Name: 수정 Zigmond 회의소 분석을 사용하여 트렁크 신경 크레스트 세포 마이그레이션 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: 학습하세요 수정 Zigmond 회의소 분석을 사용하여 트렁크 신경 크레스트 세포 마이그레이션을 분석하는 방법을. 이 비용 효율적인 기술은 화학주성을 다른 이동 영향과 구별하여 발달 생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는이 방법의 개발 기간 동안 기술 지원 리노 김, 스티브 구즈만과 Ujit Satyarthi에 특별한 감사를드립니다. 마이런 호손, 리차드 Spengel, 그리고 로베르토 로자 스 여기에 사용 된 방을 가공하고 꼭 필요한 기술 지원을 제공했습니다. 특히, 로베르토 로자 스는 그림 4를 만들었습니다. 우리는 또한 위의 chemotaxis 분석의 발전에 이전 스콧 프레이저 귀중한 조언 감사합니다. 이 작품은 부분적으로 NIH-MBRS 평가 점수 - 5S06GM048680-13 MEdB에 의해 CW의 CSU, 왕국 대학원 논문 지원 프로그램에서 수상에 의해 지원되었다.

1. 1 일 : coverslips에 밤 문화의 트렁크 신경 튜브의 분리 <ol><li> 38 56 H에 대한 여자의 알을 품어 ° C.는 부화에서 알을 제거 다소 70 %의 에탄올과 함께 물을 뿌리 한 후이를 건조 할 수 있습니다. UV-소독 유리 트레이에 열려있는 알을 해봐. </li><li> 의 난황에서 각 배아를 추출하고 여자는 벨소리의에 배치합니다. 곡선 가위로 그 피 섬 주변의 제 1 절삭하여이 작업을 수행 한 후, 무딘 집게와, 그 extraembryonic 막에 의해 배아를 들고 여자는 벨소리의 솔루션을 포함하는 멸균 플라스틱 페트리 접시에 배치합니다. </li><li> 초과 extraembryonic 멤브레인을 트리밍뿐만 아니라 텅스텐 바늘 (그림 1)를 사용하여, 두개골 vagal, 그리고 성례의 축 수준의 각 배아의 줄기를 분리합니다. 첫째, 단계 HH15-17 11 사이에 구에 대한 배아를 선택합니다. 최대 단계 HH15와 들어, forebrain 및 hindbrain 축이 예각을 형성하고 따라서 머리 caudally 기울 나타납니다. 에무대 HH17는 꼬리 꽃 봉오리는 현재이며, 틸트 ventrally했지만 아직 somites 포함되어 있지 않습니다. 텅스텐 바늘로 배에서 약 2 mm로 extraembryonic 멤브레인을 트림과 10 체절에 앞 모든 배아 조직을 잘라. 또한 다섯 번째 가장 새로 형성된 체절 주변부터 모든 꼬리 배아 조직을 제거합니다. </li><li> Dispase에서 분리 된 배아 줄기을 (0.24 U / ML DMEM) 장소 37에서 1 H 15 분에 넣어 부화 ° C 5 % CO 2. 줄기는 부화를 시작하면 배양 NT의 explants 6 coverslips (CS) (단계 1.5-1.8)를 준비 시작합니다. </li><li> 70 % 에탄올 6 CS를 (살균, ultrapure 물에 희석) 헹굼 후이를 건조 할 수 있습니다. 실험실 마커를 사용 직경 1cm (fibronectin 코트가 적용된 곳이 원 나중에 확인하는 데 도움이됩니다)에 대해 각 CS의 중심부에 원을 그립니다. 각 CS 같은 얼굴에, 그 단어 (이 Y에 도움이 될 그려 원 외부 (또는 다른 비대칭 단어 나 모양) "이"을 작성ou는 CS의 표시된면이 아래로 직면하거나 여부를 확인). </li><li> 별도의 40에 각 CS를 배치 표시된 표면이 아래로 직면하고 음식이 10 분의 살균 UV 램프 아래에 공개 앉아 할 수있는 X 10mm 무균 요리. </li><li> 60 μl fibronectin (FN, 10 μg / ML DMEM)을 적용 1cm의 원 안에 전체 지역 확인하는 동안 CS의 해제 표면에은 코팅되어 있습니다. 30 분에 37 ° C에서 배양 한 후 조심스럽게 각 CS에서 fibronectin을 기음 위해 요리를 놓습니다. </li><li> 의 FN-코팅 영역에 250 μl '문화'중간 [L-글루타민과 DMEM (2 ㎜), 페니실린 (100U/ml), 스트렙토 마이신 (100 mcg / ML) 및 8% 태아 소 혈청 (FBS)를] 추가 CS. 37 각 CS를 포함하는 요리를 놓고 ° C 5 % CO 2 다시 국세청이 분리 될 때까지. </li><li> L15 매체를 포함하는 한 5cm 유리 페트리 접시에 모든 incubated 배아 줄기를 전송하고 고급 집게와 텅스텐 바늘 (그림 1)를 사용하여 각 NT를 해부 시작합니다. CNT를 손상하지 조심하면서 arefully 날카로운 텅스텐 바늘로 NT와 somites의 국경을 따라 잘라. 이 트렁크의 꼬리 - 가장 끝에서 각각 NT를 분리 시작하는 것이 더 쉽습니다. </li><li> (약 8 15 somites 사이에 국세청이 오랜 추천) 밤 문화에 straightest과 긴 국세청 6을 선택합니다. 