Name: 마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 학습하세요 마우스 소장에서 수지상 세포와 대식세포를 빠르게 분리하는 방법을. 조직 소화와 유세포 분석을 통해 면역 세포의 표현형과 기능을 정확히 특성화할 수 있습니다.

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우리는 셀 정렬을 위해 아론 레이를 (에모리 대학 소아과학과와 애틀랜타 흐름 코어의 어린이 건강 관리) 감사합니다. 이 작품은 TLD에 NIH 교부금 AA01787001, Crohn의 및 미국의 대장염 재단의 경력 개발 수상 및 에모리 - Egleston 아동 연구 센터 종자 교부금에 의해 지원되었다

1. 해부와 창자 상피 세포의 분리 시약 및 장비의 준비 : <ul><li> 실온에 따뜻한 칼슘 2 + / MG 2 + 프리 PBS (CMF PBS). </li><li> 5% FBS (CMF HBSS / FBS)와 실온에 2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 따뜻한 칼슘 2 + / MG 2 + 무료 HBSS. </li><li> 37까지 따뜻한 궤도 흔드는 ° C. </li></ul> 참고 : 1.7-1.1 단계는 세포 사망의 범위를 최소화하고 최대 세포 수율을 달성하기 위해 최대한 빨리 수행해야합니다. <ol><li> 복부 및 흉부 향해 CO 2 챔버 및 스프레이 70 % 에탄올에 쥐를 안락사시켜야. </li><li> 가위와 다시 껍질 복막을 노출하기 위해 피부와 복부의 중간에 작은 수평 절개를합니다. </li><li> pyloric 괄약근에서 절단하여 상부 소장에서 배를 분리 진행합니다. 집게와 장간막을 떨어져 애타게과에 다시 절단ileo-cecal 밸브가 대장에서 전체 소장을 풀고있다. 항문 직전에 상처를 만들고 대장은 무료이며 때까지 다시 장간막을 떨어져 애타게. </li><li> 길이 방향 가위를 사용하여 콜론을 열고 잘라 실온에서 CMF PBS의 창자 루멘에서 배설물 내용과 점액을 씻어. </li><li> macroscopically 작은 창자의 안티 mesenteric 표면을 따라 Peyer의 패치를 해부하고 길이 방향 작은 창자를 오픈 잘라 가위와 집게를 사용하십시오. </li><li> 실온에서 CMF PBS의 지저분한 내용과 점액의 작은 창자의 루멘 씻으십시오. </li><li> 별도로 사전 예열 CMF HBSS / FBS와 2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 30 ML을 포함하는 별도의 50 ML 원뿔 튜브에 약 1.5 cm의 조각과 장소에 작은 / 큰 창자를 잘라. 50 ML 원뿔 튜브 당 1 이상 소장을 추가하지 마십시오. </li><li> 수평 ° C. &lt;37시 20 분 동안 궤도 흔드는로 각각 50 ML 원뿔 튜브를 삽입 및 250 rpm으로 위해 악수/ 리&gt; <li> 폐기물 양동이를 통해 하나의 메쉬 와이어 스트레이너를 삽입하고 소장의 1.5 cm 조각을 복구를 통해 각각 50 ML 원뿔 튜브의 내용을 부어 2로 미리 예열 CHBSS / FBS의 30 ML을 포함하는 별도의 50 ML 원뿔 튜브에 넣어 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). </li><li> 1.8 반복합니다. </li></ol> 2. 조직 소화와 창자 세포의 분리 시약 및 장비의 준비 : <ul><li> Collagenase 솔루션 : 1.5 MG / ML 타입 VIII Collagenase는 DNase 나의 40 μg / ML로 미리 예열 CMF HBSS / FBS에 녹아있는 </li><li> 사전 예열 CMF HBSS / FBS와 2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). </li><li> 37 미리 예열 궤도 흔드는 ° C. </li><li> 얼음처럼 차가운 CMF HBSS / FBS. </li></ul><ol><li> 흔들림의 두 번째 라운드 후, 스트레이너를 통해 각각 50 ML 원뿔 튜브의 내용을 부어하고 작은 플라스틱으로 소장의 1.5 cm 조각을 전송 종이 타월을 사용하여 여분의 미디어를 멀리 dabbing 후 보트를 달다. </li><li> 신속하게 1을 말하다소장의 0.5 cm 조각 체중 보트에 직접 가위를 사용하고 collagenase 용액의 20 ML에 다진 소장을 추가합니다. 가로 37에 10-20 분 동안 200 rpm으로 궤도 흔드는 및 다이제스트로 각각 50 ML 원뿔 튜브를 삽입 ° C.는 최적화에 관한 아래의 논의를 참조하십시오. </li><li> 직접 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 언제 나머지 장 조직 및 필터의 철저한 분리를 보장 간략히 소용돌이. </li><li> CMF HBSS / FBS 및 4에서 5 분 1,500 rpm으로 원심 ° C. 