Name: 전립선 세포의 방향 마이그레이션 연구에 맞춤 설계 Galvanotaxis 챔버를 활용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 배우세요 맞춤 설계 갈바노택시스 챔버를 활용하여 전기장에서 전립선 세포의 방향 마이그레이션을 평가하는 방법입니다. 비종양성 세포주의 차이를 분석하여 암 연구에 기여합니다.

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전립선 세포주 친절 암 센터, UC 데이비스 박사 링 - 유 왕 박사 싱 - 지엔 쿵에 의해 제공됩니다. 이 프로젝트는 NIH의 galvanotaxis 부여 4R33AI080604에 의해 지원됩니다.

1. 배양 전립선 세포 <ol><li> 문화 PRNS-1-1 5 % CO 2, 37 ℃에서 10 % FBS와 항생제 - 안티 곰팡이로 보충 된 RPMI 1640 배지에서 100mm 배양 접시에 PNT2 및 전립선 세포. 세포 galvanotaxis 실험에 80 % 포화 상태에 도달 할 때까지 매일 배양 배지를 새로. </li></ol> 2. 조립 Galvanotaxis 챔버 <ol><li> 하단 챔버 조립 <ol><li> 2- 프로판올와 플라스틱 galvanotaxis 챔버를 닦습니다. 주사기와 챔버의 하부 측에 원형의 개구 주변 해양 급 실리콘 실러를 적용하고 큰 커브 글라스 (도 1)에 부착. 커버 글라스를 아래로 밀어 면봉으로 초과 접착제를 닦아면 주걱의 뒷면을 사용합니다. 원형 개구부는 중간 전류는 두 매질 내부 저장소 사이에 위치 된 세포 흐르게. </li><li> 6mm × 2를 만들기 위해 작은 커버 글라스를 잘라다이아몬드 포인트 마커 5mm 스페이서. </li><li> 챔버를 뒤집습니다. 주사기 및 / 또는 하단 유리에 2 원형 구멍 사이의 세포 부착을위한 10mm X 25mm 채널 표면을 만들 수있는 금속 주걱 실리콘 접착제의 2 줄무늬를 적용합니다. 이 원형 구멍 사이에 유리 스페이서 2 개를 붙인다. 스페이서를 아래로 밀어 면봉 및 / 또는 이쑤시개와 초과 접착제를 닦아면 어플리케이터의 뒷면을 사용합니다. </li><li> 실리콘 접착제가 경화 될 때까지 24 시간 동안 챔버를 건조. 접착제에서 아세트산 잔기를 제거 증류수에 밤새 챔버를 담근다. 즉시 사용 가능한 챔버를 건조, 또는 깨끗한 용기에 나중에 사용하기 위해 챔버를 저장합니다. <img alt="유리 스페이서, 하단 덮개 유리로 조립을 자세히 설명하는 Galvanotaxis 챔버 설정 다이어그램." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : 하단 galvanotaxis 챔버의 조립. A)가 큰 커브 글라스) T 세정 챔버. B의 하단에 부착된다유리 스페이서의 조각이 원형 구멍 사이에 접착되어 하시다 세포 부착을위한 10mm X 25mm 채널을 만들 수 있습니다. </li></ol></li><li> galvanotaxis 챔버에 세포를 심는 <ol><li> 실험에 필요한 galvanotaxis 챔버의 필요 수를 준비합니다. 각 세포주 또는 치료는 하나의 galvanotaxis 챔버가 필요합니다. 2- 프로판올과 galvanotaxis 챔버를 닦습니다. 멸균 PBS의 3 배에 실을 세척하고 챔버에서 2 원형 구멍 사이의 액체 흐름을 확인합니다. </li><li> 무균 세포 배양 접시에있는 챔버를 동봉하고 15 분 동안 37 ℃에서 평형 수 있습니다. 5 분 동안 37 ° C에서 5 ml의 0.25 % 트립신 EDTA를 사용하여 배양 접시에서 전립선 세포를 분리. PBS에 5 ㎖의 10 % FBS와 트립신 EDTA를 중화. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 세포를 옮기고 200 XG, 37 ° C에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포. 상등액을 대기음 배지 1 ㎖에 세포를 다시 일시. </li><li> 20 μ를 타고셀 L의 용액은 카운팅 챔버에로드하고 세포 수를 산출한다. 문화 매체와 8 × 104 세포 / ㎖로 세포 농도를 조정합니다. </li><li> 37 ° C 배양기에서 galvanotaxis 챔버를 가져 가라. 각 챔버에 세포 현탁액 350 μl를 시드. </li><li> 킴 와이프 또는 습윤 5 % CO 2, 37 ℃에서 습도 인큐베이터 챔버에서 배양 접시에서 밤새 챔버에서 세포를 배양한다. </li></ol></li></ol><img alt="37°C, 5% CO2에서 실험 분석을 위한 인큐베이터 설정이 있는 전립선 세포 이동 다이어그램." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 챔버에 세포를 시드 하부 측실을 건조 세정 A) 전립선 세포를 트립신 카운트 챔버로 이송하고, 밤새 인큐베이션 B) 상단 커버 글라스는 촬영 전에 챔버를 밀봉하도록 부착된다... <ol start="3"><li>상단 챔버 ssembling <ol><li> 촬영하기 전에 상단 챔버를 조립합니다. 현미경은 한 번에 하나의 챔버 galvanotaxis 촬상 수용 할 수있다. 각 galvanotaxis 챔버, 37 ° C에서 배양 배지 10 ㎖ 워밍업. 37 ° C 온난화 판에 인큐베이터에서 galvanotaxis 챔버를 전송합니다. </li><li> 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 문화 매체와 세포를 씻어. 챔버 내에서 매체의 400 μl를 남겨주세요. 