Name: 높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: 학습하세요 고효율 miRNA 클로닝 방법으로 높은 처리량 시퀀싱을 통한 전사체 전체 마이크로RNA 정량 분석을 수행하는 기법입니다. 이 방법은 유전자 발현 조절 연구에 활용됩니다.

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저자는 링커 설계 및 결찰 효율성에 관한 유익한 토론을 해준 Yi 연구실 구성원들, 특히 Zhaojie Zhang에게 감사의 뜻을 전하며, J.E.L.에 대한 박사 후 연구원(#125209)을 통해 이 연구를 지원해 준 미국 암 학회(American Cancer Society)에도 감사의 뜻을 전합니다. 이 간행물에 보고된 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 관절염 및 근골격 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 지원도 받았습니다 R01AR059697 (R.Y.에게) 및 Linda Crnic Institute for Down Syndrome의 연구 보조금. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

참고 : 전체 과정 동안의 RNase가없는 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 3 &#39;링커 1. Adenylation <ol><li> 뉴 클레아 제 무 H 2 O. 100 μM 3 &#39;라이 게이션 반응을 위해 설계된 DNA 올리고 뉴클레오타이드 희석 참고 : 올리고 뉴클레오티드는 5 &#39;인산기, 5에서 무작위 뉴클레오티드&#39;끝, 및 3 &#39;dideoxycytosine이 있어야합니다. 5 adenylation 10 &#39;인산기 효율적인 5 M의 효소의 요구 사항이다.&#39; 포스페이트 직접 변형과 폴리 뉴클레오티드 키나아제와 함께 올리고 뉴클레오티드의 예비 처리에 의해 첨가되거나 주문할 수있다. 5 &#39;말단에서 무작위 뉴클레오티드는 특정 최종 끝이 다른 6 이상 반응에 합류하기위한 RNA 리가 제는 전시 순서 기본 설정을 최소화하는 데 중요합니다. 3 올리고 뉴클레오티드 t의 &#39;말단 dideoxycytosine는 (3)에 차단 부재를 배치&#39;오 후속 결찰 단계 동안 링커 링커 concatamers의 형성을 억제하고 또한 연결 반응 (11) (3 &#39;) (3)의 단부에 형성된 miRNA에 링커 분자의 말단&#39;을 차단하는 역할을한다. 다음 편견은 miR-SEQ 방법을 위해 선택된 올리고 뉴클레오티드 링커 서열은 다음 5&#39;PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 &#39;. </li><li> 200 pmol의 3 &#39;링커 올리고 뉴클레오티드, 4 ㎕의 10 배 5&#39;DNA의 adenylation 완충액 4 ㎕의 1 mM의 ATP, 4 ㎕의 M의 RNA 리가 제, 뉴 클레아 제 무 H 2 O 40 ㎕의 최종 부피로 다음 adenylation 반응을 조립한다. </li><li> 1 시간 동안 65 ° C에서 반응을 품어. 5 분 동안 85 ° C로 가열하여 반응을 종료합니다. </li><li> 잔류 ATP를 제거하기 위해 미래 반응에서 예상치 못한 결찰 않도록 100 % 에탄올 2.5 볼륨과 10 M 암모늄 아세테이트의 1/3 양을 첨가하여 석출 adenylated 링커. <ol><li> 간단히, 알을 혼합cohol, 소금, 20 분 동안 4 ° C에서의 microcentrifuge에서 최고 속도로 회전 동질성에 올리고 솔루션 (~ 15,000 XG). adenylated 올리고 50 ~ 100 μM을 산출하기 위해 핵산 분해 효소가없는 H 2 O의 적절한 볼륨에 70 % 에탄올, 공기 건조 및 재현 탁에서 펠렛을 씻으십시오. </li></ol></li><li> 18 % 폴리 아크릴 아마이드 젤을 실행하여 adenylation을 확인합니다. <ol><li> 다음 함께 혼합하여 겔을 준비 : 6.3 g 우레아, 40 % 아크릴 아미드 6.75 ㎖, 10 배 및 1.5 ml의 TBE. H 2 O 15 ML을 추가합니다. </li><li> 우레아가 완전히 용해 될 때까지 혼합하고 암모늄 퍼 설페이트 (APS) 및 15 μL의 tetramethlyethylenediamine (TEMED) (/ V w) 150 μl의 10 %를 추가한다. </li><li> 겔은 1 배 TBE 실온에서 버퍼를 실행하는 겔 폭에 24 V / cm에서 30 분간 사전 실행을 설정하면. 버퍼를 실행 30 분까지되면 플러시 우물. </li><li> 와 adenylated 올리고 뉴클레오티드 및 배 변성 RNA 로딩 버퍼의 동량 (95 % (V / V) 포름 아미드 5 pmol의 혼합0.02 % SDS, 0.02 % 브로 모 페놀 블루 (V / W), 0.01 % (V / W) (W / V) 크실렌 Cyanol, 1.0 mM의 EDTA), 열 간단히 75 ° C, 그리고 얼음에 냉각 스냅. 겔의 우물에 전체 샘플을 분배. 