Name: 의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: 학습하세요 HIV-1 바이러학적 시냅스 형성을 TIRF 현미경으로 시각화하는 방법을. 지질 이중층을 활용하여 감염 세포 표면을 모방하고 신호 분자의 위치를 분석합니다. 이 기법은 HIV 바이러스학 연구에 중요한 도구를 제공합니다.

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이 작품은 NIH 교부금 AI071815 (CEH) 및 로드맵의 Nanomedicine 개발 센터 수상 PN2EY016586 (MLD)에 의해 지원되었다.

<ol><li>Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell-dependent+alterations+in+envelope+components+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions.</a> J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).</li>
<li>Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics.</a> J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+Bond+Dynamics+in+Contacts+between+T+Lymphocytes+and+Glass-supported+Planar+Bilayers+Reconstituted+with+the+Immunoglobulin-related+Adhesion+Molecule+CD58%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58.</a> J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).</li>
<li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li>
<li>Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+host+cell-surface-derived+molecules+by+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1.</a> Aids. 10, 1611-1620 (1996).</li>
<li>Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. E., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cellular+adhesion+molecules+in+HIV+type+1+infection+and+their+impact+on+virus+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Role of cellular adhesion molecules in HIV type 1 infection and their impact on virus neutralization.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 14, Suppl 3. S247-S254 (1998).</li>
<li>Hioe, C. E., Chien, P. C., Lu, C., Springer, T. A., Wang, X. H., Bandres, J., Tuen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LFA-1+expression+on+target+cells+promotes+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">LFA-1 expression on target cells promotes human immunodeficiency virus type 1 infection and transmission.</a> J. Virol. 75, 1077-1082 (2001).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+an+intact+T-cell+actin+and+tubulin+cytoskeleton+for+efficient+assembly+and+spread+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).</li>
<li>McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li>
<li>Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cytoskeleton+in+cell-to-cell+transmission+of+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus.</a> J. Virol. , 682898-682905 (1994).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+virion+ICAM-1+to+human+immunodeficiency+virus+infectivity+and+sensitivity+to+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization.</a> J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li>
<li>Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120-induced+partial+T-cell+receptor+signaling+creates+an+F-actin-depleted+zone+in+the+virological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse.</a> J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).</li>
<li>Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120+induces+a+stop+signal+and+virological+synapse+formation+in+noninfected+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells.</a> J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).</li>
<li>Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+three-dimensional+structure+of+AIDS+virus+envelope+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes.</a> Nature. 441, 847-852 (2006).</li>
</ol>

저자는 이익의 갈등을 선언 없습니다.

이전 연구는 세포 - 세포 켤레축 시스템의 시각 VS을 가지고 있지만 이러한 연구는 시냅스에서 supramolecular 구조를 시각화하는만큼 충분히 높은 해상도의 이미지를 제공하지 않았다. 우리 실험실에서는 바이러스 봉투 gp120과 세포 접착 분자 ICAM-1을 표현 감염된 세포의 표면을 표현하기 위해 유리를 지원 평면 이중층 시스템을 활용. 높은 신호 대 노이즈 비율과 이중층 표면 100-200 nm의 안에 형광 신호를 감지 TIRF 현미경,와 함께, 우리는 VS에서 ICAM-1에서 gp120의 supramolecular 분리를 감지할 수 있었다. VS 15 gp120 - 연락처 영역으로, 퓐 또한, 표준 immunostaining 방법은 이중층 시스템에 적용할 수 있으며 Lck 활성의 구체적인 채용을 감지하고 계량 여기에 사용되었지만, 아닙니다. 따라서 평면 이중층은 TIRF 마이크로에 의한 2 차원 평면에서의 시냅스 인터페이스의 고해상도 이미징을위한 실험 시스템을 제공합니다scopy 물론 넓은 필드 또는 공촛점 조명 방법 등. 그러나 시스템은 또한 밖에서 비행기 벤딩, 리간드 이동성을 조정으로 한계를 가지고 있으며, 생물 학적 세포막의 변동은 평면 bilayers으로 복제되지 않습니다. 또한 이것은 인 - 체외 시스템이므로 이러한 분자 이동성과 휴대 운동성을 조절 감염된 세포와 cytoskeleton 기계에 존재 것입 다른 멤브레인 분자의 부족 등 다른 제한 사항을 가지고 있습니다. 또, trimers 대 gp120의 단량체로서 분자의 역학 및 배포는 이중층에 생리학적으로 표시되지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고보고 알 수있는 아니다 그것은 심지어 이러한 제한 사항으로,이 시스템은 바이러스 셀 또는 셀 - 세포 상호 작용을 공부에 대해 여전히 매우 유용하며, 이러한 방법 supramolecular 조직을 감지하는 고해상도 이미지를 추구하고 연구자에게 유용한 가이드가 될 수있다 종래의 셀 - 셀 켤레축 시스템 인치

