수정 Zigmond 회의소 분석을 사용하여 트렁크 신경 크레스트 세포 마이그레이션 분석

이 절차의 전반적인 목적은 분리된 몸통 신경능 세포에서 분자의 화학주성 및 기타 이동 반응 유도 능력을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 약 8~15개 체절 길이의 몸통 수준 신경관을 분리하고, 각각의 신경관을 피브로넥틴이 코팅된 별도의 커버슬립 위에서 하룻밤 동안 배양하여 신경능 세포의 유출을 유도합니다. 그 후, 최적의 신경능 배양물을 선택합니다.

배양액에서 신경관을 제거하고, 배양물이 포함된 커버 슬립을 변형된 zigmund 챔버에 장착하여 배양물의 가장 곧은 경계가 배양액 전체에 가해질 분자 구배(molecular gradient)의 벡터와 평행하도록 배치합니다. 세 번째 단계는 배양액 전체에 분자 구배를 형성한 후, 이전에 선택한 배양물의 곧은 경계를 따라 말초 신경능 세포(peripheral neural crest cells)의 이동을 촬영하는 것입니다. 마지막 단계는 Image J 소프트웨어를 사용하여 선택된 배양물 경계를 따라 위치한 말초 신경능 세포의 이동을 추적하고 분석하는 것입니다.

최종적으로, 획득한 세포 궤적 데이터 분석을 통해 선택한 분자가 세포의 방향성 또는 속도와 같은 다른 이동 특성을 변화시킬 수 있는지 여부를 결정할 수 있습니다. 이 기술이 Boyden chamber assay와 같은 기존 기술보다 갖는 주요 장점은 비용이 매우 저렴하다는 점입니다. 이 방법은 타임랩스 이미징을 사용하여 일차 배양 편평 배양물(primary explan cultures)의 주변부에서 이미 극성화된 세포의 이동을 분석하는 데 활용될 수 있습니다.

닭의 알을 38°C에서 56시간 동안 배양한 후, 인큐베이터에서 알을 꺼내 70% ethanol을 가볍게 분무하고 알을 건조시킵니다. 멸균된 플라스틱 페트리 접시에 Chick ringer solution을 채우고 유리 트레이를 UV 멸균합니다. 5cm 유리 페트리 접시에 dis displays를 채웁니다.

이제 달걀을 깨서 UV 멸균된 유리 트레이에 담습니다. 먼저 곡선 가위로 배아의 혈액섬(blood islands) 주변을 절개하여 각 배아를 난황에서 추출합니다. 그다음 둔두 핀셋(blunt forceps)으로 배아 외배엽 막을 잡아 배아를 들어 올린 후, Ringer 용액이 담긴 준비된 페트리 접시에 옮깁니다.

다음으로, 햄버거 및 해밀턴 단계(hamburger and Hamilton stages) 15에서 17 사이의 배아 약 9개를 선택합니다. 텅스텐 바늘을 사용하여 10번째 체절(somite)보다 앞쪽에 있는 모든 배아 조직을 절단하고, 가장 최근에 형성된 다섯 번째 체절 부근부터 시작하여 모든 척삭 배아 조직을 제거합니다. 그런 다음 배아로부터 약 2 mm 거리까지 배외막(extra embryonic membranes)의 여분 부분을 다듬어 냅니다.

분리된 배아 몸통을 배양 접시에 넣고 37 °C, 5% CO2 조건에서 1시간 15분 동안 배양합니다. 배아 몸통이 배양되는 동안, 배양용 커버 슬립 6개를 준비합니다. 먼저 70% ethanol로 세척한 후 완전히 건조시킵니다.

그 다음 실험실 마커를 사용하여, 나중에 각 커버슬립의 동일한 면에서 피브린 연결 외피(fibrin connecting coat)를 식별할 수 있도록 각 커버슬립 중앙에 지름 약 1cm의 원을 그립니다. 커버슬립의 상단과 하단을 쉽게 구별할 수 있도록 그린 원 바깥쪽에 비대칭적인 단어나 기호를 적습니다. 이제 각 커버슬립을 표시된 면이 바닥을 향하도록 하여 40 x 10mm 크기의 개별 멸균 디시에 넣고, 디시 뚜껑을 연 상태로 살균 UV 램프 아래에 10분 동안 둡니다.

