높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

이 절차의 전반적인 목표는 고처리량 염기서열분석을 위해 microRNA를 편향되지 않게 준비하는 것입니다. 이는 먼저 마이크로 RNA의 3 프라임 말단에 대한 결찰에 적합한 DNA 올리고뉴클레오티드를 준비하거나 구매함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 3 프라임 DNA 올리고뉴클레오티드를 마이크로 RNA의 3 프라임 말단에 접합하는 것입니다.

다음으로, 결찰 산물을 겔 정제하고 5 프라임 RNA 올리고뉴클레오티드 링커를 마이크로 RNA의 5 프라임 말단에 결찰합니다. 마지막 단계는 하이브리드 분자를 CDNA로 전환한 다음 중합효소 연쇄 반응에 의해 CDNA를 증폭하는 것입니다. 궁극적으로, 마이크로 RNA 클로닝과 고처리량 염기서열분석은 개별 뉴클레오티드 분해능에서 정량적 방식으로 microRNA의 전사체 폭넓은 프로파일을 보여주는 데 사용됩니다.

마이크로 염기서열분석 마이크로레이 qPCR 블롯과 같은 기존 기술에 비해 당사 기술의 주요 장점은 당사의 기술이 단일 뉴클레오티드 분해능에서 전사체 전체 실험실 규모에서 실제 마이크로레이 수준을 더 잘 반영한다는 것입니다. 이 방법은 microRNA 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 HC 클립 및 RNA-Seq와 같은 다른 고처리량 염기서열분석 기술에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 위한 DNA 올리고뉴클레오티드는 3개의 프라임 결찰 반응을 위해 설계되었으며, 5개의 프라임 인산기, 5개의 프라임 말단에 무작위 디뉴클레오티드, 3개의 프라임 시토신이 있어야 하며, DNA 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제가 없는 물에서 100마이크로몰로 희석해야 합니다.

이들 시약제를 3 프라임 링커 올리고뉴클레오티드 200 피코 몰, 5 프라임 DNA 환기 완충액 4 마이크로리터, TP 4 마이크로리터, M-T-H-R-N-A, 리가제 및 뉴클레아제 자유 정제수 4 마이크로리터를 최종 부피 40 마이크로리터로 조합하여 환기 반응을 조립한다. 섭씨 65도에서 1시간 동안 반응을 배양합니다. 섭씨 85도까지 5분 동안 가열하여 반응을 종료합니다.

2.5 부피의 100 % 에탄올과 1/3 부피의 10 몰 암모늄 아세테이트를 첨가하여 TED 링커를 침전시킵니다. 잔류 TP를 제거하고 향후 반응에서 예상치 못한 결찰을 방지하기 위해 알코올, 염 및 올리고뉴클레오티드 용액을 섭씨 4도의 마이크로 원심분리기에서 20분 동안 최고 속도로 회전하여 균질화하도록 혼합합니다. 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 공기 건조시킨 후 펠릿을 적절한 양의 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁시켜 50-100마이크로몰의 환기된 올리고뉴클레오티드를 생성합니다.

18% 폴리 아크릴아미드 겔에서 전기영동으로 올리고뉴클레오티드의 환기를 확인합니다. 실온에서 하나의 XTBE 실행 버퍼를 사용하여 24볼트 센티미터의 젤 너비에서 30분 동안 젤을 사전 실행합니다. 30분이 지나면 흐르는 버퍼로 우물을 세척합니다.

이 절차를 위한 DNA 올리고뉴클레오티드는 3개의 프라임 결찰 반응을 위해 설계되었으며 5-프라임 인산기, 5-프라임 말단의 무작위 디뉴클레오티드 및 3-프라임 옥시토신을 가져야 합니다. DNA 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제가 없는 물에서 100마이크로몰로 희석합니다. 브로모 페놀 블루가 젤 포스트 바닥까지 3/4이 될 때까지 센티미터당 24볼트에서 젤을 실행합니다.

XTBE 1개에 1개의 사이버 골드 용액으로 겔을 염색하고 UV 투광기 상자에 시각화합니다. 3 프라임 결찰 반응에 대해 M-T-H-R-N-A 리가제에 의해 환기된 DNA 올리고뉴클레오티드의 크기에서 단일 뉴클레오티드 이동이 있어야 합니다. 다음 구성 요소를 이 순서로 얼음 위에 조립하십시오.

50%PEG 8, 000 10 XRNA 리가제 완충액의 0.5 마이크로리터의 1 마이크로리터. 1 마이크로 리터의 환기 3 프라임 링커, 0.5 마이크로 리터의 RNA 억제제, 0.5 마이크로 리터의 총 RNA 0.5 마이크로 리터, 0.5 마이크로 리터의 T, 4 개의 RNA 리가제 2 및 뉴클레아제 자유 물을 5 마이크로 리터의 최종 부피로 만든다. 완전히 혼합된 후 피펫팅으로 반응을 혼합합니다.

가열된 뚜껑이 있는 열 순환기에 반응을 놓습니다. 블록을 섭씨 16도로 설정하고 4시간 동안 배양합니다. 반응은 결찰 효율의 손실 없이 20 마이크로리터의 최종 부피까지 확장될 수 있습니다.

3 프라임 ligation에 따라, 2 개의 XRNA 로딩 버퍼 열을 5 분 동안 섭씨 70도까지 가열하고 얼음에서 식히는 동일한 부피로 반응을 혼합합니다. 다음 젤. 15%poly 아크릴아미드 젤에 표본을 순화하십시오.

젤 너비 24볼트에서 최소 30분 동안 젤을 미리 실행합니다. 전원 공급 장치를 끄고 흐르는 버퍼로 우물을 세척하십시오. 샘플을 로드하고 브로모 페놀이 분출된 것이 겔에서 막 나올 때까지 사전 실행과 동일한 전압으로 겔을 실행합니다.

