수정 Zigmond 회의소 분석을 사용하여 트렁크 신경 크레스트 세포 마이그레이션 분석

이 절차의 전반적인 목적은 이식된 트렁크 신경능선 세포에서 화학주성 및 기타 이동 반응을 유도하는 분자의 능력을 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 길이가 대략 8에서 15솜 사이의 몸통 수준 신경관을 분리하고 신경능선 이동을 허용하기 위해 별도의 피브로넥틴 코팅된 커버 슬립에서 각 신경관을 하룻밤 동안 배양함으로써 수행됩니다. 다음으로, 최적의 신경능선 배양이 선택됩니다.

신경관을 배양물에서 제거하고 배양물을 포함하는 커버 슬립을 변형된 지그문트 챔버에 장착하여 배양의 가장 직선 경계가 배양 전체에 적용될 분자 구배의 벡터와 평행하도록 합니다. 세 번째 단계는 배양물 전반에 걸쳐 분자 구배를 생성한 다음 이전에 선택한 배양물의 직선 경계를 따라 말초 신경능선 세포의 이동을 촬영하는 것입니다. 마지막 단계는 Image J 소프트웨어를 사용하여 배양의 선택된 경계를 따라 위치한 말초 신경능선 세포의 이동을 추적하고 분석하는 것입니다.

궁극적으로, 선택된 분자가 세포 방향성 또는 속도와 같은 다른 이동 특성을 변경할 수 있는지 여부는 얻은 세포 궤적 데이터의 분석을 통해 결정될 수 있습니다. Boyden 챔버 분석과 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 매우 저렴한 비용으로 사용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 타임 랩스 이미징을 사용하여 1차 엑스플랜 배양의 주변에서 이미 편광된 세포의 이동을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

섭씨 38도에서 56시간 동안 병아리 알을 부화시킨 후 부화기에서 알을 꺼내 70% 에탄올을 살짝 뿌린 다음 알이 건조되는 동안 알을 건조시킵니다. 멸균 플라스틱 페트리 접시 하나에 Chick ringer 용액을 채우고 유리 트레이를 UV 살균합니다. 5cm 유리 페트리 접시에 디스플레이 디스플레이를 채웁니다.

이제 UV 살균 유리 트레이에 계란을 깨뜨립니다. 먼저 구부러진 가위로 배아의 혈액 섬 주위를 잘라 난황에서 각 배아를 추출합니다. 그런 다음 뭉툭한 집게로 여분의 배아 막으로 배아를 집어 올리고 링거가 들어 있는 준비된 페트리 접시에 배아를 넣습니다.

다음으로, 햄버거와 해밀턴 사이에 있는 약 9개의 배아를 선택합니다. 15-17단계는 텅스텐 바늘로 10번 진드기 앞쪽에 있는 모든 배아 조직을 잘라내고, 5번째로 새로 형성된 진드기 부근부터 모든 배아 조직을 제거한다. 그런 다음 배아에서 약 2mm 떨어진 곳까지 여분의 배아 막을 잘라냅니다.

분리된 배아 줄기를 디스 베이에 놓고 배아 줄기가 부화하는 동안 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 1시간 15분 동안 배양합니다. 배양을 위해 6개의 커버 슬립을 준비합니다. 먼저 70% 에탄올로 헹구고 건조시킵니다.

그런 다음 실험실 마커를 사용하여 각 커버 슬립의 중앙에 직경이 약 1cm인 원을 그려 나중에 각 커버 슬립의 동일한 면에 있는 피브린 연결 코트를 식별합니다. 커버 슬립의 상단과 하단을 쉽게 식별할 수 있도록 그려진 원 밖에 비대칭 단어나 기호를 씁니다. 이제 각 커버 슬립을 라벨이 있는 면이 아래를 향하도록 별도의 40 x 10mm 멸균 접시에 넣고 접시를 살균 UV 램프 아래에 10분 동안 열어 둡니다.