그런 다음, 표기되지 않은 커버슬립 표면의 1cm 원형 영역 안에 fibronectin 60 µL를 도포하여 원 전체 면적이 코팅되도록 합니다. 이를 37 °C 인큐베이터에 30분 동안 보관합니다. 인큐베이션 시간이 지나면 각 커버슬립에서 fibronectin을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.

다음으로, FI nin 코팅 영역에 250 µL의 배양액을 추가합니다. 커버슬립을 덮은 후, 신경관이 분리될 때까지 커버슬립을 다시 배양합니다. 커버슬립이 배양되는 동안, 5 cm 유리 페트리 접시에 L 15 배지를 채웁니다.

이제 배양된 배아 몸통을 준비된 페트리 접시에 모두 옮깁니다. 미세 핀셋과 날카로운 해부침을 사용하여, 해부침으로 신경관과 체절의 경계를 따라 조심스럽게 절개하여 신경관을 분리합니다. 인큐베이터에서 커버 슬립을 제거합니다.

가장 길고 곧은 신경관 6개를 선택한 후, 배양액이 채워진 마이크로 피펫 팁을 사용하여 6개의 커버 슬립에 각각 하나의 신경관을 옮깁니다. 마이크로 피펫을 사용하여 각 신경관이 해당 커버 슬립의 피브로넥틴 코팅 영역 내에 위치하도록 조정한 다음, 37°C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그다음, 멸균된 15 mL 원심분리 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배양액을 최소 2 mL 넣습니다.

배지의 pH가 조절될 수 있도록 튜브를 37°C, 5% carbon dioxide 조건에서 밤새 배양하는 동안 캡을 살짝 푼 상태로 둡니다. 밤샘 배양 후, 세 개의 배양물 중 최소 하나 이상의 긴 직선 가장자리가 형성된 가장 상태가 좋은 신경능 세포 배양물 3개를 선택합니다. 그중 하나를 선택하여 첫 번째 챔버에 로딩하고, 나머지는 나중에 사용하기 위해 인큐베이터로 돌려보냅니다.

그다음 면봉을 사용하여 변형된 sigmund chamber 하나에서 리저버(reservoir) 주변과 브리지(bridge) 부분에 바셀린을 얇고 고르게 도포합니다. 이어서 텅스텐 바늘을 이용해 선택된 신경능 세포 배양이 포함된 커버스립에서 신경관을 조심스럽게 제거하며, 주변의 신경능 세포들은 피브로넥틴 코팅에 부착된 상태로 둡니다. 신경능 세포 배양의 가장 직선적인 경계 방향을 기억할 수 있도록 실험실 마커로 디쉬에 표시합니다.

다음으로, 미리 배양한 배지를 수정된 zigmund chamber의 브리지 위에 몇 방울 떨어뜨립니다. 그런 다음 미세 핀셋으로 커버슬립을 집어 듭니다. 커버슬립의 가장자리를 Kim wipe로 가볍게 닦아 기존 배양 배지를 대부분 제거한 후, 촬영할 신경능 세포의 직선 경계가 브리지 길이에 맞게 중앙에 위치하고 브리지 저장조 경계와 대략 수직이 되도록 커버슬립을 수정된 zigmund chamber 위에 즉시 배치합니다.

도립 현미경을 사용하여 직선 형태의 신경능 세포 경계를 브릿지의 저장소와 가장 가까운 쪽으로 이동시키십시오. 이렇게 하면 추정되는 화학 유인 물질을 가둘 수 있으며, 직선 형태의 신경능 세포 경계를 브릿지 저장소 경계와 수직이 되도록 더 정밀하게 정렬할 수 있습니다. 이제 커버 슬립을 지그문드 챔버에 도포된 바셀린 위로 조심스럽지만 단단하게 눌러, 챔버에 완전히 밀봉되었는지 확인하십시오.

