이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도 ⁺ CD45RB ^높은 면역 결핍 마우스에게 T 세포

이 절차의 전반적인 목표는 면역 결핍 마우스로 미접촉 T 세포를 이식하여 장 염증을 유도하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 비장에서 세포를 분리하고 혈액 세포를 용해한 다음 CD 4개의 양성 T 세포를 위해 집단을 농축함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 이러한 세포를 형광 DI 복합 CD 4 및 CD 45 RB 항체로 라벨링하는 것입니다.

다음으로, 표지된 세포를 사실에 따라 CD 45, RB 낮음 및 CD 45 RB 높음 모집단으로 분류합니다. 마지막 단계는 복강내 주사를 통해 CD 45 RB high cell을 면역결핍 마우스로 이식하는 것입니다. 궁극적으로 전달된 세포가 활성화되고 T 조절 세포가 없는 상태에서 국소 조직 손상을 일으켜 실험적 대장염을 유발합니다.

이 방법은 질병 발병기전에서 특정 세포 집단 및 위장 미생물총(gastrointestinal microbiota)의 역할과 같은 염증성 장 질환 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 기증자 마우스를 안락사시킨 후 복부에 70% 에탄올을 분사하여 해당 부위를 살균합니다. 그런 다음 복부를 가로질러 수평으로 절개하고 집게를 사용하여 피부를 벗겨 복막을 드러냅니다.

복막을 내부 장기에서 멀리 떨어뜨리고 왼쪽 복부 복막을 절개합니다. 다음으로, 쥐에서 비장을 절제하고 10ml의 얼음처럼 차갑고 완전한 매체가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 두 개의 멸균 유리 슬라이드로 비장을 부수어 단일 세포 현탁액을 만듭니다.

70미크론 스트레이너를 통해 세포를 50ml 원뿔형 튜브로 여과한 다음 하나의 원뿔형 튜브에 최대 5개의 비장까지 5ml의 완전한 중간 변형으로 스트레이너를 헹굽니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 7분 동안 450배 G로 세포를 원심분리합니다. 상층액을 폐기물 용기에 흡입한 다음 10ml의 얼음 저온 라벨링 버퍼에 세포를 부드럽게 재현탁합니다.

20마이크로리터의 세포 현탁액과 180마이크로리터의 0.4%트리안 블루 용액을 결합하고 실온에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 10 마이크로 리터의 세포 현탁액을 혈구 분석기에 추가하고 현미경으로 파란색이 아닌 세포의 수를 세어 농축 펠렛을 시작하고 부드럽게 얼음 저온 라벨링 버퍼에서 20 곱하기 10의 농도로 밀리리터 당 6 개의 세포에 현탁액을 현탁시킵니다. 6개의 세포에 1회 10회 5마이크로리터의 비오틴화 CD 4개의 T 세포 농축 항체를 첨가한 다음 항체와 함께 얼음 위에서 세포를 15분 동안 배양합니다.

세포 현탁액에 라벨링 완충액 부피의 10배를 추가한 다음 450배 G에서 7분 동안 세포를 원심분리합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 흡입합니다. 다음으로, streptavidin 복합 자성 입자를 와류에 의해 다시 현탁시키고 6 개의 세포에 1 곱하기 10 당 5 마이크로 리터의 입자를 세포에 첨가합니다.

튜브를 부드럽게 튕겨 입자를 세포와 혼합한 다음 섭씨 6도에서 12도에서 30분 동안 혼합물을 배양합니다. 라벨링 버퍼를 사용하여 세포를 20-80 곱하기 10 - 10 밀리리터당 6 개의 세포의 농도로 재현탁합니다. 그런 다음 1밀리리터의 라벨링된 세포를 12mm x 75mm 원형 바닥 시험관에 옮기고 이 양성 분획 튜브를 자석에 6-8분 동안 놓습니다.

튜브를 자석에 연결한 상태에서 라벨링된 세포를 방해하지 않고 유리 파스터 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 새로운 멸균 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 이 분획은 CD 4개의 양성 T 세포를 포함합니다. 자석에서 positive fraction tube를 제거하고 격렬하게 피펫팅하여 라벨링 버퍼에 세포를 다시 부유시킵니다.