그런 다음 60 마이크로 리터의 피브로 넥틴을 1cm 원 내의 덮개 슬립의 표시되지 않은 표면에 바르고 원의 전체 영역이 코팅되었는지 확인합니다. 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다. 잠복기가 끝나면 각 커버 슬립에서 피닌을 조심스럽게 흡인합니다.

다음으로, 250 마이크로 리터의 배양 배지를 FI 닌 코팅 영역에 추가합니다. 커버가 미끄러지고, 신경관이 분리될 때까지 커버 슬립을 다시 배양합니다. 커버 슬립이 배양하는 동안 5cm 유리 페트리 접시에 L 15 배지를 채웁니다.

이제 배양된 모든 배아 줄기를 준비된 페트리 접시에 옮깁니다. 가는 집게와 날카로운 혀와 바늘을 사용하여 신경관의 경계를 따라 조심스럽게 잘라 신경관을 해부합니다. 인큐베이터에서 커버 슬립을 제거합니다.

가장 길고 곧은 신경관 6개를 선택한 다음 배양 배지로 프라이밍된 마이크로 피펫 팁을 사용하여 6개의 커버 슬립 각각에 하나의 신경관을 삽입합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 각 신경관이 해당 커버 슬립의 피브로넥틴 코팅 영역 내에 있는지 확인하고 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 밤새 배양합니다. 다음으로, 혈청이 없는 최소 2ml의 배양 배지를 멸균된 15ml 원심분리기 튜브에 넣습니다.

배지의 pH가 조정될 수 있도록 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 밤새 튜브를 배양하는 동안 송아지를 약간 풀어 둡니다. 하룻밤 배양 후, 세 가지 배양 중 적어도 하나의 긴 직선 가장자리가 있는 세 가지 최고의 신경능선 세포 배양을 선택합니다. 첫 번째 챔버를 로드하기 위해 하나를 선택하고 나중에 사용할 수 있도록 다른 하나를 인큐베이터에 반환하십시오.

그런 다음 면봉을 사용하여 하나의 수정된 Sigmund 챔버의 저수지와 다리를 둘러싼 영역에 바셀린의 얇고 균일한 층을 적용합니다. 다음으로 텅스텐 바늘을 사용하여 선택한 신경능선세포 배양이 포함된 커버 슬립에서 신경관을 부드럽게 제거하고 둘러싼 신경능선세포를 피브로넥틴 코트에 부착한 상태로 둡니다. 신경능선 세포 배양의 가장 곧은 경계의 방향을 기억하기 위해 접시에 실험실 마커를 표시합니다.

다음으로, 사전 배양된 배지 몇 방울을 변형된 지그문트 챔버의 브리지에 놓습니다. 그런 다음 가는 집게로 커버 슬립을 집습니다. 커버 슬립의 가장자리를 Kim 물티슈에 대고 오래된 배양 배지의 대부분을 제거한 다음, 즉시 커버 슬립을 변형된 지그문트 챔버에 올려 놓아 촬영할 직선 신경능선 세포 경계가 브리지의 길이를 중심으로 하고 브리지 저장소 경계에 대략 수직이 되도록 합니다.

도립 현미경을 사용하여 직선 신경능선 세포 경계를 저장소에 가장 가까운 다리 쪽으로 이동합니다. 그것은 의심되는 화학 요법을 포함하고 다리 저장소 경계에 수직인 직선 신경 능선 세포 경계를 더 미세하게 정렬합니다. 이제 덮개를 조심스럽지만 단단히 누르고 지그문트 챔버에 있는 바셀린에 밀어 넣어 챔버에 완전히 밀봉되었는지 확인합니다.

그런 다음 커버 슬립의 가장자리를 따라 추가 바셀린을 놓아 밀폐가 잘 되도록 합니다. 신경 능선 세포 경계의 각도를 다시 조정하여 천장 과정 중 움직임을 수정합니다. 다음으로, 약 300마이크로리터의 사전 배양된 배지를 1밀리리터 주사기에 넣습니다.