각각 50 ML 원뿔 튜브 톱 오프 고체 펠렛은 원심 분리 후 콜론 샘플에 대해 관찰되지 않을 경우 샘플은 3.5 분 동안 다시 centrifuged해야합니다. 한번 더이 세차 단계를 반복합니다. </li><li> 뜨는을 붓고 얼음처럼 차가운 CMF HBSS / FBS 및 장소 샘플 얼음에 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 고속 셀 sorti위한 자성-비드 농축을위한 FACS 수집 / 분석 또는 제 4 항 3으로 진행합니다NG. </li></ol> 3. DCS 및 Macrophages의 멀티 컬러 흐름 Cytometric 분석을위한 항체 염색법 시약 및 장비의 준비 : <ul><li> 얼음처럼 차가운 CMF PBS. </li><li> 얼음처럼 차가운 염색법 버퍼 (CMF PBS가 + 5퍼센트 FBS). </li><li> 죽었 / LIVE 고칠수 아쿠아 죽은 세포 얼룩 키트를 사용하여 1:1000 희석에 얼음처럼 차가운 CMF PBS에 얼룩 죽은 세포를 준비합니다. </li><li> CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (IA B) - 알렉사 형석 700 CD11b 다음 형광 라벨이 표시된 단클론 항체 (mAbs) 심심풀이 염색법 버퍼에 추가하여 항체 염색법 칵테일을 준비 - eFluor 450 F4/80-PE-Cy7. </li></ul><ol><li> 5 ML의 폴리스티렌 왕복 하단 (FACS) 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 CMF PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 죽은 세포로 품어 샘플은 어두운 얼음 속에서 15 분 동안 얼룩. </li><li> 얼음처럼 차가운 CMF PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 얼음처럼 차가운 염색법의 2.4G2 anti-FcγRIII/II있는 블록 세포얼음에 10 분 대한 버퍼. </li><li> 얼음처럼 차가운 염색법 버퍼에 세포를 씻으십시오. </li><li> 어두운 얼음 속에서 20 분 대한 항체 염색법 칵테일과 샘플을 품어. </li><li> 두번 심심풀이 염색법 버퍼로 세포를 씻어과 얼음처럼 차가운 염색법 완충액 400 μl에 샘플을 resuspend하고 FACS 튜브 40 μm의 필터 캡을 통과. </li><li> 제 5 및 그림 1에 게이팅 전략에 의해 정의된대로 LSR II cytometer (BD)에 샘플을 습득. </li></ol> 4. 소장의 DCS 및 Macrophages의 농축 시약 및 장비의 준비 : <ul><li> 얼음처럼 차가운 염색법 버퍼 (CMF PBS가 + 5퍼센트 FBS). </li></ul><ol><li> 제조 업체의 지침에 따라 CD11b와 CD11c 맥에서 구슬있는 단계를 2.5에서 얻은 단일 세포 현탁액을 품어. </li><li> 원심 분리에 의해 다음에 얼음처럼 차가운 염색법 버퍼로 세포를 씻으십시오. </li><li> 뜨는을 무시하고 1 ML 심심풀이 염색법 버퍼에 세포 펠렛을 resuspend그리고 40 μm의 셀 스트레이너 다음에 100 μm의 셀 스트레이너 통과. </li><li> 맥에서 LS 자기 컬럼을 이용하여 긍정적인 선택에 의해 자성 비드 연결된 세포에 대한 더욱 돋보이게합니다. </li><li> 단계 4.2 반복하고 뜨는 버리고. </li><li> 와 같은 단계를 3.7에서 설명한 표면 마커 mAbs과 세포를 품어. </li><li> 얼음처럼 차가운 염색법 버퍼로 두 번 마그네틱 비드 - 농축 세포를 씻으십시오. 나트륨 azide없이 500 μL 심심풀이 염색법 버퍼에 셀 알약을 Resuspend하고, FACS 튜브로 40 μm의 셀 스트레이너 통과. </li><li> 창자 DC 및 / 또는 관심있는 대식 세포의 하위 집합을 정렬하는 BD ARIA II 세포 분류기에서 FACS-분류로 진행합니다. </li></ol> 5. LP APCs위한 게이팅 전략 참고 : 흠없는 창자 세포가 긍정과 부정 인구를 구분하기 위해 성문의 적절한 배치를 지원하기 위해 부정적인 제어로 활용됩니다 유의하시기 바랍니다. <ol><li> 그림에 나타난 바와 같이1 도트 계획을 작성하고 이중어 행사의 배제 (그림의 1B 및 C) 다음에 얼룩 죽은 세포 (그림 1A) 양성 반응 세포를 제외할 수 있습니다. 그런 다음, 전달 및 사이드 분산형는 (그림의 1D) 파편을 제외해야하기에 따라 관심의 세포에 게이트. </li><li> CD45의 다른 점 줄거리와 더 게이트 만들기 +와 아이오와 B + phenotypically APCs (그림 1E)를 특징 세포. </li><li> 별도의 도트 줄거리에서 CD11b 및 특정 DC 및 대식 세포의 하위 집합을 (.; 그림 1 층 R1, R2 및 R3) 구별하는 CD11c 표현에 대해 분석합니다. R1의 세포는 CD11c + CD11b입니다 / 무뎌 - 세포. 