튜브를 자석에 다시 6-8분 동안 더 넣습니다. 다시 말하지만, SUP 나인을 농축된 분획 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 필요에 따라 농축을 반복하여 4개의 양성 T 세포의 수율을 높이고, 라벨링을 위해 세포를 준비하고, 먼저 농축된 분획을 450배 G에서 7분 동안 원심분리하고 상등액을 폐기합니다.

그런 다음 라벨링 버퍼의 세포를 10 곱하기 10의 농도로 밀리리터당 6번째 세포로 재현탁합니다. 염색되지 않은 동위원소 염색 및 단일 염색된 대조 세포에 대해 개별 마이크로 fuge 튜브에 있는 5번째 세포 중 10개를 5번 분주합니다. 그런 다음 CD 4, FE 1밀리리터당 5마이크로그램을 원래 세포 현탁액이 들어 있는 튜브에 추가합니다.

동위원소 대조 염색과 동일한 농도의 단일 염색을 적절한 세포 분취액에 추가합니다. 세포와 항체를 부드럽게 혼합한 다음 얼음 위에서 튜브를 30분 동안 배양합니다. 튜브를 덮어 빛으로부터 보호하십시오.

다음으로, 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 라벨링 버퍼에서 세포를 두 번 세척하고 라벨링 버퍼에서 밀리리터당 6개 셀의 10배에서 10배로 셀을 재현탁합니다. 그런 다음 70미크론 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 팩스 튜브에 통과시킵니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 덮으십시오 얼룩의 광 표백을 방지합니다.

염색되지 않은 단일 단계 대조 cell을 사용하여 cell sorter의 보상을 보정합니다. forward 및 side scattered gating을 사용하여 생존 불가능한 세포를 제외합니다. 그런 다음 동위원소 염색 대조군으로 CD 4 양성 세포와 CD 4 RB 양성 세포에 대한 게이팅을 설정합니다.

다음 게이트, CD 4 양성 집단 및 세포를 CD 45, RB 높음 및 CD 45 RB 낮음 집단으로 분류합니다. 2밀리리터의 완전한 배지가 들어 있는 튜브에 세포를 모은 다음 세포 분류기에서 각 분획의 세 번째 세포에 약 10배의 부분 표본을 실행하여 샘플 순도를 평가하여 주입 세척을 위한 CD 45 RB high 및 CD 45 RB low cell을 준비하고 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 적절한 세포 밀도로 PBS에 재현탁합니다. 다음으로, 수용 마우스를 단단히 제지하고 복강 내 세포 현탁액 100 마이크로 리터를 복부의 오른쪽과 왼쪽에 주입합니다.

매주 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 이식 마우스의 임상 매개변수를 모니터링합니다. 주사 후 질병 진행은 일반적으로 5주차에 뚜렷하게 나타납니다. 미리 정해진 시점에 또는 시작 체중의 20%를 잃었을 때 쥐를 희생시키고 결장을 추출합니다.

그런 다음 결장의 길이와 무게를 측정하고 기록하십시오. CD 4개의 양성 CD 45 RB 높은 T 세포를 주입 후 5주까지 rag 1개의 knockout 및 NFIL 3개의 RAG 1개의 이중 knockout 수용 마우스로 이식했습니다. 더블 넉아웃 마우스는 초기 체중의 10%를 잃었고, 래그 원 넉아웃과 더블 넉아웃 모두의 결장이 감소했습니다.

수혜자 마우스는 대조군 마우스의 결장과 비교하여 두꺼워지고 짧아졌으며, CD 4 개의 양성 CD 45 RB 높은 T 세포를 rag one knockout 및 rag one knockout P one 10 델타 돌연변이 수혜자 마우스로 이송 후 3 주에 조직 학적 분석은 rag one 녹아웃 델타 돌연변이 수용자에서 상피 증식, 염증성 세포 침투 및 소낭선 농양을 나타 냈지만 rag one 녹아웃 마우스는 마스터하지 않았습니다. 이 기술은 적절하게 수행되면 4-6시간 안에 완료할 수 있습니다.