모두 유리 스페이서의 상단에 높은 진공 그리스를 적용 할 주사기를 사용합니다. </li><li> 챔버를 밀봉하는 작은 커버 글라스를 추가합니다. 부드럽게면 주걱의 뒷면에 커버 글라스를 누르십시오. 면봉과 초과 매체를 닦아냅니다. </li><li> 유리 표면을 건조하고, 커버 글라스와 챔버 사이의 간격을 밀봉 높은 진공 그리스를 적용합니다. 그리스를 확산 금속 주걱을 사용합니다. 내부 저수지에 배지 4 ML을 추가하고 저수지 사이의 액체 흐름을 확인합니다. </li></ol></li><li> 한천 만들기다리 <ol><li> 2 인치 길이의 PVC 튜브의 한 쌍을 잘라 (16분의 503 (내경) x 5/16 (외경) x 1/16 월), 플립과 100 비이커에 삽입합니다. </li><li> 200mg의 박토 - 한천을 측정하고 2 % 한천 겔을 10 ml의 배지와 함께 50 ml의 플라스크에 추가한다. 30 초 동안 전자 레인지. 전송 피펫과 플라스틱 튜브에 한천 겔을로드합니다. 고형화 한천을 10 분 동안 실온에서 한천 교량 남기기. </li><li> galvanotaxis 챔버의 외부 저수지에 2 ml의 배지를 추가합니다. 전류를 전도하기 위해 내부 및 외부 매체 저수지에 한천 다리를 삽입합니다. </li></ol></li></ol><img alt="세포 이동을 위한 한천 브리지와 DC 전원이 있는 챔버 설정을 보여주는 Galvanotaxis 실험 다이어그램." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig3highres.jpg" width="350" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="그림 3"> 그림 3 :. 챔버에 세포를 얇은 껍질이 그림은 galvanotaxis 챔버의 최종 조립을 보여합니다. 챔버는 완전히 고 진공 그리스로 밀봉된다. 중간 t을 추가오 저수지를 작성하고 두 한천 교량 챔버에 삽입됩니다. 이어서 galvanotaxis 챔버는 현미경 스테이지에 전달되고, 전극은 전기장을 적용하도록 부착된다. 조립 galvanotaxis 챔버의 측면도는 전류가 한천 교량과 커버 유리 사이의 공간을 통해 흐르고 셀 위에 함을 입증하기에 도시된다. 3. 시간 경과 영상 <ol><li> 이전 영상에 공기 순환 2 시간에서 5 % CO 2와 37 ° C에 환경 챔버에 전환합니다. </li><li> 현미경에 전환하고 이미지 획득 소프트웨어를 시작합니다. 현미경 스테이지를 보정하고, 10 배 목표를 선택합니다. </li><li> 현미경 무대에 galvanotaxis 챔버를 전송 테이프로 실을 확보하고 세포에 초점을 맞 춥니 다. 오른쪽에 음극과 외부 저수지에 galvanotaxis 전극을 삽입합니다. 와이어와 테이프로 전극을 고정합니다. </li><li> 전력 보에 스위치X는 챔버에 전계를 적용한다. 25mm 긴 챔버 (100 MV / mm) 2.5 볼트에 도달 할 수 챔버에서 전압계와 출력 전압을 측정합니다. 출력 전류를 조절하여 실험 기간 동안 전계 강도를 유지한다. </li><li> 열 시간 경과 영화를 생성하는 소프트웨어의 필름과 챔버에서 10 점을 선택합니다. 2 시간 동안 10 분 간격으로 인수 조건을 설정합니다. </li><li> 촬영을 시작하고, 필요에 따라 출력 전류를 조정한다. </li><li> 실험의 마지막 단계에서 챔버를 제거하고 95 % 알코올로 세포를 고정한다. 청소 면도날 열린 챔버 휴식하고 다시 사용하기. </li></ol> Galvanotaxis 4. 정량화 <ol><li> 시간 경과 영화와 다시의 방향 이미지의 상단에 음극을 돌립니다. 셀 추적 소프트웨어에 영화를 내 보냅니다. </li><li> 수동으로 각 동영상 (도 4 A, B)에서 각각의 시간 지점에서 10-20 세포 (x, y)의 위치를 추적.남북 방향에 대하여 이주 거리 및 각도는, 전기장의 방향은 동일한, 셀 추적 소프트웨어 (도 4c)에서 산출한다. 주 : 평균 이동 속도가 총 이동 거리와 총 촬영 시간으로 변환됩니다. 방향성은 코사인 값 각도에서 변환된다. 세포가 임의의 방향성으로 마이그레이션하는 경우, 순 코사인의 평균은 제로에 가까운 것입니다. 세포가 음극쪽으로 이동하는 경우 직접, 코사인 값은 1이 될 것이다. 세포를 직접 애노드 측으로 이동하는 경우, 코사인 값은 -1이 될 것이다. </li></ol><img alt="세포 이동 비교, 무작위 이동 대 galvanotaxis, 방향에 대한 코사인 방정식이 있는 다이어그램." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig4highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="그림 4"> 도 4 : 셀 추적 방향성을 측정하기 위해 세포 추적 이미지 라인) 오버레이.. 셀 (X, Y) 위치는 manua 아르에서야 시간 경과 영화에서 추적. . 세포는 임의로 이동하면 평균 코사인 제로에 가까운 B) 그러나, 세포가 음극 또는 양극을 향해 이동하는 경우, 평균 코사인 값 + (음극) 또는 부근 -. (양극) 1.0 C ) 방향성은 마이그레이션 각도 (θ)에서 변환 된 코사인 값에 의해 제공됩니다. 코사인 (θ)은 거리 B (전계의 방향에 투영 거리)까지의 거리 (이동 거리)의 비율과 같다. <ol start="3"><li> 측정 값을 저장합니다. 조합 된 결과를 계산하는 데이터베이스 어플리케이션에 데이터를 가져. </li><li> 막대 그래프 (그림 5) 음모 스프레드 시트에 평균 이동 속도와 평균 코사인 값의 결합 된 데이터를 보냅니다. </li></ol>