문화 매체와 중이오 micropipette 팁을 사용하여 (1.8 단계 1.5에서) 자신의 이전 준비 CS에 6 박의 각을 전송합니다. NT는 표면에 떠있는 상태로 유지되지 않습니다 있는지 확인하십시오. NT는 부동 인 경우가 micropipette를 사용하여 침몰 때까지에 매체를 똑. </li><li> 37 ° C 5 % CO 2 박 각 접시를 놓습니다. 각 NT 바로 전에 보육에있는 접시를 (참조로 단계 1.5에서 그려진 원을 사용하여) 배치에 각 CS의 FN-코팅 지역 내에있는 유지를 위해주의하십시오. micropipette는 필요한 경우보다 각각 NT의 위치를​​ 조정하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 장소에서적어도 2는 살균 15 ML의 원심 분리기 튜브에 문화 매체의 ML (혈청없이) 37 ° C 5 % CO 2 박 품다. 뚜껑을 남겨은 약간 밤새 조정하는 매체의 pH를 허용하도록 unscrewed. 사전 잠복기 매체 것은 분자 그라디언트의 설립을 방해 할 수 있습니다 귀하의 챔버에서 거품 형성을 방지하는 것이 중요합니다. 예 : "preinc​​ubated"중간은 모든 향후 단계에 사용되어야합니다. 사용하지 않을 경우,이 매체는 37 잠복기가되어야 ° C.를 </li></ol> 2. 일 2 : 수정 Zigmond 챔버와 셀 마이그레이션의 시간 경과 분석로드 <ol><li> 배양 6 박을 버리고, 가장 분석에 적합 3 문화를 선택합니다. 일반적으로, 적어도 하나의 긴 직선 가장자리가 NCC 문화는 (그림 2A)을 선택해야합니다. 3 가장 문화는 다른 치료와 함께 각 하루 종일 셋 수정 Zigmond 챔버를로드 및 영화에 사용됩니다. 3 문화 중에 loadin에 대한 하나를 선택g는 첫 번째 챔버와 나중에 사용하기 위해 보육에 다른 사람들을 반환합니다. </li><li> 면봉 사용하여 저수지 한 수정 Zigmond 챔버의 다리를 주변 석유 젤리의 얇은, 심지어 레이어를 적용합니다. </li><li> CS의 표면에 부착 주변 NCCs을 떠나는 동안 텅스텐 바늘로 부드럽게, CS에서 NT를 제거합니다. NCC 문화의 straightest 가장자리의 방향을 기억하는 펜으로 요리를 선택합니다. </li><li> 다리에 preincubated 매체의 몇 방울을 넣으십시오. 기존의 문화 매체의 대부분을 제거 할 수 Kimwipe에 대한 고급 집게와 CS, 소량 CS의 가장자리를 들고 다음, 즉시 촬영 할 문화의 직선 가장자리가 위에 중심이되도록 수정 Zigmond 챔버에 CS를 배치 다리의 길이와 거의 수직 다리 - 저수지의 국경 (그림 2A, B)로 변경합니다. </li><li> 역 현미경 사용, 일에 가장 가까운 다리의 편에서는 게 바로 NCC 테두리를 이동(; 컨트롤이 두 번째로드 중 저수지에 해당합니다 그림 2B) 의심 chemotactant이 포함됩니다 전자 저수지. 또한보다 정교하게 다리 - 저수지의 국경에 수직이되도록 문화의 직선 가장자리를 맞 춥니 다. </li><li> 조심스럽게,하지만 안전하게 완전히 더가 밀폐 될 수 있도록 CS의 가장자리를 따라 추가 석유 젤리를 배치 한 후, 챔버에 밀봉되어 있는지 확인하고, Zigmond 챔버에 존재 석유 젤리로 CS를 누르십시오. 밀봉 과정에서 어떤 움직임을 해결하기 위해 다시 NCC 테두리의 각도를 세밀하게 조정할 수 있습니다. </li><li> 의심 chemotactant 첫 번째 (그림 2B)를 포함하지 않습니다 저수지를로드합니다. 약 300 μl preincubated 매체와 (저수지에서 거품을 생성하지 않도록주의하면서) 전체 때까지 저수지에 매체를 삽입으로 1 ML의 주사기 (첨부 바늘 인치 25 G X 1.5를)로드하여 이렇게. suff와 양쪽 저수지를 연결이전 다음 저장소를로드에 석유 젤리의 icient 금액입니다. </li><li> 후보 chemotactant를 포함하는 preincubated 매체를 사용하여이 시간을 제외하고, 단계 2.7을 반복합니다. 항상 테스트 분자를 부족한 저수지를로드 한 후 테스트 할 수있는 분자를 포함하는 저장소를로드 할 수있는 문화를 통해 분자 그라디언트를 생성 할 때이 중요합니다. </li><li> ° C 전에 촬영 1 H에 대한 배양하기 위해 37로드 Zigmond 챔버를 놓습니다. 이미지 90 초 간격으로 3시에 NCC 문화의 straightest 테두리는 약 37 ° C (그림 2A, B)에서 잠복기 동안. 이상적인 대표 점선 상자, 이전의 영화를 만드는, 획득 할 이미지의 가장자리가 함께하고 마지막 저수지로드를 인접 다리 (그림 2B, 상단 패널의 가장자리를 만지지 정렬되도록 카메라를 정렬해야합니다 이미지에 위치). 이것은 분자 적용 그라디언트와 일의 방향을 표준화하여 나중에 소프트웨어 분석을 용이하게합니다각 영화에서 촬영 저수지에서 전자 거리가 제작했다. </li><li> 컨트롤에 대한 반복 (단계 2.1)을 선택한 두 개의 다른 NCC 문화 각각에 대해 2.2-2.9 단계를하지만, 적절한 매체를 사용하여 각 저수지를 채 웁니다. 