또한 비 adenylated 제어 동량 및 저 분자량 크기 표준을 포함​​한다. </li><li> 브롬 페놀 블루는 젤의 바닥에 방법의 ¾ 때까지 24 V / cm에서 젤을 실행합니다. 1X TBE의 1X SYBR 골드 솔루션 장치, 후 얼룩 젤을 분해하여 UV-transilluminator가 상자 (그림 2)에 시각화. NOTE : 입력 RNA와 샘플에 비해 젤 &quot;은 입력 된 RNA는&quot;컨트롤 PCR 산물의 높은 양으로 생성되지 않은 경우는 상술 한 것과 유사한 방식으로 adenylated 올리고 정제. </li></ol></li></ol> 2. 링커 결찰의 miRNA의 3 &#39;끝으로 <ol><li> 3 &#39;결찰 <ol><li> (W / V) PEG 8000, 0.5 및 1.0 μL 50 % : 나열된 순서대로 얼음에 다음과 같은 구성 요소를 조립# 956; 리터 배 RNA 리가 제 완충액 (500 mM 트리스 - 염산 pH를 7.5, 100 mM의의 MgCl 2, 10 mM의 DTT), 1.0 μl의 3 &#39;링커 (100 μM), 0.5 ㎕의 RNA 분해 효소 억제제, 0.5-8.0 μg의 총 RNA를 adenylated 0.5 ㎕의 T4 RNA 리가 제의 2, 5 μL의 최종 부피로 클레아없는 H 2 O. </li><li> 용액 볼텍스에 너무 점성으로 인해 한번 충분히 혼합 PEG 8000의 고농도 피펫로 반응 믹스 가열 뚜껑 열 사이 클러에 반응 장소. 16 ° C에 블록을 설정하고 4 시간 동안 배양한다. 주 : 반응은 결찰 효율 손실없이 20 μL의 최종 볼륨으로 확장 할 수 있습니다. 주위 온도에서 4 시간 동안 반응 또는 밤새 39 ° C에서 본질적으로 동일 결찰 효율을 얻었다. </li></ol></li><li> 젤 정화 <ol><li> 3 &#39;결찰 후 2 배 RNA 로딩 완충액 동량 반응물을 혼합한다. 5 분 동안 70 ° C로 가열하고, 얼음에 멋진 스냅. </li&gt; <li> PAGE 정제를위한 15 %의 폴리 아크릴 아마이드 겔에 샘플을 실행합니다. <ol><li> 단계 150에서 전술 한 것과 유사한 방식으로, 7 M 우레아를 함유하는 15 % 폴리 아크릴 아미드 겔을 준비한다. </li><li> 적어도 30 분 동안 젤 폭의 24 V / cm에서 젤을 사전 실행합니다. 사전 실행과 동일 전압에서 전원 공급 장치, 세척 우물, 부하 샘플 및 실행 젤을 끕니다. </li><li> 샘플을로드하고 브로 모 페놀 블루가 젤을 종료 단지 때까지 페이지를 실행합니다. 목적 생성물이 크실렌 cyanol 가까이 이동한다. </li></ol></li></ol></li><li> 염색, 시각화 및 절제 <ol><li> 15 분 1X 실행 버퍼 (TBE), 1X SYBR 금, 바위와 깨끗한 트레이에 젤 장치 및 장소 젤을 분해. </li><li> 염색 접시에서 젤을 제거하고 깨끗한 플라스틱 랩으로 덮여 자외선 transilluminator가 박스에 시각화. 결찰 제품의 길이는 약 45 뉴클레오티드해야합니다. </li><li> 깨끗한 razo로 결찰 생성물을 함유하는 영역을 절제0.5 ml의 마이크로 원심 분리 관에 R 블레이드 및 장소. </li></ol></li><li> 제품의 분리 및 침전 <ol><li> 피어스 30 G 바늘 0.5 ml의 microcentrifuge 관의 바닥 및 제 깨끗하고 낮은 유지에 피어싱 튜브를 배치, 1.5 ml의 microcentrifuge 관. ~ 15,000 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 시각적으로 전체 젤 조각이 내부 튜브의 구멍을 통해 이동 한 것을 확인합니다. 필요한 경우, 가까운 구멍에 약간의 젤 조각을 밀어 깨끗한 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 빈 0.5 ML 튜브를 버리고 아크릴 아미드 슬러리에 높은 소금 열 버퍼 400 μL (25 mM 트리스 - 염산의 pH 7.5, 0.1 % SDS HSCB 400 mM의 염화나트륨을)를 추가합니다. 4 ° C에서 하룻밤 락 튜​​브 (들). </li><li> 넓은 구멍 피펫 팁을 사용하여 0.22 미크론 셀룰로오스 아세테이트 스핀 컬럼에 슬러리를 전송합니다. ~ 15,000 XG에 실온에서 3 분 동안 원심 분리기 멀리 아크릴 아마이드 겔 매트릭스에서 모든 액체를 수집합니다. </li><li> 깨끗하고 낮은 유지에 액체를 이동, 1.5 ml의 튜브 포함20 ㎎ / ㎖ 글리코겐 1 μl를 보내고. 이소프로판올 같은 부피의 1/10 부피의 아세트산 나트륨을 추가한다. 튜브를 수회 반전시켜 용액을 혼합하고 20 분 동안 냉동실 ° C에서 -80 침전. </li><li> 20 분 동안 4 ° C에서 최고 속도로 원심 분리기는 핵산을 펠렛. 상층 액을 제거하고 70 % 에탄올로 씻는다. 공기 건조 실온에서 10 분 동안 펠릿 5 &#39;결찰 단계로 바로 진행. </li></ol></li></ol> 링커 하이브리드 3. 