 세포의 형질 감염은 칼슘 포스페이트 (24, 25), 양이온 성 중합체 (DEAE 덱스 트란, 폴리 브렌, 폴리 리신, 폴리 에틸 이민 (PEI)) 또는 양으로 하전 된 양이온 성 리포좀을 포함하여 다수의 제 26 ~ 29의 도움으로 달성된다. PEI는 다양 이온, 대전, 또는 ​​선형 DNA와 안정한 복합체를 형성하고있다 endocytosed 분기 고분자 (25 kDa의) (26)이다. 엔도 좀의 산성화되면, PEI는 세포질 26,30에 엔도 좀과 DNA의 릴리스의 파열로 이어지는, 팽창 생각된다. suspensi에서 최근까지, 일시적 형질배양에서 세포 배양 물 (29)을 첨가하여 종래 DNA / PEI 복합체 형성에 의해 실시 하였다. 그러나 WURM 및 동료 31,32 동일계에서 DNA / PEI 복합체를 형성 HEK293 세포에서 재조합 단백질 생산을 위해 최적화 고효율 프로토콜을보고했다. 이 배지 내로 제제 복합체의 살균 및 버퍼 교환을 피했다. 상당한 수율 증가 (33)을 주도 식 향상 플라스미드를 포함하여 더 최적화. 여기에서 이러한 발전에 구축하고 광범위하게 적용하는 방법이다. 발현 조건도 글리 칸 N 조성에 영향을 위해 변경 될 수있다. 중간 단계에서 N 글리 칸 처리를 정지 유전자 결실 감염된 HEK293S 세포 라인은, (GlcNAc의 2 사람 5) 34 (2) N- 아세틸 글루코사민 잔기 플러스 다섯 만노스 잔기로 이루어진 균일 한 N 글리 칸으로 단백질의 발현에 이르게 (35). 이 세포N-acetylglucosaminyl 트랜스퍼 I (GntI) 하류 N-글리 칸 처리 (36, 37)에 필요한 유전자가 부족합니다. kifunensine, 시알 산 유사체와 푸 코스 아날로그 및 2- 데 옥시 -2- 플루오로 - 퓨 코스를 포함하여 당 전이 효소 억제제의 사용은 유사한 효과 및 N- 글리 칸 38-41 처리 한계를 가진다. 프로토콜은 여기에보고 한도 42,43에 도시 된 바와 같이 pGEn2 벡터를 사용하여, PEI를 이용한 일시적인 포유류 세포 선 (또는 HEK293F 감염된 HEK293S 세포)에 형질 감염하고, 적절히 글리코 실화 된 단백질의 높은 수율의 복구. 이 시스템은 강건하고, 재조합 단백질의 큰 역가의 제조 동위 원소 표지 및 당쇄 공학을 포함하는 다양한 요인을 수용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>생물 안전 캐비닛&nbsp;</td><td>주식회사 누에어레</td><td>CellGard ES NU-S475-400</td><td>Class II, Type A2 생물학적 안전 캐비닛</td></tr><tr><td>인큐베이션 쉐이커</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>Multitron Cell&nbsp;</td></tr><tr><td>미디엄 A: 프리스타일 익스프레션 미디엄&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>매체 B: ExCell 293 무혈청 매체&nbsp;</td><td>시그마</td><td>14571C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>125 통풍 캡이 있는 삼각 플라스크</td><td>Corning Incorporated/Life Sciences</td><td>431143</td><td></td></tr><tr><td>250 통풍 캡이 있는 삼각 플라스크</td><td>Corning Incorporated/Life Sciences</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle HEK 293F Cells</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 일회용 혈청학 피펫</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10B</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 일회용 혈청학 피펫</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 일회용 혈청학 피</td>펫 <td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>피펫터 (Pipet-Aid XP)</td><td>Drummond Scientific</td><td>161263</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution&nbsp;</td><td>써모 사이언티픽&nbsp;</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 계산&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>TC20 자동 세포 카운터&nbsp;</td><td>바이오 라드&nbsp;</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민(PEI)</td><td>폴리사이언스 Inc.</td><td>23966</td><td>25mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 및 150mM NaCl(pH 7.5)을 함유한 완충액에 1mg/ml 농도의 원액을 준비합니다. PEI를 완전히 용해시킵니다. 0.22 &mu를 통해 살균; M 주사기를 걸러서 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>4- (2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES)</td> <td>EMD Chemicals Inc.</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>25mm 주사기 필터, 0.22 & M</td><td>Fisher Scietific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Trisaminomethane (Tris base)</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue</td><td>Stratagene</td><td>222249</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Fluka Analytical&nbsp;</td><td>92144</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 염화물</td><td>BDH 화학물질</td><td>BDH8014</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 정화 키트</td><td>QIAGEN</td><td>12145</td><td></td></tr><tr><td>Valproic (VPA)</td><td>SIGMA</td><td>P4543</td><td>물 속에 220 mM&nbsp;의 재고 용액을 준비하고, 멸균 0.22 mm 필터를 통해 멸균한 후 -20°C에서 보관하십시오; C</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EW-17707-65</td><td></td></tr><tr><td>단백질 A-세파로스 컬럼</td><td>SIGMA</td><td>P9424</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>QIAGEN</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>10 kDa 분자량 컷오프 Amicon&reg; 초원심 필터&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데실 설페이트</td><td>ALDRICH</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>베타-메르캅토에탄올</td><td>ALDRICH</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>SIGMA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein All Blue Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0373</td><td></td></tr><tr><td>아세트산, 빙산&nbsp;</td><td>Fisher Scietific</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>coomassie 브릴리언트 블루&nbsp;</td><td>바이오 라드&nbsp;</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOFMS 보이저-DE PRO&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15N labeled L-Tyrosine</td><td>ALDRICH</td><td>332151</td><td></td></tr><tr><td>15N labeled L-Lysine</td><td>ALDRICH</td><td>592900</td><td></td></tr><tr><td>비표지 L-페닐알라닌</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>13C6-Glucose</td><td>ALDRICH</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>2- 데옥시-2-플루오로-L-푸코스&nbsp;</td><td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>sc-283123</td><td></td></tr></tbody></table>