지역, R2는 이러한 세포가 R1의 세포와 같이 CD11c 위해 표면 표현의 유사한 수준을 가지고 있지만 R2의 세포도 급행 CD11b 그러한 delineated있다. - 이후 R3 지역은 CD11b +를 그리고 / 무딘 CD11c있는 세포를 위해 지정되어 있습니다. </li><li>지역 R1, R2, 그리고 대식 세포 및 DC 인구를 차별화하기 위해 R3 F4/80에 대한 그리고 CD103 표현, 각각을 alyze. CD11c + CD11b / 무딘 - αE 인테, CD103, 그리고 F4/80의 낮은 수준 (그림 1G)의 R1 명시적인 높은 수준의 세포. CD11b + CD11c + R2의 세포는 CD103과 F4/80 (그림 1H)들의 dichotomous 표현을 바탕으로 DCS 및 macrophages 모두 구성되어 있습니다. 마지막으로, CD11b + CD11c 무딘 / - R3의 세포가 F4/80 +와 CD103의 phenotypic 프로파일을 기반으로 macrophages를 구성 - (그림 1I) 16. </li></ol> 6. 대표 결과 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4040/4040fig1.jpg" /> 1 그림. 창자 DCS 및 macrophages를위한 게이팅 전략. 죽은 세포 ()와 doublets (B와 C)은 첫번째 작은 intesti 다음 분석에서 제외하고 있었다nal 세포 전달 따라 게이트와 사이드 분산형 (D) 였는데, APCs는 CD45과 같이 정의되었다 + 아이오와 B + (E). Macrophages와 DC가이 CD11b와 CD11c (F)의 표현에 의해 확인되었다. CD103과 사전 문이 R1 (G), R2 (H)와 인구 (I) R3에서 전지 F4/80 식을 분석되었다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4040/4040fig2.jpg" /> 그림 2. 세포 수율 및 항체 염색법 품질은 소화 시간에 따라 달라집니다. CD11b와 CD11c 염색법 패턴 이하 - (A, D)의 총 세포 수율, 최적 - (B, E) 또는 오버 소화는 (C, F) 장 조직. 창자 세포는 C57BL / 6 마​​우스 소장으로부터 격리되었고 DCS 및 macrophages는 BD LSR II에 FACS로 분석되었다. 전압 및 보상은 흠없는 및 단일 fluorochrome 묻은 splenocytes를 사용하여 설정되었다. 죽은 세포 (그림 1A) 및 doublets은 (그림의 1B 및 C) 처음부터 제외되었습니다분석. 관심있는 세포 그 다음 전달하고 따라 분석되었다 CD45에 게이팅 뒤에 사이드 분산형 (그림의 1D) + 및 IA B + 세포 (그림 1E). 이후 CD11b와 CD11c 표현은 CD45 사이에 평가되었다 + 아이오와 B 세 지역 (R1, R2 및 R3., 그림 1 층) 윤곽을 그리다하기 + 세포. 세 지역에서 CD103과 F4/80 표현은 각각 DCS 및 macrophages 구별 평가되었다. CD11c + CD11b 무딘 / - R1의 세포가 αE 인테, CD103, 그리고 F4/80의 낮은 수준 (그림 1G)의 높은 수준을 보였다. CD11b + CD11c + CD11b + CD11c / 무딘 동안 R2의 세포는 CD103과 F4/80 (그림 1H)들의 dichotomous 표현을 바탕으로 DCS 및 macrophages 모두 구성되어 있었다 - R3의 세포 F4 /의 phenotypic 프로파일을 기반으로 macrophages를 구성 80 +와 CD103 - ( <str긴 사연&gt; 그림. 1I) 16. R3 게이트에서 R2 게이트와 macrophages 내에서 Macrophages 유사한 순방향 및 사이드 산란 특성을 가지고 있으며 CD11c 표현하여 구별할 수 있습니다. 이 하위 집합의 기능적인 이분법은 불완전하게 이해 남아 있습니다. 총 세포 수율 및 CD11b와 CD11c의 표현에 대한 조직 소화 기간의 관계는 그림 2에 설명된됩니다. 3 분 (이하 - 소화)를 소화했다 장 조직은 낮은 총 휴대폰 번호 (그림 2D) 그래서 몇 DCS 및 특성에 사용할 수 macrophages (그림 2A)를 굴복. 11 분 용 티슈는 소화 CD11b와 CD11c 높은 수준을 표명하고 (그림 2C) phenotypically 독특했다 DCS 및 macrophages의 인구 라이브 셀 (그림의 2E)의 강력한 수확량을 생산했다. 대조적으로 50 분 (오버 소화)에 대한 소화가 유사한 세포 수율으로 이어지는 경우 공동최적 소화 (그림 2E와 F)에 mpared 그러나, CD11b와 CD11c를 사용하여 서로 다른 세포 집단의 묘사는 (그림 2C) CD11c 줄었의 표현으로 더 애매한되어 죽은 세포의 숫자 (데이터가 표시되지 않음) 증가했다.