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<li>Pullar, C. E., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+mediates+keratinocyte+directional+migration+in+an+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP mediates keratinocyte directional migration in an electric field.</a> J Cell Sci. 118 (9), 2023-2034 (2005).</li>
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<li>Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electric+field+near+human+skin+wounds+declines+with+age+and+provides+a+noninvasive+indicator+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Rep.+and+Reg%22%5BJournal%5D)">The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing.</a> Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).</li>
</ol>

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셀의 galvanotaxis 응답의 분석은 많은 셀룰러 이동성 또는 성장을위한 중요한 기능 표시기 (27), (28)를 처리했다. 여기서 우리는 두 전립선 세포주 영화를 유리 표면에 특별 주문품 실을 사용한다. 이들 세포주 galvanotaxis 상이한 정도를 보여, 우리는 세포 내 위치 파악 또는 galvanotaxis - 매개 단백질의 활성화는 galvanotaxis 응답의 관측 차이의 결과로, 불멸 세포주를 생성하는 과정을 방해 할 수 있음을 추측. 배양 접시 (27), (28)에서 만들어진 다른 galvanotaxis 챔버 설계에 비해 현재 디자인에 여러 가지 이점이있다. 먼저, 유리 표면은 이미징에 적합하며 세포 면역 염색 용 커버 글라스 galvanotaxis 후 검색 될 수있다. 본 연구에서 우리는 셀들의 그룹을 모니터링 10X 대물 렌즈의 사용을 저배율. 그러나, 살전와E 향상된 유리 광학, 그것을 형광 단백질 표지 세포를...