한 가지 유형의 제어를 들어 preincubated 매체가 테스트 할 수있는 분자를 포함하지 않는과 두 저수지를 채 웁니다. 두 번째 제어 치료, 프라임 CS를 장착하기 전에 의심 chemotactant를 포함하는 preincubated 매체의 몇 방울과 다리입니다. 그런 다음, 의심 chemotactant를 포함하는 동일한 매체 모두 저수지를로드합니다. </li><li> ImageJ (NIH) 수동 추적 사용 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">(rsb.info.nih.gov / 엘 제이 / 플러그인 / 트랙 / track.html)</a> 와 Chemotaxis 및 마이그레이션 도구 v1.01 <a href="http://www.ibidi.de/applications/ap_chemo.html">(/ www.ibidi.de / 응용 프로그램 ap_chemo.html)</a> 추적 플러그인을 문화 제이의 직선 국경을 따라 주변 NCCs의 마이그레이션이군요 이미징 및 취득 철새 궤도 (그림 2B-C)의 다양한 매개 변수를 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 대표 결과 : 많은 트렁크 NCCs이 위 기술을 사용하여 후보 chemoattractant에 응답했다 영화에서 셀 궤도의 샘플 (그림 2D) 표시됩니다. 긍정적 인 응답이 예에서 대부분의 세포는 chemoattractant 그라디언트 최대 순 이동을합니다 (빨간색으로 표시) 표시됩니다. 탄도 데이터는뿐만 아니라 세포 이주의 다른 속성을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 시각적으로 수정 Zigmond 챔버, 알렉사 형석 488 IgM 공액 (MW ~ 900 kDa)의 적용 기울기를 평가하기 위해 수정 Zigmond 챔버의 두 번째 저수지 (약 40 μg / ML H 2 O에서)에로드되었습니다. 기울기는 (그림 3) 1 H에 의해 설립, 26 H 후 여전히 다소 존재하지만, 크게 50 H가 감소되었습니다. 테스트 할 수있는 분자가 작은 경우에는 응용 그라디언트 부표시되는 내용보다 더 빨리 저하하겠습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. fibronectin - 코팅 coverslips에 하룻밤 배양을위한 트렁크 수준 국세청의 Explantation. 등쪽 NT에서 트렁크 NCCs의 delaminate이 somites 8-28 인접 해 있기 때문에, NT의 세그먼트는 microdissection 및 NT의 explant에서 NCCs의 이민을 허용 할 fibronectin 코팅 CS에서 하룻밤 배양에 의해 격리되어 있습니다. 사람들이 더 이상 직선 국경과 NCC 문화를 얻을하는 경향이로 8-15 somites 길고 상대적으로 직선 사이에 절연 국세청은 최고의 하루 아침에 배양에 적합합니다. 다른 신경 크레스트 축 수준을 야기 할 신경 튜브의 영역은 작은 글꼴로 표시됩니다. 초, 체절. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. explanted 트렁크 NCCs의 마이그레이션을 평가하기위한 방법수정 Zigmond 챔버를 사용합니다. (A) 가늘고 긴 트렁크 NCC 문화는 적어도 하나의 긴 직선 테두리와 함께 국세청과 결과 NCC 문화의 밤 배양에 의해 준비가되어이 실험을 위해 선택됩니다. 선택한 문화의 가장 긴 직선 테두리가 다음 다리 - 저수지의 국경에 수직 위치, 그리고 미래를 적용 그라디언트의 벡터에 따라서 평행하다. Zigmond 챔버 및 씰링에 NCC 문화의 위치를 미세 조정 (B) 후 챔버에 coverslip은 챔버가로드됩니다. chemotaxis을 테스트를 할 때, 의심 chemotactant 포함되지 않습니다 저수지 (이 -) 첫 번째와 봉인로드됩니다. 그런 다음, 다른 저수지는 의심 chemotactant (+)와 봉인과 함께로드됩니다. 이전에 선택한 국경을 따라 주변 NCCs는 이미징 및 ImageJ (아래 패널)에 대한 수동 추적 플러그인을 사용하여 추적 할 수 있습니다. 반응 (C) 많은 철새 특성에 적용 기울기는 추적 데이터를 기준으로 평가 될 수있다. 예를 들어, chemotaxis 지수는이 마이그레이션 한 총 거리에 의해 X-축을 따라 세포의 변위를 나누어 도출 할 수 있습니다. (D) 매력 응답의 예는 처음 Chemotaxis 및 마이그레이션에 의해 생성 된 셀 궤적 플롯으로 표시됩니다 ImageJ에 대한 도구 플러그인. 각 궤도의 시작 지점은 원점 (0,0)으로 설정되어 있습니다. 또한 chemoattractant 원본에 가까운 (동일 가중치를 모든 셀 파란색 십자가)은 최종 위치에있는 모든 세포의 질량의 chemoattractant source.The 센터쪽으로 이주 얼마나 더 많은 세포합니다. NCCs, 신경 크레스트 세포, 레드 트랙과로드 저수지를 향해 마이그레이션 세포 의심 chemoattractant, 블랙 트랙, 거리에 마이그레이션 세포, (+), 높은 chemotactant 농도, (-), 낮은 chemotactant 농도. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> <stron>알렉사 형석 488 IgM의 공액의 추가에 따라 다른 시간에 수정 Zigmond 챔버의 다리 g&gt; 그림 3. 강도 프로필이. 챔버는 메인 예외 프로토콜에 설명 된 그와 비슷한 방식으로로드 된 그 preincubated 물 (대신 preincubated 매체의) 40 μg / ML에 항체를 희석하는 데 사용하고, 작은 공기 주머니가 다리의 끝 (거리에 위의 강도 프로필 촬영 슬라이스에서)에 참석했다되었습니다. 처음에는 아무 그라디언트가 다리의 대부분에 걸쳐 존재 없었다. 로 1 하 기울기는 설립 26 H에 이르기까지 현재 남아되었다. 50 H하여 그라디언트의 존재가 다리의 서로 다른 영역에서 일관했고, 때 현재, 그라디언트의기구가 크게 감소되었습니다. 모든 프로필은 AxioVision 4.6 소프트웨어를 사용하여 다리 동일한 슬라이스 (한 다리 저수지 국경에서 다른까지)에서 생성되었습니다. 참고 동안에도 공기포켓이 존재했다, 기울기는 중단되지 않았습니다. 높은, 높은 강도, 낮은, 낮은 강도, 다리의 전체 너비 (2 ㎜)에서 X 축, 거리, (+), 알렉사 형석 488 IgM 켤레와 함께로드 저수지, (-), 저장소 켤레에로드되지 않았습니다. </stron><img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 수정 Zigmond 챔버 사양. 표시는 차원 사양 (± 0.2 mm)과 함께 여기에 사용되는 수정 Zigmond 챔버의 다이어그램이다. 측정은 적당한 개인 환경 설정을 일치하기 위해 조정할 수 있습니다. 보충 프로토콜 : 수정일 Zigmond 상공 회의소의 제작 아래의 프로토콜에 대한 참고 자료로 4 그림 참조하십시오 : <ol><li> 16분의 3 "두께의 광택 아크릴 (4.45 mm 실제 두께)의 시트를 구입하십시오. </li><li> 테이블을 사용하여보고에 대형 챔버 공백을 잘라33.25 mm X 64.57 mm의 거친 크기. 이 가공 3.175 mm 추가 자료를 수 있습니다. </li><li> 바이스에 챔버 빈을 설정합니다. 30.07 mm X 61.39 mm : 밀링 머신 및 6.35 mm (1 / 4 ") 엔드 밀 비트, 마무리 가공 정확한 크기로 챔버의 측면이 있습니다. </li><li> 밀링 머신에 챔버를 비워 놓고 x와 가장자리 찾기와 Y 축 모두 함께 빈의 중심을 찾으 한 후 중앙 위치를 제로. </li><li> 상단 표면에 엔드 밀 비트를 터치하면 챔버 높이 (Z 축)을 취득하고 높이를 제로. </li><li> 3.91 mm (0.154 ") 엔드 밀 비트를 사용하여 첫 번째 저수지의 X-축 (긍정적 인 방향)을 따라 비트 3.03 mm 오프셋. 2.84 mm의 깊이에 챔버로 가공을 시작 완벽한 저수지에 반대 (음수) 방향으로 "(7.62 mm 0.300)로 통과 한 후 7.62 mm (0.300)"로 y 축 (긍정적 인 방향)을 따라 이동하면서 15.24 mm (0.600 ")의 길이입니다. 오프셋X-축 (부정적인 방향)을 따라 3.03 mm (0.119 ")에 비트와 두 번째 저수지에 대해 동일한 과정을 반복합니다. </li><li> 의 가장자리에있는 챔버를 놓고 실험하는 동안 미디어를로드하는 챔버의 측면에 저수지의 끝을 연결하는 각 저수지 (4 총)의 말에 1.09 mm (인치 0.043) 드릴 비트를 사용하여 구멍을 뚫는다. </li><li> 어떤 화학 오염 물질을 제거하는 데 도움 따뜻한 비눗물에 잘 챔버를 적시 게. </li><li> 모든 비누를 제거 두 번 증류수에 잘 챔버를 적시하고 헹굼. 방은 이제 위에서 설명한대로 사용할 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

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트렁크 NCCs에 chemotaxis 조사를 실시하는 것은 이유 시리즈 도전 입증되었습니다. 따라서 트렁크 NCCs은 트렁크 수준 NT의 주 explantation에서 구할 수해야하며 간선 NCCs는 교양 장기 경우 차별화 이기종 줄기 세포 인구를 구성합니다. 체외에서 homogenously 배포 세포 인구의 chemotactic 응답을 공부하는 종래의 방법은 먼저 세포가 고립과 chemotaxis 챔버 (예를 들어, Boyden 챔버 12)의 replated homogenously 아르해야하기 때문에 트렁크 NCCs에서 테스트하기가 어렵습니다. 국세청 수십 explantation은 단 한 실험에 대한 충분한 트렁크 NCCs의 균일 한 분포를 생성해야 할 수 있으므로 충분한 NCCs을 분리하는 것은 지루한 수 있습니다. 