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<img src="/files/ftp_upload/4040/4040fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 세포 수율 및 표면 항원 표현의 최적화에 중요한 요인. 세포 수율 및 표면 항원 표현이 직접적으로 조직 소화 기간의 영향을받는, collagenase의 구체적인 특성, 닦지 조직의 정도와 염증의 유무, 이는 조직 무결성 및 cellularity 영향을 미칠 수 있습니다. 불충 분한 조직 소화가 분석을위한 세포의 소수가 발생할 수도 있지만 장기 조직 소화가 감소 세포 생존 능력과 표면 항원 발​​현을 초래할 수 있습니다. 여기서는 멀티 컬러 유동세포계측법를 사용 phenotypic 특성과 세포를 정화에 기능성 연구를 수행하도록 정렬 맥을 비즈와 세포를 사용하여 농축을위한 마우스 창자 DCS 및 macrophages의 급속한 분리에 대한 방법론을 상세하게. collagenase의 농도를 최적화및 조직 소화 기간은 생존과 표면...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 1X PBS, CA 2 + -와 MG 2 + 프리 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 페놀 레드와 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) </td><td> 피셔 과학 </td><td> SH3001603 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 중탄산염 </td><td> 시그마 </td><td> S6014 </td><td></td></tr><tr><td> 0.85 % NaCl에서 1M HEPES </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> 애틀랜타 생체 </td><td> S11150H </td><td> 히트-inactivated </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0) </td><td> Cellgro </td><td> 46-034-CI </td><td></td></tr><tr><td> CollagenasE 타입 VIII </td><td> 시그마 </td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 로슈 </td><td> 14785000 </td><td> 증권 솔루션 : 100mg/ml </td></tr><tr><td> 405 나노미터 여기에 죽은 / LIVE 고칠수 아쿠아 죽은 세포 얼룩 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> L34957 </td><td> 1:1000에서 사용 </td></tr><tr><td> CD45-PerCP mAb (30F11) </td><td> BD </td><td> 557,235 </td><td> 1:100에서 사용 </td></tr><tr><td> CD103-PE mAb (M290) </td><td> BD </td><td> 557,495 </td><td> 1:100에서 사용 </td></tr><tr><td> FcγRIII / II mAb (2.4G2) </td><td> BD </td><td> 553,141 </td><td> 1:200에​​서 사용 </td></tr><tr><td> CD11c-APC mAb (N418) </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82 </td><td> 1:100에서 사용 </td></tr><tr><td> MHC-II (I-AB) - 알렉사 형석 700 mAb </td><td> eBioscience </td><td> 56-5321-82 </td><td> 1:100에서 사용 </td></tr><tr><td> CD11b-eFluor 450mAb (M1/70) </td><td> eBioscience </td><td> 48-0112-82 </td><td> 1:200에​​서 사용 </td></tr><tr><td> F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801-82 </td><td></td></tr><tr><td> CD11b microbeads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-049-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD11c microbeads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-052-001 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML 원뿔 튜브 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,098 </td><td></td></tr><tr><td> 단일 메쉬 와이어 스트레이너 </td><td> Chefmate </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 스몰 보트를 달다 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-732-116 </td><td></td></tr><tr><td> 100 μm의 셀 스트레이너 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,360 </td><td></td></tr><tr><td> 40 μm의 셀 스트레이너 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 35,2340 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ML의 폴리스티렌 왕복 하단 튜브 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,235 </td><td> 1:100에서 사용 </td></tr><tr><td> MaxQ 4450 benchtop 궤도 흔드는 </td><td> 써모 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LS 맥에서 칼럼 </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> LSR II </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FACSAria II </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 소장에서 돌기 세포 및 macrophages의 분리 및 특성화