서스펜션의 hek293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

복잡한 번역 후 수정 재조합 단백질을 생산하는 기술은 구조와 기능 연구를위한 주요 과제를 나타냅니다. 일시적으로 형질 감염된 포유 동물 세포주로부터 신속한 확립하고 높은 회복 자연스럽게 ER 및 골지체 매개 분비 경로를 통해 표출되는 단백질을 발현하는 효과적인 수단이 장벽을 해결하고있다. 여기서 인간 HEK293F 및 높은 단백질 수율을 위해 설계 포유 동물 발현 벡터로 형질 감염된 HEK293S 세포 라인을 사용하여 단백질 발현을위한 하나의 프로토콜이다. 이 시스템의 적용은 문화의 리터 당 회수 정제 단백질의 95-120 mg의 사이의 수익률로 표현 세 대표하는 당 단백질을 사용하여 설명된다. 이들 단백질은 인간과 쥐 FcγRIIIa α2-6 시알 산 전이 효소, ST6GalI 모두 N 말단 GFP 융합으로 표현뿐만 아니라 변형되지 않은 인간 면역 글로불린 G1 된 Fc이다. 이 강력한 시스템 요로 감염동위 원소 적으로 농축 된 단백질 및 질량 분광법 및 핵 자기 공명 분광법을 이용한 구조 연구 탄수화물의 발현에 적응할 혈청 배지를 활용합니다. 또한, N 글리 칸의 조성물은 수율을 감소시키지 않는 방식으로 특정 당쇄 변형을 방지하는 작은 분자를 첨가함으로써 조절 될 수있다.

높은 수준의 단백질 발현 및 순도 이 최적화 된 발현 시스템은 단백질의 글리코 실화를 고 수율로 생성. 전형적인 패턴의 IgG1-FC (도 1)의 발현에 나타낸다. 이 경우, 주 0 조 배지에서 가용성 발현 분획을 사용하여 분석된다 주 5. 단백질 발현까지 1 일 (희석)이어서 형질 일 이후 배양 일이다. 배양 된 분취 량의 희석 배양 후 3 시간이 인출되었을 단백질 발현의 매우 소량 일 1에서 관찰되었다. 이것은 배지에서 뚜렷한 녹색을 표시 GFP 표지 된 단백질과 시각화를 용이하다. 이러한 증가는 5 일 하루 4 주 (5) 사이에 관찰의 날 (5)에 2 일에서 GFP - FcγRIIIa 및 GFP - ST6GalI의 표현에 대한 표현에 유의 한 증가가 관찰되지 않았다, 세포가 있었다 &lt;50 %따라서 가능한 배양 단백질 분...

적절한 번역 후 변형을 통한 진핵 단백질의 실험실 규모 생산은 상당한 장벽을 나타냅니다. 다음은 포유류 발현 시스템을 사용하여 단백질 발현을 위한 신속한 확립 및 전환을 제공하는 강력한 프로토콜입니다. 이 시스템은 선택적 아미노산, 단백질의 선택적 표지 및 글라이칸 조성의 저분자 조절제를 지원합니다.