또한, NCCs는 해제되지 혼합하고, homogenously 자연 맥락에서 재배포 않습니다. 따라서, 특정 종래의 chemotaxis의 assays을 수행하기 위해 repla...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 오메가 과학 </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린의 스트렙토 마이신 솔루션 </td><td> 오메가 과학 </td><td> PS-20 </td><td> 100X 주식 농도 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> 오메가 과학 </td><td> GS-60 </td><td> 100X 주식 농도 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 오메가 과학 </td><td> FB-11 </td><td> 롯 # 105247 (또는 비교가 또) </td></tr><tr><td> 수정 Zigmond 챔버 </td><td> 홈 만든 </td><td> N / A </td><td> 저수지 볼륨 : ~ 160 μl EA, 추가 사양, 그림을 참조하십시오. 4 보충 제조 프로토콜 </td></tr><tr><td> 세포 배양 접시 </td><tD&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 X 10mm </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> 10X 증권은 1 ML H 2 O 9 ML DMEM에 1 밀리그램 FN을 diluting하여 준비 </td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> 어부 </td><td> 12-548-B </td><td> Precleaned, 22 X 22mm </td></tr><tr><td> L15 매체 </td><td> 열 과학 </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> 석유 젤리 </td><td> 불우 </td><td> 011110794642 </td><td> 백퍼센트 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 관 </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 ML </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 전지 시스템 </td><td> 4Z0-850 </td><td> 10X 주식 농도 </td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> 바늘 </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G X 1.5 인치 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 488-IgM </td><td> 나는nvitrogen </td><td> A21042 </td><td> 주식은 2 밀리그램 / ML이다; 7 첩자 염료 / 사마귀 IgM </td></tr><tr><td> 해부 집게 </td><td> FST </td><td> 기타. </td><td> 뒤몽 # 5 또는 55, 직선 날붙이, 스테인리스 스틸 또는 티타늄 </td></tr><tr><td> 텅스텐 니들 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 집에서 만든, 핀 홀더에 배치 </td></tr><tr><td> 부근 집게 </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> 계란 노른자에서 벨소리 집으로 배아를 전송하는 데 사용 </td></tr></tbody></table> 보충 프로토콜 : 수정일 Zigmond 상공 회의소의 제작 아래의 프로토콜에 대한 참고 자료로 4 그림 참조하십시오 : <ol><li> 16분의 3 &quot;두께의 광택 아크릴 (4.45 mm 실제 두께)의 시트를 구입하십시오. </li><li> 테이블을 사용하면 33.25 mm X 64.57 mm의 거친 크기에 대형 챔버 공백을 잘라, 보았다. 