내인성 전기장 피부 1, 32, 33, 2와 같은 다양한 뇌 조직에서 검출된다. 생리 전계 신경 공정 5, 6의 생장을 유도하고 상피 각막 상처 봉합 1,7 촉진 지향, 배 발달 3,4- 포함한 특정 생물학적 기능을 제공. 시험관 내 배양 된 세포에 직류 전계인가 모방 생리 전기장을하고 방향 세포의 이동, 또는 galvanotaxis를 유도한다. Galvanotaxis는 neuroblasts 2, 신경 전구 세포 (14), 섬유 아세포 8, 물고기 각질 9, 인간 상피와 각막 각질 10-12 연구 13 림프구되었습니다. (-) 극인가 필드에 노출되는 경우, 세포 연구의 대부분은 방향성 cathodal 향해 이동한다. 그러나, 고도 등 여러 전이성 암세포인간의 유방암 세포와 인간 전립선 암 세포주 PC-3M이 anodal (+) 극 (15, 16)로 이동한다. 여러 메커니즘 galvanotaxis을 중재 또는 활성화를 포함하는 전기장을 감지하는 세포의 능력을 설명하기 위해 제안 EGF 12 수용체, 상피 나트륨 채널 (17)는 PI3K 및 PTEN (18), 및 칼슘의 방출이기구는 아직 완전히 이해되지. 15 (19) 이온 및 그것은 여러 신호 전달 경로가 galvanotaxis에 참여하는 것이 가능하다. 여기 보여 2 차원 galvanotaxis 방법은 점착성, 운동성 세포의 방향 이동을 특성화하기 위해, 하나 (18), (20).이 기법에서 수정 된 융합 세포의 시트를 개개의 세포 이동을 10, 12, 17 또는 이동을 모니터링하는 데 유용 펭과 제피 (21), 그리고 니시무라 등. 주문 제작, 명확한 PVC 챔버 10, 이동식 coversl와IPS와 같은 면역 형광 이미징 차 분석을위한 galvanotaxis, 후 쉽게 셀 검색을 허용. galvanotaxis 챔버의 유리 표면은 고배율과 형광 표지 된 세포와 촬영을 허용하는 광학 호환이다. 그것은 또한 표면 코팅 또는 전하 변경과 같은, 유리의 표면 개질과 실험 설계를 허용한다. 제 1 커버 글라스로 이루어지는 스페이서 위에 셀 전류 흐름을 최소화하기 위해 챔버에 사용된다; 따라서, 전류 흐름의 제곱에 비례 주울 가열, 실험 기간 동안 세포를 과열 않을 것이다. 한천 연결 교량 셀 전극의 직접 접촉을 방지하고 galvanotaxis 동안 매체의 pH 나 이온 농도의 변화를 방지한다. 두 개의 비 - 인간 종 양성 전립선 세포주는이 연구에서 galvanotaxis 그들의 응답을 조사 하였다. PRNS-1-1 22 PNT2 (23)는 모두 SV4 있습니다성장 인자 의존적 세포주는 전립선 특이 항원 (PSA)의 낮은 또는 전혀 식 5, 8, 18, 19 아세포 상피 마커를 발현하는, 0 - 불멸화. 두 세포주 정상 상피 세포의 다각형 형태를 유지하지만, 염색체 이상은 핵형 (22, 24)에서 관찰되었다. PRNS-1-1과 PNT2 대부분의 실험에서 유사한 행동을 공유하지만, 그들이 선포 구조의 형성과의 차이를 표시 할 galvanotaxis. 3-D 행렬에, 마트 리겔은 PRNS-1-1 세포는 정상적인 전립선 조직 (25)을 닮은 루멘 선포의 중공 구조를 형성한다. 그러나 PNT2 세포 내강 상피 (26) 또는 편광없이 고체 스페 로이드를 형성한다. PRNS-1-1 세포는 또한 현재 연구 PNT2보다 높은 galvanotactic 응답을 보여준다. 선포의 구조의 형성 및 galvanotaxis 간의 상관 관계는 PRNS-1-1 galvanotactic 신호 (PR)를 조직에서 역할을 할 수 있음을 시사ostate 선 조직 내생 전기장에 대응 움직임, 그리고이 두 세포주를 구별하기 위해 추가 특성을 제공한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cells</td></tr><tr><td>pRNS-1-1 전립선 세포</td><td></td><td></td><td>Lee, et al. (1994)</td></tr><tr><td>PNT2 전립선 세포</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95012613-1VL</td><td>Berthon, et al. (1995)</td></tr><tr><td colspan="4">Medium and solutions</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>37까지 워밍업; C 사용 전</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>PBS에서 10%, 최대 37°C까지 예열; C 사용 전</td></tr><tr><td>항생제-항진균제(100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240</td>은 1,000ml의 H<><><><<2/sub>4에 <td>5ml를 500ml 매체</td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>VWR</td><td>BDH1133-5GL</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>-</td><td></td><td>-137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4/sub에 추가합니다> O, pH 7.4 및 오토클레이브, 최대 37°C까지 예열; 사용 전</td></tr><tr><td>C 0.25% 트립신-EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td>은 <td>37도까지 워밍업합니다. C는 사용의 앞에, 37 &deg에 3-5 분 동안 세포를 대우합니다; C</td></tr><tr><td colspan = "4 ">< 강력 > Galvanotaxis 장치 < / 강력 ></td></tr><tr><td>Galvanotaxis 챔버</td><td>Precision Plastics Inc, CA</td><td></td><td>맞춤 설계 (1/4 "x 2"x 3.5 "), 무독성, 투명 PVC 챔버. 