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

소장 내에서 concomitantly 남아 침입 병원균의 1,2으로 염증 반응을 마운트 태세를하면서 공생 식물 및 식품 항원으로 허용 오차를 추진에 관여하고 타고난 및 적응 면역 세포의 독특한 인구 거주. 항원 제시 세포, 특히 DCS 및 macrophages은 감각 능력을 통해 장내 면역 항상성을 유지하는 중요한 역할을 적절하게 microbiota 3-14에 대응. 창자 DCS 및 macrophages의 효율적인 분리는 이러한 세포의 표현형 및 기능을 특성화의 중요한 단계입니다. DCS 및 macrophages를 포함한 장내 면역 세포를, 분리 많은 효과적인 방법은 6,10,15-24 설명되어 있지만, 많은 사람들이 부정적인 세포 표면 항원 발현, 세포 생존 및 / 또는 세포 수율에 영향을 미칠 수있다 긴 digestions 시간에 의존. viabl 다수의 신속한 격리를위한 여기서는 세부 방법론을E, 창자 DCS 및 macrophages. 창자 DCS 및 macrophages의 Phenotypic 특성화 직접 멀티 컬러 흐름 cytometric 분석을위한 구체적인 형광 라벨이 표시된 단클론 항체와 격리된 창자 세포를 더럽히는 것에 의해 수행됩니다. 또한, 매우 순수 DC 및 대식 세포의 인구는 셀 정렬 뒤에 CD11c 및 CD11b 자기가 활성화된 세포 분류 구슬을 이용한 기능성 연구에 대해 격리됩니다.

여기서는 자세하게 마우스 장 돌기 세포 (DC가)와 macrophages의 급속한 분리를위한 방법론. 창자 DCS 및 macrophages의 Phenotypic 특성은 세포 정렬 뒤에 자석 구슬 농축은 기능적 연구를위한 매우 순수 인구를 얻을하는 데 사용하는 동안 멀티 컬러 플로우에게 cytometric 분석을 사용하여 수행됩니다.