이 가공 3.175 mm 추가 자료를 수 있습니다. </li><li> 바이올렛에 챔버를 비워 설정SE. 30.07 mm X 61.39 mm : 밀링 머신 및 6.35 mm (1 / 4 &quot;) 엔드 밀 비트, 마무리 가공 정확한 크기로 챔버의 측면이 있습니다. </li><li> 밀링 머신에 챔버를 비워 놓고 x와 가장자리 찾기와 Y 축 모두 함께 빈의 중심을 찾으 한 후 중앙 위치를 제로. </li><li> 상단 표면에 엔드 밀 비트를 터치하면 챔버 높이 (Z 축)을 취득하고 높이를 제로. </li><li> 3.91 mm (0.154 &quot;) 엔드 밀 비트를 사용하여 첫 번째 저수지의 X-축 (긍정적 인 방향)을 따라 비트 3.03 mm 오프셋. y 축 따라 이동하는 동안 (2.84 mm의 깊이에 챔버로 가공을 시작합니다 7.62 mm (0.300까지) 방향으로 긍정적 인 15.24 mm (0.600 &quot;)의 전체 저수지의 길이에 반대 (음수) 방향으로)&quot;를 선택한 다음)과 7.62 mm (0.300으로 통과 &quot;. X-축 (부정적인 방향)을 따라 3.03 mm (0.119 &quot;)에 비트 오프셋 두 번째 저수지에 대해 동일한 과정을 반복합니다. </li><li> 의 가장자리에있는 챔버를 배치합니다그리고 실험 기간 동안 미디어를로드하는 챔버의 측면에 저수지의 끝을 연결하는 각 저수지 (4 총)의 말에 1.09 mm (0.043 인치) 드릴 비트를 사용하여 구멍을 뚫는다. </li><li> 어떤 화학 오염 물질을 제거하는 데 도움 따뜻한 비눗물에 잘 챔버를 적시 게. </li><li> 모든 비누를 제거 두 번 증류수에 잘 챔버를 적시하고 헹굼. 방은 이제 위에서 설명한대로 사용할 수 있습니다. </li></ol>

수정 zigmond 회의소 분석을 사용하여 트렁크 신경 크레스트 세포 마이그레이션 분석

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

신경 크레스트 세포는 (NCCs) 상피 - 중간 엽 전이 1,2를 진행 한 후 등쪽의 신경 튜브 (NT)에서 이민을하는 척추 동물의 개발에 존재하는 세포의 과도 인구입니다. 자신의 목표에 도달 할 때까지 EMT 따라 NCCs는 stereotypic 경로를 따라 큰 거리를 마이그레이션. NCCs는 뉴런, glia, melanocytes, 그리고 1-3 chromaffin 세포를 포함한 세포 유형의 광대 한 배열로 차별화. 자신의 적절한 타겟 위치에 도달하고 인식 NCCs의 능력 트렁크 구성 요소를 세 NCC-파생를 포함하는 모든 구조의 적절한 형성을위한 기초입니다. 트렁크 NCC 마이그레이션에 대한 지침의 메커니즘을 Elucidating하는 것은 큰 의미를 갖는 일이었다. 많은 분자 NCC 마이그레이션 4 안내하는 입증되었습니다. 예를 들어, 트렁크 NCCs는 이러한 Semaphorin, Ephrin, 그리고 슬릿 리간드 5-8 등의 제외지도 단서에 의해 거부 될 것으로 알려져 있습니다. 그러나,하지최근 트렁크 NCCs 9 식별 된 모든 chemoattractants이 때까지. 자기편 세포의 chemotactic 동작을 공부에 체외 접근 방법에서 기존는 불후의, homogenously 배포 세포를 가지고 가장 적합한하지만, 처음 균일 분포를 부족 빠르게 (예 : NCCs 등) 차별화 특정 기본 줄기 세포 문화에 적용 할 더 도전합니다. chemotaxis 연구 트렁크 NCCs의 분포를 균질화하는 한 접근 방식이 기본 NT의 explant 문화에서 트렁크 NCCs를 분리하는 것입니다 다음, 리프트하고는 거의 100 % 합류 할 replate. 그러나,이 도금 방식은 시간과 충분한 세포를 explant 노력의 상당한 양을 필요로 거칠고이며, 생체 조건에서 발견 할 수있는 이종 방식으로 트렁크 NCCs를 배포합니다. 여기, 우리는 requirin없이 트렁크 NCCs의 chemotaxis 및 다른 철새 반응을 평가 할 수 있습니다에서 체외 접근 방식을보고균일 한 세포 분포를 GA. 이 기술은, 기본의 시간 경과 영상을 이용하여 수정 Zigmond 챔버 (표준 Zigmond 챔버가 다른 10 설명) 내부 트렁크 NCCs을 교란되지 않은. 자신의 예측 자연 방향에 수직 인 chemotactant 그라디언트로 문화의 주변에서 트렁크 NCCs를 노출하여 적용 chemotactant 기울기에 의해 유도 철새 극성에 변경이 감지 할 수 있습니다. 이 기술은 저렴 복제 치료를 당 두 개의 NT의 explants의 배양을 필요로, 거친 셀 리프팅 (예 : trypsinization 등) 방지 생체 조건에 유사한 배포판에 트렁크 NCCs을 떠난, explantation과 실험 사이의 시간의 양 다운 컷 (이 가능성이 차별화의 위험을 감소), 그리고 수많은 철새 특성을 시간 경과 평가를 할 수 있습니다.

explanted 전지 (트렁크 신경 크레스트 세포)의 마이그레이션을 분석 접근 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은, 저렴한 부드러운, 그리고 차 트렁크 신경 크레스트 세포 배양에서 세포 세포의 상호 작용에서 파생 된 것과 같은 철새 극성에 모두 chemokinesis 및 기타 영향의 chemotaxis를 구별 할 수 있습니다.

수정 Zigmond 회의소 분석을 사용하여 트렁크 신경 크레스트 세포 마이그레이션 분석

신경능 세포(Neural crest cells, NCCs)는 척추동물의 발생 과정에서 나타나는 일시적인 세포 집단으로, ... 이후 등쪽 신경관(dorsal neural tube, NT)에서 이주합니다.