링커 내고 5 &#39;의 miRNA-3의 끝&#39; <ol><li> 펠렛 핵산, 다음과 같은 구성 요소 추가 : 2 μL PEG 8000 (50 % / W V), 0.5 μL 10 배 RNA 리가 버퍼, 0.5 μL의 ATP (10 mM)을 0.5 μL NN-RNA 올리고 (100 μM) 및 H 4 ㎕의 최종 부피로 2 O. NOTE : 5&#39;-반전 디데 옥시 TCUACAGUCCGACGAUCNN3 다음 &#39;와 제조사에서 HPLC를 통해 정제시켜 같이&#39;NN-RNA 올리고 &#39;의 조성물이다. </li><li> 혼합아래로 반복적으로 피펫 팅에 의해이 샘플. 펠렛 완전히 다시 용해되어 있는지 확인하는 데 시간 (최대 5 분까지)에 대해이 작업을 수행합니다. 다시 용해가 문제가있는 경우 37 ° C에 샘플 잠시 (3-5 분) 가열 혼합 피펫을 다시 시작합니다. </li><li> RNA 분해 효소 억제제 및 T4 RNA 리가 제 1 (5 대)의 1 : 1 혼합물 펠릿을 용액에 다시되면, (1)의 1 μl를 함유하는 깨끗한 PCR 튜브에 콘텐츠를 전송. 다시 피펫 아래로 섞는다. </li><li> 4 시간 동안 37 ° C에서 열 사이 클러에 반응을 부화. cDNA 합성에 바로 진행합니다. </li></ol> 4. 역전사 / cDNA를 합성 <ol><li> 5 다음과 같은 구성 요소를 추가 &#39;결찰 반응 : 2 μL 5 배 RT 버퍼, 0.75 μL 100 mM의 DTT, 1 μL 일루미나 RT 프라이머 5&#39;-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#39;(1 μM) 0.5 μL의 dNTPs를 (10 mm)이다. </li><li> 5 분 동안 65 ° C로 피펫과 열에 의해 섞는다. 그런 다음 천천히 벤치 t에 냉각영업 이익. </li><li> 반응물을 얼음에 실온, 도시 튜브로 냉각시키고, 역전사 효소 및 RNA 분해 효소 억제제의 각 0.5 μl를 추가하면. 제조업체의 지침에 표시된 확장 단계에 대한 열 자전거 타는 사람에 피펫 팅 장소로 섞는다. </li><li> 완료되면 추가는 핵산 분해 효소가없는 H 2 O 5 μL 15 μL까지의 cDNA 라이브러리의 최종 볼륨을 가지고 있습니다. </li></ol> 5. 도서관 준비 <ol><li> 인덱싱 PCR를 들어, 얼음에 다음과 같은 반응 조립 : 6 μL 5 배 Phusion 버퍼, 1 μL의 dNTPs를 (10 mM)을 0.9 μL DMSO, 0.75 μL 5 &#39;프라이머 (25 μM), 0.75 μL 3&#39;프라이머 (25 μM) 3 μL의 cDNA 라이브러리 (입력의 양에 따라 가변 농도), 0.5 ㎕의 폴리머 라제 Phusion (1 부), 30 ㎕의 최종 부피로 클레아없는 H 2 O. 템플릿과의 시퀀싱 플랫폼과의 호환성을 보장하기 위해 프라이머 시퀀스를 선택선택. <ol><li> 15 초 동안 72 ° C에서 연장, 제 4 사이클, 3 분 동안 98 ° C에서 초기 변성을 15 초 동안 50 ° C에서 15 초, 어닐링 98 ° C 변성 : PCR을 다음과 같이 설정하여 반응을 실행 . 주 : 입력 재료의 양에 따라, 전체 PCR 사이클 수를 변화. 통상적으로, 총 RNA의 1-2 μg의 입력, 총 13 PCR 사이클은 miR-SEQ 라이브러리를 생성하기에 충분하다. </li><li> 어닐링 및 연장 사이클 합하고 30 초 및 변성을 위해 70 ° C에서 수행되는 두 단계의 방법으로 예를 들어 후속 사이클, 5-12 사이클을 수행해 다시 15 초 동안 98 ° C이다. NOTE은 : 반응 부피는 PCR 프로그램을 일시 정지 허가 및 목적 생성물의 출현을 모니터링하기 위해 미리 결정된 사이클 번호에 10 μl의 분취 량을 제거하기 위해 30 μL이다. 일반적으로, 사이클 10, 13, 및 16은 총 RNA 샘플로부터의 시험을 위해 선택된다. </li></ol></li><li> 준비40 % 아크릴 아미드 2 ㎖, 10 배 TBE 1 ㎖, 및 H 2 O 10 ㎖에 혼합하여 8 % 비 - 변성 아크릴 아마이드 겔. 그런 다음 10 % APS 100 ㎕ 및 TEMED의 10 μl를 추가합니다. 젤을 붓고 설정할 수 있습니다. <ol><li> 30 분 동안 젤 폭의 12 V / cm에서 젤을 사전 실행합니다. 세척 우물. 10 배 로딩 버퍼 1 μL 추가 (15 % 피콜-400, 66 mM의 EDTA, 20 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 0.1 % (w / 블루 / V) 브로 모 페놀 승 V) SDS, 0.01 % (), 10 μl를 추가 치수의 각 웰 5mm X 1mm X 15mm에 샘플. 일반적으로, 각 웰 샘플 30 μL까지 넣을 수 있습니다. 브롬 페놀 블루 염료가 바로 젤의 바닥에서 실행될 때까지 1X TBE 버퍼에 젤 폭의 10 V / cm에서 샘플 젤을 실행합니다. </li><li> 얼룩 단계 2.3에서 기술 된 바와 같이 겔을 시각화. </li><li> 146 염기쌍 밴드를 절제하고 2.4 절에 설명되어있는 것과 유사한 방식으로 HSCB 0.25 ml의 하룻밤 용출. 이소프로판올 같은 부피의 1/10 부피 아세트산 나트륨에서 DNA를 침전. 70 % 전자에 세척 펠렛TE 버퍼에 thanol 및 재현 탁. </li><li> 제조업체의 권장 사항에 따라 picogreen 사용하여 라이브러리를 정량화. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