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 그의 태그가 HIV gp120 </td><td> 닥터 조의 선물 </td><td></td><td> DH12 </td></tr><tr><td> 그의 태그가 HIV gp120 </td><td> 면역 기술 </td><td></td><td> 각종 X4 또는 R5 열대 </td></tr><tr><td> HSA </td><td> 윌리엄스 의료 회사 </td><td> 521,302 </td><td> 인간 혈청 알부민 25% </td></tr><tr><td> Amicon 울트라 원심 필터 </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30K </td></tr><tr><td> 토끼 mAb Lck </td><td> 세포 시그널링 </td><td> 2787 </td><td></td></tr><tr><td> 래빗 PAB P-Lck </td><td> 산타 크루즈 생명 공학 주식 회사 </td><td> SC-101728 </td><td> 티르 394 </td></tr><tr><td> 퓐 래빗 mAb </td><td> Millipore </td><td> 04-353 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 형석 568 2 °; AB </td><td> 분자 프로브 </td><td> A11034 </td><td> 염소 안티 - 토끼 IgG (H + L) </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 488 </td><td> 분자 프로브 </td><td> -20000 </td><td> 카르복실산 에스테르 succinimidyl </td></tr><tr><td> FCS2 상공 회의소 </td><td> Bioptechs </td><td> 060319-2-03 </td><td></td></tr><tr><td> 슬라이드 Microaqueduct </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> 30mm 라운드 W / 구멍 </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-08-750 </td><td> 0.75mm 두께 </td></tr><tr><td> 직사각형 데려간 </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-1422-250 </td><td> 14x24 0.25mm 두께 </td></tr><tr><td> Tygon 튜빙 </td><td> Bioptechs </td><td> 20202275 </td><td> 16분의 1 &quot;(25피트) </td></tr><tr><td> 세 방향 꼭지 </td><td> BioRad </td><td> 7,328,103 </td><td></td></tr><tr><td> 양방향 꼭지 </td><td> BioRad </td><td> 7,328,102 </td><td></td></tr><tr><td> 끈적 슬라이드 나 0.2 Luer </td><td> Ibidi </td><td> 80168 </td><td></td></tr><tr><td> 안경을 커버 </td><td> Ibidi </td><td> 10,812 </td><td></td></tr><tr><td> 1ml 주사기 </td><td> BD </td><td> 309,659 </td><td></td></tr><tr><td> 개들은-NTA </td><td> 아벤티 폴라 Lipids </td><td> 790404C </td><td></td></tr><tr><td> DOPC </td><td> 아벤티 폴라 Lipids </td><td> 850375C </td><td></td></tr><tr><td> 유리 coverslip </td><td> Bioptechs </td><td> 40-1313-0319 </td><td> 40mm </td></tr><tr><td> TIRF 현미경 </td><td> 니콘 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> 건강의 국립 연구소 </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~V</a> </td></tr></tbody></table>