디자인 사양에 대해서는 저작자에게 문의하시기 바랍니다.</td></tr><tr><td>갈바노타시스 전극</td><td>UCD 전기 상점</td><td></td><td>백금 코일 전극(플렉서블 코드 포함)</td></tr><tr><td>갈바노타시스 전원 박스</td><td>기판 엔지니어링, 전압</td><td>계가 있는 CA</td><td></td> 맞춤형 DC 전원 출력</tr><tr><td>현미경 커버 유리, 대형, 45 x 50mm, No. 1.5</td><td>Fisher</td><td>12-544-F</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리, 소형, 25 x 25mm, No. 1</td><td>ThermoScientific</td><td>3307</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 포인트 마커</td><td>ThermoScientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>해양 등급 실리콘 실러, 투명</td><td>3M</td><td>051135-08019</td><td></td></tr><tr><td>고진공 그리스</td><td>다우코닝</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>6 ml 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-64</td><td></td></tr><tr><td>Nichiryo 주사기, 1.5 ml</td><td>Nichiryo</td><td>SG-M</td><td></td></tr><tr><td>면 애플리케이터</td><td>Purtian 의료 제품</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Qtips</td><td>존슨 & Johnson</td><td>729389</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 180 PVC 튜브&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>8000-9030</td><td>503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall</td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td>make 2% 한천 솔루션</td></tr><tr><td>Razor Blade</td><td>Personna</td><td>74-0001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipments and Software</td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>operated with a A-4-62 rotor</td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4</td><td>Nexcelom</td><td>자동 T4</td><td></td></tr><tr><td>셀로미터 계수 챔버</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td>로드 20 &#956; l 세포 솔루션</td></tr><tr><td>배양 온도 온난화 플레이트</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>370150000</td><td>galvanotaxis 챔버를 37 °C로 유지하기 위해; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>전동 스테이지 및 환경 챔버가 있는 Eclipse TE-2000 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor 10X/0.30 대물렌즈</td><td>len Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga EX CCD 카메라&nbsp;</td><td>Qimaging</td><td></td><td>냉각 CCD 카메라, 단색, 12비트</td></tr><tr><td>압축 공기(5% CO2</td><td>Airgas</td><td></td><td>특별 주문</td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>이미지 획득 소프트웨어</td></tr><tr><td>Improvision OpenLab 5.5.2</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>세포 추적 소프트웨어 및 마이그레이션 각도 측정을 위한 사용자 정의</td></tr><tr><td>FileMaker Pro Advanced, 8.0</td><td>FileMaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Microsoft Excel 2008, Mac용</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

