의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

이 방법은 감염된 세포 표면을 모방하는 지질 이중층을 생성합니다. 형광 염료로 관심 단백질을 처음 표지하기 위해 1차 인간 CD 4개의 T 세포로 형성된 HIV 바이러스 시냅스를 연구한 다음 지질 이중층을 생성하고 세포가 시냅스를 형성하고 신호 분자의 시각화를 위해 형광 항체로 세포를 고정 및 염색할 수 있도록 합니다. 그런 다음 전체 내부 반사, 형광 또는 잔디 현미경을 사용하여 시냅스 형성 세포 내의 신호 분자 이미지를 획득합니다.

잔디 이미지를 분석하여 바이러스학적 시냅스 구조와 관련된 활성 신호 분자의 국소화를 설명합니다. 이 실험적 접근법은 림프구 특이적 단백질 키나아제 LCK와 같은 세포 단백질이 HIV 바이러스 시냅스에 모집되는지 여부를 나타낼 수 있습니다. 이 방법은 바이러스 시냅스에 관여하는 세포 구성 요소와 같은 HIV 바이러스학 및 면역학의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.

시냅스 형성에서 어떤 역할을 하며 세포에서 세포로의 HIV 전달에 어떤 영향을 미칠 수 있는지. 이 bier 시스템은 시냅스의 말단기 보기를 제공하며 단일 평면에서 높은 특수 해상도로 시냅스를 시각화할 수 있는 이점이 있습니다. 그 결과는 시냅스 구조를 명확하게 묘사하여 bier를 형성하고 flow cell을 조립하는 것은 예술 형식인 kinter입니다.

여기에서는 감염성 바이러스 또는 감염된 세포를 사용하는 연구를 위해 또는 제한된 시약으로 인해 소량을 사용해야 하는 경우 바이오 광학 플로우 셀에서 bilar 준비를 보여줍니다. 일회용 OB 플로우 셀은 동일한 bilar 준비 절차와 함께 사용할 수 있습니다. 마이클 크레이머(Michael Kramer)와 저는 단백질에 태그를 붙이는 절차를 시연할 것입니다.

단백질 결합에 효과적인 LOR 4 88과 같은 엄선된 형광 염료는 현미경 이미징에 충분히 광적으로 안정적이며 현미경 장비에서 사용할 수 있는 레이저의 여기 파장과 일치합니다. 순화하는으로 시작한다 그의 표를 붙인 GP 1 20 DH 12 단백질. 분자량 컷오프가 50킬로달톤인 원심 필터 장치를 사용하여 단백질 완충액을 멸균 PBS로 교환합니다.

다음으로, pH를 확인하고 pH 9.0의 중탄산나트륨을 첨가하여 pH가 약 8.5인 중탄산나트륨의 최종 농도 50밀리몰을 얻습니다. 그런 다음 10배 몰 과잉에서 평균 반응성 LOR 4 88 형광 염료를 추가합니다. 이 혼합물을 어두운 곳에서 45분에서 1시간 동안 배양합니다.

원심 필터 장치로 여분의 염료를 제거하십시오. 컬럼에 새로운 멸균 PBS를 추가하고 유리 염료에서 단백질을 계속 세척합니다. 그런 다음 GP one 20 단백질을 밀리리터당 약 1밀리그램으로 농축합니다.

488나노미터에서 형광 염료의 농도를 측정합니다. 또한 NanoDrop 분광 광도계로 단백질 농도를 측정하십시오. proteins 및 labels 설정 사용.

두 숫자를 나누어 단백질 분자당 형광 강도를 결정합니다. 플라스틱 클램프로 45밀리리터, 황산, 15밀리리터, 30% 과산화수소의 피라냐 용액을 준비합니다. 커버 슬립을 15분 동안 담그십시오.

커버 슬립을 PIKA 정수수가 채워진 비커로 옮기고 각 커버 슬립을 각 면을 1분에 2분 동안 흐르는 물에 씻고 랙에 올려 말리십시오. varona etal 2008에 의해 이전에 설명된 대로 광학 F CS 두 개의 챔버로 조립을 진행합니다. 다음으로 히스 GP one 20을 캡처하여 이중층 표면에 제시 팁을 유리에 건드리지 않습니다.

포좀 혼합물 5방울을 마이크로 수로 슬라이드에 5방울 떨어뜨려 플로우 셀당 5개의 이중층을 준비합니다. 이제 지질 위에 커버 슬립을 놓습니다. 다음으로, 흰색 고정 링을 스테인리스 스틸 클램프 베이스 유닛으로 덮습니다.

전체 장치를 뒤집고 밀봉합니다. 그런 다음 이중층의 위치를 표시하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 양방향 스톱 콕이 있는 튜브를 왼쪽 관류 튜브에 부착합니다.

3방향 스톱 콕에 부착된 튜브에 1%human 혈청 알부민을 heis 완충 식염수에 채우고 설정에 기포가 없는지 확인합니다. 이제 이 튜브를 오른쪽 관류 튜브에 연결하고 양성 반월판을 생성합니다. 플로우 셀을 통해 버퍼를 부드럽게 밀어 이중층을 차단합니다.

300마이크로리터의 100마이크로몰 염화니켈 ENC 카제인이 들어 있는 1밀리리터 주사기를 3방향 스톱 콕에 부착하고 완충액을 부드럽게 밀어 닫습니다. 둘 다 풀리기 전에 자지를 멈춥니다. 주사기는 실온에서 30분 동안 배양합니다.