의 이미징 hiv-1 봉투 유발 virological 시냅스와 합성 지질 bilayers에 신호

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

인간 면역 결핍 바이러스 1 형 (HIV-1) 감염 셀 전송 2,10,11으로 세포를 통해 가장 효율적으로 발생합니다. CD4 사이의 셀 전송 + T 세포이 세포는 CD4와 함께 감염된 세포에서 HIV-1 봉투 gp120의 참여에 따라 형성된 F-actin에 의존 세포 - 세포 접합니다 virological 시냅스 (VS)의 형성과 관련된 대상 세포 8 케모카인 수용체 (CKR) CCR5 또는 CXCR4. 그들이 바이러스에 감염된 기증자의 세포 표면에 존재로서 gp120에 추가 및 그 수용체, 특히 다른 멤브레인 단백질, 유착 분자 LFA-1과 그 리간드에서 ICAM 제품군은, VS 형성 및 바이러스 전달에 중요한 역할을 및 대상 세포뿐만 아니라 HIV-1 virions 1,4,5,6,7,13의 봉투에. VS 형성은 또한 수용체의 gp120-포용의 결과로 transduced되는 세포내 신호 전달 이벤트를 동반한다. 실제로, 우리는 최근 그 CD4를 보여주했습니다 &lt;&gt; gp120과 + T 세포의 상호 작용은 TCR의 Lck 포함한 signalosome, CD3ζ, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk 및 PLCγ 15과 관련된 신호 전달 분자의 모집 및 인산화을 유도 저녁을 먹다. 이 문서에서는 supramolecular 배치와 VS 형성 동안 이야기되었던 멤브레인 - 근위 신호 이벤트를 시각화하는 방법을 제시한다. 우리는 바이러스 봉투 gp120과 세포 접착 분자 ICAM-1을 간직한 HIV에 감염된 세포의 표면을 표현하기 위해 reductionist 모델과 같은 유리를 지원 평면 이중 레이어 시스템을 활용합니다. 프로토콜은 상호 작용하는 세포에서 세포 내 신호 전달 분자를 감​​지하는 HIV-1 gp120 유발 VS 조립 및 플로우 셀에 I) 이중 레이어 준비와 어셈블리를 포함한 신호 활성화 이벤트, II) 세포 immunofluorescence 염색법의 주입 모니터링을위한 일반 절차를 설명 TIRF 현미경에 의한 HIV-1 이중 레이어의 gp120과 ICAM-1, 3) 이미지 수집과차 IV) 데이터 분석. 그것이 하위 도메인에 모집 특정 신호 분자와 함께 VS의 개별 분자 구성 요소의 고​​유한 클러스터의 검출을 허용으로이 시스템은 종래의 셀 - 셀 시스템을 구현할 그 외의 VS 인터페이스의 고해상도 이미지를 생성합니다.

이 문서는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경에 의한 유리를 지원 평면 bilayers에서 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성을 시각화하는 방법을 설명합니다. 메소드는 또한 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성시 발생하는 신호 전달 분자의 활성화 및 재배포를 탐지하기 immunofluorescence 염색법과 결합 할 수 있습니다.

의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1) 감염은 세포 간 전송을 통해 가장 효율적으로 발생합니다2,10,11. 이러한 세포 간 전송은 ...

