마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

여기서는 자세하게 마우스 장 돌기 세포 (DC가)와 macrophages의 급속한 분리를위한 방법론. 창자 DCS 및 macrophages의 Phenotypic 특성은 세포 정렬 뒤에 자석 구슬 농축은 기능적 연구를위한 매우 순수 인구를 얻을하는 데 사용하는 동안 멀티 컬러 플로우에게 cytometric 분석을 사용하여 수행됩니다.

이 절차의 전반적인 목표는 표현형 및 기능적 특성 분석을 위해 마우스 장 수지상 세포 또는 dc와 대식세포를 신속하게 분리하는 것입니다. 이는 먼저 장 조직을 채취하여 이루어집니다. 두 번째 단계는 장 상피와 라민 프로프리아(Lamin propria)를 분리하는 것입니다.

다음으로, 장의 Lamin Propria는 절차의 마지막 단계에서 소화됩니다. Lamin propria 세포는 형광으로 염색되고, 접합 항체가 형성되며, 특정 세포 집단에 대해 게이트가 형성됩니다. 궁극적으로, 장내 DC 및 대식세포 집단은 사이토카인 생산, 항원 발현 및 면역 세포의 조절을 평가하기 위한 기능 연구를 위해 보다 정확하게 특성화되고 정제될 수 있습니다.

따라서 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 조직 소화의 속도가 빨라 최적의 세포 표면 항원 발현, 세포 생존율 및/또는 세포를 보장한다는 것입니다. 쥐를 안락사시키고 발가락 꼬집음 반사로 사망을 확인한 후 동물의 복부와 흉부에 70% 에탄올을 시험 스프레이합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 복부 중앙을 수평으로 작게 절개하고 피부를 벗겨 복막을 드러냅니다.

괄약근을 쯔쯤 잘라 상부 소장에서 위를 분리하고 집게를 사용하여 장간막을 떼어낸 후 가위를 사용하여 복막을 엽니다. 회장 판막을 다시 잘라 대장에서 소장 전체를 빼냅니다. 계속해서 장간막과 대장을 떼어내고 항문 가장자리를 자릅니다.

가위를 사용하여 결장을 세로로 자르고 실온 C-M-F-P-B-S를 사용하여 장 내강에서 대변 내용물과 점액을 씻어냅니다. 그런 다음 가위와 집게를 사용하여 거시적으로 봅니다. 소장의 장간막 방지 표면을 따라 장작더미 패치를 해부하고 소장을 세로로 잘라냅니다.

다음으로, 배설물 내용물과 점액의 소장 내강을 더 높은 실온 C-M-F-P-B-S로 제거합니다. 별도로 소장과 대장을 약 1.5cm 조각으로 자르고 조각을 FBS가 있는 30ml의 전쟁 전 C-M-F-H-B-S-S와 2밀리몰 EDTA가 들어 있는 개별 50ml 원뿔형 튜브에 넣습니다. 각 50ml 원뿔형 튜브를 궤도 셰이커에 수평으로 놓고 섭씨 37도에서 20분 동안 250RPM으로 튜브를 흔듭니다.

다음으로 쓰레기 양동이 위에 단일 메쉬 와이어 스트레이너를 놓습니다. 각 50 밀리리터 원뿔 튜브의 내용물을 메쉬를 통해 쏟아 부어 장 조각을 복구 한 다음 2 밀리 몰 EDTA와 FBS와 Prewarm C-M-F-H-B-S-S 30 밀리리터를 포함하는 새로운 개별 50 밀리리터 원뿔 튜브에 넣습니다. 마지막으로, 튜브를 안와 쉐이커에 다시 20분 더 넣습니다.

두 번째 흔들기 후 각 튜브의 내용물을 여과기에 붓습니다. 다시 종이 타월을 사용하여 여분의 매체를 두드려 제거한 다음 장 조각을 작은 플라스틱 유청 보트에 옮깁니다. 이 기술의 가장 어려운 측면은 성공을 보장하기 위한 조직 소화이며, 소화 기간, 콜라겐 분해 효소의 특성, 조직 무결성 및 소화할 조직의 크기에 대한 모든 다른 매개변수를 모두 고려해야 합니다. 가위를 빠르게 사용합니다.