본원에 기재된 방법은 결찰 효율, 즉 PEG, 무작위 링커의 사용의 높은 농도, 및 링커 2,6,9 고농도을 최대화하기 위해 여러 주요 변수를 사용한다. 이 방식은 총 RNA 시료 (2)로부터 안정적으로 정량적 시퀀싱 라이브러리를 허용한다. 우리는 입력 RNA의 다수의 적정을 수행하고 선행하는 방법론 (데이터 미기재) 1-8 μg의 범위에서 총 RNA 량에 가장 적합한 것으로 결론 지었다. 10-500 ng의 범위의 양으로 사용하는 경우, 판독 공간의 대부분은 어댑터 concatamers 및 RNA 리가 제를 정제하는 박테리아 서열에 의해 소비된다. 그러나, 그것은 저에이 숫자를 읽 불구하고 동일한 높은 입력 샘플과 비교했을 때 현재 미르 종, 여전히 실제 금액을 반영 이러한 낮은 입력 실험에서 주목할 가치가있다. 위해 총 RNA 샘플에서 관찰 미르 프로필이 실제 반영되도록하려면, 다른 샘플의 반대 심문을 할 수 있도록 양 우리는 정기적으로 세 합성 교정기 RNA를 12의</su...

높은 처리량 시퀀싱 기반의 방법론은 널리 크게 생물학적 시스템 3,4의 분자 복잡성에 대한 우리의 이해를 확장 최근 몇 년 동안 많은 생물학적 시료에 적용되고있다. 그러나, 높은 처리량 시퀀싱 RNA 샘플의 제조는 종종 이러한 강력한 기술의 잠재 성을 제한하는 고용 방법론에 내재 특정 바이어스를 부여한다. 이 방법은 특정 편견 잘 결찰 기반, 작은 RNA 라이브러리 준비 1,2,5,6- 문서화되어있다. 이러한 편견은 1,000 배의 변화에​​에서 격렬 변수 및 오류가 발생하기 쉬운 시퀀싱 데이터에서 miRNA의 풍요의 추론을, 몰 합성의 miRNA에 대한 숫자를 읽 결과. 파아지 - 유래의 T4 RNA 리가 제의 특성에 초점을 연구 효소는 높은 처리량 시퀀싱 실험에서와 같이 편향된 라이브러리를 나타내 뉴클레오타이드 기반 선호도 7 나타내는 것을 문서화 <s1,2,8&gt;까지. RNA 리가 제에 의해 부여 된 편향을 최소화하기 위하여, 여러 전략이 사용되었다; 거대 분자, 9 군집 결찰 사이트 6 근접한 어댑터 뉴클레오타이드 서열을 랜덤 화하고, 결찰 어댑터 (2)의 높은 농도를 채용. 이 세 가지 방법의 조합을 통해 우리는 높은 처리량 시퀀싱 (그림 1) 호환 작은 RNA 라이브러리의 편견 준비를위한 작업 흐름을 개발했다. 현재의 프로토콜과 우리의 최적화 된 방법 사이의 직접 비교를 위해, 우리의 최근 보고서 2를 참조하시기 바랍니다. 이 최적화 된 방법은 모두 3 &#39;및 5&#39;단계에서 95 % 초과의 결찰 효율을 산출하고, 합성과 생물학적 시료 (2)로부터 소형 RNA 분자의 공평 결찰을 허용한다.