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

본 절차의 전반적인 목표는 재조합 단백질을 소포체(ER) 및 GOGI 매개 분비 경로로 타겟팅함으로써 적절한 포유류 당쇄화가 이루어진 포유류 당단백질을 발현시키는 것입니다. 이 방법은 특정 단백질의 역할, 항체 및 항체 단편의 구조적 패턴 및 면역 활성화 잠재력과 같은 면역학의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 세포를 사용하여 인간 단백질을 발현시킨다는 점이며, 이는 타겟 단백질이 적절하게 접히고 수정될 수 있도록 적합한 세포 환경을 제공합니다.세포 배양을 위한 인큐베이터 쉐이커는 배양 접종 최소 1시간 전에 135 RPM, 80% 습도, 8% 이산화탄소, 37 °C로 작동시켜야 합니다. 생물안전작업대의 UV 램프를 켜고, 밀봉된 배지 A와 배지 B 병을 37 °C 항온수조에서 예열하십시오. UV 램프를 끄고 70% 에탄올 수용액으로 생물안전작업대를 멸균하십시오.70% 에탄올 수용액을 분사하여 125 mL 삼각 플라스크, 통기성 캡, 피펫, 피펫팅 도구 및 미리 데워둔 배지 병을 멸균합니다. 이 항목들을 실험 과정 전반에 걸쳐 생물안전작업대 내에 배치하십시오. 모든 품목은 생물안전작업대로 반입하기 전에 반드시 이 방식으로 멸균해야 합니다.배지 A 26 mL와 배지 B 3 mL를 취해 125 mL 삼각 플라스크에 옮겨 30 mL 배양을 위한 신선한 배양 배지를 준비합니다. 부드럽게 흔들어 섞어줍니다. -80 °C에서 냉동 보관했던 HEK 2 93 F 세포 바이알을 37 °C 항온 수조에서 가온하여 세포를 부분적으로 해동합니다. 이 과정은 약 1분 정도 소요되며, 세포가 완전히 해동되지 않도록 주의해야 합니다.다음으로, 바이알 외부를 70% 에탄올 수용액으로 소독한 후 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내부로 옮깁니다. 1 mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 취해 29 mL의 신선한 배지가 들어 있는 125 mL 삼각플라스크에 옮깁니다. 배양 플라스크의 뚜껑을 닫고 인큐베이터 쉐이커에 넣어 24시간 동안 배양합니다.배양 접종 24시간 후, 세포 밀도를 확인하고 배양 플라스크를 70% ethanol 및 증류수 용액으로 소독한 후 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내부로 이동시킵니다. 1mL 피펫과 피펫터를 사용하여 배양액 100µL를 천천히 흡입하여 멸균된 0.5mL einor 튜브로 옮깁니다.배양 플라스크의 덮개를 닫고 가능한 한 빨리 배양 플라스크를 인큐베이터 셰이커로 되돌립니다. 7.5 µL의 트라이판 블루 용액과 7.5 µL의 세포를 혼합합니다. 격렬하게 혼합한 후, 혼합액 7.5 µL를 계수 슬라이드로 옮깁니다.자동 세포 계수기를 켜고 카운팅 슬라이드를 로딩 챔버에 넣습니다. 자동 판독기가 활성화되면 mL당 세포 수와 생존율(%) 단위로 세포가 자동으로 계수됩니다. 신선한 배양액으로 옮겨 mL당 300,000개의 생존 세포 밀도를 얻기 위해 필요한 공여 배양액의 부피를 결정합니다.이전에 설명한 대로 배지 A 23 milliliters와 배지 B 3 milliliters를 새 125 milliliter 배양 플라스크로 옮겨 신선한 배양 배지를 준비합니다. 그 후, 오염 위험을 줄이기 위해 배지 A와 배지 B의 스톡 병을 생물안전작업대에서 꺼냅니다. 인큐베이터에서 HEK 2 93 F 세포 배양 플라스크를 꺼냅니다.70% 에탄올 수용액으로 분무한 후 생물안전작업대 내에 배치합니다. 새로운 피펫을 사용하여, 배양물에서 정확한 양의 세포 분주액을 취해 신선한 배지가 담긴 플라스크로 옮깁니다. 두 배양물 모두 생물안전작업대에서 인큐베이터 셰이커로 옮깁니다.트랜스펙션을 수행하기 전, 세포를 mL당 약 200만에서 300만 개의 생존 세포 밀도로 배양합니다. 이전에 설명한 방법에 따라 세포 밀도를 확인하고 트랜스펙션에 사용할 세포 양을 결정합니다. 멸균된 세롤로지컬 피펫을 사용하십시오.적절한 부피의 세포 현탁액을 250 milliliter 원심분리 튜브에 옮깁니다. 100 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다. 멸균 후, 세포 펠릿이 포함된 튜브를 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮깁니다.멸균 피펫을 사용하여 소모된 배양 배지로 구성된 상청액을 따라냅니다. 10 milliliters의 신선한 배양 배지를 사용하여 피펫팅을 반복함으로써 펠릿 형태의 세포를 격렬하게 재현탁하고, 신선한 형질전환 배양이 들어 있는 준비된 플라스크로 옮깁니다. 통기성 세포 배양 플라스크의 캡을 돌려 닫고, 세포가 배양되는 동안 인큐베이터 셰이커에서 15분에서 1시간 동안 배양합니다.