이 방법은 감염된 세포 표면을 모사하는 지질 이중층을 생성합니다. 일차 인간 CD4 T 세포와 형성된 HIV 바이러스 시냅스(Virological synapse)를 연구하기 위해서는, 먼저 관심 단백질을 형광 염료로 표지한 다음, 지질 이중층을 생성하여 세포가 시냅스를 형성하도록 합니다. 이후 세포를 고정하고 형광 항체로 염색하여 신호 전달 분자를 시각화합니다. 그런 다음 전반사 형광 현미경(TIRF microscopy)을 사용하여 시냅스를 형성하는 세포 내의 신호 전달 분자 이미지를 획득합니다.터프(turf) 이미지를 분석하여 바이러스학적 시냅스 구조와 관련하여 활성 신호 분자의 국소화 위치를 설정하십시오. 이러한 실험적 접근 방식은 림프구 특이 단백질 키나제 LCK와 같은 세포 단백질이 HIV 바이러스학적 시냅스로 모집되는지 여부를 나타낼 수 있습니다. 이 방법은 바이러스학적 시냅스에 어떤 세포 구성 요소가 관여하는지와 같이 HIV 바이러스학 및 면역학의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.시냅스 형성에 있어 어떤 역할을 하며, 이것이 세포 간의 HIV 전이에 어떻게 영향을 미치는지에 대해 알아봅니다. 이 bier 시스템은 단일 평면에서 고해상도로 시냅스를 시각화할 수 있다는 장점이 있으며, 시냅스의 단면 뷰를 제공합니다. 결과는 시냅스 구조를 명확하게 묘사하며, bier를 형성하고 플로우 셀을 조립하는 과정은 매우 정교한 기술과 예술적 감각을 필요로 합니다.본 영상에서는 감염성 바이러스 또는 감염된 세포를 이용한 연구, 또는 시약의 양이 제한되어 적은 부피를 사용해야 하는 경우를 위한 바이오 광학 유동 셀(bio optic flow cell) 상의 bilar 준비 과정을 시연합니다. 일회용 OB 유동 셀 또한 동일한 bilar 준비 절차로 사용할 수 있습니다. Michael Kramer와 제가 단백질 태깅(tagging) 절차를 시연하겠습니다.단백질 결합에 효과적이고, 현미경 이미징에 충분한 광안정성을 가지며, 현미경 장비에서 사용 가능한 레이저의 여기 파장과 일치하는 LOR 4 88과 같은 형광 염료를 선택하십시오. 정제된 his-tagged GP one 20 DH 12 단백질로 시작합니다. 분자량 컷오프(molecular weight cutoff)가 50 kilodaltons인 원심분리 필터 유닛을 사용하여 단백질 버퍼를 멸균된 PBS로 교체하십시오.다음으로 pH를 확인하고, pH 9.0의 탄산수소나트륨을 첨가하여 최종 농도가 50 millimolar이며 pH가 약 8.5가 되도록 조절합니다. 그 후 10배 몰 과량의 mean reactive LOR 4 88 형광 염료를 첨가합니다. 이 혼합물을 암소에서 45분에서 1시간 동안 배양합니다.원심분리 필터 장치를 사용하여 과량의 염료를 제거합니다. 컬럼에 신선한 멸균 PBS를 첨가하고 유리 염료로부터 단백질을 계속 세척합니다. 그런 다음 GP one 20 단백질을 약 1 mg/mL로 농축합니다.488 nm에서 형광 염료의 농도를 측정합니다. 또한 NanoDrop 분광광도계의 단백질 및 라벨(proteins and labels) 설정을 사용하여 단백질 농도를 결정합니다.두 수치를 나누어 단백질 분자당 형광 강도를 결정합니다. 플라스틱 클램프를 사용하여 황산 45 mL와 30% 과산화수소 15 mL로 구성된 피라냐 용액을 준비합니다. 커버슬립을 15분 동안 담급니다.