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

장 내에는 공생 미생물군에 대한 내성을 촉진하고 ... 하는 데 관여하는 선천성 및 적응성 면역 세포의 고유한 집단이 존재합니다.

이 프로시저의 전체적인 목표는 표현형 및 기능적 특성 분석을 위해 마우스의 장 dendritic cells(dcs) 및 대식세포를 신속하게 분리하는 것입니다. 이는 먼저 장 조직을 수확함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 장 상피를 고유층(lamina propria)으로부터 분리하는 것입니다.다음으로, 절차의 마지막 단계에서 장 고유층(Lamin Propria)을 소화합니다. 고유층 세포를 형광 표지된 접합 항체로 염색하고, 특정 세포군을 분류하기 위해 게이팅(gating)합니다. 최종적으로 장 수지상세포(DC) 및 대식세포군을 더욱 정확하게 특성화하고 정제하여, 사이토카인 생성, 항원 제시 및 면역 세포 조절을 평가하는 기능 연구에 활용할 수 있습니다.이 기술이 기존 방법보다 갖는 주요 장점은 조직 소화 속도가 매우 빨라 세포 표면 항원 발현, 세포 생존력 및 세포 상태를 최적으로 유지할 수 있다는 것입니다. 마우스를 안락사시킨 후 발가락 집기 반사로 사망을 확인하고, 동물의 복부와 흉부에 70%ethanol을 분무하십시오. 그런 다음 가위를 사용하여 복부 중앙에 작은 가로 절개를 넣고 피부를 젖혀 복막을 노출시킵니다.유문 괄약근 부위를 절개하여 위와 상부 소장을 분리하고, 포셉을 사용하여 장간막을 떼어낸 후 가위로 복막을 엽니다. 회맹판 부위를 다시 절개하여 소장 전체를 대장에서 분리합니다. 대장에서 장간막을 계속해서 분리하고 항문 입구 쪽을 절개합니다.가위로 결장을 세로 방향으로 절개하고, 상온의 C-M-F-P-B-S를 사용하여 장관 내강의 분변 내용물과 점액을 세척해 냅니다. 그런 다음 가위와 핀셋을 사용하여 소장의 장간막 반대쪽 표면을 따라 파이어 패치(pyres patches)를 육안으로 확인하며 분리하고, 소장을 세로 방향으로 절개합니다.다음으로, 실온의 C-M-F-P-B-S를 더 사용하여 소장 내강의 분변 내용물과 점액을 제거합니다. 별도로 소장과 대장을 약 1.5 centimeter 길이로 자르고, 각 조각을 FBS와 2 millimolar EDTA가 포함된 30 milliliter의 예열된 C-M-F-H-B-S-S가 들어 있는 개별 50 milliliter 원심분리 튜브에 넣습니다. 각 50 milliliter 원심분리 튜브를 오비탈 쉐이커에 수평으로 배치하고 37 degrees Celsius에서 20분 동안 250 RPM으로 흔들어 줍니다.다음으로 폐액 버킷 위에 메쉬 와이어 스트레이너를 하나 놓습니다. 각 50 milliliter 원뿔형 튜브의 내용물을 메쉬에 부어 장 조각들을 회수하고, 이를 2 millimolar EDTA가 포함된 FBS 함유 Prewarm C-M-F-H-B-S-S 30 milliliters가 들어 있는 새로운 개별 50 milliliter 원뿔형 튜브에 넣습니다. 마지막으로, 튜브들을 다시 오비탈 쉐이커에 넣고 20분 동안 더 반응시킵니다.두 번째 흔들기 단계가 끝난 후, 각 튜브의 내용물을 체에 걸러 붓습니다. 다시 한번 종이 타월을 사용하여 과도한 배지를 닦아낸 다음, 장 조각들을 작은 플라스틱 유청 보트(whey boat)로 옮깁니다. 이 기술에서 가장 어려운 부분은 조직 소화 과정이며, 성공적인 결과를 얻기 위해서는 소화 시간, 콜라게나제(collagenase)의 특성, 조직의 무결성 및 소화할 조직의 크기와 같은 모든 다양한 매개변수를 가위로 신속하게 처리하며 고려해야 합니다.장 조각들을 잘게 자른 다음, 다져진 장 조직을 20 mL의 collagenase 용액이 들어 있는 50 mm 원뿔형 튜브에 넣습니다. 원뿔형 튜브를 궤도 셰이커(orbital shaker)에 수평으로 배치하고, 37 °C에서 200 RPM으로 10분에서 20분 동안 장 조각들을 소화시킵니다. 