이제 HIV V 1 표면에서 발견되는 말단 클러스터의 국소 밀도를 모방하기 위해 GP 1 20 / micron으로 표시된 LOR 4 88 태그가 지정된 250개의 쉿 분자를 로드합니다. 실온의 어두운 곳에서 30분 동안 배양하고 5ml의 H-B-S-H-S-A 버퍼로 겹겹이 씻습니다. 플로우 셀(flow cell)을 섭씨 37도로 평형을 이룹니다.

1 밀리리터 주사기를 사용하여 활성화 된 인간 CD 4 개의 양성 T 세포를 섭씨 37 도의 인큐베이터에서 45 분 동안 45 분 동안 1 % 인간 혈청 알부민 용액 배양에 첨가하여 세포가 층별로 지질에 부착 할 수 있도록합니다. 다음으로 세포를 고정하기 위해 2 % 파라 알데히드를 주입 한 다음 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양합니다. 1밀리리터로 세 번 세탁하십시오.

그런 다음 PBS는 5% 염소 혈청이 함유된 카제인이 함유된 PBS 블록으로 1밀리리터 3회 세척한 후 실온에서 0.1% Triton X 100을 25분 동안 주입하여 세포를 침투시킵니다. 실온에서 PBS로 세 번 세척하십시오. 그런 다음 플로우 셀당 1차 항체와 300마이크로리터 버퍼를 20분에서 1시간 동안 추가합니다.

실온에서 PBS를 3회 세척한 후 적절한 형광 표지된 2차 항체를 완충액에 추가합니다. 실험에서 층 샘플에 의한 대조군은 이 시약의 비특이적 신호 수준을 결정하기 위해 2차 항체로만 처리됩니다. 실온에서 20분 동안 배양한 다음 1ml로 3회 세척합니다.

PBS는 내부 전반사(total internal reflection)에 의해 모든 샘플의 이미지를 획득합니다. 형광 현미경 검사. 이미지 분석 애플리케이션 패키지(예: analyze set measurements) 탭의 이미지 J를 사용하여 이미지의 정량 분석을 수행합니다.

area 및 mean gray value(회색 평균 값)에 대한 상자를 선택합니다. 이미지에서 관심 영역(polygon 또는 freehand traced closed shape)을 선택합니다. 그런 다음 소프트웨어가 이 측정의 데이터를 기록할 측정값 분석 탭을 선택합니다.

결과 표에서 측정값을 평균 및 면적에 대한 값으로 설정한 다음 각 세포 트레이스에 대한 하나의 실험 조건에 대한 이미지를 열고 관심 영역과 트레이스를 측정하고 각 실험 조건에 대한 배경 영역도 측정합니다. 측정값을 복사하여 Excel에 붙여넣습니다. 모든 데이터가 수집되면 평균 강도를 임의의 단위로 계산합니다.

평균에서 배경 강도를 뺀 다음 면적을 곱하여 초기 막 근위 신호 분자의 활성화 및 모집을 측정하기 위해 임의의 단위로 단백질의 통합 강도를 얻습니다. VIROLOGICAL synapse human primary CD에서 GP one 20과의 상호 작용의 결과로, 4개의 양성 T 세포가 G 1 20 및 ICAM 1 세포를 지닌 이중층에 도입되었으며, ICAM 1개만 신호전달의 기본 수준을 정의하기 위한 대조군 역할을 했습니다. 세포가 GP one 20 및 ICAM one 을 포함하는 이중층과 상호 작용한 후 one LCK 단백질을 Virological synapse interface에 모집하고 GP one 20으로 col localization했습니다.

총 LCK의 평균 강도는 ICAM 1 단독보다 GP one 20 및 ICAM 1을 모두 포함하는 이중층에서 더 높았습니다. 흥미롭게도 통합 강도 수준은 비슷했습니다. 함께 복용하면 됩니다.

이러한 데이터는 LCK가 중앙 클러스터로 재분포되어 있음을 시사합니다. CD에 GP 1 20에 4개의 긍정적인 T 세포 결합. 여기에서 잔디 현미경으로 검출된 평균 및 통합 인산 LCK 티로신 3,94 강도를 이미지화하고 정량화했습니다.

결과는 GP one 20 결합이 LCK 활성화 루프에서 잔기 티로신 3 94의 인산화를 증가시켰음을 나타냅니다. 대조적으로, GP 1 20 및 ICAM 1을 모두 포함하는 이중층보다 ICAM 1 단독 이중층의 세포 접촉 영역에 더 많은 핀이 존재했습니다. 따라서 핀은 바이러스 시냅스에 모집되지 않았습니다.

결과적으로, 우리는 Finn이 아닌 LCK가 HIV one GP one 20 induced virological synapse의 활성 키나아제라고 결론지었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 특정 단백질이 로드된 바이어를 선호하는 방법, 전반사 현미경을 사용하여 플로우 셀 이미지 세포 bilar 상호 작용에 대한 면역형광 염색을 수행하는 방법, 기본 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 bilar 시스템은 바이러스학적 등록 형성의 역학을 모니터링할 수 있는 라이브 셀 이미징에도 유용합니다.

더욱이, 세포는 GFPs Z 70과 같은 형광 표지된 단백질로 형질 주입될 수 있습니다. 이를 통해 시냅스에 대한 신호 분자의 분포 및 모집 변화를 실시간으로 추적할 수 있습니다.