커버 슬립을 PIKA 정제수가 담긴 비커로 옮깁니다. 각 커버 슬립을 흐르는 물에서 양면을 각각 1분씩, 총 2분 동안 세척한 후 랙에 올려 건조시킵니다. Varona 외(2008)가 이전에 기술한 방식에 따라 optics F CS two 챔버를 조립합니다. 다음으로, 팁 끝이 유리에 닿지 않도록 주의하며 bilayer 표면의 hiss GP one 20을 캡처하여 제시합니다.플로우 셀당 5개의 이중층을 형성하기 위해, 리포좀 혼합물 1 µL 방울 5개를 마이크로 아쿠아덕트 슬라이드 위에 피펫팅합니다. 그다음, 지질 위에 커버슬립을 덮습니다. 이어서, 스테인리스 스틸 클램프 베이스 유닛으로 흰색 고정 링을 덮어 고정합니다.장치 전체를 뒤집어 밀봉합니다. 그런 다음 이층막의 위치를 표시하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 2방향 스톱콕(two-way stop cock)이 연결된 튜브를 왼쪽 관류 튜브에 연결합니다.3방향 스톱콕(three-way stop cock)에 연결된 튜빙을 heis buffered saline 내의 1% human serum albumin으로 채우고, 설정에 기포가 없는지 확인하십시오. 이제 이 튜빙을 오른쪽 관류 튜브에 연결하고 양의 메니스커스(positive meniscus)를 생성하십시오. 버퍼를 유량 셀(flow cell)을 통해 부드럽게 밀어 넣어 이중층(bilayer)을 차단하십시오.100 µM 염화 니켈 ENC 카제인을 300 µL 포함하는 1 mL 주사기를 3방향 스톱콕(three-way stop cock)에 연결하고, 분리하기 전에 두 스톱콕을 모두 닫은 상태에서 버퍼를 천천히 밀어 넣습니다. 해당 주사기를 실온에서 30분 동안 배양합니다.이제 HIV V1 표면에서 발견되는 엔드 클러스터(end clusters)의 국소 밀도를 모방하기 위해, 마이크론당 20개로 표지된 his-tagged LOR 4 88 labeled GP1 분자 250개를 로딩합니다. 상온의 암소에서 30분 동안 배양한 후, 5 mL의 HBS-HSA 완충액으로 층별 세척을 수행합니다. 유동 셀(flow cell)을 37 °C로 평형화합니다.1 mL 시린지를 사용하여, 1% Human serum albumin 용액 400 µL에 포함된 활성화된 인간 CD4 양성 T-세포를 첨가하고, 세포가 지질 이중층에 부착될 수 있도록 37 °C 인큐베이터에서 45분 동안 배양합니다. 다음으로 세포를 고정하기 위해 2% paraformaldehyde를 주입한 후, 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 1 mL로 3회 세척합니다.PBS로 3회(각 1 mL) 세척한 후, 실온에서 0.1% Triton X 100을 주입하여 5분 동안 세포를 투과성 있게 만듭니다. 5% goat serum가 포함된 casein으로 25분 동안 블로킹합니다. 실온에서 PBS로 3회 세척합니다. 그 후, 1차 항체와 함께 플로우 셀당 300 µL의 버퍼를 넣고 20분에서 1시간 동안 반응시킵니다.PBS로 3회 세척한 후, 실온에서 버퍼에 희석된 적절한 형광 표지 2차 항체를 첨가합니다. 실험에서 대조군 샘플은 이 시약으로 인한 비특이적 신호 수준을 결정하기 위해 2차 항체만 처리합니다. 실온에서 20분 동안 배양한 다음, 1mL로 3회 세척합니다.