전립선 세포의 방향 마이그레이션 연구에 맞춤 설계 galvanotaxis 챔버를 활용

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

생리 전기장은 배아 발달, 신경 가지 상피 상처 치유에 세포의 이동을 지시하는 등 특정 생물학적 기능을 제공합니다. 시험 관내에서 배양 된 세포에 직류 전계를인가하여 세포의 이동 방향, 또는 galvanotaxis을 유도한다. 여기 보여 2 차원 galvanotaxis 방법은 주문 제작 된 폴리 (비닐 클로라이드) (PVC) 챔버, 유리 표면에, 백금 전극과 셀 묘화되는 동력 스테이지를 이용하여 수정된다. PVC 챔버 및 백금 전극은 낮은 세포 독성을 전시하고 저렴하고 다시 사용 가능한입니다. 유리 표면과 전동 현미경 스테이지는 이미지의 품질을 개선하고 세포에 유리 표면과 치료 가능한 수정을 허용한다. 우리는 두 가지 비 - 종양 형성, SV40-전립선 무한 증식 세포주, PRNS-1-1의 PNT2 galvanotaxis을 촬영. 이들 두 세포주는 유사한 이동 속도를 보여 모두를 향해 이동음극,하지만 그들은 galvanotaxis의 방향성의 다른 정도를 보여 않습니다. 이 프로토콜을 통해 얻어진 결과 PRNS-1-1 PNT2 세포주들은 지향성 응답 이동성을 관리 다른 고유 특성을 가질 수 있음을 시사한다.

전립선 세포 (PRNS-1-1과 PNT2)의 두 라인은이 방법으로 조사 하였다. 두 줄의 셀은 2 시간 (도 5a)에 걸쳐 1.0 +/- 0.3 미크론 / 분의 속도로 이동 유사한. 그러나, 전계 지향성 PRNS-1-1 선 0.7 +/- 0.3 및 PNT2 라인 (도 5B) 0.2 +/- 0.8이다. 결과들은 상이한 위치 단서 지향성 응답이 발생할 다른 세포 시그널링 메커니즘을 가지고 있음을 시사 (100 세포 추적 하였다 p &lt;0.01)이 두 세포주 galvanotaxis에서 상당한 차이를 나타낸다. <img alt="Galvanotaxis 속도 및 방향성 막대 차트; pRNS-1-1 대 PNT2 그룹; 실험 결과." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig5highres.jp...