<table><tbody><tr><td>3' 링커(5' 인산화, 3' 차단)</td><td>통합 DNA 기술</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>5' 링커</td><td>통합 DNA 기술</td><td>맞춤형</td><td>5' 차단, HPLC 정제</td></tr><tr><td>T4RNL2(1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>사전 아데닐화 DNA 어댑터의 결찰에 특화</td></tr><tr><td>10x 결찰 완충액(ATP 제외)</td><td>뉴잉글랜드 </td><td>M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10x 결찰 완충액(ATP 포함)</td>에 포함된 BiolabsM0204L <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr>에 포함된 New <tr>England Biolabs<td>폴리에틸렌 글리콜(mol. Wt. 8,000)</td><td>M0204L</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>에 포함된 New England Biolabs우리는 증류 장치에서 수집한 물이 동일한 품질임을 발견했습니다.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III RT 키트</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Illumina RP1 프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>맞춤형</td><td>Illumina</td></tr><tr><td>Illumina RT 프라이머</td>에서 사용 가능한 <td>서열 정보 Integrated DNA Technologies</td><td>맞춤형</td><td>Illumina Illumina 인덱스 프라이머에서 사용 가능한 서열 정보</td></tr><tr><td>Integrated</td> <td>DNA Technologies</td><td>맞춤형</td><td>Illumina</td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP14081</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethyethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x Denaturing RNA loading buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>포함 M0351S</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>포함 VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>SpinX Centricon 튜브</td><td>Costar</td><td>CLS8161</td><td></td></tr><tr><td>저잔류 마이크로퓨지 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Adenylation kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 rna 정량을위한 작은 rna 분자의 고효율 내고

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

미르 복제 및 높은 처리량 시퀀싱 미르-SEQ는, 단일 염기 해상도의 miRNAs를 정량화하기 위해 사체 차원의 접근 방식으로 독립적이라고. 이 기술은 miRNA의 분자 3 &#39;, 5&#39;올리고 뉴클레오티드 어댑터를 연결하여 miRNA가를 캡처하고 새로이 miRNA의 검색을 할 수 있습니다. 강력한 차세대 시퀀싱 플랫폼과 커플 링,은 miR-SEQ는 miRNA의 생물학의 연구 수단이되어왔다. 그러나, 올리고 뉴클레오티드 결찰 단계에 의해 도입 상당한 편향 정확한 정량 도구로서 사용되는은 miR-SEQ을 방지했다. 이전의 연구는 현재의 miR-SEQ 방법의 편견은 종종 일부 miRNA가 1,2 1,000 배까지 오류가 부정확 한 miRNA의 정량으로 이어질 것을 보여줍니다. RNA 결찰에 의해 부여 이러한 편견을 해결하기 위해, 우리는 모두 3 &#39;, 5&#39;결찰 단계에 대한 95 %의 결찰 효율성을 초래 작은 RNA 결찰 방법을 개발했다. 이 메신저를 벤치마킹지속적으로 기대 값에서보다 두 배 편차 번호를 읽어 산출, 몰 또는 차등 혼합 된 합성의 miRNA를 사용하여 라이브러리 생성 방법을 입증했다. 또한,이 고효율의 miR-SEQ 방법은 생체 내 총 RNA 샘플 2에서 정확한 게놈 전체의 miRNA의 프로파일 링을 허용한다.

위의 방법에 대한 예상 결과는 처음에 (그림 2) M의 RNA 리가 아제에 의한 adenylation의 대상이었다 DNA 올리고 뉴클레오타이드의 크기의 단일 염기 변화 (증가)의 관찰해야한다. 3 '결찰 후, 아크릴 아미드 겔의 시각화 (도 3 참조) 겔 100-300 뉴클레오티드 영역에서 분명 날카로운 고 분자량 밴드를 나타낸다. 이것은 사용되는 총 RNA 샘플 고품질 인 것을 나타낸다 (악화되지 않음). 둘째 하나는 초과 인 젤의 25 뉴클레오티드 지역에서 매우 밝은 신호, unligated 3 '링커를 관찰해야한다. 또한, (3 ')에 결찰 입력이없는 RNA 제어를 포함하는 것이 도움이 될 수있다. 이는 3 '링커의 순도를 나타내는 것이며, 또한, 비특이적 신호가 문제 될 때 사이클 넘버의 표시에 대한 PCR 단계로 연결되는 실시 할 수있다. 5 '결찰에 대한 진단도 없다그러나도 4에 도시 채용 PEG8000의 고농...

MicroRNA(miRNA)는 널리 보존된 조절 분자 부류입니다. 여기에서는 두 가지 강력한 ligation 단계와 high-throughput sequencing에 의존하는 miRNA 클로닝 방법에 대해 설명합니다. 당사의 방법은 miRNA의 정확한 게놈 전체 정량을 가능하게 합니다.

