신경치료 응용을 위한 유전자 조작 중간엽 줄기 세포의 특성화

골수에서 유래한 다능성 세포인 형질전환 마우스 중간엽 줄기 세포로 시작합니다.

세포는 신경 성장과 생존을 지원하는 GFP 및 치료용 신경 영양 인자를 발현하도록 조작되었습니다.

세포를 완충액으로 세척하고 고정하여 세포 무결성을 보존합니다.

완충액으로 다시 세척한 다음 용액을 첨가하여 세포막과 핵막을 투과화하고 비특이적 결합 부위를 차단합니다.

분열하는 세포의 핵에서만 발현되는 세포 증식 마커 단백질을 표적으로 하는 1차 항체를 도입합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 완충액으로 세척합니다.

1차 항체를 표적으로 하는 형광단 접합 2차 항체와 DNA 결합 염료를 첨가하여 핵을 대조염색합니다.

결합되지 않은 시약을 제거하기 위해 완충액으로 세척합니다.

플레이트를 고함량 스크리닝 시스템에 로드하고 이미지를 캡처하여 형광 신호를 검출합니다.

세포 증식 마커의 발현은 활성 세포 분열을 나타내며, 이는 신경 치료 응용에 대한 형질전환 세포의 적합성을 시사합니다.

Ki-67 세포 증식 분석을 수행하려면 0.1몰 인산염 완충액을 사용하여 세포 배양액을 1분 동안 헹굽니다. 세척을 반복한 후 4% 파라포름알데히드(PFA)를 실온에서 20분 동안 사용하여 배양액을 고정합니다.

고정 후 PFA를 제거하고 PBS를 사용하여 웰을 각각 7분 동안 3회 헹구십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 차단한 후 각 웰에 100마이크로리터의 1차 항체 용액을 도포합니다. 접시를 덮고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

세척에 대해 7분 동안 세포를 3회 세척한 후 2차 항체를 도포하고 세포를 어두운 곳에 두고 실온에서 90분 동안 배양합니다. 세 번 더 세척한 후 플레이트를 덮고 이미징할 때까지 섭씨 4도에서 보관합니다.

자동 이미징을 수행하려면 면역 표지 플레이트를 HCS 시스템에 로드하고 플레이트가 20분 동안 평형을 이루도록 합니다. HCS 시스템 이미지 수집 및 분석 소프트웨어를 엽니다. 카메라 비닝을 1로 하고 게인 설정을 2로 사용하여 10X 대물렌즈에 대한 획득 설정을 선택합니다.

자동 노출 기능을 사용하여 세포가 상주하는 Z 평면을 찾고 관심 있는 각 파장에 대한 오프셋을 계산합니다. 여기에 설명된 분석을 위해 DAPI, GFP 및 Cy3에 대한 이미지를 캡처합니다.

네거티브 컨트롤 웰이 이미지 획득을 위한 신호를 표시하지 않는 최대 강도 수준을 선택합니다. 포지티브 웰에 대해 동일한 임계값 설정을 사용합니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 따라 이미지 분석을 수행하기 전에 이미지를 캡처하여 데이터베이스에 저장합니다.