우리는 맞춤형 갈바노타시스 챔버에서 이주하는 불멸의 전립선 세포에 생리학적 전기장을 적용하는 방법을 제시합니다. 이 방법을 사용하여 비종양형성 전립선 세포의 2개 계통이 현장에서 다른 정도의 이동 방향을 나타낸다는 것을 입증합니다.

전립선 세포의 방향 마이그레이션 연구에 맞춤 설계 Galvanotaxis 챔버를 활용

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

이 절차의 전반적인 목표는 적용된 전기장에서 세포의 방향성 이동을 평가하기 위한 분석인 Galvan Axxis를 수행하는 것입니다. 이것은 먼저 Galvan axxis 챔버를 조립한 다음 관심 세포와 함께 시딩하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 챔버를 밀봉하고 저속 이미징을 위해 전기장을 적용합니다.마지막 단계에서는 개별 세포의 이동 속도와 전기장에 대한 상대적인 각도를 추적합니다. 궁극적으로 공동 서명합니다. 세포가 전기장에 어떻게 반응하는지, 그리고 음극으로 방향으로 이동하는지 여부를 보여주는 데 사용할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 2차 분석을 위해 텍사스를 투여한 후 세포를 쉽게 검색할 수 있다는 점과 고배율 및 형광 표지된 세포로 이동을 쉽게 촬영할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시각화는 챔버 조립 단계가 바닥 챔버를 조립하는 시연 없이는 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 두 개의 프로판올로 플라스틱 갈반 axxis 챔버를 닦는 것으로 시작합니다.그런 다음 주사기를 사용하여 챔버 바닥의 원형 구멍 주위에 해양 등급 실리콘 실러를 도포합니다. 실런트 위에 큰 커버 유리를 놓고 면봉 끝으로 제자리에 눌러 넣고 면봉으로 여분의 접착제를 닦아냅니다. 그런 다음 다이아몬드 포인트 마커를 사용하여 작은 커버 유리를 잘라 6 x 25mm 공간을 만들고 챔버를 뒤집습니다.다음으로, 주사기를 사용하여 두 줄의 실리콘을 도포하여 바닥 유리의 두 원형 개구부 사이에 세포를 부착할 수 있는 10 x 25mm 채널 표면을 만듭니다. 그런 다음 원형 개구부 사이에 두 개의 유리 공간을 붙이고 새 면 어플리케이터로 공간을 밀어 넣고 방금 시연한 것처럼 여분의 접착제를 닦아냅니다. 실리콘 접착제가 경화될 때까지 24시간 동안 챔버를 사용해 보십시오.다음날, 챔버를 증류수에 밤새 담가 챔버에 세포를 파종하기 전에 접착제에서 아세트산 잔류 물을 제거합니다. 방금 시연 된 것처럼 두 개의 프로판올로 챔버를 말리고 닦습니다. 멸균 PB S3로 세척한 다음 챔버의 두 원형 구멍 사이의 액체 흐름을 확인하십시오.챔버가 양호한 작동 상태인지 확인한 후 멸균 배양 접시에 넣고 챔버를 섭씨 37도에서 15분 동안 놓습니다. 챔버가 평형을 이루는 동안 섭씨 37도에서 5ml의 트립신 EDTA로 배양 접시에서 전립선 세포를 분리합니다. 5분 후 5mL의 10%FBS로 반응을 중화합니다.PBS에서 분리된 세포를 15ml 튜브로 옮긴 다음 5분

utilizing-custom-designed-galvanotaxis-chambers-to-study-directional

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

3D 조직 문화의 시간 저속 영상은 대뇌 피질에서 fractionated 단백질 추출에 대한 반응으로 ganglionic 예하에서 발생하는 각각의 세포의 철새 행동을 공부하고 있습니다.