신선한 배양 배지를 사용하여 플라스마 DNA와 POLYETHERAMINE 또는 PEI 스톡을 최종 농도 0.5 µg/µL가 되도록 희석합니다. 세포가 분산된 배양 플라스크를 인큐베이터 쉐이커에서 꺼내 바이오안전 작업대로 옮깁니다. 마이크로 피펫을 사용하여 300 µL의 플라스마 DNA를 배양액에 첨가하고 부드럽게 수동으로 흔들어 섞어준 뒤, 900 µL의 PEI를 배양액에 첨가하고 다시 섞습니다. 그 후 3.8 mL의 신선한 배양 배지를 첨가합니다.플라스크를 인큐베이터 셰이커로 옮겨 24시간 동안 배양합니다. 형질전환 24시간 후, 세포 배양액을 희석해야 합니다. 희석 배지를 먼저 준비하려면, 멸균된 1mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 미리 데워둔 220mM valproic acid(VPA) 1mL를 취해 멸균된 50mL 튜브로 옮깁니다.다음으로, 멸균된 혈청분주기(serological pipette)를 사용하여 미리 데워둔 배지 B 5 mL와 미리 데워둔 배지 A 44 mL를 VPA 용액에 첨가합니다. 이렇게 하면 VPA의 최종 농도가 4.4 mM인 신선한 배양액 50 mL가 만들어집니다. 인큐베이터에서 형질전환된 배양물을 꺼냅니다.플라스크 외부를 멸균한 후 생물안전작업대(biosafety cabinet) 안에 놓습니다. 준비된 희석 배지를 배양액에 첨가합니다. 형질전환 후 4~5일 동안 플라스크를 다시 진탕 배양기에 넣어 배양합니다.앞서 설명한 절차에 따라 매일 세포 생존력을 모니터링하십시오. 단백질 발현 분석을 위해 transfection 후 5~6일이 지났거나 세포 생존력이 50% 미만으로 떨어진 경우, 매일 aliquot를 보관해야 합니다. 세포와 배지를 1000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수확하십시오. 분비 단백질이 포함된 상층액을 수집하고, HEK 세포 펠릿에 10% 표백제 용액 5 mL를 가한 후 생물학적 위험물로 폐기하십시오.그 후, 수집된 상층액으로부터 단백질을 정제합니다. 이 발현 시스템은 HK 2 93 F 세포의 일시적 형질전환 후 IgG 1 fc의 전형적인 발현 패턴에서 알 수 있듯이, 높은 수율의 당화 단백질을 생성했습니다. IgG 1 FC용 단백질 컬럼 또는 FC gamma receptor III A가 포함된 히스티딘 태그 GFP용 니켈 컬럼을 이용한 친화성 정제를 통해 고순도의 단백질을 얻었습니다.이 시스템은 수소 핵과 직접 결합된 아미드 질소의 공명 주파수를 상관시키는 이 2차원 NMR 스펙트럼에서 동위원소 농축 IgG one FC를 효율적으로 발현했습니다. 15개 원자의 신호가 잘 분산되어 관찰되었습니다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 전리 질량 분석법(MALDI-MS) 분석 결과에서 알 수 있듯이, 서로 다른 배양 조건 하의 HEK 2 93 F 및 HEK 2 93 s 세포를 통해 서로 다른 당쇄 형태가 생성되었습니다.HEK 293S 세포에서 발현된 IgG1 FC는 5개의 mannose와 2개의 N-acetylglucosamine 잔기로 구성되며 fucose를 포함하지 않는 형태의 glycans를 보유하고 있었습니다. HEK 293F 발현 물질에서 유래한 glycans는 core fucose를 포함하는 complex type biantennary 형태로, 대부분 terminal N-acetylglucosamine을 가지거나 소량의 mono- 또는 di-fucosylated 형태로 나타났습니다. HEK 293F 세포를 이용한 발현 과정에 glycan 저해제를 첨가한 결과, fucose 통합이 90% 이상 감소하는 것으로 나타났습니다. 숙련된 경우, 일시적 형질전환(transient transfection) 수립은 1일 차에 1.5시간, 2일 차에 15분 내로 완료할 수 있습니다. 4~6일의 발현 기간 후, 단백질이 포함된 용액을 15분 만에 수확할 수 있습니다.마지막으로, 단백질 정제에는 약 1.5시간이 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때, transfection 전까지 안정적인 배양 상태를 유지하고, 활발하게 성장하는 세포에 transfection을 진행하며, PEI를 첨가하기 전에 DNA를 먼저 첨가해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에, 발현된 당단백질의 구조와 기능을 조사하기 위해 다양한 생물리학적 기법을 이용한 단백질 기능 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 IgG와 당화의 구조-활성 관계를 in vitro 및 in vivo에서 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 K 2 93 F 세포와 PZ N two 벡터의 조합을 사용하여 당단백질을 준비하고 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

