December 7th, 2014
우리는 맞춤형 갈바노타시스 챔버에서 이주하는 불멸의 전립선 세포에 생리학적 전기장을 적용하는 방법을 제시합니다. 이 방법을 사용하여 비종양형성 전립선 세포의 2개 계통이 현장에서 다른 정도의 이동 방향을 나타낸다는 것을 입증합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 적용된 전기장에서 세포의 방향성 이동을 평가하기 위한 분석인 Galvan Axxis를 수행하는 것입니다. 이것은 먼저 Galvan axxis 챔버를 조립한 다음 관심 세포와 함께 시딩하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 챔버를 밀봉하고 저속 이미징을 위해 전기장을 적용합니다.
마지막 단계에서는 개별 세포의 이동 속도와 전기장에 대한 상대적인 각도를 추적합니다. 궁극적으로 공동 서명합니다. 세포가 전기장에 어떻게 반응하는지, 그리고 음극으로 방향으로 이동하는지 여부를 보여주는 데 사용할 수 있습니다.
이 기술의 주요 장점은 2차 분석을 위해 텍사스를 투여한 후 세포를 쉽게 검색할 수 있다는 점과 고배율 및 형광 표지된 세포로 이동을 쉽게 촬영할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시각화는 챔버 조립 단계가 바닥 챔버를 조립하는 시연 없이는 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 두 개의 프로판올로 플라스틱 갈반 axxis 챔버를 닦는 것으로 시작합니다.
그런 다음 주사기를 사용하여 챔버 바닥의 원형 구멍 주위에 해양 등급 실리콘 실러를 도포합니다. 실런트 위에 큰 커버 유리를 놓고 면봉 끝으로 제자리에 눌러 넣고 면봉으로 여분의 접착제를 닦아냅니다. 그런 다음 다이아몬드 포인트 마커를 사용하여 작은 커버 유리를 잘라 6 x 25mm 공간을 만들고 챔버를 뒤집습니다.
다음으로, 주사기를 사용하여 두 줄의 실리콘을 도포하여 바닥 유리의 두 원형 개구부 사이에 세포를 부착할 수 있는 10 x 25mm 채널 표면을 만듭니다. 그런 다음 원형 개구부 사이에 두 개의 유리 공간을 붙이고 새 면 어플리케이터로 공간을 밀어 넣고 방금 시연한 것처럼 여분의 접착제를 닦아냅니다. 실리콘 접착제가 경화될 때까지 24시간 동안 챔버를 사용해 보십시오.
다음날, 챔버를 증류수에 밤새 담가 챔버에 세포를 파종하기 전에 접착제에서 아세트산 잔류 물을 제거합니다. 방금 시연 된 것처럼 두 개의 프로판올로 챔버를 말리고 닦습니다. 멸균 PB S3로 세척한 다음 챔버의 두 원형 구멍 사이의 액체 흐름을 확인하십시오.
챔버가 양호한 작동 상태인지 확인한 후 멸균 배양 접시에 넣고 챔버를 섭씨 37도에서 15분 동안 놓습니다. 챔버가 평형을 이루는 동안 섭씨 37도에서 5ml의 트립신 EDTA로 배양 접시에서 전립선 세포를 분리합니다. 5분 후 5mL의 10%FBS로 반응을 중화합니다.
PBS에서 분리된 세포를 15ml 튜브로 옮긴 다음 5분 동안 원심분리합니다. 200 배에서 G, 배지를 흡입 한 다음 펠릿을 1 밀리리터의 배지에 재현탁시킵니다. 그런 다음 세포를 계수 한 후 배양 배지와 종자를 사용하여 세포 농도를 8 x 10으로 밀리리터당 4 개의 세포로 조정하십시오.
350 마이크로 리터의 세포 현탁액을 각 챔버에 놓습니다. 챔버의 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 젖은 김 물티슈로 배양 접시에 밤새 배양합니다. 다음날, 먼저 각 갈반 AXS 챔버에 대해 섭씨 37도에서 중간까지 10밀리리터의 배양물을 예열하여 상부 챔버 조립을 시작합니다.
매체가 가열되는 동안 인큐베이터에서 Galvan axxis 챔버를 섭씨 37도 온난판으로 옮기고 챔버를 배양 배지로 헹굽니다. 부착되지 않은 셀을 제거하려면 챔버에 400마이크로리터의 매체를 그대로 둔 다음 주사기를 사용하여 두 유리 공간 위에 고진공 그리스를 도포합니다. 커버 유리와 면 어플리케이터로 챔버를 밀봉한 다음 유리 표면을 건조시킵니다.