이 절차의 전반적인 목적은 분리된 몸통 신경능 세포에서 분자의 화학주성 및 기타 이동 반응 유도 능력을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 약 8~15개 체절 길이의 몸통 수준 신경관을 분리하고, 각각의 신경관을 피브로넥틴이 코팅된 별도의 커버슬립 위에서 하룻밤 동안 배양하여 신경능 세포의 유출을 유도합니다. 그 후, 최적의 신경능 배양물을 선택합니다.배양액에서 신경관을 제거하고, 배양물이 포함된 커버 슬립을 변형된 zigmund 챔버에 장착하여 배양물의 가장 곧은 경계가 배양액 전체에 가해질 분자 구배(molecular gradient)의 벡터와 평행하도록 배치합니다. 세 번째 단계는 배양액 전체에 분자 구배를 형성한 후, 이전에 선택한 배양물의 곧은 경계를 따라 말초 신경능 세포(peripheral neural crest cells)의 이동을 촬영하는 것입니다. 마지막 단계는 Image J 소프트웨어를 사용하여 선택된 배양물 경계를 따라 위치한 말초 신경능 세포의 이동을 추적하고 분석하는 것입니다.최종적으로, 획득한 세포 궤적 데이터 분석을 통해 선택한 분자가 세포의 방향성 또는 속도와 같은 다른 이동 특성을 변화시킬 수 있는지 여부를 결정할 수 있습니다. 이 기술이 Boyden chamber assay와 같은 기존 기술보다 갖는 주요 장점은 비용이 매우 저렴하다는 점입니다. 이 방법은 타임랩스 이미징을 사용하여 일차 배양 편평 배양물(primary explan cultures)의 주변부에서 이미 극성화된 세포의 이동을 분석하는 데 활용될 수 있습니다.닭의 알을 38°C에서 56시간 동안 배양한 후, 인큐베이터에서 알을 꺼내 70% ethanol을 가볍게 분무하고 알을 건조시킵니다. 멸균된 플라스틱 페트리 접시에 Chick ringer solution을 채우고 유리 트레이를 UV 멸균합니다. 5cm 유리 페트리 접시에 dis displays를 채웁니다.이제 달걀을 깨서 UV 멸균된 유리 트레이에 담습니다. 먼저 곡선 가위로 배아의 혈액섬(blood islands) 주변을 절개하여 각 배아를 난황에서 추출합니다. 그다음 둔두 핀셋(blunt forceps)으로 배아 외배엽 막을 잡아 배아를 들어 올린 후, Ringer 용액이 담긴 준비된 페트리 접시에 옮깁니다.다음으로, 햄버거 및 해밀턴 단계(hamburger and Hamilton stages) 15에서 17 사이의 배아 약 9개를 선택합니다. 텅스텐 바늘을 사용하여 10번째 체절(somite)보다 앞쪽에 있는 모든 배아 조직을 절단하고, 가장 최근에 형성된 다섯 번째 체절 부근부터 시작하여 모든 척삭 배아 조직을 제거합니다. 그런 다음 배아로부터 약 2 mm 거리까지 배외막(extra embryonic membranes)의 여분 부분을 다듬어 냅니다.분리된 배아 몸통을 배양 접시에 넣고 37 °C, 5% CO2 조건에서 1시간 15분 동안 배양합니다. 배아 몸통이 배양되는 동안, 배양용 커버 슬립 6개를 준비합니다. 먼저 70% ethanol로 세척한 후 완전히 건조시킵니다.그 다음 실험실 마커를 사용하여, 나중에 각 커버슬립의 동일한 면에서 피브린 연결 외피(fibrin connecting coat)를 식별할 수 있도록 각 커버슬립 중앙에 지름 약 1cm의 원을 그립니다. 커버슬립의 상단과 하단을 쉽게 구별할 수 있도록 그린 원 바깥쪽에 비대칭적인 단어나 기호를 적습니다. 이제 각 커버슬립을 표시된 면이 바닥을 향하도록 하여 40 x 10mm 크기의 개별 멸균 디시에 넣고, 디시 뚜껑을 연 상태로 살균 UV 램프 아래에 10분 동안 둡니다.그런 다음, 표기되지 않은 커버슬립 표면의 1cm 원형 영역 안에 fibronectin 60 µL를 도포하여 원 전체 면적이 코팅되도록 합니다. 이를 37 °C 인큐베이터에 30분 동안 보관합니다. 인큐베이션 시간이 지나면 각 커버슬립에서 fibronectin을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.다음으로, FI nin 코팅 영역에 250 µL의 배양액을 추가합니다. 커버슬립을 덮은 후, 신경관이 분리될 때까지 커버슬립을 다시 배양합니다. 커버슬립이 배양되는 동안, 5 cm 유리 페트리 접시에 L 15 배지를 채웁니다.이제 배양된 배아 몸통을 준비된 페트리 접시에 모두 옮깁니다. 미세 핀셋과 날카로운 해부침을 사용하여, 해부침으로 신경관과 체절의 경계를 따라 조심스럽게 절개하여 신경관을 분리합니다. 인큐베이터에서 커버 슬립을 제거합니다.가장 길고 곧은 신경관 6개를 선택한 후, 배양액이 채워진 마이크로 피펫 팁을 사용하여 6개의 커버 슬립에 각각 하나의 신경관을 옮깁니다. 마이크로 피펫을 사용하여 각 신경관이 해당 커버 슬립의 피브로넥틴 코팅 영역 내에 위치하도록 조정한 다음, 37°C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그다음, 멸균된 15 mL 원심분리 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배양액을 최소 2 mL 넣습니다.배지의 pH가 조절될 수 있도록 튜브를 37°C, 5% carbon dioxide 조건에서 밤새 배양하는 동안 캡을 살짝 푼 상태로 둡니다. 밤샘 배양 후, 세 개의 배양물 중 최소 하나 이상의 긴 직선 가장자리가 형성된 가장 상태가 좋은 신경능 세포 배양물 3개를 선택합니다. 