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

이 절차의 전반적인 목표는 고처리량 염기서열분석을 위해 microRNA를 편향되지 않게 준비하는 것입니다. 이는 먼저 마이크로 RNA의 3 프라임 말단에 대한 결찰에 적합한 DNA 올리고뉴클레오티드를 준비하거나 구매함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 3 프라임 DNA 올리고뉴클레오티드를 마이크로 RNA의 3 프라임 말단에 접합하는 것입니다.다음으로, 결찰 산물을 겔 정제하고 5 프라임 RNA 올리고뉴클레오티드 링커를 마이크로 RNA의 5 프라임 말단에 결찰합니다. 마지막 단계는 하이브리드 분자를 CDNA로 전환한 다음 중합효소 연쇄 반응에 의해 CDNA를 증폭하는 것입니다. 궁극적으로, 마이크로 RNA 클로닝과 고처리량 염기서열분석은 개별 뉴클레오티드 분해능에서 정량적 방식으로 microRNA의 전사체 폭넓은 프로파일을 보여주는 데 사용됩니다.마이크로 염기서열분석 마이크로레이 qPCR 블롯과 같은 기존 기술에 비해 당사 기술의 주요 장점은 당사의 기술이 단일 뉴클레오티드 분해능에서 전사체 전체 실험실 규모에서 실제 마이크로레이 수준을 더 잘 반영한다는 것입니다. 이 방법은 microRNA 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 HC 클립 및 RNA-Seq와 같은 다른 고처리량 염기서열분석 기술에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 위한 DNA 올리고뉴클레오티드는 3개의 프라임 결찰 반응을 위해 설계되었으며, 5개의 프라임 인산기, 5개의 프라임 말단에 무작위 디뉴클레오티드, 3개의 프라임 시토신이 있어야 하며, DNA 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제가 없는 물에서 100마이크로몰로 희석해야 합니다.이들 시약제를 3 프라임 링커 올리고뉴클레오티드 200 피코 몰, 5 프라임 DNA 환기 완충액 4 마이크로리터, TP 4 마이크로리터, M-T-H-R-N-A, 리가제 및 뉴클레아제 자유 정제수 4 마이크로리터를 최종 부피 40 마이크로리터로 조합하여 환기 반응을 조립한다. 섭씨 65도에서 1시간 동안 반응을 배양합니다. 섭씨 85도까지 5분 동안 가열하여 반응을 종료합니다.2.5 부피의 100 % 에탄올과 1/3 부피의 10 몰 암모늄 아세테이트를 첨가하여 TED 링커를 침전시킵니다. 잔류 TP를 제거하고 향후 반응에서 예상치 못한 결찰을 방지하기 위해 알코올, 염 및 올리고뉴클레오티드 용액을 섭씨 4도의 마이크로 원심분리기에서 20분 동안 최고 속도로 회전하여 균질화하도록 혼합합니다. 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 공기 건조시킨 후 펠릿을 적절한 양의 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁시켜 50-100마이크로몰의 환기된 올리고뉴클레오티드를 생성합니다.18% 폴리 아크릴아미드 겔에서 전기영동으로 올리고뉴클레오티드의 환기를 확인합니다. 실온에서 하나의 XTBE 실행 버퍼를 사용하여 24볼트 센티미터의 젤 너비에서 30분 동안 젤을 사전 실행합니다. 30분이 지나면 흐르는 버퍼로 우물을 세척합니다.이 절차를 위한 DNA 올리고뉴클레오티드는 3개의 프라임 결찰 반응을 위해 설계되었으며 5-프라임 인산기, 5-프라임 말단의 무작위 디뉴클레오티드 및 3-프라임 옥시토신을 가져야 합니다. DNA 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제가 없는 물에서 100마이크로몰로 희석합니다. 브로모 페놀 블루가 젤 포스트 바닥까지 3/4이 될 때까지 센티미터당 24볼트에서 젤을 실행합니다.XTBE 1개에 1개의 사이버 골드 용액으로 겔을 염색하고 UV 투광기 상자에 시각화합니다. 3 프라임 결찰 반응에 대해 M-T-H-R-N-A 리가제에 의해 환기된 DNA 올리고뉴클레오티드의 크기에서 단일 뉴클레오티드 이동이 있어야 합니다. 다음 구성 요소를 이 순서로 얼음 위에 조립하십시오.50%PEG 8, 000 10 XRNA 리가제 완충액의 0.5 마이크로리터의 1 마이크로리터. 1 마이크로 리터의 환기 3 프라임 링커, 0.5 마이크로 리터의 RNA 억제제, 0.5 마이크로 리터의 총 RNA 0.5 마이크로 리터, 0.5 마이크로 리터의 T, 4 개의 RNA 리가제 2 및 뉴클레아제 자유 물을 5 마이크로 리터의 최종 부피로 만든다. 완전히 혼합된 후 피펫팅으로 반응을 혼합합니다.가열된 뚜껑이 있는 열 순환기에 반응을 놓습니다. 블록을 섭씨 16도로 설정하고 4시간 동안 배양합니다. 반응은 결찰 효율의 손실 없이 20 마이크로리터의 최종 부피까지 확장될 수 있습니다.3 프라임 ligation에 따라, 2 개의 XRNA 로딩 버퍼 열을 5 분 동안 섭씨 70도까지 가열하고 얼음에서 식히는 동일한 부피로 반응을 혼합합니다. 다음 젤. 15%poly 아크릴아미드 젤에 표본을 순화하십시오.젤 너비 24볼트에서 최소 30분 동안 젤을 미리 실행합니다. 전원 공급 장치를 끄고 흐르는 버퍼로 우물을 세척하십시오. 샘플을 로드하고 브로모 페놀이 분출된 것이 겔에서 막 나올 때까지 사전 실행과 동일한 전압으로 겔을 실행합니다.