원하는 제품은 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동이 완료되면 크실렌 시안(xylene cyan)에 가깝게 이동합니다. 런닝 버퍼 1개와 사이버 골드 1개와 록이 있는 깨끗한 트레이에 젤을 15분 동안 놓습니다. 염색 접시에서 젤을 제거하고 깨끗한 플라스틱 랩으로 덮인 UV 투광기 상자에 시각화합니다.

결찰 산물은 길이가 약 45개의 뉴클레오티드여야 합니다. 이 결찰 산물은 일반적으로 보이지 않기 때문에 결찰 산물이 포함된 영역인 깨끗한 면도날 절제를 사용하여 인접 레인에 양성 대조군 합성 RNA 샘플을 포함하는 것이 중요합니다. 합성 RNA 샘플의 위치와 크기 표준에 따라 안내됩니다.

소비세 젤 조각을 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 30 게이지 바늘로 0.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브의 바닥을 뚫고 피어싱 튜브를 두 번째 깨끗한 낮은 유지, 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브 원심 분리기에 약 15, 000 번으로 5 분 동안 놓습니다. G. 전체 젤 슬라이스가 내부 튜브의 구멍을 통해 이동했는지 육안으로 확인합니다.

필요한 경우 깨끗한 피펫 팁을 사용하여 일부 젤 조각을 구멍에 더 가깝게 밀어 넣습니다. 빈 0.5ml 튜브를 버리고 아크릴아마이드 슬러리에 400마이크로리터의 고염 컬럼 버퍼를 추가합니다. 다음 날 밤새 섭씨 4도에서 튜브를 흔듭니다.

넓은 구멍 피펫 끝 분리기를 사용하여 0.22 미크론 셀룰로오스 아세테이트 스핀 란에 대략 15, 000 시간에 실내 온도에 3 분 동안 슬러리를 옮깁니다. 아크릴아미드 젤 모체에서 모든 액체를 멀리 모으기 위하여 G. 액체를 1.5밀리리터 글리코겐 용액 1마이크로리터가 들어 있는 깨끗하고 낮은 잔류 20밀리리터 튜브로 옮깁니다.

동일한 부피의 이소프로판올과 10분의 1 부피의 아세트산나트륨을 추가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 용액을 혼합합니다. 영하 80도의 냉동고에서 20분 동안 침전시킵니다. 섭씨 4도에서 20분 동안 최고 속도로 원심분리기를 사용합니다.

핵산을 펠렛화하려면 스내트를 제거하고 70% 에탄올 공기로 세척하십시오. 펠릿을 실온에서 10분 동안 건조시키고 5 프라임 결찰 단계로 바로 진행합니다. 이 절차를 시작하기 위해, 앞서 펠릿화된 핵산에 다음 성분을 추가하고, 2마이크로리터의 PEG 8, 000 0.5마이크로리터의 RNA 리가제 완충액, 0.5마이크로리터의 TP 0.5마이크로리터의 링커, RNA 올리고뉴클레오티드 및 물을 4마이크로리터의 최종 부피에 추가합니다.

펠릿이 완전히 다시 용해되었는지 확인하기 위해 최대 5분 동안 위아래로 반복적으로 피펫팅하여 이 샘플을 혼합합니다. 펠릿이 용액에 들어가면 위아래로 피펫팅하여 혼합된 RNA 억제제와 T 4개의 RNA 리가아제의 일대일 혼합물 1마이크로리터가 들어 있는 깨끗한 PCR 튜브로 내용물을 옮깁니다. 반응물을 섭씨 37도의 열 순환기에서 4시간 동안 배양합니다.

반응이 완료되면 RNA의 3 프라임 말단에 대한 링커 결찰 후 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 CD NA 합성을 즉시 진행하고 반응의 페이지 분석을 진행합니다. 겔의 100 - 300 뉴클레오티드 영역에서 날카로운 고분자량 띠가 뚜렷하게 나타나며, 이는 사용 중인 총 RNA 샘플의 품질이 높다는 것을 나타냅니다. 겔의 25 뉴클레오티드 영역에서 매우 밝은 신호는 과잉 비ligated 3 프라임 링커 합성 RNA는 합성 마이크로 RNA의 5 피코몰 및 겔 정제 된 3 프라임 링커로 수행 된 결찰을 나타냅니다.

여기에 표시된 것은 P 32 5 프라임 및 표지된 합성 마이크로 RNA로 수행된 3개의 프라임 결찰 반응의 자동 방사선 사진입니다. 반응이 진행되도록 허용된 시간은 상단에 표시되어 있으며, 하단의 숫자는 unligated 및 ligated의 합에 대한 백분율로 결찰된 양을 나타냅니다. 이 자동 방사선 사진은 P 32 5 프라임 말단 표지 합성 마이크로 RNA 3 프라임 링커 하이브리드로 수행된 5개의 프라임 결찰 반응에 대한 것입니다.

하단의 숫자는 unligated 및 ligated의 합계에 대한 백분율로 결찰된 양을 나타내며 고농도의 PEG 8, 000 작은 R-N-A-D-N-A 사용의 중요성을 나타냅니다. 고처리량 염기서열분석(sequencing)과 호환되는 라이브러리는 이후에 PCR에 의해 생성됩니다. 적절한 PCR 주기 수는 경험적으로 결정됩니다.

이 예에서 예상되는 DNA 산물의 크기는 146 염기쌍입니다.일단 마스터하면 이 기술을 단 이틀 만에 적절하게 수행할 수 있습니다. 이 기술을 수행하는 동안 모든 팁과 튜브에 RNA가 없도록 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.