그중 하나를 선택하여 첫 번째 챔버에 로딩하고, 나머지는 나중에 사용하기 위해 인큐베이터로 돌려보냅니다.그다음 면봉을 사용하여 변형된 sigmund chamber 하나에서 리저버(reservoir) 주변과 브리지(bridge) 부분에 바셀린을 얇고 고르게 도포합니다. 이어서 텅스텐 바늘을 이용해 선택된 신경능 세포 배양이 포함된 커버스립에서 신경관을 조심스럽게 제거하며, 주변의 신경능 세포들은 피브로넥틴 코팅에 부착된 상태로 둡니다. 신경능 세포 배양의 가장 직선적인 경계 방향을 기억할 수 있도록 실험실 마커로 디쉬에 표시합니다.다음으로, 미리 배양한 배지를 수정된 zigmund chamber의 브리지 위에 몇 방울 떨어뜨립니다. 그런 다음 미세 핀셋으로 커버슬립을 집어 듭니다. 커버슬립의 가장자리를 Kim wipe로 가볍게 닦아 기존 배양 배지를 대부분 제거한 후, 촬영할 신경능 세포의 직선 경계가 브리지 길이에 맞게 중앙에 위치하고 브리지 저장조 경계와 대략 수직이 되도록 커버슬립을 수정된 zigmund chamber 위에 즉시 배치합니다.도립 현미경을 사용하여 직선 형태의 신경능 세포 경계를 브릿지의 저장소와 가장 가까운 쪽으로 이동시키십시오. 이렇게 하면 추정되는 화학 유인 물질을 가둘 수 있으며, 직선 형태의 신경능 세포 경계를 브릿지 저장소 경계와 수직이 되도록 더 정밀하게 정렬할 수 있습니다. 이제 커버 슬립을 지그문드 챔버에 도포된 바셀린 위로 조심스럽지만 단단하게 눌러, 챔버에 완전히 밀봉되었는지 확인하십시오.그다음 커버슬립 가장자리를 따라 바셀린을 추가로 도포하여 기밀성을 더욱 확실히 합니다. 밀봉 과정 중 발생했을 수 있는 움직임을 보정하기 위해 신경능 세포 경계의 각도를 다시 조정합니다. 다음으로, 미리 배양한 배지 약 300 µL를 1 mL 주사기에 넣습니다.25게이지, 1.5인치 부착 바늘을 사용하여 화학유인물질이 포함되지 않은 리저버에 배지를 가득 찰 때까지 주입합니다. 이때 리저버 내에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.그다음 다음 리저버를 로딩하기 전에 양쪽 리저버를 충분한 양의 바셀린으로 막아줍니다. 이제 원하는 화학 유인 물질이 포함되어 사전 배양된 배지 300 µL를 두 번째 주사기에 로딩합니다. 그런 다음 동일한 방식으로 반대편 리저버에 배지를 주입합니다.다시 한번 바세린으로 리저버를 조심스럽게 밀봉합니다. 촬영 전, 시료가 로딩된 Sigmund 챔버를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 약 37 °C로 배양하면서 대조군으로 사용할 신경능 세포 배양물의 가장 곧은 경계 영역을 90분 간격으로 3시간 동안 이미지화하고, 앞서 보여준 방식과 동일하게 다른 두 가지 신경능 세포 배양물이 포함된 zigmund 챔버를 로딩합니다.저장조를 채우고 브릿지를 프라이밍하기 위해 적절한 대조군 처리를 사용합니다. Image J의 manual tracking 플러그인을 사용하여 배양 구역의 직선 경계를 따라 이동하는 말초 신경능 세포의 이동을 추적합니다. chemotaxis and migration tool 플러그인을 사용하여 획득한 이동 궤적의 다양한 파라미터를 분석합니다.신경관을 하룻밤 동안 배양하여 신장된 몸통 신경능 세포 배양물을 준비하였으며, 결과적으로 최소 하나 이상의 긴 직선 경계를 가진 신경능 세포 배양물을 실험 대상으로 선택하였다. 선택된 배양물 중 가장 긴 직선 경계를 브릿지 저장소 경계와 수직이 되도록, 즉 향후 적용될 구배의 벡터와 평행하게 배치하였다. 추정 화학 유인 물질을 포함하지 않는 저장소(여기서는 마이너스 기호로 표시됨)를 먼저 채운 후 밀봉하였다.그 다음, 플러스(+) 기호로 표시된 추정 화학 유인 물질을 다른 저장소에 넣고, 이전에 선택한 경계를 따라 밀봉된 주변 신경능 세포를 Image J의 수동 추적 플러그인을 사용하여 이미징하고 추적하였습니다. 이 그래프에 나타난 것처럼, 얻어진 추적 데이터를 기반으로 적용된 구배에 반응하는 수많은 이동 특성을 평가할 수 있습니다. 예를 들어, 세포의 x축 방향 변위를 총 이동 거리로 나누어 화학주성 지수를 도출할 수 있습니다. 여기에 제시된 세포 궤적 도표는 추적된 모든 세포의 유인 반응을 보여줍니다.각각의 빨간색 궤적은 화학 유인 물질로 추정되는 물질이 들어 있는 저장조를 향해 이동한 세포의 경로입니다. 이 그림에서는 검은색 궤적에 비해 빨간색 궤적의 양이 상당히 더 많습니다. 또 다른 테스트에서는 분자 농도 기울기를 유지하는 변형된 시그먼드 챔버(sigmund chamber)의 능력이 검증되었습니다.Alexa Fluor 488 IGM 접합체를 왼쪽 저장조에 첨가하고, 브릿지 전반의 형광 강도를 여러 시간대에 걸쳐 측정하였습니다. 농도 구배는 최소 26시간 동안 유지되었습니다. 영상을 시청한 후, 수정된 지그문드 챔버 분석법(zigmund chamber assay)을 사용하여 적출된 몸통 신경능세포 배양물에서 분자의 화학주성 유도 능력 및 기타 이동 행동을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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수정 Zigmond 회의소 분석을 사용하여 트렁크 신경 크레스트 세포 마이그레이션 분석

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