이후 인간 게놈 시대에 원시 conformations에서 재조합 단백질의 가용성은 구조적 기능적 및 치료 연구와 개발에 매우​​ 중요합니다. 여기서는 테스트 및 재조합 단백질의 다양한 생산하는 데 사용할 수있는 인간의 배아 신장 293T 세포에 대규모 단백질 발현 시스템을 설명합니다.

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형질주입된 포유류 세포의 배치 과성장 배양에서 항체 생산

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소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

여기에서는 순수하고 완전히 글리코실화되었으며 효소 활성 프로테아제를 높은 수율로 생산하는 HEK293T 세포를 사용하는 비용 효율적인 그랜자임 발현 시스템을 설명합니다.

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이것은 분비된 당화(glycosylated mammalian protein)의 생산 및 X선 결정학 및 기타 생물물리학 연구를 위한 균질한 단백질의 충분한 수율을 가진 후속 1단계 정제를 위한 빠르고 비용 효율적인 프로토콜입니다.

효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

이 프로토콜은 포유 동물 발현 시스템에서의 치료 용 항체의 생산을 설명한다. 설명하는 방법은 친 화성 크로마토 그래피를 사용하여 대규모 문화와 정화의 설정 벡터 DNA, 안정적인 형질 전환 및 인간 배아 신장 293 세포주의 무 혈청 적응의 준비를 포함한다.

실험실 규모의 생산과 치료 용 항체의 정제

이종 발현 시스템을 통해 공부하는 이온 채널은 생물 의학 연구의 핵심 기술이되고있다. 이 논문에서는, 유도 성 프로모터의 조절하에 일시적인 형질 감염을 수행함으로써 엄격하게 제어 이온 채널 표현을 달성하는 시간 효율적인 방법을 제안한다.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Nonlytic 곤충 세포 발현 시스템은 생산 세포 트래 피킹 / 제이션, 및 재조합 단백질의 기능 분석을 위해 충분히 활용된다. 여기서 우리는 상업적으로 이용 가능한 나비목 세포주에서 발현 벡터 및 후속 과도 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명합니다. 세포 내 형광 마커 단백질과 Bemisia의 담배가 루이의 아쿠아 포린의 공동 제이션 또한 제공된다.

배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

자사는 HEK293 세포에서 구조체 설계, 일시적 형질감염, 전장 인간 헌팅틴 단백질 변이체의 발현 및 정제를 포괄하는 확장 가능한 프로토콜을 제공합니다.

일시적 발현 시스템을 사용한 포유류 세포에서 전장 인간 헌팅틴 변이체의 효율적이고 확장 가능한 생산

여기에서 현탁액 HEK293 셀 기반 AAV 생산 프로토콜이 제시되어 상용 공급업체에서 연구 목적으로 사용할 수 있는 구성 요소를 사용하여 벡터 생산에 필요한 시간과 노동력을 줄일 수 있습니다.

HEK293 부유 세포를 사용한 고수율 Adeno 관련 벡터 배치 생산

배우세요 HEK293 세포를 이용한 과도 형질전환으로 재조합 인간 당단백질을 고수율로 발현하는 방법입니다. 이 기술은 면역학 연구에서 항체 구조와 면역 활성화 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

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