다음으로, 주사기로 고진공 그리스를 도포하여 커버 유리와 챔버 사이의 틈을 밀봉합니다. 그런 다음 배양 배지를 내부 저장소에 추가합니다. 기포를 제거하고 저장소 사이의 액체 흐름을 확인하십시오.
한천 다리가 한 쌍의 2인치 PVC 튜브를 자르도록 하려면 뒤집은 다음 조각을 100ml 비커에 넣습니다. 다음으로, 200 밀리그램의 bact toe 한천을 50 밀리리터 플라스크에 10 밀리리터의 배양 배지와 함께 추가하여 2 % 한천 젤을 만듭니다. 30초 동안 전자레인지에 돌린 후 전사 피펫을 사용하여 한천 젤을 플라스틱 튜브에 넣고 한천 브리지를 실온에서 10분 동안 그대로 두어 한천을 응고시킵니다.
그런 다음 gal 챔버의 외부 저장소에 2ml의 배양 배지를 추가하고 한천 브리지를 내부 및 외부 배지 저장소에 삽입하여 전류를 전도하여 이동의 타임 랩스 이미징을 수행합니다. 먼저 현미경 스테이지에서 Galvan 챔버를 섭씨 37도의 환경 챔버로 옮기고 테이프로 챔버를 고정하고 10 x 대물렌즈 아래의 세포에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 음극이 오른쪽에 오도록 하여 Galvan Axxis 전극을 외부 저장소에 삽입하고 와이어와 전극을 테이프로 고정합니다.
그런 다음 전원 상자를 켜서 챔버에 전기장을 적용하고 전압 미터를 사용하여 챔버 전체의 출력 전압을 측정하여 2.5mm 길이의 챔버에 대해 25볼트에 도달합니다. 이제 10개의 타임랩스 동영상을 생성하기 위해 챔버 전체에서 10개의 지점을 선택하고 획득 조건을 2시간 동안 10분 간격으로 설정합니다. 그런 다음 촬영을 시작하고 실험 중에 자기장 강도를 유지하기 위해 필요에 따라 출력 전류를 조정합니다.
실험이 끝나면 스테이지에서 챔버를 제거하고 세포를 95% 알코올로 고정합니다. 그런 다음 챔버를 부수고 엽니다. 커버 슬립은 나중을 위해 보관할 수 있습니다.
염색 및 이미징. 향후 몇 년 동안 챔버를 청소하십시오. Galvan Axxis를 정량화하려면 타임랩스 동영상을 회전하여 음극이 이미지 상단으로 향
하도록 합니다.세포를 추적하는 소프트웨어에 영화를 수출하고 수동으로 각 영화에서 각 시점에 10개에서 20개의 세포의 XY 위치를 추적하고, 이동 거리 및 북쪽 남쪽 방향에 상대적인 각도는, 전기장의 동일한 방향이 세포 추적 소프트웨어에서 계산됩니다. 마지막으로, 측정값을 저장하고 데이터를 데이터베이스 응용 프로그램으로 가져와서 결합된 결과를 계산합니다. 이 대표적인 Galvan Axxis 실험에서 전립선 세포선은 2시간 동안 비슷한 속도로 이동하는 것으로 확인되었습니다.
그러나 전기장에 대한 방향성은 PRNS 1 1 라인의 경우 0.7 플러스 마이너스 0.3, PNT 2 라인의 경우 0.2 플러스 마이너스 0.8이었으며, 이는 이들 두 세포주의 갈반 축에서 상당한 차이를 나타내며, 이는 고반 텍사스 방법의 개발 후 전기장에 대한 세포 신호 전달 메커니즘의 직접 차동 이동 반응을 시사합니다. 이 기술은 연구자들이 전기장에서 방향성 세포 이동 메커니즘을 탐구하는 데 도움이 됩니다.
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이 연구는 맞춤형 갈바노탁시스 챔버를 사용하여 이동하는 불멸화된 전립선 세포에 생리학적 전기장을 적용하는 방법을 제시합니다. 결과는 두 종류의 비종양성 전립선 세포가 전기장에 반응하여 다른 정도의 이동 방향성을 나타냄을 보여줍니다.
This method enables mechanistic de-risking of prostate cell migration phenotypes by quantifying directional responses to physiological electric fields, supporting target validation in early discovery. The custom galvanotaxis chamber provides a reproducible, disease-relevant system for assessing intrinsic migratory behavior, which can inform lead identification strategies by highlighting functional differences between cell models. Such electrophysiological profiling adds predictive confidence to preclinical models by linking cellular signaling mechanisms to functional outputs under controlled stimuli.
The galvanotaxis assay integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, providing electrophysiological readouts that complement biochemical and imaging-based screening cascades.