전반사 형광 현미경을 사용하여 모든 샘플의 이미지를 획득합니다. Image J의 analyze set measurements 탭과 같은 이미지 분석 애플리케이션 패키지를 사용하여 이미지의 정량 분석을 수행합니다.면적(area)과 평균 회색조 값(mean gray value) 확인란을 선택하십시오. 이미지에서 다각형 또는 프리핸드로 그려진 폐곡선 형태의 관심 영역(region of interest)을 선택하십시오. 그런 다음 소프트웨어가 이 측정 데이터를 기록하도록 분석 측정(analyze measure) 탭을 선택하십시오.결과 테이블에서 측정 항목을 평균(mean) 및 면적(area)으로 설정한 다음, 각 세포 추적(cell trace)에 대해 하나의 실험 조건에 해당하는 이미지를 열어 관심 영역(ROI)과 추적 영역을 측정하고, 각 실험 조건에 대해 배경 영역도 측정하십시오. 측정값을 복사하여 엑셀에 붙여넣으십시오. 모든 데이터 수집이 완료되면 임의 단위(arbitrary units)로 평균 강도를 계산하십시오.평균값에서 배경 강도를 뺀 후, 면적을 곱하여 임의 단위(arbitrary units)로 단백질의 적분 강도를 구함으로써 초기 막 근접 신호 전달 분자의 활성화 및 모집을 측정합니다. GP120과의 상호작용 결과, 인간 일차 CD4 양성 T 세포를 GP120과 ICAM-1이 포함된 이중층 위에 도입하였으며, ICAM-1만 포함된 이중층에 도입된 세포를 신호 전달의 기저 수준을 정의하기 위한 대조군으로 사용하였습니다. 세포가 GP120과 ICAM-1을 포함하는 이중층과 상호작용한 후, LCK 단백질이 바이러스 시냅스(Virological synapse) 인터페이스로 모집되어 GP120과 공국소화되었습니다.전체 LCK의 평균 강도는 ICAM 1만 포함된 이중층보다 GP120과 ICAM 1이 모두 포함된 이중층에서 더 높았습니다. 흥미롭게도, 적분 강도 수준은 비슷했습니다. 이를 종합하면 다음과 같습니다.이러한 데이터는 LCK가 중앙 클러스터로 재배치됨을 시사합니다. CD4 양성 T 세포가 GP120에 결합함에 따라, TIRF 현미경으로 검출된 phospho LCK tyrosine 394의 평균 및 통합 강도를 이미지화하고 정량화하였습니다.결과에 따르면 GP120 결합은 LCK 활성 루프의 tyrosine 394 잔기 인산화를 증가시켰습니다. 반면, GP120과 ICAM1이 모두 포함된 이중층보다 ICAM1 단독 이중층 위의 세포 접촉 부위에서 더 많은 fin이 관찰되었습니다. 따라서 Finn은 바이러스 시냅스로 보충되지 않았습니다.결과적으로, HIV-1 gp120으로 유도된 바이러스 시냅스에서 활성 키나아제는 Fyn이 아니라 LCK라는 결론을 내릴 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 특정 단백질이 로딩된 빌라(bilayer)를 준비하고, 플로우 셀에서 면역형광 염색을 수행하며, 전반사 조명 현미경(total internal reflection microscopy)을 사용하여 세포-빌라 상호작용을 이미징하고 기본적인 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 빌라 시스템은 바이러스 시냅스 형성의 역학을 모니터링할 수 있는 살아있는 세포 이미징에도 유용합니다.또한, GFP와 같이 형광 표지된 단백질을 세포에 형질 전환할 수 있습니다. 이를 통해 시냅스로의 신호 전달 분자 분포 및 모집의 변화를 실시간으로 추적할 수 있습니다.