이제 튜브를 짧게 볼텍싱(vortex)하여 남아 있는 장 조직이 완전히 해리되도록 한 다음, 세포 슬러리를 100 µm 세포 스트레이너로 걸러 50 mL 원뿔형 튜브에 직접 담습니다.마지막으로, 원추형 튜브의 빈 공간을 FBS가 포함된 C-M-F-H-B-S-S로 채우고, 세포 용액을 4 °C에서 425 ×g로 5분 동안 두 번 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 따라내고 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 FBS 포함 C-M-F-H-B-S-S에 다시 현탁하여 샘플을 얼음에 둡니다. 이후 관심 있는 세포 표면 단백질에 대해 세포를 염색합니다.여기에 표시된 것과 같이 사멸 세포 염색 양성 세포를 제외하여 도트 플롯(dot plot)을 생성하는 것으로 시작하십시오. 다음으로, 여기와 여기에 표시된 대로 더블렛(doublet) 이벤트를 제외하십시오. 이제 전방 산란광(forward scatter)과 측방 산란광(side scatter) 채널을 사용하여 파편(debris)을 반드시 제외하고 분석 대상 세포를 게이팅(gate)하십시오.그런 다음 CD 45 양성과 IAB 양성 항원 제시 세포를 게이팅하여 또 다른 점 도표(dot plot)를 생성합니다. 별도의 점 도표에서 특정 DC 및 대식세포 서브셋을 구분하기 위한 영역을 설정합니다. 여기에서 표시된 R1 영역은 CD 11 C 양성 및 CD 11 B dull 음성 세포를 포착합니다.R2 영역은 R1 영역의 세포들과 유사한 수준의 CD11C 표면 발현을 보이지만, 동시에 CD11B를 발현하는 세포들을 나타냅니다. R3 영역은 CD11B 양성이면서 CD11C 약음성(dull negative)인 세포들을 지정합니다. 이 세 영역은 각각 대식세포와 수지상세포(DC) 집단을 구분하기 위해 F4/80 및 CD103 발현을 추가로 분석할 수 있습니다. 이 도트 플롯에서 볼 수 있듯이, R1 영역의 CD11C 양성 CD11B 약음성 세포들은 높은 수준의 αE CD103과 낮은 수준의 F4/80을 발현할 것입니다.이 도트 플롯(dot plot)은 R2 영역의 CD11b 양성 CD11c 양성 세포가 CD103과 F4/80의 이분법적 발현을 바탕으로 DC와 대식세포 모두로 구성됨을 보여줍니다. 마지막으로, F4/80 양성 및 CD103 음성 표현형 프로파일인 R3를 바탕으로, 게이팅된 CD11b 양성 CD11c 델타 음성 세포는 대식세포로 구성됩니다. 조직 소화 시간과 총 세포 수율, 그리고 CD11b 및 CD11c 발현 사이의 관계는 다음 6개 그림에 나타나 있습니다. 3분 동안 소화한 장 조직은 총 세포 수가 적어 특성 분석에 사용할 수 있는 DC와 대식세포가 거의 없습니다. 11분 동안 조직을 소화하면 살아있는 세포가 충분히 수득되며, CD11b와 CD11c를 높게 발현하고 표현형적으로 뚜렷이 구분되는 DC 및 대식세포 집단을 얻을 수 있습니다.반면, 50분 동안 소화시키면 최적화된 소화 과정과 유사한 세포 회수율을 얻을 수 있습니다. 하지만 CD 11 B와 CD 11 C를 이용한 서로 다른 세포 군집의 구분이 더 어려워집니다. 이는 CD 11 C의 발현이 감소하고 사멸 세포의 수가 증가하기 때문입니다.따라서 장 조직 소화를 위한 파라미터를 최적화함으로써, 견고한 세포 수율을 신속하게 얻을 수 있습니다. 결과적으로, 마우스 장 내 DC와 대식세포를 빠르게 분리하는 방법은 표면 항원이 온전하게 보존된 면역 세포의 기능적 특성을 평가하는 데 유용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Miltenyi 맥스 키트를 사용 lymphocytes의 격리는 전체 림프 조직 homogenates에서 세포를 정화하는 안정적인 방법입니다. Miltenyi 시스템을 사용하여 정화 세포는 일반적으로 ≥ 96% 순수하고 있습니다. 여기, 우리는 CD4 + T 세포, Miltenyi에서 제공하는 많은 키트 중 하나를 분리하기 위해 취한 단계를 보여줍니다.