원하는 제품은 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동이 완료되면 크실렌 시안(xylene cyan)에 가깝게 이동합니다. 런닝 버퍼 1개와 사이버 골드 1개와 록이 있는 깨끗한 트레이에 젤을 15분 동안 놓습니다. 염색 접시에서 젤을 제거하고 깨끗한 플라스틱 랩으로 덮인 UV 투광기 상자에 시각화합니다.결찰 산물은 길이가 약 45개의 뉴클레오티드여야 합니다. 이 결찰 산물은 일반적으로 보이지 않기 때문에 결찰 산물이 포함된 영역인 깨끗한 면도날 절제를 사용하여 인접 레인에 양성 대조군 합성 RNA 샘플을 포함하는 것이 중요합니다. 합성 RNA 샘플의 위치와 크기 표준에 따라 안내됩니다.소비세 젤 조각을 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 30 게이지 바늘로 0.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브의 바닥을 뚫고 피어싱 튜브를 두 번째 깨끗한 낮은 유지, 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브 원심 분리기에 약 15, 000 번으로 5 분 동안 놓습니다. G. 전체 젤 슬라이스가 내부 튜브의 구멍을 통해 이동했는지 육안으로 확인합니다.필요한 경우 깨끗한 피펫 팁을 사용하여 일부 젤 조각을 구멍에 더 가깝게 밀어 넣습니다. 빈 0.5ml 튜브를 버리고 아크릴아마이드 슬러리에 400마이크로리터의 고염 컬럼 버퍼를 추가합니다. 다음 날 밤새 섭씨 4도에서 튜브를 흔듭니다.넓은 구멍 피펫 끝 분리기를 사용하여 0.22 미크론 셀룰로오스 아세테이트 스핀 란에 대략 15, 000 시간에 실내 온도에 3 분 동안 슬러리를 옮깁니다. 아크릴아미드 젤 모체에서 모든 액체를 멀리 모으기 위하여 G. 액체를 1.5밀리리터 글리코겐 용액 1마이크로리터가 들어 있는 깨끗하고 낮은 잔류 20밀리리터 튜브로 옮깁니다.동일한 부피의 이소프로판올과 10분의 1 부피의 아세트산나트륨을 추가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 용액을 혼합합니다. 영하 80도의 냉동고에서 20분 동안 침전시킵니다. 섭씨 4도에서 20분 동안 최고 속도로 원심분리기를 사용합니다.핵산을 펠렛화하려면 스내트를 제거하고 70% 에탄올 공기로 세척하십시오. 펠릿을 실온에서 10분 동안 건조시키고 5 프라임 결찰 단계로 바로 진행합니다. 이 절차를 시작하기 위해, 앞서 펠릿화된 핵산에 다음 성분을 추가하고, 2마이크로리터의 PEG 8, 000 0.5마이크로리터의 RNA 리가제 완충액, 0.5마이크로리터의 TP 0.5마이크로리터의 링커, RNA 올리고뉴클레오티드 및 물을 4마이크로리터의 최종 부피에 추가합니다.펠릿이 완전히 다시 용해되었는지 확인하기 위해 최대 5분 동안 위아래로 반복적으로 피펫팅하여 이 샘플을 혼합합니다. 펠릿이 용액에 들어가면 위아래로 피펫팅하여 혼합된 RNA 억제제와 T 4개의 RNA 리가아제의 일대일 혼합물 1마이크로리터가 들어 있는 깨끗한 PCR 튜브로 내용물을 옮깁니다. 반응물을 섭씨 37도의 열 순환기에서 4시간 동안 배양합니다.반응이 완료되면 RNA의 3 프라임 말단에 대한 링커 결찰 후 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 CD NA 합성을 즉시 진행하고 반응의 페이지 분석을 진행합니다. 겔의 100 - 300 뉴클레오티드 영역에서 날카로운 고분자량 띠가 뚜렷하게 나타나며, 이는 사용 중인 총 RNA 샘플의 품질이 높다는 것을 나타냅니다. 겔의 25 뉴클레오티드 영역에서 매우 밝은 신호는 과잉 비ligated 3 프라임 링커 합성 RNA는 합성 마이크로 RNA의 5 피코몰 및 겔 정제 된 3 프라임 링커로 수행 된 결찰을 나타냅니다.여기에 표시된 것은 P 32 5 프라임 및 표지된 합성 마이크로 RNA로 수행된 3개의 프라임 결찰 반응의 자동 방사선 사진입니다. 반응이 진행되도록 허용된 시간은 상단에 표시되어 있으며, 하단의 숫자는 unligated 및 ligated의 합에 대한 백분율로 결찰된 양을 나타냅니다. 이 자동 방사선 사진은 P 32 5 프라임 말단 표지 합성 마이크로 RNA 3 프라임 링커 하이브리드로 수행된 5개의 프라임 결찰 반응에 대한 것입니다.하단의 숫자는 unligated 및 ligated의 합계에 대한 백분율로 결찰된 양을 나타내며 고농도의 PEG 8, 000 작은 R-N-A-D-N-A 사용의 중요성을 나타냅니다. 고처리량 염기서열분석(sequencing)과 호환되는 라이브러리는 이후에 PCR에 의해 생성됩니다. 적절한 PCR 주기 수는 경험적으로 결정됩니다.이 예에서 예상되는 DNA 산물의 크기는 146 염기쌍입니다.일단 마스터하면 이 기술을 단 이틀 만에 적절하게 수행할 수 있습니다. 이 기술을 수행하는 동안 모든 팁과 튜브에 RNA가 없도록 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 샘플 제한된 양의 작업 특히, microRNA (miRNA) 표현 수준에 대해 비용과 시간 효율 높은 처리량 검사 도구로 microfluidic 플랫폼와 함께 최적화된 멀티 플렉스 반전 transcriptase 정량 PCR (qRT - PCR) 프로토콜을 설명합니다.