Ganglionic 에미넨스 문화에서 생성된 세포의 철새 행동

explanted 전지 (트렁크 신경 크레스트 세포)의 마이그레이션을 분석 접근 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은, 저렴한 부드러운, 그리고 차 트렁크 신경 크레스트 세포 배양에서 세포 세포의 상호 작용에서 파생 된 것과 같은 철새 극성에 모두 chemokinesis 및 기타 영향의 chemotaxis를 구별 할 수 있습니다.

수정 Zigmond 회의소 분석을 사용하여 트렁크 신경 크레스트 세포 마이그레이션 분석

이 프로토콜은 세포를 추적할 수 있습니다 맞춤 디자인 electrotactic의 실에서 2D 및 3D 환경을 설정하는 데 사용 방법을...

2D 및 3D 환경에서 신경 전구 세포의 전기장 제어 감독 마이 그 레이션

ECIS / 택시 시스템은 세포 chemotaxis를 측정하는 자동화된 실시간 분석이다. 본 분석에서는 세포 표적 전극에 도착하는 아가로 오스의 레이어 아래로 이동합니다. 세포 운동은 AC 전류를 0으로 저항의 발병에 의해 측정됩니다.

ECIS / 택시와 셀룰러 Chemotaxis 측정

이 프로토콜에서 우리는 galvanotaxis 동안 신경 전구체 세포 translocation을 얻은 성인 뇌의 시간 경과 영상을 사용하려면 직류 전기장의 응용 프로그램을 허용 사용자 정의 챔버를 구성하는 방법을 보여줍니다.

외부 응용 직류 전기 분야에 신경 전구체 세포 마이그레이션 속도론 분석을위한 Galvanotaxis 분석

일차원 국한 미세 환경에서 세포의 자발적인 이동을 연구하는 정량적 방법이 설명된다. 이 방법은 미세 채널을 활용하고 번의 실험에서 서로 다른 조건 하에서 세포의 다수의 이동을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

미세 채널에서 세포의 이동에 관한 연구

세포 이동은 인간의 발달과 생활에서 중요한 부분을 차지합니다. 세포 이동을 변경할 수 있는 메커니즘을 이해하기 위해 3D 콜라겐 매트릭스에서 화학주성을 조사할 수 있는 평면 구배 확산 시스템을 제시하여 기존 분석법의 최신 확산 챔버 한계를 극복할 수 있습니다.

평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

많은 미세유체 장치가 전기택시 연구에 사용하기 위해 개발되었습니다. 그러나 이러한 칩 중 어느 것도 세포에 대한 동시 화학 및 전기장(EF) 효과를 효율적으로 연구할 수 없습니다. 우리는 전기택시 연구에 사용하기 위해 더 잘 제어되고 공존하는 EF 및 화학적 자극을 제공하는 폴리메틸메타크릴레이트 기반 장치를 개발했습니다.

멀티 채널 듀얼 전기장 미세 유체 칩을 이용하여 폐암 세포의 Electrotaxis 연구

카메라 화학 주성 분석 화학 주성은 매개 세포 이동 방향을 제어하는​​ 방법에 진핵 세포의 이해에 필수적이다. 1) 실시간 다중 화학 주성 분석법 고해상도 모니터링 및 2)에 동시에 화학 유인 그라데이션 시각화 및 호중구와 같은 HL60 세포의 이벤트 신호의 시공간 역학 : 여기서는 대한 구체적인 방법을 설명한다.

이미징 G의 호중구와 같은 HL60 세포에서 화성과 시그널링 이벤트 수용체가 매개 단백질 결합

이 프로토콜은 또한 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 결정하기 위해 사용될 수있다 화학 유인 물질에 응답하여 세포 이동을 측정하는 방법을 자세히 맞춤형.

측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소

배우세요 맞춤 설계 갈바노택시스 챔버를 활용하여 전기장에서 전립선 세포의 방향 마이그레이션을 평가하는 방법입니다. 비종양성 세포주의 차이를 분석하여 암 연구에 기여합니다.

전립선 세포의 방향 마이그레이션 연구에 맞춤 설계 Galvanotaxis 챔버를 활용

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