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

마우스 폐 돌기 세포의 고도 정화 준비가 설명되어 있습니다. 구체적인 중점이 종래의 돌기 세포 집합의 고립에 제공됩니다.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

Peyer의 패치에있는 셀의 특정 subpopulations (조달청), 창자 관련 림프의 조직의 주요 유도 사이트의 면역 기능을 이해 증가 관심이 있습니다. 여기 흐름 cytometric 분석 및 immunostaining을위한 PP cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비 병렬 프로토콜을 설명합니다.

림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

이 프로토콜은 항원 밀도 단일 세포 현탁액을 원심 분리하고 그 세포 집단의 마지막 자석 및 / 또는 FACS 정렬 뒤에 조직의 소화 효소의 여러 단계를 통해 인간 흉선에서 제시 세포 분리하는 방법을 자세히 설명.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

장 림프구의 정량적 특성화에 대한 관심이 높아지고 있는데, 이는 이러한 세포가 다양한 장 및 전신 질환에서 중요한 역할을 한다는 인식이 높아짐에 따라 발생합니다. 이 프로토콜에서는 후속 유세포 분석 특성 분석을 위해 다른 소장 구획에서 단일 세포 집단을 분리하는 방법을 설명합니다.

쥐 소장 림프구의 분리 및 유세포 특성

여기 분리 하 고 그들의 phenotypical 및 기능 특성의 평가 대 한 인간의 여성 재생산 지역에 다른 해 부 격실에서 수지상 세포를 정화 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다른 면역 세포 또는 다른 점 막 조직에서 수지상 세포를 분리 적용할 수 있습니다.

Phenotypical 및 기능 연구에 대 한 인간의 여성 생식 관에서 수지상 세포의 고립

Monocyte 파생 된 DC (MoDC) 위험 관련 된 분자의 작은 금액을 느낄 수 및 따라서 쉽게 끝났다. 우리는 혈액과 종양과 그들의 조기 활성화를 피하기 위해 고려해 야 하는 주요 조치를 강조 하면서 면역성이 있는 복합물으로 그들의 활성화에서 MoDC의 격리에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

이 프로토콜의 목표는 콜라게나제를 사용하여 조직의 효소 소화에 의해 결장의 라미나 프로피리아에 있는 단핵 세포를 분리하는 것입니다. 이 프로토콜은 단일 핵 세포의 효율적인 분리를 허용하여 단일 세포 현탁액을 생성하여 강력한 면역 세포 증식에 사용할 수 있습니다.

콜라게나아제 E를 사용하여 뮤린 결장에서 라미나 프로프리아 단핵 세포의 분리

이 연구는 분리 된 관류 된 마우스 뇌 맥락막 신경총에 대한 유세포 측정과 두 가지 게이팅 전략을 사용합니다. 이 프로토콜은이 뇌 구조를 채우는 주요 면역 세포 하위 집합을 식별합니다.

미세 해부된 마우스 맥락막 신경총으로부터 면역 세포의 분리 및 특성화

학습하세요 마우스 소장에서 수지상 세포와 대식세포를 빠르게 분리하는 방법을. 조직 소화와 유세포 분석을 통해 면역 세포의 표현형과 기능을 정확히 특성화할 수 있습니다.

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

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