25 게이지 x 1.5 인치 바늘이 부착되어 있습니다. 가득 찰 때까지 화학 요법을 포함하지 않는 저장소에 배지를 주입합니다. 저장소에 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오.

그런 다음 다음 저장소를 로드하기 전에 충분한 양의 바셀린으로 저장소의 양쪽을 막습니다. 이제 원하는 화학 요법이 포함된 300마이크로리터의 사전 배양 배지를 두 번째 주사기에 로드합니다. 그런 다음 같은 방식으로 매체를 반대쪽 저장소에 주입합니다.

다시 말하지만, 저장소를 바셀린으로 조심스럽게 밀봉하십시오. 적재된 지그문트 챔버를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양한 후 촬영합니다. 그런 다음 약 섭씨 37도에서 배양하는 동안 대조군을 위해 92번째 간격으로 3시간 동안 신경능선 세포 배양의 가장 직선 경계인 이미지를 그림과 같이 다른 두 개의 최상의 신경능선 세포 배양액을 각각 포함하는 지그문트 챔버를 로드합니다.

저수지를 채우고 다리를 프라이밍하기 위해 적절한 제어 처리를 사용합니다. image J manual trackin 플러그인을 사용하여 배양의 직선 경계를 따라 말초 신경 능선 세포의 이동을 추적할 수 있습니다. chemotaxis and migration tool 플러그인을 사용하여 얻은 이동 궤적의 다양한 매개변수를 분석합니다.

길쭉한 몸통 신경능선세포 배양은 신경관의 하룻밤 배양에 의해 준비되었으며, 그 결과 하나 이상의 긴 직선 경계가 있는 신경능선 세포 배양이 실험을 위해 선택되었습니다. 그런 다음 선택된 하나의 배양물의 가장 긴 직선 경계는 교량 저수지 경계에 수직으로 배치되었으므로 미래에 적용된 기울기의 벡터와 평행합니다. 여기에 마이너스 기호로 표시된 의심되는 화학 유인 물질이 들어 있지 않은 저장소가 먼저 적재되고 밀봉되었습니다.

그런 다음 다른 저장소에는 플러스 기호로 표시된 의심되는 화학 유인 물질이 적재되고 이전에 선택된 경계를 따라 밀봉된 말초 신경 능선 세포를 이미지화하고 이미지 J에 대한 수동 추적 플러그인을 사용하여 추적했습니다. 적용된 기울기에 대한 반응으로 수많은 이동 특성을 이 그래프와 같이 얻은 추적 데이터를 기반으로 평가할 수 있습니다. 예를 들어, 화학주성 지수는 x축을 따라 있는 세포 치환을 이동한 총 거리로 나누어 도출할 수 있습니다. 추적된 모든 세포의 매력적인 반응은 여기에 표시된 세포 궤적 플롯에 의해 입증되었습니다.

각 빨간색 트랙은 의심되는 화학 유인 물질이 적재된 저장소로 이동한 세포의 궤적입니다. 이 그림에는 검은색에 비해 빨간색 트랙이 훨씬 더 많습니다. 또 다른 테스트에서는 분자 구배를 유지하는 수정된 지그문트 챔버의 능력이 검증되었습니다.

Alexa Fluor 4 88 IGM conjugate를 왼쪽 저장소에 추가하고 다리를 가로지르는 형광 강도를 다양한 시간에 측정했습니다. 그래디언트가 최소 26시간 동안 유지됨 비디오를 시청한 후에는 변형된 지그문트 챔버 분석을 사용하여 이식된 트렁크 신경능선 세포 배양에서 화학주성 및 기타 이동 거동을 유도하는 분자의 능력을 분석하는 방법을 잘 이해해야 합니다.