imaging-hiv-1-envelope-induced-virological-synapse-signaling-on

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

지원되는 평면 bilayers는 면역 버렸네에서 분자 상호 작용을 모델로 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 지질 bilyer의 위쪽 전단지에 버렸네 형성을 조절하고 TIRF 현미경을 사용하여 버렸네 형성을 시각화하는 것으로 알려진 세포 부착 단백질을 고정하는 방법을 보여줍니다.

면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

프로토콜은 cryo - 전자 tomography와 3 차원 영상 처리를 사용하여 막 단백질의 구조를 결정하기 위해 높은 처리량 접근 방식을 설명합니다. 이것은 시편 준비의 세부 사항, 데이터 수집, 데이터 처리 및 해석을 포함하고, 접근, HIV - 1 봉투 당단백질에 대한 대표적인 대상의 생산 마칩니다. 이러한 계산 절차는 원격 작업 및 데이터 처리 및 구조 분석에 기여하는 연구자와 학생을 수있는 방식으로 설계되었습니다.

Cryo - 전자 Tomography 및 자동 하위 tomogram 평균을 사용하여 HIV의 봉투 Glycoproteins의 분자 구조 결정

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

이 비디오는 지원되는 지질 이중층(SLB)에서 자연살해(NK) 세포의 면역학적 시냅스 형성을 시각화하는 기술을 보여줍니다. SLB는 먼저 형광단 표지된 NK 세포 활성화 수용체 리간드로 표지된 다음 NK 세포로 배양합니다. 그 후, 세포는 중합된 액틴 및 퍼포린 양성 용해 과립을 위해 염색됩니다. 이 접근 방식을 사용하면 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경을 사용하여 시냅스 형성을 시각화할 수 있습니다.

지원되는 지질 이중층에서 NK 세포 면역학적 시냅스 형성의 초고해상도 이미징

이 비디오는 일차 인간 T 세포와 지지된 지질 이중층(SLB) 사이의 면역 시냅스 형성을 연구하는 시험관 내 기술을 보여줍니다. T 세포 표면 단백질은 SLB에 고정된 각 리간드와 상호 작용하여 면역 시냅스를 형성한 다음, lytic granule이 시냅스를 향해 이동하며, 이는 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

지원되는 평면 지질 이중층과의 T 세포 상호 작용을 연구하기 위한 In Vitro 기술

이 비디오는 T 림프구와 형광 항원을 운반하는 상피 세포 간의 상호 작용을 조사하여 면역학적 시냅스 토폴로지의 라이브 셀 이미징을 보여줍니다. 형광 현미경 검사는 내피 세포에서 적색 세포질 변위와 노란색 막 고리를 보여주어 면역학적 시냅스의 형성을 나타냅니다.

Live-Cell Imaging을 통한 면역학적 Synapse 토폴로지 평가

항체 중화를 평가하고 효과적인 백신 면역원의 설계를 안내하려면 바이러스 표면 항원 구조를 이해하는 것이 필요합니다. 여기에서는 특정 anti-Env 항체에 의해 transfection된 세포의 표면에서 발현되는 trimeric HIV-1 Env의 인식에 대한 연구를 가능하게 하는 세포 기반 ELISA 분석에 대해 설명합니다.

셀 기반의 ELISA 분석을 사용하여 HIV-1 삼량 봉투 당 단백질의 구조적 평가

여기에서는 면역학적 시냅스를 형성하는 유리 지지 지질 이중층 기술과 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경의 초고해상도 이미징 기술의 조합을 설명합니다. 이 프로토콜의 목표는 이러한 두 가지 기술을 성공적으로 수행하는 데 필요한 지침을 사용자에게 제공하는 것입니다.

유리 - 지원 평면 지질 이중층에 자연 살해 세포 면역 시냅스의 슈퍼 해상도 이미징

적응 면역은 T 세포와 항원 제시 세포 사이에 형성된 역동적인 '면역학적 시냅스'에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜은 연구가 부족한 생리학적 APC이자 새로운 유형의 '평면 세포 APC 모델'로서 내피 세포를 조사하는 방법을 설명합니다.

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

여기서는 밀 배아 기반 체외 번역 시스템에서 합성된 YFP 태그 Gag와 전기 형성 기술로 준비된 GUV를 사용하여 HIV-1 Gag와 지질막 간의 상호 작용을 시각적으로 분석하는 시험관 외 막 결합 분석을 설명합니다.

거대한 단일 층 소포 (GUV) 막 바인딩 HIV-1 개그의 시각화

이러한 프로토콜은 면역학적 시냅스 형성및 면역학적 시냅스를 향한 후속 편광 분비 트래픽을 모두 이미지화한다. 세포 접합체는 초항원 펄스 라지 세포 (항원 제시 세포역할을 함)와 Jurkat 클론 (이펙터 도우미 T 림프구로 작용)사이에 형성되었습니다.

인간 면역학적 시냅스 이미징

학습하세요 HIV-1 바이러학적 시냅스 형성을 TIRF 현미경으로 시각화하는 방법을. 지질 이중층을 활용하여 감염 세포 표면을 모방하고 신호 분자의 위치를 분석합니다. 이 기법은 HIV 바이러스학 연구에 중요한 도구를 제공합니다.

의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

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