장 조각을 자른 다음 다진 장을 20ml의 콜라겐 분해 효소 용액이 들어 있는 50mm 원뿔형 튜브에 넣습니다. 원뿔형 튜브를 궤도 셰이커에 수평으로 놓고 섭씨 37도에서 10-20분 동안 200RPM으로 장 조각을 소화합니다. 이제 튜브를 간단히 소용돌이쳐 남아 있는 장 조직의 철저한 해리를 확인한 다음 100미크론 세포 여과기를 통해 세포 슬러리를 50ml 원추형 튜브로 직접 여과합니다.

마지막으로, 원뿔형 튜브에 FBS가 있는 C-M-F-H-B-S-S를 얹고 세포 용액을 섭씨 4도에서 425배 G로 5분 동안 두 번 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 붓고 FBS와 함께 얼음처럼 차가운 C-M-F-H-B-S-S에 세포 펠릿을 다시 현탁시키고 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 관심 있는 표면 단백질에 대해 세포를 염색한 후.

여기에서 설명한 것처럼 죽은 세포 염색에 대해 양성인 세포를 제외한 점도표를 만드는 것으로 시작합니다. 다음으로, here 와 here 와 같이 doublet 이벤트를 제외합니다. 이제 전방 및 측면 산란 채널을 사용하여 관심 세포를 게이트하고 파편을 제외해야 합니다.

그런 다음 CD 45 양성 및 IAB 양성 항원에 대한 또 다른 점도표 게이팅을 만듭니다. 별도의 점도표로 세포를 표시하면 특정 DC 및 대식세포 하위 집합을 구별할 수 있는 영역이 생성됩니다. 여기에 표시된 R 1 영역은 CD 11 C 양성 CD 11 B 둔한 음성 세포를 포착합니다.

R 2 영역은 R 1 영역의 세포와 CD11 C에 대한 표면 발현 수준이 유사한 세포를 설명하지만, CD 11 B를 발현하는 세포를 나타냅니다. R 3 영역은 CD 11, B 양성 및 CD 11 C 둔한 음성의 세포를 나타냅니다. 이 세 영역은 각각 대식세포 집단과 DC 집단을 구별하기 위해 F 4, 80 및 CD 1, 0, 3 발현에 대해 추가로 분석할 수 있습니다. 이 점도표에서 볼 수 있듯이, R 1 영역의 CD 11 C positive CD 11 B 둔한 음성 세포는 alpha ein CD 1 0 3 의 높은 수준과 F 4 80의 낮은 수준을 발현합니다.

이 점도표는 R 2 영역의 CD 11 B 양성 CD 11 C 양성 세포가 CD 1 0 3 및 F 4 80의 이분형 발현을 기반으로 DCS 및 대식 세포로 구성된다는 것을 보여줍니다. 마지막으로, 이들의 F 4 80 양성 및 CD 1 0 3 음성 표현형 프로파일 R 3, 게이트 CD 11 B 양성 CD 11 C del 음성 세포는 대식 세포로 구성될 것이며, 총 세포 수율에 대한 조직 소화 기간과 CD 11 B 및 CD 11 C의 발현 사이의 관계는 다음 6 개의 그림에 예시되어 있습니다. 3분 동안 소화된 장 조직은 총 세포 수가 적어 특성화에 사용할 수 있는 dcs 및 대식세포가 거의 생성되지 않으며, 11분 동안 조직을 소화하면 살아있는 세포의 강력한 수율을 생성하여 표현형적으로 구별되는 높은 수준의 CD 11 B 및 CD 11 C를 발현하는 dc 및 대식세포 집단을 생성합니다.

대조적으로, 50분 동안 분해하면 최적화된 분해와 비교하여 유사한 세포 수율을 얻을 수 있습니다. 그러나, CD 11 B 및 CD 11 C를 사용하여 상이한 세포 집단을 묘사하는 것은 더욱 어려워진다. CD11 C의 발현이 감소하고 사멸 세포의 수가 증가함에 따라.

따라서 장 조직 소화를 위한 매개변수를 최적화하면 강력한 세포 수율을 빠르게 달성할 수 있습니다. 결과적으로, 마우스 장 dcs 및 대식세포의 신속한 분리는 온전한 표면 항원을 가진 면역 세포의 기능적 특성을 평가하는 데 유용할 수 있습니다.