그다음 커버슬립 가장자리를 따라 바셀린을 추가로 도포하여 기밀성을 더욱 확실히 합니다. 밀봉 과정 중 발생했을 수 있는 움직임을 보정하기 위해 신경능 세포 경계의 각도를 다시 조정합니다. 다음으로, 미리 배양한 배지 약 300 µL를 1 mL 주사기에 넣습니다.

25게이지, 1.5인치 부착 바늘을 사용하여 화학유인물질이 포함되지 않은 리저버에 배지를 가득 찰 때까지 주입합니다. 이때 리저버 내에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.

그다음 다음 리저버를 로딩하기 전에 양쪽 리저버를 충분한 양의 바셀린으로 막아줍니다. 이제 원하는 화학 유인 물질이 포함되어 사전 배양된 배지 300 µL를 두 번째 주사기에 로딩합니다. 그런 다음 동일한 방식으로 반대편 리저버에 배지를 주입합니다.

다시 한번 바세린으로 리저버를 조심스럽게 밀봉합니다. 촬영 전, 시료가 로딩된 Sigmund 챔버를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 약 37 °C로 배양하면서 대조군으로 사용할 신경능 세포 배양물의 가장 곧은 경계 영역을 90분 간격으로 3시간 동안 이미지화하고, 앞서 보여준 방식과 동일하게 다른 두 가지 신경능 세포 배양물이 포함된 zigmund 챔버를 로딩합니다.

저장조를 채우고 브릿지를 프라이밍하기 위해 적절한 대조군 처리를 사용합니다. Image J의 manual tracking 플러그인을 사용하여 배양 구역의 직선 경계를 따라 이동하는 말초 신경능 세포의 이동을 추적합니다. chemotaxis and migration tool 플러그인을 사용하여 획득한 이동 궤적의 다양한 파라미터를 분석합니다.

신경관을 하룻밤 동안 배양하여 신장된 몸통 신경능 세포 배양물을 준비하였으며, 결과적으로 최소 하나 이상의 긴 직선 경계를 가진 신경능 세포 배양물을 실험 대상으로 선택하였다. 선택된 배양물 중 가장 긴 직선 경계를 브릿지 저장소 경계와 수직이 되도록, 즉 향후 적용될 구배의 벡터와 평행하게 배치하였다. 추정 화학 유인 물질을 포함하지 않는 저장소(여기서는 마이너스 기호로 표시됨)를 먼저 채운 후 밀봉하였다.

그 다음, 플러스(+) 기호로 표시된 추정 화학 유인 물질을 다른 저장소에 넣고, 이전에 선택한 경계를 따라 밀봉된 주변 신경능 세포를 Image J의 수동 추적 플러그인을 사용하여 이미징하고 추적하였습니다. 이 그래프에 나타난 것처럼, 얻어진 추적 데이터를 기반으로 적용된 구배에 반응하는 수많은 이동 특성을 평가할 수 있습니다. 예를 들어, 세포의 x축 방향 변위를 총 이동 거리로 나누어 화학주성 지수를 도출할 수 있습니다. 여기에 제시된 세포 궤적 도표는 추적된 모든 세포의 유인 반응을 보여줍니다.

각각의 빨간색 궤적은 화학 유인 물질로 추정되는 물질이 들어 있는 저장조를 향해 이동한 세포의 경로입니다. 이 그림에서는 검은색 궤적에 비해 빨간색 궤적의 양이 상당히 더 많습니다. 또 다른 테스트에서는 분자 농도 기울기를 유지하는 변형된 시그먼드 챔버(sigmund chamber)의 능력이 검증되었습니다.

Alexa Fluor 488 IGM 접합체를 왼쪽 저장조에 첨가하고, 브릿지 전반의 형광 강도를 여러 시간대에 걸쳐 측정하였습니다. 농도 구배는 최소 26시간 동안 유지되었습니다. 영상을 시청한 후, 수정된 지그문드 챔버 분석법(zigmund chamber assay)을 사용하여 적출된 몸통 신경능세포 배양물에서 분자의 화학주성 유도 능력 및 기타 이동 행동을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.