Cryo - 전자 Tomography 및 자동 하위 tomogram 평균을 사용하여 HIV의 봉투 Glycoproteins의 분자 구조 결정

6000만 명이 넘는 사람들이 에이즈를 일으키는 바이러스인 HIV에 감염되었다. HIV AIDS는 세계적인 보건 위기이며, 집중적인 연구 노력으로 감염된 개인의 생명을 극적으로 앗아갔지만, 진정한 백신은 여전히 찾기 어렵습니다. HIV 백신 연구의 주요 초점은 HIV가 표적 세포에 침투하는 데 사용하는 외피 당단백질입니다.

이 비디오에서는 초저온 전자 단층촬영(cryo-electron tomography)이라는 이미징 기술을 사용하여 이 중요한 단백질의 구조를 얻는 방법을 보여줍니다. 정제된 HIV부터 시작하여 냉동 표본을 준비하는 단계, 이러한 냉동 표본에서 전자 현미경 이미지를 기록하는 단계, 이러한 이미지를 HIV 에이즈 백신 설계에 유용할 수 있는 구조 모델로 변환하는 단계를 보여줍니다. 이 비디오에서 소개하는 것의 독특한 측면은 중고등학생부터 대학생 및 대학원생, 박사 후 연구원 및 선임 과학자에 이르기까지 다양한 연령대의 실험실 구성원이 작업을 시연한다는 것입니다.

초저온 전자 단층촬영에 적합한 유리화 바이러스 샘플의 준비는 구리 그리드로 지지되는 탄소 필름의 작은 구멍을 가로질러 바이러스의 수성 현탁액을 퍼뜨린 다음 바이러스를 빠르게 동결함으로써 수행됩니다. 이 단계의 목표는 거의 네이티브 상태에서 포획된 온전한 바이러스의 냉동 표본을 준비하는 것입니다. 시작하려면 그리드가 글로우 방전 장치 내부에 배치됩니다.

이 장치는 그리드를 이온화 된 가스에 노출시켜 그리드를 청소합니다. 이제 그리드를 사용할 준비가 되었으므로 작은 금 입자와 혼합된 바이러스의 현탁액이 준비됩니다. 이러한 입자는 데이터 수집 및 처리에 필수적입니다.

다음으로, 바이러스 현탁액 한 방울을 갓 플라즈마 세척된 그리드에 놓습니다. 그런 다음 그리드를 로봇에 로드하면 여과지로 닦아 액체의 박막으로 떨어지는 것을 줄입니다. 그런 다음 샘플을 액체 에탄에 담그면 초당 100, 000켈빈을 초과하는 속도로 바이러스를 빠르게 얼립니다.

그런 다음 플런지 동결 그리드는 현미경으로 운반하기 위해 보관 상자로 옮겨집니다. 이것은 원하는 수의 그리드가 동결될 때까지 반복됩니다. 이제 바이러스 샘플 그리드가 준비되었으므로 다음 단계는 이를 현미경에 로드하는 것입니다.

이미징의 경우 수동으로 또는 로봇 보조를 통해 이 작업을 수행할 수 있습니다. 샘플 그리드가 수동으로 로드되면 사용자는 액체 질소에서 샘플을 조작할 수 있는 특수 스테이션에 앉아 샘플을 밀봉하고 배출한 다음 현미경에 부착하는 휴대용 질소 냉각 챔버에 넣습니다. 최신 현미경은 보다 자동화된 샘플 로딩이 가능합니다.

여기 Titan Cryos 현미경에서 사용자는 동결된 샘플을 현미경으로 전달한 다음 현미경에 로드된 샘플 그리드와 함께 로봇으로 로드합니다. 이미징을 시작하기 전에 사용자가 각 그리드를 검사할 수 있습니다. 현미경 매개변수는 관심 기능이 있는 샘플 그리드의 각 영역에 대해 설정됩니다.

이 경우 특징은 HIV 바이러스입니다. 각각의 새로운 영역이 정의되면 현미경 컴퓨터는 영역별 이미징 매개변수를 저장합니다. 사용자가 관심 있는 모든 위치를 정의하면 컴퓨터는 자동으로 각 위치를 다시 방문하여 데이터 세트를 수집합니다.

각 데이터 세트는 전자빔에 대해 샘플 그리드를 기울여 수집되는 동시에 빔이 그리드의 동일한 지점에 초점을 유지하도록 합니다. 전자 현미경을 통한 데이터 수집은 전통적으로 사용자가 현미경 앞에 앉아서 장비와 물리적으로 상호 작용해야 했습니다. 이러한 현미경 상호 작용 스타일은 오바마 대통령이 인텔 공장을 방문하는 동안 여기에 표시됩니다.

최근 현미경 컴퓨터 인터페이스의 발전으로 사용자는 이제 실험실이나 다른 곳의 원격 컴퓨터에서 실시간으로 데이터 수집을 모니터링하고 조정할 수 있습니다. 엔벨로프의 모양을 시각화하기 위해 당단백질 스파이크는 수백 개의 개별 이미지에서 얻은 정보를 평균화하여 신호를 증폭해야 합니다. 이것은 계산 집약적인 프로세스이며, 여기에서 Bio Wolf라는 컴퓨터 클러스터를 사용하여 수행됩니다.

NIH에 위치한 강력한 방법이 개발되어 높은 소음 수준에서 작동할 수 있는 알고리즘을 사용하여 개별 볼륨을 추출하고 정보를 평균화합니다. 이러한 유형의 데이터에 내재된 네이티브 바이러스와 생물학적으로 중요한 분자에 복합적인 바이러스에서 얻은 밀도 맵은 HIV의 구조 생물학에 대한 풍부한 정보 데이터베이스를 제공합니다. 밀도 맵은 데이터가 포락선 당단백질 스파이크를 구성하는 개별 소단위의 X선 결정학 정보와 결합될 때 분자 세부 사항에서 생생하게 나타납니다.

이러한 토모에서 나오는 데이터는 매우 밀집되어 interpret. 3D 어려울 수 엔터테인먼트 산업용 소프트웨어를 사용하여 색상, 질감 및 조명을 추가하여 3D 모델을 더 쉽게 분석할 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 시각화 소프트웨어에는 Mirror, 3D, Studio Max 및 Maya가 포함됩니다.

우리는 봉투의 구조에 대한 분자 모델을 얻는 방법에 대한 단계별 절차를 시연했습니다. 정제된 HIV에서 시작하는 당단백질. 이 방법을 사용하여 바이러스를 결합하고 활용할 수 있는 다양한 분자와 복합체를 이루는 외피 당단백질의 구조를 결정했습니다.

여기에서 우리는 B12라는 항체와 복합체를 이루는 외피 당단백질의 구조에 대한 예를 보여줍니다. 일부 분자는 바이러스와 결합하고 활용할 수 있는 반면 다른 분자는 그렇지 않은 이유를 이해하는 것은 합리적인 백신 설계에 매우 중요합니다. HIV 또는 인플루엔자 및 에볼라와 같은 다른 바이러스로부터 외피 당단백질의 분자 구조를 결정하는 것은 바이러스 진입 및 활용을 이해하는 데 중요합니다.

보시다시피 초저온 전자 단층촬영은 이제 이러한 목표를 달성하기 위한 강력한 도구로 부상하고 있습니다.