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

우리는 뇌척수액 (CSF)에서 마이크로 RNA 프로필 실시간 PCR의 프로토콜을 설명합니다. RNA 추출 프로토콜을 제외하고, 절차는 다른 체액, 배양 된 세포 또는 조직 표본에서 추출한 RNA로 확장 될 수있다.

정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

순환 마이크로 RNA는 최근 각종 암 및 기타 질환에 대한 유망한 새로운 바이오 마커로 등장했다. 이 문서의 목적은 세 가지 다른 프로브 기반의 실시간 PCR 플랫폼 및 정량화 및 마이크로 RNA 순환의 풍요 로움을 결정하는 데 사용할 수있는 방법을 논의하는 것입니다.

프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

이 프로토콜의 목표는 다운스트림 RNA 분석을 위해 이질적인 전립선 조직에서 세포 유형의 순수한 집단을 분리하는 효과적인 방법으로 레이저 캡처 미세 해부를 사용하는 것입니다.

RNA 분석을위한 인간의 전립선 상피 세포의 레이저 캡처 이외에 Microdissection

여기서는 작은 RNA를 격리하고, microRNAs를 보강하고, 처리량이 높은 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하기 위한 단계별 전략을 설명합니다. 그런 다음 시퀀스 읽기를 처리하고 오픈 소스 도구를 사용하여 microRNAs에 정렬하는 방법을 설명합니다.

MicroRNAs를 격리하고 시퀀싱하고 오픈 소스 도구를 사용하여 분석하기 위한 완벽한 파이프라인

우리는 표준 방법 보다는 더 적은 편견을 가진 상세한 작은 RNA 라이브러리 배상 프로토콜 및 2'-O-메틸 RNA를 위한 증가한 감도를 제시합니다. 이 프로토콜은 비용을 절감하기 위해 수제 시약을 사용하거나 편의를 위해 키트를 사용하여 따를 수 있습니다.

작은 RNA-seq 개선: 2'-O-메틸 RNA의 더 적은 편견 및 더 나은 검출

이 방법은 전체 RNA 추출물로부터 miRNAs를 검출하기 위해 북부 혼성화 기술의 사용을 보여줍니다.

식물 MicroRNAs의 검출 및 정량화를 위한 RNA 블롯 분석

절대 정량 RNA 염기서열분석(AQRNA-seq)은 생물학적 혼합물에서 모든 소형 RNA의 환경을 정량화하기 위해 개발된 기술입니다. 여기에서는 AQRNA-seq의 라이브러리 준비 및 데이터 처리 단계를 모두 시연하여 기아 유발 휴면 기간 동안 Mycobacterium bovis BCG의 전달 RNA(tRNA) 풀의 변화를 정량화합니다.

small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

Gaussia 루시페라아제 (GLuc) 유전자를 포함하는 선형화된 플라스미드로부터 캡핑 및 비캡핑 mRNA를 모두 고수율로 in vitro 합성하는 방법을 설명합니다. 합성된 RNA를 정제하고, 비캡핑 RNA의 일부를 Vaccinia 바이러스 캡핑 효소를 사용하여 효소적으로 캡핑합니다. 마지막 단계로, mRNA를 HeLa 세포에 형질전환하고 세포 배양 상청액의 루시페라아제 활성을 측정합니다.

HELA 세포 Transfection 얹는 Gaussia의 루시페라제의 mRNA의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에

학습하세요 고효율 miRNA 클로닝 방법으로 높은 처리량 시퀀싱을 통한 전사체 전체 마이크로RNA 정량 분석을 수행하는 기법입니다. 이 방법은 유전자 발현 조절 연구에 활용됩니다.

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

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