셀 기반의 ELISA 분석을 사용하여 HIV-1 삼량 봉투 당 단백질의 구조적 평가

다음 실험의 전반적인 목표는 단클론 항체를 사용하여 RIC HIV one envelope glycoprotein 또는 ENV 확인을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 부착 세포를 transection하여 세포 표면에서 키메라 HIV one E NV 단백질을 발현함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 세포는 항원결정기 노출에 따라 ENV에 결합하는 항 ENV 단일클론 항체로 배양됩니다.

다음으로, 화학발광 분석에 의한 항체 상호작용을 정량화하기 위해 HRP 접합 2차 항체를 추가합니다. 각각에 대해 획득된 상대적인 광 단위를 기반으로 VNV 결합 항체의 상대적 수준을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 사실에 근거한 동행(facts-based tying)과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술이 적은 양의 항체로 수행될 수 있고 높은 처리량으로 실험실의 박사후 연구원이 이 기술을 수행할 것이라는 것입니다.

이 실험에는 인간 골육종 세포가 transfection plate 하루 전에 사용되며, 웰당 4번째 세포에 10배의 2배를 사용합니다. 불투명한 96웰 세포 배양 플레이트에서 발광 판독에 적합합니다. 소 태아 혈청과 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 사용된 델코스 변형 독수리 배지는 다음 날 섭씨 37도와 5%의 이산화탄소에서 밤새 세포를 배양합니다.

형질주입 혼합물을 준비합니다. 먼저 2개의 튜브, 2개의 베이와 2개의 B에서 2개의 베이로 설정합니다. 25 밀리몰 히피가 보충된 5 마이크로리터의 DMEM을 첨가한 다음, 10 나노그램의 문신 및 코팅 플라스미드, 150 나노그램의 키메라 HIV 1 엔벨로프 당단백질 인코딩 플라스미드를 첨가합니다.

TAT 인코딩 플라스미드는 5마이크로리터의 DMM과 450나노그램의 폴리에탈린 또는 PEI에서 2개의 B로 플라스미드를 인코딩하는 TAT 의존성 HIV 1포락 당단백질을 사용하는 경우에만 필요합니다. 시약과 DNA의 양은 동일한 HIV one envelope glycoprotein으로 transfection할 well의 수에 따라 조정해야 합니다. 다음으로 2 개의 B의 내용물을 2 개의 베이에 넣고 10 초 동안 볼텍싱하여 철저히 혼합합니다.

트랜스펙션 믹스를 실온에서 10분 동안 배양합니다. 10분 후, 96웰 플레이트의 웰당 10마이크로리터의 트랜스펙션 혼합물을 섭씨 37도에서 48시간 동안 5%탄소 산화물로 배양합니다. 단클론 항체에 의한 키메라 HIV 1 envelope 당단백질의 인식을 연구하기 위한 Ali SA는 인간 골육종 세포의 형질주입 2일 후에 수행됩니다.

동시에 사용하는 접시당 250ml의 세탁 버퍼를 준비합니다. 세척 버퍼에 125%의 무지방 분유와 5밀리몰의 트리스 pH 8.0을 추가하여 플레이트당 1ml의 차단 버퍼를 준비합니다. 96 well plate에서 세포 배양 배지와 transfection mix를 제거합니다.

웰당 100마이크로리터의 차단 버퍼를 추가하고 20분 동안 배양합니다. 실온에서 상등액을 제거하고 차단 완충액에 적절한 농도로 희석된 웰당 50마이크로리터의 항체를 첨가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

100마이크로리터의 차단 버퍼로 세 번 세척한 다음 세탁 과정을 세 번 반복합니다. 100마이크로리터의 블로킹 버퍼로 3회 세척한 다음 마지막 세척 후 100마이크로리터의 세척 버퍼로 3회 세척합니다. 사테를 제거합니다.

100마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가하고 5분 동안 배양합니다. 실온에서 상등액을 제거하고 차단 완충액에 1-3000으로 희석된 2차 항체 50마이크로리터를 첨가합니다. 40분 후 실온에서 40분 동안 배양합니다.

100마이크로리터의 블로킹 버퍼로 3회 세척한 다음 100마이크로리터의 세척 버퍼로 3회 세척합니다. 데이터 수집을 위해 샘플을 준비하려면 96웰 플레이트에서 상층액을 제거하고 웰당 30마이크로리터의 향상된 화학발광 기질을 추가합니다. 적절한 플레이트 리더에서 웰당 1초 동안 화학발광 신호를 획득합니다.

제조사의 지침에 따르면, 외피 당단백질 또는 ENV에 대한 CD 4 I 에피토프의 노출에 대한 용해성 CD 4 또는 S CD 4의 영향은 CD 4와 ENV의 분석 상호 작용이 보조 수용체 결합 부위와 겹치는 17 B 및 48 D 에피토프를 노출하는 ENV 확인 변화를 유도하지만, 항체 2 G 12를 인식하는 외부 도메인에는 영향을 미치지 않는다. NV 확인에서 점 돌연변이의 영향을 평가하기 위해 CD 4 bound confirmation을 자발적으로 샘플링하는 경향이 감소한 H 66 A와 NV를 CD four bound state에 소인시키는 S3 75 W의 두 가지 ENV 돌연변이가 사용되었습니다. 발현 레벨에 따라 원시 데이터를 정규화하면 H 66 A는 CD 4 I 17 B 인식을 감소시키는 반면 S3 75 W는 17 B 신호를 향상시키고 H 66의 표현형을 복원하기에 충분하다는 것을 알 수 있습니다.

돌연변이 분석 세포 침대는 CD 4 발현자의 증가량으로 형질 주입되었습니다. NV 파란색 막대와 함께 CD 4 I 단클론 항체, A 3, 2 및 C 11에 대한 신호가 증가하여 ENV 당단백질의 내부 도메인에서 불연속 항원결정기를 인식하는 것으로 나타났습니다. GP one 20 ENV 인식은 2개의 G 12 항체에 의해 영향을 받지 않았다.

마지막으로, 원시 데이터는 2개의 G 12로 정규화되었으며, ENV와 상호 작용하는 능력이 감소된 CD 4 돌연변이와 COT가 상호 작용할 때 32 및 C 11 변조가 없다는 것은 증가된 신호가 E NV CD 4 상호 작용에 의존했음을 나타냅니다. 일단 마스터하면 이 기술을 4시간 내에 완료할 수 있습니다.